JP6404822B2 - アプタマーおよびその使用 - Google Patents

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Description

相互参照
本出願は、2012年10月23日に出願された米国特許仮出願第61/717,566号；2012年11月29日に出願された同第61/731,419号；2012年12月11日に出願された同第61/735,915号；2013年1月2日に出願された同第61/748,437号；2013年1月7日に出願された同第61/749,773号；2013年1月8日に出願された同第61/750,331号；2013年1月18日に出願された同第61/754,471号；2013年2月20日に出願された同第61/767,131号；2013年2月25日に出願された同第61/769,064号；2013年3月26日に出願された同第61/805,365号；2013年4月3日に出願された同第61/808,144号；2013年5月7日に出願された同第61/820,419号；2013年5月23日に出願された同第61/826,957号；2013年6月24日に出願された同第61/838,762号；2013年7月5日に出願された同第61/843,256号；2013年8月6日に出願された同第61/862,809号；2013年8月8日に出願された同第61/863,828号；2013年8月14日に出願された同第61/866,014号；2013年8月20日に出願された同第61/867,978号；2013年8月28日に出願された同第61/871,107号；および2013年9月6日に出願された同第61/874,621号の恩典を主張し、これらの全ての出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
EFS-WEB経由で提出された配列表
MPEP §1730 II.B.2(a)において認可されかつ明記される米国特許商標庁EFS-WEBサーバを介した配列表の以下の電子的提出物の全内容は、参照によりその全体があらゆる目的のために本明細書に組み入れられる。この配列表は、電子的に提出された、以下に特定されるテキストファイルに包含されている。
ファイル名：37901811601SeqList.txt
作成日：2013年10月23日
サイズ（バイト）：82,464,193 バイト
発明の背景
本発明は、微小胞表面抗原に結合することが可能なアプタマーの分野に概して関連し、これらのアプタマーは、微小胞が関係する癌および/または他の疾患もしくは障害の治療薬および診断薬として有用である。本発明はさらに、微小胞に結合することが可能なアプタマーの投与のための材料および方法にも関連する。微小胞は、癌を示す細胞に由来し得る。
アプタマーは、分子に対し、古典的なワトソン-クリック型塩基対形成以外の相互作用による特異的な結合親和性を有する、核酸分子である。
アプタマーは、ファージディスプレイによって作製されたペプチドまたはモノクローナル抗体（「mAb」）と同様に、選択された標的に特異的に結合することおよび標的が有する活性を調節することが可能であり、例えばアプタマーは、結合を通してそれらの標的が機能する能力をブロックし得る。インビトロ選択プロセスによってランダム配列オリゴヌクレオチドのプールから作製される場合、アプタマーは、成長因子、転写因子、酵素、免疫グロブリン、および受容体を含む100種を超えるタンパク質に対して作製されている。典型的なアプタマーは、サイズが10〜15 kDa（30〜45ヌクレオチド）であり、サブナノモルの親和性によってその標的に結合し、かつ密接に関連する標的を識別する（例えば、アプタマーは典型的に、同じ遺伝子ファミリー由来の他のタンパク質には結合しない）。一連の構造試験は、アプタマーが、抗体-抗原複合体において親和性および特異性を駆動する同じタイプの結合相互作用（例えば、水素結合、静電気的相補性、疎水性接触、立体排除）を使用できることを示している。
アプタマーは、高い特異性および親和性、生物学的有効性、ならびに優れた薬物動態学的特性を含む、治療薬および診断薬として使用するための複数の望ましい特徴を有する。加えて、これらは抗体および他のタンパク質生物製剤と比較して、例えば以下の特有の競合的優位性を有している。
スピードおよび管理。アプタマーは、全面的にインビトロプロセスによって作製され、このことは、治療用リードを含む最初のリードの迅速な作製を可能にする。インビトロ選択は、アプタマーの特異性および親和性が厳しく管理されることを可能にし、かつ毒性および非免疫原性の標的の両方に対するリードを含むリードの作製を可能にする。
毒性および免疫原性。あるクラスのアプタマーは、毒性も免疫原性もほとんど無いかまたは全くないことが実証されている。高レベルのアプタマーによるラットまたはウッドチャックの長期にわたる投薬（毎日10 mg/kgを90日間）において、臨床的、細胞の、または生化学的測定のどれによっても毒性は観察されない。一方、多くのモノクローナル抗体の有効性は、抗体自身に対する免疫応答によって激しく制限され得る。最も可能性が高い理由としてアプタマーがMHCを介してT細胞に対して提示されず、かつ免疫応答は一般に核酸断片を認識しないようにされていることから、アプタマーに対する抗体を顕在化させることは極めて困難である。
投与。このことから、最近承認された抗体治療薬は、静脈内注入（典型的に2〜4時間にわたる）によって投与され、アプタマーは、皮下注射によって投与することができる（皮下投与によるアプタマーの生物学的利用率は、サルにおける研究では80%を超える（Tucker et al., J. Chromatography B. 732: 203-212, 1999（非特許文献1）））。この違いは、比較的低い溶解性およびこれによる大部分の治療用mAbに必要な多大な量に主に起因する。良好な溶解性（>150 mg/mL）かつ比較的低い分子量（アプタマー：10〜50 kDa；抗体：150 kDa）では、アプタマーの一週間の用量は、注射により0.5 mL未満の量で送達され得る。加えて、小さいサイズのアプタマーは、これらが、抗体または抗体断片は侵入することができない立体構造的に狭窄の領域中に侵入することを可能にする。このことは、アプタマーをベースにした治療薬または予防法のさらに別の利点を示している。
スケーラビリティおよびコスト。アプタマーは、化学的に合成され、かつ診断的または治療的用途のための生産需要を満たすために必要に応じて容易にスケール変更される。生産のスケール変更における問題は、現在一部の生物製剤の有用性を制限しており、かつ大規模なタンパク質生産プラントの資本コストは莫大であるが、単一の大規模オリゴヌクレオチド合成装置は、100 kg/年を上回って生産することができ、かつ必要とする初期投資は比較的控えめである。キログラムスケールでのアプタマー合成用の製品の現在のコストは$100/gと推定され、これは高度に最適化された抗体用のコストに匹敵する。
安定性。アプタマーは、化学的に頑強である。これらは元来、熱および変性剤などの因子に対する暴露に続いて活性を回復するように適合されており、かつ長期の間（>1年）、室温で凍結乾燥粉末として保管することができる。
参照による組み込み
本明細書で言及したすべての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により本明細書に組み入れられているよう具体的かつ個々に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み入れられる。
Tucker et al., J. Chromatography B. 732: 203-212, 1999
本発明の組成物および方法は、微小胞表面抗原または微小胞表面抗原の機能的断片などの関心対象のバイオマーカーに結合するアプタマーを提供する。様々な態様において、本発明のアプタマーは、診断、予後判定、またはセラノーシス用の（theranostic）プロセスにおいて、診断、予後判定、またはセラノーシス用の読み出し情報を提供することが確認されている微小胞表面抗原の存在またはレベルについて、生物学的試料をスクリーニングするために使用される。この診断、予後判定、またはセラノーシス（theranosis）は、癌に関連しうる。本発明はまた、アプタマーライブラリーのスクリーニングを容易にするための方法および組成物ならびにアプタマー検出方法も提供する。
ある局面において、本発明は、（a）表18に記載される、SEQ ID NO: 230900〜230903、230908、230913〜230927、もしくは任意の上記配列の可変配列；または（b）任意の上記配列の機能的断片のいずれかと、少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、または100パーセント相同である核酸配列を含む、微小胞に結合するアプタマーを提供する。アプタマーは、SEQ ID NO: 230900〜230903、230908、230913〜230927、またはそれらの機能的断片のいずれかを含み得る。機能的断片は、アプタマーの標的に結合する能力を保持する任意の断片を含んでもよく、限定するわけではないが、表18に示される「可変配列」領域を含む。一部の態様において、微小胞は、前立腺癌細胞から流出したものである。
別の局面において、本発明は、（a）表23に記載される、SEQ ID NO: 231018〜231031もしくはそれらの可変配列；（b）表24に記載される、SEQ ID NO: 231032〜231051もしくはそれらの可変配列；（c）SEQ ID NO: 231032〜241535；または（d）任意の上記配列の機能的断片のいずれかと、少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、または100パーセント相同である核酸配列を含む、微小胞に結合するアプタマーを提供する。アプタマーは、SEQ ID NO: 231018〜231031またはそれらの機能的断片のいずれかを含み得る。アプタマーはまた、SEQ ID NO: 231032〜231051またはそれらの機能的断片のいずれかも含み得る。機能的断片は、アプタマーの標的に結合する能力を保持する任意の断片を含んでもよく、限定するわけではないが、表23〜24のいずれかに示される「可変配列」領域を含む。一部の態様において、微小胞は、乳癌細胞から流出したものである。
さらに別の局面において、本発明は、（a）SEQ ID NO: 1〜230810；（b）表11、12、13、15に記載される、SEQ ID NO: 230822〜230899、230904〜230907、230909〜230911、もしくは任意のそれらの可変配列；または（c）任意の上記配列の機能的断片のいずれかと、少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、または100パーセント相同である核酸配列を含む、上皮細胞接着分子（EpCAM）タンパク質に結合するアプタマーを提供する。アプタマーは、アプタマー4 (SEQ ID NO: 1)、オリゴ6 (SEQ ID NO: 230810)、オリゴ4B (SEQ ID NO: 183132)、CAR003 (SEQ ID NO: 230822またはSEQ ID NO: 230823)、CAR016 (SEQ ID NO: 230840)、またはそれらの機能的断片のいずれかを含み得る。アプタマーは、表5、6、7、8、11、12、13、15、16、またはそれらの機能的断片のいずれかに由来し得る。機能的断片は、アプタマーの標的に結合する能力を保持する任意の断片を含んでもよく、限定するわけではないが、表11、12、13、15のいずれかに示される「可変配列」領域、またはこれらの機能的断片を含む。一部の態様において、アプタマーは、インビトロでのEpCAMシグナル伝達を調節する能力を有する。さらに、アプタマーは、インビボでのEpCAMシグナル伝達を調節する能力を有し得る。
さらに別の局面において、本発明は、（a）表20に記載される、SEQ ID NO: 230932〜230935もしくはそれらの可変配列；または（b）任意の上記配列の機能的断片のいずれかと、少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、または100パーセント相同である核酸配列を含む、前立腺特異的膜抗原（PSMA）タンパク質に結合するアプタマーを提供する。
本発明のアプタマーは、本明細書において、DNAまたはRNAの形態で特定され得る。特記しない限り、当業者は、アプタマーは一般的に核酸の様々な形態で合成され得る事を認識するであろう。アプタマーはまた、様々な化学修飾を有してもよく、かつ依然として本発明の範囲内であり得る。
一部の態様において、本発明のアプタマーは、少なくとも1つの化学修飾を含むように改変されている。修飾は、限定するわけではないが、核酸の、糖位置での化学的置換；リン酸位置での化学的置換；および塩基位置での化学的置換を含み得る。一部の態様において、修飾は、ビオチン化、蛍光標識の取り込み、修飾ヌクレオチドの取り込み、2'-修飾ピリミジン、3'キャッピング、アミンリンカーへの結合、高分子量の非免疫原性化合物への結合、親油性化合物への結合、薬物への結合、細胞傷害性部分への結合、および放射性同位体を用いた標識、または本明細書に開示される他の修飾からなる群より選択される。修飾の位置は、所望に応じ変化し得る。例えば、ビオチン化、蛍光標識、または細胞傷害性部分が、アプタマーの5'末端に結合し得る。ビオチン化、蛍光標識、または細胞傷害性部分はまた、アプタマーの3'末端にも結合し得る。
一部の態様において、細胞傷害性部分は、ナノ粒子中に封入されている。ナノ粒子は、リポソーム、デンドリマー、および櫛形ポリマーからなる群より選択され得る。他の態様において、細胞傷害性部分は、小分子の細胞傷害性部分を含む。小分子の細胞傷害性部分は、限定するわけではないが、ビンブラスチンヒドラジド、カリチアマイシン、ビンカアルカロイド、クリプトフィシン、ツブリシン、ドラスタチン-10、ドラスタチン-15、アウリスタチンE、リゾキシン、エポチロンB、エポチロンD、タキソイド、メイタンシノイド、ならびにそれらの任意のバリアントおよび誘導体を含み得る。さらに別の態様において、細胞傷害性部分は、タンパク毒素を含む。例えば、タンパク毒素は、ジフテリア毒素、リシン、アブリン、ゲロニン、およびシュードモナス外毒素Aからなる群より選択され得る。本発明と共に使用するための非免疫原性の高分子量化合物は、ポリアルキレングリコール、例えばポリエチレングリコールを含む。適切な放射性同位体は、イットリウム-90、インジウム-111、ヨウ素-131、ルテチウム-177、銅-67、レニウム-186、レニウム-188、ビスマス-212、ビスマス-213、アスタチン-211、およびアクチニウム-225を含む。アプタマーは、γ線放出放射性同位体によって標識されていてもよい。
本発明の一部の態様において、活性物質がアプタマーに結合している。例えば、活性物質は、治療物質または診断物質であり得る。治療物質は、チロシンキナーゼ阻害剤、キナーゼ阻害剤、生物学的活性物質、生物学的分子、放射性核種、アドリアマイシン、アンサマイシン系抗生物質、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、カルムスチン、カペシタビン、クロラムブチル、シタラビン、シクロホスファミド、カンプトセシン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エトポシド、エポチロン、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルカプトプリン、メルファラン、メトトレキサート、ラパマイシン（シロリムス）、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニトロソ尿素、パクリタクセル、パミドロナート、ペントスタチン、プリカマイシン、プロカルバジン、リツキシマブ、ストレプトゾシン、テニポシド、チオグアニン、チオテパ、タキサン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、タキソール、コンブレタスタチン、ディスコデルモリド、トランスプラチナ（transplatinum）、抗血管内皮成長因子化合物（「抗VEGF」）、抗上皮細胞成長因子受容体化合物（「抗EGFR」）、5-フルオロウラシルおよび誘導体、放射性核種、ポリペプチド毒素、アポトーシス誘導物質、治療増感物質、酵素またはその活性断片、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択され得る。
本発明は、治療的有効量の前記アプタマーまたはその塩、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、薬学的組成物をさらに提供する。本発明はまた、治療的有効量のアプタマーまたはその塩、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む薬学的組成物も提供する。関連して、本発明は、それを必要とする対象に薬学的組成物を投与する工程を含む、疾患または障害を治療するかまたは寛解させる方法を提供する。対象に治療的有効量の組成物を投与する工程は、以下をもたらす：（a）活性物質単独の送達と比較した、疾患部位への活性物質の送達の増大；または（b）微小胞クリアランスの増大による、アプタマーの標的となる微小胞の血中濃度の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、もしくは90%の低下；または（c）該アプタマーの標的となる微小胞の生物活性の、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、もしくは90%の低下。ある態様において、微小胞の生物活性は、免疫抑制または遺伝情報の伝達を含む。疾患または障害は、限定するわけではないが、本明細書に開示するものを含み得る。例えば、疾患または障害は、新生物性の、増殖性の、または炎症性の、代謝性の、心血管の、または神経性の疾患または障害を含み得る。「表現型」の項を参照すること。
本発明は、本明細書に開示されるアプタマーまたはその薬学的組成物を含むキットをさらに提供する。
ある局面において、本発明は、前記アプタマーを生物学的試料と接触させる工程および該生物学的試料中の微小胞に対する該アプタマーの結合の有無を検出する工程を含む方法を提供する。本明細書に開示するように、生物学的試料は、組織、流体、または細胞培養物試料であり得る。例えば、生物学的試料は、血液または血液成分を含み得る。一部の態様において、アプタマーは、生物学的試料と接触させる工程の前に基体に結合している。例えば、基体はビーズまたは平板ウェルを含み得る。アプタマーはまた、検出可能な標識に結合していてもよい。方法の様々な構成が、本明細書に提供される。例えば、図1A〜1Bを参照されたい。
関連する局面において、本発明は、微小胞集団を含有することが疑われる生物学的試料中の該微小胞集団の存在またはレベルを検出する方法であって、該生物学的試料を、微小胞集団に特異的な1種または複数種の結合物質および1種または複数種の前記アプタマーと接触させる工程、ならびに、該1種または複数種の結合物質および該1種または複数種のアプタマーの両方によって認識された微小胞を検出する工程であって、それによって該生物学的試料中の該微小胞集団の存在またはレベルを検出する、工程を含む、方法を提供する。
生物学的試料は、組織試料、細胞培養物、または体液であり得る。体液は、任意の有用な流体であり得、限定するわけではないが、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（CSF）、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液もしくは尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、体毛、涙液、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤胞腔液、および臍帯血の1つまたは複数を含む。一部の態様において、体液は、血液、血清、または血漿を含む。
任意の有用な結合物質が、主題の方法に使用され得る。一部の態様において、1種または複数種の結合物質は、表3、表4、およびそれらの組み合わせから選択される微小胞表面抗原に対する抗体またはアプタマーを含む。1種または複数種の結合物質はまた、表26中の標的から選択される微小胞表面抗原に対する抗体またはアプタマーであり得る。例えば、1種または複数種の結合物質は、EpCam、CD9、PCSA、CD63、CD81、PSMA、B7H3、PSCA、ICAM、STEAP、KLK2、SSX2、SSX4、PBP、SPDEF、EGFR、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される微小胞表面抗原に対する抗体またはアプタマーであり得る。1種または複数種の結合物質はまた、EGFR、PBP、EpCAM、KLK2、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される微小胞表面抗原に対する抗体またはアプタマーを含み得る。
本発明は、様々な構成を意図する。例えば、「サンドイッチ」形式が使用され得る。例えば、図1A〜1Bを参照されたい。方法の一部の態様において、1種または複数種の結合物質は、生物学的試料と接触させる工程の前に基体に結合している。この構成において、1種または複数種のアプタマーは、検出物質として機能するために、検出可能な標識に結合していてもよい。他の態様において、1種または複数種の結合物質は、検出可能な標識に結合している。この構成において、1種または複数種のアプタマーは、捕捉物質として機能するために、生物学的試料と接触させる工程の前に基体に結合していてもよい。さらに、1種または複数種のアプタマーは、生物学的試料と接触させる工程の前に基体に結合していてもよく、かつ/または、1種または複数種のアプタマーは、検出可能な標識に結合している。このような場合、1種または複数種のアプタマーは、捕捉物質および検出物質のどちらか一方または両方として機能することができる。
生物学的試料中の微小胞集団の存在またはレベルを検出する方法は、疾患または障害の診断、予後判定、またはセラノーシスを提供するために使用され得る。疾患または障害は、限定するわけではないが、本明細書に開示するものを含み得る。例えば、疾患または障害は、新生物性の、増殖性の、または炎症性の、代謝性の、心血管の、または神経性の疾患または障害を含み得る。「表現型」の項を参照すること。ある態様において、疾患は癌を含む。例えば、疾患は、急性リンパ芽球性白血病；急性骨髄性白血病；副腎皮質癌；AIDS関連癌；AIDS関連リンパ腫；肛門癌；虫垂癌；星状細胞腫；非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍；基底細胞癌；膀胱癌；脳幹神経膠腫；脳腫瘍（脳幹神経膠腫、中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、星状細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、上衣腫、髄芽腫、髄上皮種、中間型松果体実質腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、および松果体芽腫を含む）；乳癌；気管支腫瘍；バーキットリンパ腫；原発不明癌；カルチノイド腫瘍；原発不明癌腫；中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍；中枢神経系胚芽腫；子宮頸癌；小児癌；脊索腫；慢性リンパ球性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖性疾患；結腸癌；結腸直腸癌；頭蓋咽頭腫；皮膚T細胞リンパ腫；内分泌膵島細胞腫瘍；子宮内膜癌；上衣芽腫；上衣腫；食道癌；鼻腔神経芽細胞腫；ユーイング肉腫；頭蓋外胚細胞腫瘍；性腺外胚細胞腫瘍；肝臓外胆管癌；胆嚢癌；胃癌；消化管カルチノイド腫瘍；消化管間質細胞腫瘍；消化管間質腫瘍（GIST）；妊娠性絨毛性腫瘍；神経膠腫；毛様細胞性白血病；頭頸部癌；心臓癌；ホジキンリンパ腫；下咽頭癌；眼内黒色腫；膵島腫瘍；カポジ肉腫；腎臓癌；ランゲルハンス細胞組織球症；喉頭癌；口唇癌；肝臓癌；肺癌；悪性線維性組織球腫；骨癌；髄芽腫；髄上皮種；黒色腫；メルケル細胞癌；メルケル細胞皮膚癌；中皮腫；原発不明転移性扁平上皮性頸部癌；口腔癌；多発性内分泌腫瘍症候群；多発性骨髄腫；多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍；菌状息肉腫；骨髄異形成症候群；骨髄増殖性腫瘍；鼻腔癌；鼻咽頭癌；神経芽細胞腫；非ホジキンリンパ腫；非黒色腫皮膚癌；非小細胞肺癌；口腔癌；口腔癌；口腔咽頭癌；骨肉腫；その他の脳および脊髄の腫瘍；卵巣癌；卵巣上皮癌；卵巣胚細胞腫瘍；卵巣低悪性度腫瘍；膵臓癌；乳頭腫症；副鼻腔癌；副甲状腺癌；骨盤癌；陰茎癌；咽頭癌；中間型松果体実質腫瘍；松果体芽腫；下垂体腫瘍；形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫；胸膜肺芽腫；原発性中枢神経系（CNS）リンパ腫；原発性肝細胞肝癌；前立腺癌；直腸癌；腎臓癌；腎細胞（腎臓）癌；腎細胞癌；気道癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；唾液腺癌；セザリー症候群；小細胞肺癌；小腸癌；軟部組織肉腫；扁平上皮癌；頸部扁平上皮癌；胃癌；テント上原始神経外胚葉性腫瘍；T細胞リンパ腫；精巣癌；咽喉癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺癌；移行上皮癌；腎盂尿管移行上皮癌；絨毛性腫瘍；尿管癌；尿道癌；子宮癌；子宮肉腫；膣癌；外陰癌；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；またはウィルムス腫瘍であり得る。癌は、前立腺癌であり得る。癌は、乳癌であり得る。
もう一つの関連の局面において、本発明は、（a）生物学的試験試料を、本明細書に提供される1種または複数種のアプタマーと接触させる工程；（b）工程（a）において形成された生物学的試験試料中、1種または複数種のアプタマーと、1種または複数種のアプタマーと結合した標的との複合体の存在またはレベルを検出する工程；および（c）工程（b）において検出された存在またはレベルを、生物学的対照試料からの参照レベルと比較し、それにより、疾患または障害を特徴決定する工程を含む、疾患または障害を特徴決定する方法を提供する。参照レベルは、健康な試料個体、たとえば疾患または障害を有しない、または有するとは思われない個体中の標的のレベルから導出され得る。参照レベルはまた、治療された、抑制された、または代替の疾患を有する個体または試料から導出されてもよい。
生物学的試験試料および生物学的対照試料は、それぞれ、組織試料、細胞培養物または生物学的流体を含み得る。いくつかの態様において、生物学的流体は体液を含む。体液は、非限定的に末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（CSF）、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液もしくは尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、毛髪、涙液、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胞胚腔液または臍帯血の一つまたは複数を含む任意の有用な流体であることができる。いくつかの態様において、体液は血液、血清または血漿を含む。生物学的流体は、微小胞を含み得る、または含むことが疑われ得る。
1種または複数種のアプタマーはポリペプチドまたはそのフラグメントに結合し得る。結合は、所望により、乱雑的であってもよいし、または選択的であってもよい。ポリペプチドまたはそのフラグメントは、たとえば微小胞または細胞フラグメントの膜中、可溶性であることもできるし、または膜結合状態であることができる。ポリペプチドまたはそのフラグメントは、表3、表4または表26におけるバイオマーカーを含む。1種または複数種のアプタマーは、生物学的試料中の微小胞表面抗原に結合することができる。
疾患または障害を特徴決定する本明細書の方法は、疾患または障害の診断、予後判定またはセラノーシスを提供する工程を含み得る。疾患または障害は、非限定的に、本明細書に開示されるものを含むことができる。たとえば、疾患または障害は、癌、前癌状態、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患もしくは障害、心臓血管疾患もしくは障害、神経学的疾患もしくは障害、感染症および／または疼痛を含み得る。本明細書の「表現型」の項を参照すること。いくつかの態様において、疾患または障害は癌を含む。癌は、急性リンパ芽球性白血病；急性骨髄性白血病；副腎皮質癌；AIDS関連癌；AIDS関連リンパ腫；肛門癌；虫垂癌；星状細胞腫；非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍；基底細胞癌；膀胱癌；脳幹神経膠腫；脳腫瘍（脳幹神経膠腫、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、星状細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、上衣腫、髄芽腫、上衣細胞腫、中間型松果体実質腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍および松果体芽腫を含む）；乳癌；気管支腫瘍；バーキットリンパ腫；原発不明癌；カルチノイド腫瘍；原発不明癌腫；中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍；中枢神経系胚芽腫；子宮頸癌；小児癌；脊索腫；慢性リンパ球性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖性疾患；結腸癌；結腸直腸癌；頭蓋咽頭腫；皮膚T細胞リンパ腫；内分泌膵島細胞腫瘍；子宮内膜癌；上衣芽腫；上衣腫；食道癌；嗅神経芽細胞腫；ユーイング肉腫；頭蓋外胚細胞腫瘍；性腺外胚細胞腫瘍；肝臓外胆管癌；胆嚢癌；胃癌；消化管カルチノイド腫瘍；消化管間質細胞腫瘍；消化管間質腫瘍（GIST）；妊娠性絨毛性腫瘍；神経膠腫；毛様細胞性白血病；頭頸部癌；心臓癌；ホジキンリンパ腫；下咽頭癌；眼内黒色腫；膵島腫瘍；カポジ肉腫；腎臓癌；ランゲルハンス細胞組織球症；喉頭癌；口唇癌；肝臓癌；肺癌；悪性線維性組織球腫；骨癌；髄芽腫；上衣細胞腫；黒色腫；メルケル細胞癌；メルケル細胞皮膚癌；中皮腫；原発不明転移性扁平上皮性頸部癌；口腔癌；多発性内分泌腫瘍症候群；多発性骨髄腫；多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍；菌状息肉腫；骨髄異形成症候群；骨髄増殖性腫瘍；鼻腔癌；鼻咽頭癌；神経芽細胞腫；非ホジキンリンパ腫；非黒色腫皮膚癌；非小細胞肺癌；口腔癌；口腔癌；口腔咽頭癌；骨肉腫；他の脳および脊髄の腫瘍；卵巣癌；卵巣上皮癌；卵巣胚細胞腫瘍；卵巣低悪性度腫瘍；膵臓癌；乳頭腫症；副鼻腔癌；副甲状腺癌；骨盤癌；陰茎癌；咽頭癌；中間型松果体実質腫瘍；松果体芽腫；下垂体腫瘍；形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫；胸膜胚芽腫；原発性中枢神経系（CNS）リンパ腫；原発性肝細胞肝癌；前立腺癌；直腸癌；腎臓癌；腎細胞（腎臓）癌；腎細胞癌；気道癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；唾液腺癌；セザリー症候群；小細胞肺癌；小腸癌；軟部組織肉腫；扁平上皮癌；頸部扁平上皮癌；胃癌；テント上原始神経外胚葉性腫瘍；T細胞リンパ腫；精巣癌；咽喉癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺癌；移行上皮癌；腎盂および尿管の移行上皮癌；絨毛性腫瘍；尿管癌；尿道癌；子宮癌；子宮肉腫；膣癌；外陰癌；ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症；またはウィルムス腫瘍を含む。癌は前立腺癌であることができる。癌は乳癌であることができる。
本発明はさらに、本明細書の方法を実施するための試薬を含むキットおよび方法を実施するための試薬の使用を提供する。試薬は、本明細書に開示されるアプタマーおよび／または本明細書に開示される他の成分を含み得る。
本発明は、関心対象のバイオマーカーを検出するための複数のオリゴヌクレオチドを含むアプタマープールの使用のための組成物および方法を提供する。そのような組成物および方法は、生物学的試料中の表現型の特徴決定を容易にし得る。一つの局面において、本発明は、生物学的試料中に存在する複数の標的に結合することができる、SEQ ID NO: 1〜230810、230811〜230899、230900〜230927または231018〜241535から選択される複数のオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供する。組成物はまた、SEQ ID NO: 1〜230810、230811〜230899、230900〜230927または231018〜241535から選択されるオリゴヌクレオチドを含み得る。ある態様において、組成物は、SEQ ID NO: 231018〜241535に列挙されたオリゴヌクレオチドの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000またはすべてを含む。もう一つの態様において、組成物は、SEQ ID NO: 1〜230810に列挙されたオリゴヌクレオチドの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000またはすべてを含む。本発明はまた、生物学的試料中に存在する複数の標的に結合することができる、表23〜24のいずれかに記載された1種または複数種のオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供する。組成物は、表23〜24のいずれかに列挙された1種または複数種のオリゴヌクレオチドを含み得る。いくつかの態様において、組成物は、表23または表24に列挙された1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個のオリゴヌクレオチドを含む。
関連の局面において、本発明は、微小胞試料を、前記微小胞試料中に存在する1種または複数種の標的に結合することができる複数のオリゴヌクレオチドと接触させる工程、試料と一緒に複合体を形成するオリゴヌクレオチドのセットを同定する工程であって、該セットが、試料の状態を特徴決定することが事前に確認されており、それにより試料の状態を特徴決定する、工程を含む、試験試料の状態を特徴決定する方法を提供する。オリゴヌクレオチドを同定する工程は、オリゴヌクレオチドのすべてまたはいくつかの配列決定を実施する工程を含み得る。同定する工程はまた、たとえばPCR方法論およびその変形（RT-PCR、qPCRなど）によってオリゴヌクレオチドのすべてまたはいくつかの増幅を実施する工程を含むことができる。同定する工程はまた、オリゴヌクレオチドのすべてまたはいくつかの、アレイへのハイブリダイゼーションを実施する工程を含むことができる。状態は疾患または障害であることができる。たとえば、状態は、癌、前癌状態、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患もしくは障害、心臓血管疾患もしくは障害、神経学的疾患もしくは障害、感染症および／または疼痛であることができる。本明細書の「表現型」の項を参照すること。
もう一つの関連の局面において、本発明は、（a）微小胞試料を複数のオリゴヌクレオチドと接触させて、微小胞試料と一緒に複合体を形成するオリゴヌクレオチドのセットを単離する工程、（b）（a）において微小胞試料と一緒に複合体を形成したオリゴヌクレオチドそれぞれの配列および／またはコピー数を決定し、それにより、試験試料と結合したオリゴヌクレオチドのセットを同定する工程を含む、試験試料と結合したオリゴヌクレオチドのセットを同定する方法を提供する。工程（b）は、ハイスループット配列決定を実施する工程を含むことができる。工程（b）はまた、アレイへのハイブリダイゼーションまたは増幅を実施する工程を含むことができる。ある態様において、試料は、癌を有することが疑われる、または癌の素因を有する対象由来である。いくつかの態様において、複数のオリゴヌクレオチドは、正常細胞から流出した微小胞よりも罹病細胞から流出した微小胞に優先的に結合することができる。罹病細胞は、癌、前癌状態、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患もしくは障害、心臓血管疾患もしくは障害、神経学的疾患もしくは障害、感染症または疼痛と関連していることができる。
さらに別の関連の局面において、本発明は、微小胞試料を、非癌試料由来の微小胞に比べて癌試料由来の微小胞と一緒に優先的に複合体を形成することが事前に確認されている複数のオリゴヌクレオチドと接触させる工程を含む、試料を癌性試料または癌の素因を有する試料として診断する方法を提供する。
いくつかの態様において、複数のオリゴヌクレオチドは、一段階または複数段階のポジティブ選択またはネガティブ選択を通して事前に選択され、ポジティブ選択は、試験試料に比べて実質的に類似した特徴を有する試料に対するオリゴヌクレオチドの選択を含み、ネガティブ選択は、試験試料に比べて実質的に異なる特徴を有する試料に対するオリゴヌクレオチドの選択を含む。
さらに別の関連の局面において、本発明は、（a）生物学的試験試料をアプタマープールと接触させる工程；（b）工程（a）においてアプタマープールのメンバーと生物学的試験試料との間で形成された複合体の存在またはレベルを検出する工程；および（c）工程（b）において検出された存在またはレベルを参照レベルと比較し、それにより、疾患または障害を特徴決定する工程を含む、疾患または障害を特徴決定する方法を提供する。参照レベルは、健康な試料個体、たとえば疾患または障害を有しない、または有するとは思われない個体中の標的のレベルから導出され得る。参照レベルはまた、治療された、抑制された、または代替の疾患を有する個体または試料からも導出され得る。生物学的試験試料は、組織試料、細胞培養物または生物学的流体を含み得る。いくつかの態様において、生物学的流体は体液を含む。体液は、非限定的に末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（CSF）、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液もしくは尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、毛髪、涙液、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胞胚腔液または臍帯血の一つまたは複数を含む任意の有用な流体であることができる。いくつかの態様において、体液は血液、血清または血漿を含む。生物学的流体は、微小胞を含み得る、または含むことが疑われ得る。そのような場合、アプタマープールは、微小胞に結合するように選択することができる。微小胞は、アプタマープールとの接触の前に単離することもできるし、または試験試料をアプタマープールと直接接触させたのち単離することもできる。
前記のように、複数のオリゴヌクレオチドを含むアプタマープールの使用のための組成物および方法は、非限定的に癌、前癌状態、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患もしくは障害、心臓血管疾患もしくは障害、神経学的疾患もしくは障害、感染症または疼痛を含む様々な疾患および障害を検出、診断、予後判定またはセラノーシス判定するために使用することができる。諸態様において、癌は、急性リンパ芽球性白血病；急性骨髄性白血病；副腎皮質癌；AIDS関連癌；AIDS関連リンパ腫；肛門癌；虫垂癌；星状細胞腫；非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍；基底細胞癌；膀胱癌；脳幹神経膠腫；脳腫瘍（脳幹神経膠腫、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、星状細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、上衣腫、髄芽腫、上衣細胞腫、中間型松果体実質腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍および松果体芽腫を含む）；乳癌；気管支腫瘍；バーキットリンパ腫；原発不明癌；カルチノイド腫瘍；原発不明癌腫；中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍；中枢神経系胚芽腫；子宮頸癌；小児癌；脊索腫；慢性リンパ球性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖性疾患；結腸癌；結腸直腸癌；頭蓋咽頭腫；皮膚T細胞リンパ腫；内分泌膵島細胞腫瘍；子宮内膜癌；上衣芽腫；上衣腫；食道癌；嗅神経芽細胞腫；ユーイング肉腫；頭蓋外胚細胞腫瘍；性腺外胚細胞腫瘍；肝臓外胆管癌；胆嚢癌；胃癌；消化管カルチノイド腫瘍；消化管間質細胞腫瘍；消化管間質腫瘍（GIST）；妊娠性絨毛性腫瘍；神経膠腫；毛様細胞性白血病；頭頸部癌；心臓癌；ホジキンリンパ腫；下咽頭癌；眼内黒色腫；膵島腫瘍；カポジ肉腫；腎臓癌；ランゲルハンス細胞組織球症；喉頭癌；口唇癌；肝臓癌；肺癌；悪性線維性組織球腫；骨癌；髄芽腫；上衣細胞腫；黒色腫；メルケル細胞癌；メルケル細胞皮膚癌；中皮腫；原発不明転移性扁平上皮性頸部癌；口腔癌；多発性内分泌腫瘍症候群；多発性骨髄腫；多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍；菌状息肉腫；骨髄異形成症候群；骨髄増殖性腫瘍；鼻腔癌；鼻咽頭癌；神経芽細胞腫；非ホジキンリンパ腫；非黒色腫皮膚癌；非小細胞肺癌；口腔癌；口腔癌；口腔咽頭癌；骨肉腫；他の脳および脊髄の腫瘍；卵巣癌；卵巣上皮癌；卵巣胚細胞腫瘍；卵巣低悪性度腫瘍；膵臓癌；乳頭腫症；副鼻腔癌；副甲状腺癌；骨盤癌；陰茎癌；咽頭癌；中間型松果体実質腫瘍；松果体芽腫；下垂体腫瘍；形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫；胸膜胚芽腫；原発性中枢神経系（CNS）リンパ腫；原発性肝細胞肝癌；前立腺癌；直腸癌；腎臓癌；腎細胞（腎臓）癌；腎細胞癌；気道癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；唾液腺癌；セザリー症候群；小細胞肺癌；小腸癌；軟部組織肉腫；扁平上皮癌；頸部扁平上皮癌；胃癌；テント上原始神経外胚葉性腫瘍；T細胞リンパ腫；精巣癌；咽喉癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺癌；移行上皮癌；腎盂および尿管の移行上皮癌；絨毛性腫瘍；尿管癌；尿道癌；子宮癌；子宮肉腫；膣癌；外陰癌；ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症；またはウィルムス腫瘍を含む。前癌状態はバレット食道であり得る。いくつかの態様において、自己免疫疾患は、炎症性腸疾患（IBD）、クローン病（CD）、潰瘍性大腸炎（UC）、骨盤炎症、血管炎、乾癬、糖尿病、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、重症性筋無力症、I型糖尿病、関節リウマチ、乾癬、全身性エリテマトーデス（SLE）、橋本甲状腺炎、グレーブス病、強直性脊椎炎、シェーグレン病、CREST症候群、強皮症、リウマチ性疾患、臓器拒絶反応、原発性硬化性胆管炎または敗血症を含む。他の態様において、心臓血管疾患は、アテローム硬化症、うっ血性心不全、脆弱性プラーク、脳卒中、虚血、高血圧症、狭窄症、血管閉塞または血栓性イベントを含む。神経学的疾患は、非限定的に、多発性硬化症（MS）、パーキンソン病（PD）、アルツハイマー病（AD）、統合失調症、双極性障害、うつ病、自閉症、プリオン病、ピック病、認知症、ハンチントン病（HD）、ダウン症候群、脳血管疾患、ラズムッセン脳炎、ウイルス性髄膜炎、神経精神全身性エリテマトーゼス（NPSLE）、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、伝染性海綿状脳症、虚血性再かん流損傷（たとえば脳卒中）、脳外傷、微生物感染または慢性疲労症候群を含み得る。疼痛は、線維筋痛、慢性神経障害性疼痛または末梢神経障害性疼痛を含み得る。諸態様において、感染症は、細菌感染、ウイルス感染、酵母感染、ウィップル病、プリオン病、肝硬変、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、HIV、HCV、肝炎、梅毒、髄膜炎、マラリア、結核、インフルエンザを含む。
複数のオリゴヌクレオチドを含むアプタマープールの使用方法において、複数のオリゴヌクレオチドは、本明細書に提供される組成物であることができる。
もう一つの関連の局面において、本発明は、（a）微小胞試料を用いて複数のオリゴヌクレオチドの少なくとも1回の（i）ネガティブ選択または（ii）1回のポジティブ選択を実施する工程；（b）オリゴヌクレオチドのセットを取得して、複数のオリゴヌクレオチドのネガティブ結合物質サブセットまたはポジティブ結合物質サブセットを提供する工程であって、複数のオリゴヌクレオチドのネガティブ結合物質サブセットが微小胞試料に結合せず、複数のオリゴヌクレオチドのポジティブ結合物質サブセットが微小胞試料に結合する、工程；（c）ネガティブ結合物質サブセットまたはポジティブ結合物質サブセットを試験試料と接触させる工程；（d）試験試料に結合したオリゴヌクレオチドを溶離させて複数の溶離物オリゴヌクレオチドを提供する工程；および（e）複数の溶離物オリゴヌクレオチドのハイスループット配列決定を実施して、複数の溶離物オリゴヌクレオチドのメンバーの配列および／またはコピー数を同定する工程を含む、ハイスループット配列決定を実施する方法を提供する。
もう一つの関連の局面において、本発明は、（a）試料としての複数のオリゴヌクレオチドを富化して、標的試料と一緒に複合体を形成することが事前に確認されているオリゴヌクレオチドのセットを提供する工程；（b）（a）における複数のオリゴヌクレオチドを試験試料と接触させて、オリゴヌクレオチドと試験試料との複合体の形成を可能にする工程；（c）（b）において複合体を形成したオリゴヌクレオチドを回収して、回収されたオリゴヌクレオチドのサブセットを提供する工程；および（d）回収されたオリゴヌクレオチドのサブセットをハイスループット配列決定、増幅またはハイブリダイゼーションによってプロファイリングし、それにより、試験試料に特異的なオリゴヌクレオチドを同定する工程を含む、試験試料に特異的なオリゴヌクレオチドを同定する方法を提供する。試験試料は複数の微小胞を含むことができる。オリゴヌクレオチドは、RNA、DNAまたは両方であることができる。方法はさらに、インフォマティクス解析を実施して、少なくとも90％の配列同一性を含むオリゴヌクレオチドのサブセットを同定する工程を含み得る。
本発明はさらに、アプタマープールの使用の方法を実施するための試薬を含むキットおよびまたそのような方法を実施するための試薬の使用を提供する。試薬は、本明細書に開示される関連のアプタマーもしくは組成物および／または本明細書に開示される他の成分を含み得る。
本発明はまた、アプタマーのプールを同定する方法を提供する。一つの局面において、生物学的試料のための標的特異的アプタマープロフィールを同定するそのような方法は、生物学的試験試料をアプタマー分子のプールと接触させる工程、プールを対照生物学的試料または参照生物学的試料と接触させる工程、前記試験試料中の成分に結合するが、対照試料にも参照試料にも結合しない1種または複数種のアプタマーを同定し、それにより、前記生物学的試験試料のためのアプタマープロフィールを同定する工程を含む。
もう一つの関連の局面において、本発明は、（a）生物学的対照試料をオリゴヌクレオチドのプールと接触させる工程；（b）生物学的対照試料に結合しない、オリゴヌクレオチドのプールの第一のサブセットを単離する工程；（c）生物学的試験試料をオリゴヌクレオチドのプールの第一のサブセットと接触させる工程；および（d）生物学的試験試料に結合するオリゴヌクレオチドのプールの第二のサブセットを単離し、それにより、アプタマーのプールを選択する工程を含む、アプタマーのプールを選択する方法を提供する。オリゴヌクレオチドの出発プールは、多数の配列、たとえば少なくとも107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017個または少なくとも1018個のオリゴヌクレオチドを含み得る。工程（a）〜（d）は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19回または少なくとも20回繰り返すことができ、各反復において、工程（d）において選択されたアプタマーのプールが工程（a）におけるオリゴヌクレオチドのプールとして使用される。
いくつかの態様において、生物学的試験試料および生物学的対照試料は微小胞を含む。生物学的試験試料および場合によっては生物学的対照試料は、本明細書に開示される任意の有用な生物学的試料であることができる。たとえば、試料は体液を含み得る。体液は、非限定的に、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（CSF）、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液、尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、毛髪、涙液、嚢胞液、胸膜液、腹膜液、悪性流体、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液または他の洗浄液を含み得る。生物学的試験試料および場合によっては生物学的対照試料はまた、組織試料または細胞培養物を含み得る。生物学的試験試料は疾患試料であることができ、生物学的対照試料は非疾患試料であることができる。このような構成が、疾患試料を優先的に認識する、または非疾患試料を優先的に認識するアプタマーのプールの同定を可能にする。
さらに別の関連の局面において、本発明は、（a）アプタマーのプールを第一の試料由来の微小胞の集団と接触させる工程；（b）第一の試料由来の微小胞の集団に対して親和性を示すアプタマーのサブプールを富化する工程；（c）サブプールを第二の試料由来の微小胞の第二の集団と接触させる工程；および（d）第二の試料由来の微小胞の第二の集団に対して親和性を示すアプタマーの第二のサブプールを枯渇させ、それにより、第一の試料由来の微小胞の集団に対して優先的な親和性を有するアプタマーのプールを選択する工程を含む、アプタマーの群を選択する方法を提供する。
第一の試料および／または第二の試料は、本明細書に開示される任意の有用な生物学的試料であることができる。たとえば、試料は体液を含み得る。体液は、非限定的に、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（CSF）、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液、尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、毛髪、涙液、嚢胞液、胸膜液、腹膜液、悪性流体、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液または他の洗浄液を含み得る。第一の試料および／または第二の試料はそれぞれ、プールされた試料、すなわち、様々な供給源、たとえば様々な個体からいっしょにプールされた試料を含み得る。第一の試料は疾患試料であってもよく、一方、第二の試料は対照試料を含み、場合によっては、対照試料は非疾患試料である。あるいはまた、第一の試料は対照試料であってもよく、一方、第二の試料は疾患試料を含み、場合によっては対照試料は非疾患試料である。
工程（a）〜（d）は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20回繰り返してもよく、各反復において、工程（d）において選択されたアプタマーのプールが工程（a）におけるアプタマーのプールとして使用される。諸態様において、工程（a）〜（d）を繰り返す前に、第一の試料および／または第二の試料を異なる試料と交換する。たとえば、第一の試料および／または第二の試料は、異なる個体由来であることもできるし、または異なる試料プールを含むこともできる。
方法はさらに、選択されたアプタマーの群のメンバーを同定する工程を含み得、場合によっては、同定工程は、ハイスループット配列決定、増幅またはハイブリダイゼーションによって実施される。
ある局面において、本発明は、（a）アプタマー候補のプールを、標的分子を含む試料と接触させる工程；（b）非結合アプタマー候補を除去する工程；（c）試料を標的分子に対するリガンドと接触させる工程；および（d）リガンドとの競合によって標的分子から分離したアプタマー候補を単離し、それにより、リガンドと同じ標的に結合するアプタマーの群を選択する工程を含む、アプタマーの群を選択する方法を提供する。標的分子は、非限定的に微小胞表面抗原を含むタンパク質であることができる。標的分子は基体につながれる。いくつかの態様において、標的分子は微小胞の表面抗原であり、微小胞は基体につながれる。リガンドは小分子またはタンパク質であることができ、たとえばリガンドは抗体であることができる。工程（a）〜（d）は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20回繰り返すことができ、各反復において、工程（d）において単離されたアプタマー候補が工程（a）に投入されるアプタマーのプールとして使用される。方法はさらに、選択されたアプタマーの群のメンバーを同定する工程を含み得、場合によっては、同定工程は、ハイスループット配列決定、増幅またはハイブリダイゼーションによって実施される。第一の試料は疾患試料であってもよく、一方、第二の試料は対照試料を含み、場合によっては、対照試料は非疾患試料である。あるいはまた、第一の試料は対照試料であってもよく、一方、第二の試料は疾患試料を含み、場合によっては、対照試料は非疾患試料である。
関連の局面において、本発明は、（a）第一の生物学的試料から標的を分離して、標的枯渇生物学的試料を形成する工程；（b）分離した標的を基体につなぐ工程；（c）つながれた標的を干渉生物学的試料と混合する工程；（d）（c）からの混合物を出発アプタマーライブラリーと接触させる工程；および（e）つながれた標的に優先的に結合するアプタマーライブラリーのメンバーを回収し、それにより、標的に結合する1種または複数種のアプタマーを選択する工程を含む、関心対象の標的に結合する1種または複数種のアプタマーを選択する方法を提供する。基体はビーズまたは平面であることができる。干渉生物学的試料は、（a）からの標的枯渇生物学的試料を含み得る。標的は微小胞であることができる。いくつかの態様において、標的は関心対象の微小胞を含み、干渉生物学的試料は非標的微小胞を含む。工程（c）の前に、非標的微小胞を、標的微小胞とは異なる基体につなぐことができる。いくつかの態様においては、基体が磁性ビーズを含み、異なる基体が非磁性ビーズを含む、または、基体が非磁性ビーズを含み、異なる基体が磁性ビーズを含む。
第一の生物学的試料および／または干渉生物学的試料は、本明細書に開示される任意の有用な生物学的試料であることができる。たとえば、試料は体液を含み得る。体液は、非限定的に、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（CSF）、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液、尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、毛髪、涙液、嚢胞液、胸膜液、腹膜液、悪性流体、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液または他の洗浄液を含み得る。ある態様において、第一の生物学的試料は疾患試料を含んでもよく、干渉生物学的試料は非疾患試料を含む。あるいはまた、第一の生物学的試料は非疾患試料を含んでもよく、干渉生物学的試料は疾患試料を含む。
本発明は、アプタマーのような結合物質のライブラリーをスクリーニングして、関心対象の標的への結合物質を同定する方法を提供する。ある局面において、本発明は、（a）参照微小胞集団を、1種または複数種の微小胞表面マーカーに結合することができる複数のリガンドと接触させる工程；（b）複数の参照リガンドを単離する工程であって、複数の参照リガンドが、参照微小胞集団に対して親和性を有しない複数のリガンドのサブセットを含む、工程；（c）1種または複数種の試験微小胞を複数の参照リガンドと接触させる工程；および（d）複数の参照リガンドから、1種または複数種の試験微小胞上の表面マーカーと一緒に複合体を形成するリガンドのサブセットを同定し、それにより、複数の標的リガンドを同定する工程を含む、複数の標的リガンドを同定する方法を提供する。方法はさらに、標的微小胞の表面マーカーを同定する工程を含み得る。複数のリガンドはアプタマーおよび／または抗体であることができる。
関連の局面において、本発明は、（a）候補アプタマーのプールを1種または複数種のアッセイ成分と接触させる工程であって、アッセイ成分が関心対象の標的を含まない、工程；（b）（a）において1種または複数種のアッセイ成分に結合しない、候補アプタマーのプールのメンバーを回収する工程；（c）（b）において回収された候補アプタマーのプールのメンバーを、1種または複数種の交絡する（confounding）標的の存在下、関心対象の標的と接触させる工程；および（d）工程（c）において関心対象の標的に結合する候補アプタマーを回収し、それにより、関心対象の標的に特異的なアプタマーを同定する工程を含む、関心対象の標的に特異的なアプタマーを同定する方法を提供する。方法は、非標的分子に結合する候補アプタマーを除去することができる。工程（c）を実施する前に、工程（a）〜（b）を少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19回または少なくとも20回繰り返すことができる。加えて、関心対象の標的に特異的なアプタマーを同定する前に、工程（c）〜（d）を少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19回または少なくとも20回繰り返すことができる。候補アプタマーの出発プールは、少なくとも106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017または少なくとも1018の核酸配列を含むことができる。1種または複数種のアッセイ成分は、非限定的に、基体、ビーズ、平面アレイ、カラム、チューブ、ウェルまたはフィルタの一つまたは複数を含むことができる。
ある態様において、関心対象の標的および1種または複数種の交絡する標的はタンパク質を含む。関心対象の標的および1種または複数種の交絡する標的はまた、微小胞を含んでもよい。いくつかの態様において、関心対象の標的および1種または複数種の交絡する標的は1種または複数種の微小胞表面抗原を含む。微小胞表面抗原は、表3、4および／または26から選択することができる。非限定的な例として、関心対象の標的は、SSX4、SSX2、PBP、KLK2、SPDEFからなる群より選択されるタンパク質であることができ、一方、1種または複数種の交絡する標的は、その群の他のメンバーを含む。
1種または複数種の微小胞表面抗原は、非限定的に本明細書に開示されるものを含む疾患または障害のバイオマーカーであることができる。いくつかの態様において、疾患は、癌、前癌状態、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患もしくは障害、心臓血管疾患もしくは障害、神経学的疾患もしくは障害、感染症または疼痛を含む。癌は、急性リンパ芽球性白血病；急性骨髄性白血病；副腎皮質癌；AIDS関連癌；AIDS関連リンパ腫；肛門癌；虫垂癌；星状細胞腫；非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍；基底細胞癌；膀胱癌；脳幹神経膠腫；脳腫瘍（脳幹神経膠腫、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、星状細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、上衣腫、髄芽腫、上衣細胞腫、中間型松果体実質腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍および松果体芽腫を含む）；乳癌；気管支腫瘍；バーキットリンパ腫；原発不明癌；カルチノイド腫瘍；原発不明癌腫；中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍；中枢神経系胚芽腫；子宮頸癌；小児癌；脊索腫；慢性リンパ球性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖性疾患；結腸癌；結腸直腸癌；頭蓋咽頭腫；皮膚T細胞リンパ腫；内分泌膵島細胞腫瘍；子宮内膜癌；上衣芽腫；上衣腫；食道癌；嗅神経芽細胞腫；ユーイング肉腫；頭蓋外胚細胞腫瘍；性腺外胚細胞腫瘍；肝臓外胆管癌；胆嚢癌；胃癌；消化管カルチノイド腫瘍；消化管間質細胞腫瘍；消化管間質腫瘍（GIST）；妊娠性絨毛性腫瘍；神経膠腫；毛様細胞性白血病；頭頸部癌；心臓癌；ホジキンリンパ腫；下咽頭癌；眼内黒色腫；膵島腫瘍；カポジ肉腫；腎臓癌；ランゲルハンス細胞組織球症；喉頭癌；口唇癌；肝臓癌；肺癌；悪性線維性組織球腫；骨癌；髄芽腫；上衣細胞腫；黒色腫；メルケル細胞癌；メルケル細胞皮膚癌；中皮腫；原発不明転移性扁平上皮性頸部癌；口腔癌；多発性内分泌腫瘍症候群；多発性骨髄腫；多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍；菌状息肉腫；骨髄異形成症候群；骨髄増殖性腫瘍；鼻腔癌；鼻咽頭癌；神経芽細胞腫；非ホジキンリンパ腫；非黒色腫皮膚癌；非小細胞肺癌；口腔癌；口腔癌；口腔咽頭癌；骨肉腫；他の脳および脊髄の腫瘍；卵巣癌；卵巣上皮癌；卵巣胚細胞腫瘍；卵巣低悪性度腫瘍；膵臓癌；乳頭腫症；副鼻腔癌；副甲状腺癌；骨盤癌；陰茎癌；咽頭癌；中間型松果体実質腫瘍；松果体芽腫；下垂体腫瘍；形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫；胸膜胚芽腫；原発性中枢神経系（CNS）リンパ腫；原発性肝細胞肝癌；前立腺癌；直腸癌；腎臓癌；腎細胞（腎臓）癌；腎細胞癌；気道癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；唾液腺癌；セザリー症候群；小細胞肺癌；小腸癌；軟部組織肉腫；扁平上皮癌；頸部扁平上皮癌；胃癌；テント上原始神経外胚葉性腫瘍；T細胞リンパ腫；精巣癌；咽喉癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺癌；移行上皮癌；腎盂および尿管の移行上皮癌；絨毛性腫瘍；尿管癌；尿道癌；子宮癌；子宮肉腫；膣癌；外陰癌；ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症；またはウィルムス腫瘍であることができる。前癌状態はバレット食道であり得る。いくつかの態様において、自己免疫疾患は、炎症性腸疾患（IBD）、クローン病（CD）、潰瘍性大腸炎（UC）、骨盤炎症、血管炎、乾癬、糖尿病、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、重症性筋無力症、I型糖尿病、関節リウマチ、乾癬、全身性エリテマトーデス（SLE）、橋本甲状腺炎、グレーブス病、強直性脊椎炎、シェーグレン病、CREST症候群、強皮症、リウマチ性疾患、臓器拒絶反応、原発性硬化性胆管炎または敗血症を含む。他の態様において、心臓血管疾患は、アテローム硬化症、うっ血性心不全、脆弱性プラーク、脳卒中、虚血、高血圧症、狭窄症、血管閉塞または血栓性イベントを含む。神経学的疾患は、非限定的に、多発性硬化症（MS）、パーキンソン病（PD）、アルツハイマー病（AD）、統合失調症、双極性障害、うつ病、自閉症、プリオン病、ピック病、認知症、ハンチントン病（HD）、ダウン症候群、脳血管疾患、ラズムッセン脳炎、ウイルス性髄膜炎、神経精神全身性エリテマトーゼス（NPSLE）、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、伝染性海綿状脳症、虚血性再かん流損傷（たとえば脳卒中）、脳外傷、微生物感染または慢性疲労症候群を含み得る。疼痛は、線維筋痛、慢性神経障害性疼痛または末梢神経障害性疼痛を含み得る。諸態様において、感染症は、細菌感染、ウイルス感染、酵母感染、ウィップル病、プリオン病、肝硬変、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、HIV、HCV、肝炎、梅毒、髄膜炎、マラリア、結核、インフルエンザを含む。
本発明は、複数の細胞外微小胞を、ランダムに生成された結合物質のライブラリーと接触させる工程、および細胞外微小胞の1種または複数種の成分に対して親和性を有する結合物質のライブラリーのサブセットを同定する工程を含む、結合物質を同定する方法を提供する。結合物質はアプタマーおよび／または抗体であることができる。
本発明の方法によって同定されたオリゴヌクレオチドアプタマーを含むリガンドは、アッセイにおいて、試料の表現型を特徴決定して、たとえば疾患または障害の診断、予後判定および／またはセラノーシスを提供するために使用することができる。そのような表現型を特徴決定する方法は、生物学的試験試料を、関心対象の標的に結合する1種または複数種のリガンドまたはアプタマーと接触させる工程を含み得る。表現型は、本明細書に開示される疾患または障害を検出する工程を含み得る。
本発明はさらに、1種または複数種の関心対象の標的に対してリガンドおよびアプタマーライブラリーをスクリーニングする方法を実施するための試薬を含むキットを提供する。本発明はまた、1種または複数種の関心対象の標的に対してリガンドおよびアプタマーライブラリーをスクリーニングする方法を実施するための試薬の使用を提供する。試薬は、本明細書に開示されるアプタマーライブラリーもしくは組成物および／または本明細書に開示される他の成分を含み得る。
1種または複数種の関心対象の標的に対してリガンドおよびアプタマーライブラリーをスクリーニングする方法はさらに、選択されたリガンド／アプタマーの1種または複数種の標的を同定する工程を含むことができる。そのような方法は、本明細書に開示されている、および／または当技術分野において公知である。たとえば図14を参照すること。そのような局面において、本発明は、（a）結合物質を標的と接触させて標的を結合物質と結合させる工程であって、標的が微小胞の表面抗原を含む、工程；（b）標的と結合物質との結合を分断しない条件下で、微小胞を分断する工程；（c）標的と結合物質との複合体を単離する工程；および（d）結合物質と結合した標的を同定する工程を含む、結合物質の標的を同定する方法を提供する。結合物質は、上記または本明細書の他のところに記されたスクリーニング法によって同定されるリガンドまたはアプタマーであり得る。たとえば図13A〜13Bを参照すること。結合物質の標的は、タンパク質、核酸、脂質、糖質または微小胞を含む任意の適切なバイオマーカーであることができる。
いくつかの態様においては、工程（b）の前に、標的を結合物質に架橋させる。架橋は、光架橋、イミドエステル架橋剤、ジメチルスベリミデート、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル架橋剤、ビススルホスクシンイミジルスベレート（BS3）、アルデヒド、アクロレイン、クロトンアルデヒド、ホルムアルデヒド、カルボジイミド架橋剤、N,N'−ジシクロヘキシルカルボジイミド（DDC）、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）、1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩（EDCまたはEDAC）、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレート（SMCC）およびスルホスクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート（スルホ-SMCC）、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジル-2-(6-[ビオチンアミド]-2-(p-アジドベンズアミド)ヘキサノアミド)エチル-1,3'-ジチオプロピオネート(スルホ-SBED)、2-[N2-(4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロベンゾイル)-N6-(6-ビオチンアミドカプロイル)-L-リジニル]エチルメタンチオスルホネート（Mts-Atf-ビオチン）、2-{N2-[N6-(4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロベンゾイル-6-アミノカプロイル)-N6-(6-ビオチンアミドカプロイル)-L-リジニルアミド]}エチルメタンチオスルホネート（Mts-Atf-LC-ビオチン）、光反応性アミノ酸、L-フォトロイシン、L-フォトメチオニン、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）架橋剤、NHS-アジド試薬、NHS−アジド、NHS-PEG4-アジド、NHS-PEG12-アジド、NHS-ホスフィン試薬、NHS-ホスフィン、スルホ-NHS-ホスフィンまたはそれらの任意の組み合わせもしくは変形を含み得る。工程（b）における微小胞の分断は、洗浄剤、界面活性剤、溶媒、酵素、機械的剪断、ビーズミリング、ホモジネーション、マイクロ流体化、音波処理、フレンチプレス、衝突、コロイドミル、減圧、浸透圧性ショック、加熱分解、凍結融解および乾燥の一つまたは複数の使用を含むことができる。酵素は、リゾチーム、リソスタフィン、ザイモラーゼ、セルラーゼ、ムタノリシン、グリカナーゼ、プロテアーゼおよびマンナーゼの一つまたは複数であることができる。有用な洗浄剤は、オクチルチオグルコシド（OTG）、オクチルβ−グルコシド（OG）、非イオン界面活性剤、Triton X、Tween 20、脂肪アルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、セトステアリルアルコール、オレイルアルコール、ポリオキシエチレングリコールアルキルエーテル（Brij）、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ポリオキシプロピレングリコールモノアルキルエーテル、グルコシドアルキルエーテル、デシルグルコシド、ラウリルグルコシド、オクチルグルコシド、ポリオキシエチレングリコールオクチルフェノールエーテル、ポリオキシエチレングリコールアルキルフェノールエーテル、ノノキシノール−9、グリセロールアルキルエステル、グリセリルラウレート、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル、ポリソルベート、ソルビタンアルキルエステル、コカミドMEA、コカミドDEA、ドデシルジメチルアミンオキシド、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのブロックコポリマー、ポロキサマー、ポリエトキシル化獣脂アミン（POEA）、両性イオン洗浄剤、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート（CHAPS）、直鎖アルキルベンゼンスルホネート（LAS）、アルキルフェノールエトキシレート（APE）、コカミドプロピルヒドロキシスルタイン、ベタイン、コカミドプロピルベタイン、レシチン、イオン洗浄剤、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、臭化セトリモニウム（CTAB）、塩化セチルトリメチルアンモニウム（CTAC）、オクテニジン二塩酸塩、塩化セチルピリジニウム（CPC）、塩化ベンザルコニウム（BAC）、塩化ベンゼトニウム（BZT）、5−ブロモ−5−ニトロ−1,3−ジオキサン、塩化ジメチルジオクタデシルジメチルアンモニウム、臭化ジオクタデシルジメチルアンモニウム（DODAB）、デオキシコール酸ナトリウム、ノニルフェノキシポリエトキシエタノール（TergitolタイプNP-40、NP-40）、ラウリル硫酸アンモニウム、ラウレス硫酸ナトリウム（ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（SLES））、ミレス硫酸ナトリウム、アルキルカルボキシレート、ステアリン酸ナトリウム、ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、カルボキシレート系フッ素系界面活性剤、ペルフルオロノナノエート、ペルフルオロオクタノエート（PFOAまたはPFO）およびバイオサーファクタントの一つまたは複数を含む。
ある態様において、結合物質は基体につながれる。たとえば図14を参照すること。基体はミクロスフェアまたは平面基体であることができる。結合物質は標識されることができる。いくつかの態様において、標的と結合物質との複合体を単離する工程は、標識によって結合物質を捕捉する工程を含む。標識はビオチン標識であることができる。
標的がタンパク質を含む態様において、標的を同定する工程は、質量分析法（MS）、ペプチドマスフィンガープリンティング法（PMF；タンパク質フィンガープリンティング法）、配列決定法、N末端アミノ酸分析法、C末端アミノ酸分析法、エドマン分解法、クロマトグラフィー法、電気泳動法、二次元ゲル電気泳動法（2Dゲル）、抗体アレイおよびイムノアッセイ法の使用を含み得る。
本発明はさらに、標的同定法を実施するための試薬を含むキットを提供する。本発明はまた、標的同定法を実施するための試薬の使用を提供する。試薬は、様々な基体、リンカー、洗浄剤および／または本明細書に開示される他の成分を含み得る。
本発明は、アプタマーライブラリースクリーニングおよびアプタマーベースのアッセイを容易にするための組成物および方法を提供する。これらは、非限定的に、陰性対照およびブロッキングアプタマーを含む。そのような局面において、本発明は、SEQ ID NO: 230938〜231008のいずれかからなる群より選択される配列に対して少なくとも50、60、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100％相同である配列を含む核酸を提供する。本発明はまた、SEQ ID NO: 230938〜231008のいずれかからなる群より選択される配列を含む核酸を提供する。本発明はさらに、SEQ ID NO: 230938〜231008のいずれかからなる群より選択される配列に対して少なくとも50、60、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100％相同である配列を含む単離された核酸を提供する。本発明は、SEQ ID NO: 230938〜231008のいずれかからなる群より選択される配列を含む単離された核酸を提供する。核酸はさらに、少なくとも一つの化学的修飾を含むように改変されることができる。修飾は、非限定的に、糖位置の化学的置換；リン酸位置の化学的置換；および核酸の塩基位置の化学的置換を含み得る。修飾は、修飾されたヌクレオチドの組み込み、3'キャッピング、2'-修飾ピリミジン、ビオチン化、アミンリンカーへのコンジュゲート、高分子量非免疫原性化合物へのコンジュゲート、親油性化合物へのコンジュゲートからなる群より選択することができる。諸態様において、非免疫原性高分子量化合物はポリアルキレングリコール、たとえばポリエチレングリコールである。
本発明は、上記核酸を含む組成物、およびまた上記核酸または組成物を含むキットを提供する。本発明はさらに、基体に結合した非標的結合核酸を含む陰性対照組成物を提供する。非標的結合核酸は基体に共有結合していてもよい。あるいはまた、非標的結合核酸は非共有結合的に基体に結合していてもよい。非標的結合核酸は上記核酸（たとえば、SEQ ID NO: 230938〜231008のいずれかに関するもの）であることができる。非標的結合核酸は、SEQ ID NO: 1〜241535のいずれかのスクランブル配列またはその機能性フラグメントを含み得る。スクランブル配列は、全体的または部分的にランダムに再編成されている配列を含む。
関連の局面において、本発明は、生物学的実体を含有することが疑われる生物学的試料中の該生物学的実体の存在またはレベルを検出する方法であって、（a）上記のような基体および陰性対照組成物を含む組成物を提供する工程であって、基体が、生物学的実体への1種または複数種の結合物質を含む、工程；（b）生物学的試験試料を、工程（a）において提供された組成物と接触させる工程；（c）工程（b）において1種または複数種の結合物質によって認識された生物学的実体の量に対応する標的シグナルを検出する工程；および（d）工程（c）において検出された標的シグナルを、陰性対照組成物によって生成されたシグナルの量に対応する対照シグナルに正規化し、それにより、生物学的試料中の生物学的実体の存在またはレベルを検出する工程を含む、方法を提供する。標的シグナルを正規化する工程は、標的シグナルから対照シグナルを減じる工程を含み得る。
ある態様において、1種または複数種の結合物質は抗体またはアプタマーを含む。生物学的実体はタンパク質であることができる。生物学的実体はまた、微小胞であることもできる。いくつかの態様において、1種または複数種の結合物質は、非限定的に表3〜4または26のいずれかから選択される微小胞表面抗原を含む微小胞表面抗原に特異的である。生物学的実体、たとえばタンパク質、微小胞または微小胞表面抗原を、疾患または障害のバイオマーカーとして選択することができる。そのような場合、方法は、本明細書でさらに説明するように、疾患または障害の診断、予後判定またはセラノーシスを提供し得る。
本発明はさらに、方法を実施するための試薬を含むキットを提供する。本発明はまた、方法を実施するための試薬の使用を提供する。試薬は陰性対照組成物を含み得る。
もう一つの関連の局面において、本発明は、非標的結合核酸を含むブロッキング組成物を提供する。非標的結合核酸は、上記に開示された核酸、たとえばSEQ ID NO: 230938〜231008のいずれかに関するものを含み得る。ブロッキング組成物はさらに、ウシ血清アルブミン（BSA）、カゼイン、pepticase、非イオン界面活性剤、Tween（登録商標）20、Triton（登録商標）X-100、非反応性抗体またはそのフラグメント、FSG（フィッシュスキンゼラチン）、高純度ゼラチン、ゼラチンヒドロラーゼ、ポリエチレングリコール（PEG）、非反応性血清および非反応性タンパク質からなる群より選択される1種または複数種の成分を含むことができる。
さらに別の関連の局面において、本発明は、生物学的実体を含有することが疑われる生物学的試料中の該生物学的実体の存在またはレベルを検出する方法であって、（a）基体を上記ブロッキング組成物と接触させる工程であって、基体が、生物学的実体への1種または複数種の結合物質を含む、工程；（b）該生物学的試料を、工程（a）において提供されたブロックされた基体と接触させる工程；および（c）工程（b）において生物学的実体が1種または複数種の結合物質によって認識されるかどうかを検出し、それにより、生物学的試料中の生物学的実体の存在またはレベルを検出する工程を含む、方法を提供する。
ある態様において、1種または複数種の結合物質は抗体またはアプタマーを含む。生物学的実体はタンパク質であることができる。生物学的実体はまた、微小胞であることもできる。いくつかの態様において、1種または複数種の結合物質は、非限定的に表3〜4または26のいずれかから選択される微小胞表面抗原を含む微小胞表面抗原に特異的である。生物学的実体、たとえばタンパク質、微小胞または微小胞表面抗原は、疾患または障害のバイオマーカーとして選択することができる。そのような場合、方法は、本明細書でさらに説明するように、疾患または障害の診断、予後判定またはセラノーシスを提供し得る。
本発明はさらに、方法を実施するための試薬を含むキットを提供する。本発明はまた、方法を実施するための試薬の使用を提供する。試薬は陰性対照組成物を含み得る。
ある局面において、本発明は、官能基に特異的に結合するアプタマーを提供する。官能基結合アプタマーは、上記に開示された核酸、たとえばSEQ ID NO: 230938〜231008のいずれかに関するものを含み得る。いくつかの態様において、官能基結合アプタマーは、様々な官能基をブロックすることによってブロッキング物質として働き、したがって、アッセイの性能を高めるために使用され得る。
官能基は、炭化水素、ハロゲン、酸素含有基（すなわちC-O結合）、窒素含有基、硫黄含有基、リン含有基またはホウ素含有基からなる群より選択することができる。いくつかの態様において、炭化水素は、アルカン、アルケン、アルキン、ベンゼン誘導体、トルエン誘導体、分岐鎖状または環式アルカン、カルボカチオンおよびカルボアニオンからなる群より選択される。他の態様において、ハロゲンは、ハロアルカン、フルオロアルカン、クロロアルカン、ブロモアルカンおよびヨードアルカンからなる群より選択される。さらに他の態様において、酸素含有基は、アルコール、ケトン、アルデヒド、ハロゲン化アシル、カーボネート、カルボキシレート、カルボン酸、エステル、ヒドロペルオキシド、エーテル、ヘミアセタール、ヘミケタール、アセタール、ケタール、オルトエステルおよびオルトカーボネートからなる群より選択される。窒素含有基は、アミド、アミン、イミン、イミド、アジド、アゾ化合物、シアネート、ニトレート、ニトリル、ニトライト、ニトロ化合物、ニトロソ化合物およびピリジン誘導体からなる群より選択することができる。硫黄含有基は、チオール、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、硫酸、スルホン酸、チオシアネート、イソシアネート、チオンおよびチアールからなる群より選択することができる。ある態様において、リン含有基は、ホスフィン、ホスファン、ホスホン酸、ホスフェートおよびホスホジエステルからなる群より選択される。ホウ素含有基は、ボロン酸、ボロン酸エステル、ボリン酸およびボリン酸エステルからなる群より選択され得る。
官能基は、アセタール、アシル基、ハロゲン化アシル、アルケニル基、アルコキシド、アルコキシ基、アルキニル基、アミド、アミンオキシド、アミン、カルボジイミド、カルボキシミデート、カルボン酸、シアナミド、シアネート、ジチオカルバメート、エノール、エステル、エーテル、ヒドラジン、ヒドラゾン、ヒドロキサム酸、イミド、イソシアネート、イソシアニド、イソチオシアネート、ケタール、ケテン、ケトン、脱離基、ニトリル、有機ハロゲン化物、有機リン、オルトエステル、オキシム、ホスホノフルオリデート、ホスホノチオエート、ホスホラミドチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロフルオリデート、ホスホロチオエート、保護基、ピロホスフェート、セミカルバジド、セミカルバゾン、スルファメート、スルホン酸エステル、スルホン、スルホン酸、スルホニル基、スルホキシミン、スルフリル化合物、チオアミド、チオシアネート、チオエステル、チオレート、チオン、チオホスホリル化合物およびチオスルフィネートからなる群より選択することができる。官能基はまた、アセタール、アセトキシ基、アセチリド、酸無水物、活性化基、塩化アシル、ハロゲン化アシル、アシラール、アシロイン、アシルシラン、アルコール、アルデヒド、アルジミン、アルカン、アルケン、アルコキシド、アルキルシクロアルカン、亜硝酸アルキル、アルキン、アレン、アミド、アミジン、アミナール、アミンオキシド、アジド、アジン、アジリジン、アゾキシ、二官能性ビスチオセミカルバゾン、ビウレット、ボロン酸、カルバメート、カルバミノ、カルバジド、カルベン、カルビノール、炭酸エステル、カルボニル、カルボキサミド、カルボキシミデート、カルボン酸、クロロホルメート、クムレン、シアン酸エステル、シアニミド、シアノヒドリン、不活性化基、デプシド、ジアゾ、ジオール、ジチオカルバメート、エナミン、エンジイン、エノール、エノールエーテル、エノン、エンイン、エピスルフィド、エポキシド、エステル、エーテル、フルオロスルホネート、ハロヒドリン、ハロケトン、ヘミアセタール、ヘミアミナール、ヘミチオアセタール、ヒドラジド、ヒドラゾン、ヒドロキサム酸、ヒドロキシル、ヒドロキシルアミン、イミン、イミニウム、イソチオウロニウム、ケテン、ケテンイミン、ケトン、ケチル、ラクタム、ラクトール、ラクトン、メチン、メチル基、ニトレート、ニトリルイリド、ニトリルイミン、ニトロ化合物、ニトロアミン、ニトロネート、ニトロン、ニトロニウムイオン、ニトロサアミン、ニトロソ、オルトエステル、オサゾン、オキサジリジン、オキシム、n-オキソアンモニウム塩、ペルオキシド、過酸、持続性カルベン、フェノール、ホスファアルケン、ホスファアルキン、ホスフェート、ホスフィネート、ホスフィン、ホスフィンオキシド、ホスフィナイト、ホスホネート、ホスホナイト、ホスホニウム、ホスホラン、s−ニトロソチオール、シッフ塩基、セレノール、セレノン酸、セロン、セミカルバジド、セミカルバゾン、シリルエノールエーテル、シリルエーテル、スルフェンアミド、スルフェン酸、塩化スルフェニル、スルフィド、スルフィルイミン、スルフィンアミド、スルフィン酸、亜硫酸エステル、スルホンアミド、スルホンアニリド、スルホネート、スルホニル、ハロゲン化スルホニル、スルホキシド、スルフリル、スルトン、テルロール、チアール、チオアセタール、チオアミド、チオカルバメート、チオカルボキシ、チオシアネート、チオエステル、チオエーテル、チオケタール、チオケトン、チオール、チオラクトン、チオ尿素、トシルヒドラゾン、トリアゼン、トリオール、尿素、バニリル、キサンテート、イリドおよびイノラートからなる群より選択することができる。いくつかの態様において、官能基は、カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシル基、ヒドラジド基および／またはクロロメチル基を含む。たとえば、官能基はカルボキシル基であることができる。
本発明はさらに、官能基結合アプタマーおよび基体を含む組成物を提供する。基体は、任意の有用な基体、たとえば平面基体またはミクロスフェアであることができる。たとえば図16A〜16Bを参照すること。基体は、たとえば、カルボキシル修飾、アミノ修飾、ヒドロキシル修飾、ヒドラジド修飾、クロロメチル修飾およびそれらの組み合わせからなる群より選択される一つまたは複数の修飾によって改変されていることができる。ある態様において、基体はカルボキシル基を含む。アプタマーはカルボキシル基に結合し得る。基体はまた、非限定的に抗体またはアプタマーを含む結合物質を含むことができる。いくつかの態様において、組成物はさらに微小胞を含む。
本発明はさらに、試薬および試薬の使用を含むキットであって、試薬が官能基結合アプタマーおよび／または上記組成物を含み得る、キットを提供する。
関連の局面において、本発明は、上記のような官能基結合アプタマーを基体、たとえば平面基体またはミクロスフェアと接触させる工程を含む方法を提供する。上記のように、基体は、たとえば、カルボキシル修飾、アミノ修飾、ヒドロキシル修飾、ヒドラジド修飾、クロロメチル修飾およびそれらの組み合わせからなる群より選択される一つまたは複数の修飾によって改変されていることができる。ある態様において、基体はカルボキシル基を含む。アプタマーはカルボキシル基に結合し得る。基体はまた、非限定的に抗体またはアプタマーを含む結合物質を含むことができる。いくつかの態様において、組成物はさらにを含む。方法はさらに、基体を結合物質の標的、たとえばタンパク質または微小胞と接触させる工程を含むことができる。
本発明はさらに、方法を実施するための試薬を含むキットを提供する。本発明はまた、方法を実施するための試薬の使用を提供する。試薬は、官能基結合アプタマーおよび／または上記組成物を含み得る。
もう一つの関連の局面において、本発明は、生物学的実体を含有することが疑われる生物学的試料中の該生物学的実体の存在またはレベルを検出する方法であって、（a）カルボキシル化基体に付着した生物学的実体に特異的な1種または複数種の結合物質を含む組成物を提供する工程であって、カルボキシル化基体が官能基結合アプタマーと結合している、工程；（b）該生物学的試料を、工程（a）において提供された組成物と接触させる工程；および（c）工程（b）において生物学的実体が1種または複数種の結合物質によって認識されるかどうかを検出し、それにより、生物学的試料中の生物学的実体の存在またはレベルを検出する工程を含む、方法を提供する。官能基結合アプタマーは上記の官能基結合アプタマーであることができる。
ある態様において、1種または複数種の結合物質は抗体またはアプタマーを含む。生物学的実体はタンパク質であることができる。生物学的実体はまた、微小胞であることもできる。いくつかの態様において、1種または複数種の結合物質は、非限定的に表3〜4または26のいずれかから選択される微小胞表面抗原を含む微小胞表面抗原に特異的である。生物学的実体、たとえばタンパク質、微小胞または微小胞表面抗原は、疾患または障害のバイオマーカーとして選択することができる。そのような場合、方法は、本明細書でさらに説明するように、疾患または障害の診断、予後判定またはセラノーシスを提供し得る。
本発明はさらに、方法を実施するための試薬を含むキットを提供する。本発明はまた、方法を実施するための試薬の使用を提供する。試薬は、官能基結合アプタマーおよび基体の一つまたは複数を含み得る。
もう一つの関連の局面において、本発明は、（a）基体を、カルボキシル基に結合することができるアプタマーと接触させる工程であって、基体がまた、1種または複数種の選択された核酸またはポリペプチド分子を含む、工程；および（b）基体を、核酸またはポリペプチド分子に結合することができる結合物質と接触させる工程を含み、カルボキシル基に結合するアプタマーが、核酸またはポリペプチド分子への結合物質の結合を高める、結合を高める方法を提供する。官能基結合アプタマーは上記の官能基結合アプタマーであることができる。基体は、任意の有用な基体、たとえば平面基体またはミクロスフェアであることができる。核酸またはポリペプチドは、アミド結合を介してカルボキシル基に共有結合していることができる。いくつかの態様において、基体は結合物質を含む。
本発明はさらに、方法を実施するための試薬を含むキットを提供する。本発明はまた、方法を実施するための試薬の使用を提供する。試薬は、官能基結合アプタマーおよび基体の一つまたは複数を含み得る。
本発明は、基体と試料との複合体を含む組成物およびその使用方法を提供する。そのような局面において、本発明は、（a）基体を生物学的試料と接触させて、基体−生物学的試料複合体の形成を可能にする工程；（b）基体−生物学的試料複合体を複数の候補結合物質と接触させる工程；および（c）基体−生物学的試料複合体と結合する複数の候補結合物質の一つまたは複数のメンバーを同定し、それにより、1種または複数種の結合物質を選択する工程を含む、1種または複数種の結合物質を選択する方法を提供する。1種または複数種の結合物質は、核酸、DNA分子、RNA分子、抗体、抗体コンジュゲート、抗体フラグメント、アプタマー、ペプトイド、zDNA、ペプチド核酸（PNA）、ロックド核酸（LNA）、レクチン、ポリペプチド、ペプチド、デンドリマー、膜タンパク質標識物質、化学物質またはそれらの組み合わせであることができる。いくつかの態様において、1種または複数種の結合物質はアプタマーを含む。
生物学的試料は、任意の有用な試料、たとえば組織試料、細胞培養物または生物学的流体であることができる。いくつかの態様において、生物学的流体は体液を含み、場合によっては、体液は、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（CSF）、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液もしくは尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、毛髪、涙液、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胞胚腔液、臍帯血またはそれらのいずれかの由来物を含む。生物学的試料は異種微小胞集団または同種微小胞集団を含むことができる。
いくつかの態様において、生物学的試料は、濃縮血漿試料、血清試料、浄化血清試料または浄化血漿試料である。浄化血清または浄化血漿試料は、非浄化対照試料に比べて低下したレベルの1種または複数種の高存在量タンパク質を有し得る。1種または複数種の高存在量タンパク質は血液タンパク質であることができる。そのような高存在量血液タンパク質は、非限定的に、アルブミン、IgG、トランスフェリン、フィブリノーゲン、フィブリン、IgA、α2マクログロブリン、IgM、α1抗トリプシン、補体C3、ハプトグロブリン、アポリポタンパク質A1、A3およびB；α1酸糖タンパク質、セルロプラスミン、補体C4、C1q、IgD、プレアルブミン（トランスチレチン）、プラスミノーゲン、それらのいずれかの由来物およびそれらの組み合わせを含む。1種または複数種の高存在量タンパク質は、アルブミン、免疫グロブリン、フィブリノーゲン、プレアルブミン、α1抗トリプシン、α1酸糖タンパク質、α1フェトタンパク質、ハプトグロビン、α2マクログロブリン、セルロプラスミン、トランスフェリン、補体タンパク質C3およびC4、β2ミクログロブリン、βリポタンパク質、γグロブリンタンパク質、C反応性タンパク質（CRP）、リポタンパク質（カイロミクロン、VLDL、LDL、HDL）、他のグロブリン（α、βおよびγ型）、プロトロンビン、マンノース結合レクチン（MBL）、それらのいずれかの由来物およびそれらの組み合わせの一つまたは複数を含み得る。
いくつかの態様において、1種または複数種の高存在量タンパク質は、クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、イムノアフィニティー、沈降またはそれらの組み合わせにより、浄化血清または浄化血漿試料から全体的または部分的に分離される。1種または複数種の高存在量タンパク質はまた、生物学的試料をトロンボプラスチンと接触させたのち、浄化血清または浄化血漿試料から分離することもできる。いくつかの態様においては、非浄化対照試料に比べて、1種または複数種の高存在量タンパク質の少なくとも25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％または100％が浄化血清または浄化血漿試料から分離される。
基体−生物学的試料複合体は、基体と生物学的試料の成分との間の架橋を含み得、場合によっては、架橋は、光架橋、イミドエステル架橋剤、ジメチルスベリミデート、脂質架橋剤、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル架橋剤、ビススルホスクシンイミジルスベレート（BS3）、アルデヒド、アクロレイン、クロトンアルデヒド、ホルムアルデヒド、カルボジイミド架橋剤、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DDC）、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）、1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩（EDCまたはEDAC）、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート（SMCC）、スルホスクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート（スルホ-SMCC）、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジル-2-(6-[ビオチンアミド]-2-(p-アジドベンズアミド)ヘキサノアミド)エチル-1,3'-ジチオプロピオネート（スルホ-SBED）、2-[N2-(4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロベンゾイル)-N6-(6-ビオチンアミドカプロイル)-L-リジニル]エチルメタンチオスルホネート（Mts-Atf-ビオチン）、2-{N2-[N6-(4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロベンゾイル-6-アミノカプロイル)-N6-(6-ビオチンアミドカプロイル)-L-リジニルアミド]}エチルメタンチオスルホネート（Mts-Atf-LC-ビオチン）、光反応性アミノ酸、L-フォトロイシン、L-フォトメチオニン、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）架橋剤、NHS-アジド試薬、NHS-アジド、NHS-PEG4-アジド、NHS-PEG12-アジド、NHS-ホスフィン試薬、NHS-ホスフィン、スルホ-NHS-ホスフィンまたはそれらの任意の組み合わせもしくは変形を含む。基体は、生物学的試料の成分に直接架橋させることもできるし、または基体は、リンカーを介して生物学的試料の成分に架橋させることもできる。
方法のいくつかの態様において、生物学的試料の成分は微小胞を含む。リンカーが使用されるとき、リンカーは微小胞膜の中に埋め込まれてもよい。たとえば図10A〜10Bを参照すること。そのようなリンカーは非限定的に官能化脂質を含み得、場合によっては、官能化脂質は、16:0ビオチニルPE1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ−3−ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)（ナトリウム塩）、18:1ビオチニルPE1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)（ナトリウム塩）、16:0ビオチニルCap PE1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(capビオチニル)（ナトリウム塩）、18:1ビオチニルCap PE1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(capビオチニル)（ナトリウム塩）またはそれらの組み合わせを含む。
リンカーはまた、ジアシルグリセロール、ジアシルホスホグリセロール（リン脂質）もしくはステロール、ジアルキルグリセロール、ジアルキルもしくはジアシル-1-アミノ-2,3-ジヒドロキシプロパン、長鎖アルキルもしくはアシル、スフィンゴ脂質、セラミド、リン脂質、グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）膜アンカー配列、糖リン脂質膜アンカー、膜受容体フラグメント、タンパク質結合受容体、金属キレート受容体、免疫グロブリンFc結合受容体、サイトカインもしくは成長因子結合受容体、薬物受容体結合、脂質模倣受容体、膜貫通受容体、合成タンパク質結合受容体、合成金属キレート受容体、合成免疫グロブリンFc結合受容体、合成サイトカインもしくは成長因子結合受容体、合成薬剤結合受容体、合成脂質模倣受容体、合成膜貫通受容体、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、スフィンゴ脂質、ステロイド、コレステロール、ジヒドロコレステロール、エルゴステロール、ブラシカステロール、コレステリルアミン、ジヒドロコレステリルアミン、エルゴステリルアミン、ブラシカステリルアミン、3-コレステリルアミン、3-ジヒドロコレステリルアミン、3-エルゴステリルアミン、3-ブラシカステリルアミン、3β-コレステリルアミン、3β-ジヒドロコレステリルアミン、3β−エルゴステリルアミン、3β-ブラシカステリルアミンまたはそれらのいずれかの機能性フラグメントもしくは誘導体を含むことができる。
方法のいくつかの態様において、基体は、生物学的試料の成分への結合物質にコンジュゲートされる。結合物質は、抗体、アプタマーまたはレクチンであり得、場合によっては、レクチンはコンカナバリンA（ConA）を含む。生物学的試料の成分は微小胞であることができ、場合によっては、結合物質は、微小胞表面抗原への結合物質を含む。たとえば図7A〜7Dを参照すること。
方法はさらに、たとえば本明細書に開示される方法を使用して1種または複数種の結合物質を同定する工程を含み得る。
関連の局面において、本発明は、基体−微小胞複合体を含む組成物を提供し、ここで、基体は合成基体を含む。そのような基体はビーズ、ウェルまたは平面基体であり得、場合によっては、ビーズは磁性ビーズまたはポリスチレンビーズを含む。
本発明はさらに、方法を実施するための試薬を含むキットを提供する。本発明はまた、方法を実施するための試薬の使用を提供する。試薬は、基体−微小胞複合体およびリンカー物質の一つまたは複数を含み得る。試薬は上記組成物を含み得る。
もう一つの関連の局面において、本発明は、基体を微小胞と接触させる工程を含み、基体が、微小胞の表面上に存在する少なくとも一つの成分に直接結合することができる化学基で官能化されている、安定な基体−微小胞複合体を製造する方法を提供する。基体は、ビーズ、ウェル、マトリックスまたは平面基体であることができる。少なくとも一つの成分は、非限定的にペプチド、ポリペプチド、タンパク質、脂質、糖質、それらの由来物またはそれらの組み合わせを含む有用なバイオマーカーであり得る。化学基は、ペプトイド、zDNA、ペプチド核酸（PNA）、ロックド核酸（LNA）、レクチン、ペプチド／ポリペプチド、デンドリマー、膜タンパク質標識物質、化学物質、光架橋、イミドエステル架橋剤、ジメチルスベリミデート、脂質架橋剤、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル架橋剤、ビススルホスクシンイミジルスベレート（BS3）、アルデヒド、アクロレイン、クロトンアルデヒド、ホルムアルデヒド、カルボジイミド架橋剤、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DDC）、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）、1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩（EDCまたはEDAC）、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート（SMCC）、スルホスクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート（スルホ-SMCC）、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジル-2-(6-[ビオチンアミド]-2-(p-アジドベンズアミド)ヘキサノアミド)エチル-1,3'-ジチオプロピオネート（スルホ-SBED）、2-[N2-(4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロベンゾイル)-N6-(6-ビオチンアミドカプロイル)-L-リジニル]エチルメタンチオスルホネート（Mts-Atf-ビオチン）、2-{N2-[N6-(4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロベンゾイル-6-アミノカプロイル)-N6-(6-ビオチンアミドカプロイル)-L-リジニルアミド]}エチルメタンチオスルホネート（Mts-Atf-LC-ビオチン）、光反応性アミノ酸、L-フォトロイシン、L-フォトメチオニン、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）架橋剤、NHS-アジド試薬、NHS-アジド、NHS-PEG4-アジド、NHS-PEG12-アジド、NHS-ホスフィン試薬、NHS-ホスフィン、スルホ-NHS-ホスフィンまたはそれらの組み合わせであることができる。ある態様において、化学基は、炭化水素、ハロゲン、酸素含有基（すなわちC−O結合）、窒素含有基、硫黄含有基、リン含有基、ホウ素含有基またはそれらの組み合わせを含む。もう一つの態様において、炭化水素は、アルカン、アルケン、アルキン、ベンゼン誘導体、トルエン誘導体、分岐鎖状または環式アルカン、カルボカチオンおよびカルボアニオンからなる群より選択される。さらに別の態様において、ハロゲンは、ハロアルカン、フルオロアルカン、クロロアルカン、ブロモアルカンおよびヨードアルカンからなる群より選択される。酸素含有基は、アルコール、ケトン、アルデヒド、ハロゲン化アシル、カーボネート、カルボキシレート、カルボン酸、エステル、ヒドロペルオキシド、エーテル、ヘミアセタール、ヘミケタール、アセタール、ケタール、オルトエステルおよびオルトカーボネートからなる群より選択することができる。窒素含有基は、アミド、アミン、イミン、イミド、アジド、アゾ化合物、シアネート、ニトレート、ニトリル、ニトライト、ニトロ化合物、ニトロソ化合物およびピリジン誘導体からなる群より選択することができる。いくつかの態様において、硫黄含有基は、チオール、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、硫酸、スルホン酸、チオシアネート、イソシアネート、チオンおよびチアールからなる群より選択される。リン含有基は、ホスフィン、ホスファン、ホスホン酸、ホスフェートおよびホスホジエステルからなる群より選択することができる。諸態様において、ホウ素含有基は、ボロン酸、ボロン酸エステル、ボリン酸およびボリン酸エステルからなる群より選択される。
化学基は、アセタール、アシル基、ハロゲン化アシル、アルケニル基、アルコキシド、アルコキシ基、アルキニル基、アミド、アミンオキシド、アミン、カルボジイミド、カルボキシミデート、カルボン酸、シアナミド、シアネート、ジチオカルバメート、エノール、エステル、エーテル、ヒドラジン、ヒドラゾン、ヒドロキサム酸、イミド、イソシアネート、イソシアニド、イソチオシアネート、ケタール、ケテン、ケトン、脱離基、ニトリル、有機ハロゲン化物、有機リン、オルトエステル、オキシム、ホスホノフルオリデート、ホスホノチオエート、ホスホラミドチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロフルオリデート、ホスホロチオエート、保護基、ピロホスフェート、セミカルバジド、セミカルバゾン、スルファメート、スルホン酸エステル、スルホン、スルホン酸、スルホニル基、スルホキシミン、スルフリル化合物、チオアミド、チオシアネート、チオエステル、チオレート、チオン、チオホスホリル化合物および／またはチオスルフィネートを含み得る。化学基は、アセタール、アセトキシ基、アセチリド、酸無水物、活性化基、塩化アシル、ハロゲン化アシル、アシラール、アシロイン、アシルシラン、アルコール、アルデヒド、アルジミン、アルカン、アルケン、アルコキシド、アルキルシクロアルカン、亜硝酸アルキル、アルキン、アレン、アミド、アミジン、アミナール、アミンオキシド、アジド、アジン、アジリジン、アゾキシ、二官能性ビスチオセミカルバゾン、ビウレット、ボロン酸、カルバメート、カルバミノ、カルバジド、カルベン、カルビノール、炭酸エステル、カルボニル、カルボキサミド、カルボキシミデート、カルボン酸、クロロホルメート、クムレン、シアン酸エステル、シアニミド、シアノヒドリン、不活性化基、デプシド、ジアゾ、ジオール、ジチオカルバメート、エナミン、エンジイン、エノール、エノールエーテル、エノン、エンイン、エピスルフィド、エポキシド、エステル、エーテル、フルオロスルホネート、ハロヒドリン、ハロケトン、ヘミアセタール、ヘミアミナール、ヘミチオアセタール、ヒドラジド、ヒドラゾン、ヒドロキサム酸、ヒドロキシル、ヒドロキシルアミン、イミン、イミニウム、イソチオウロニウム、ケテン、ケテンイミン、ケトン、ケチル、ラクタム、ラクトール、ラクトン、メチン、メチル基、ニトレート、ニトリルイリド、ニトリルイミン、ニトロ化合物、ニトロアミン、ニトロネート、ニトロン、ニトロニウムイオン、ニトロソアミン、ニトロソ、オルトエステル、オサゾン、オキサジリジン、オキシム、n−オキソアンモニウム塩、ペルオキシド、過酸、持続性カルベン、フェノール、ホスファアルケン、ホスファアルキン、ホスフェート、ホスフィネート、ホスフィン、ホスフィンオキシド、ホスフィナイト、ホスホネート、ホスホナイト、ホスホニウム、ホスホラン、s−ニトロソチオール、シッフ塩基、セレノール、セレノン酸、セロン、セミカルバジド、セミカルバゾン、シリルエノールエーテル、シリルエーテル、スルフェンアミド、スルフェン酸、塩化スルフェニル、スルフィド、スルフィルイミン、スルフィンアミド、スルフィン酸、亜硫酸エステル、スルホンアミド、スルホンアニリド、スルホネート、スルホニル、ハロゲン化スルホニル、スルホキシド、スルフリル、スルトン、テルロール、チアール、チオアセタール、チオアミド、チオカルバメート、チオカルボキシ、チオシアネート、チオエステル、チオエーテル、チオケタール、チオケトン、チオール、チオラクトン、チオ尿素、トシルヒドラゾン、トリアゼン、トリオール、尿素、バニリル、キサンテート、イリドおよびイノラートからなる群より選択され得る。諸態様において、化学基は、カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシル基、ヒドラジド基および／またはクロロメチル基を含む。たとえば、化学基はカルボキシル基であることができる。
関連の局面において、本発明は、基体−微小胞複合体を含む組成物を提供し、ここで、基体は上記のような合成基体を含む。本発明はさらに、不活性基体に直接コンジュゲートした微小胞を含む、安定化された微小胞組成物を提供する。基体は、ビーズ、ウェル、マトリックスまたは平面基体であることができ、場合によっては、ビーズは磁性ビーズまたはポリスチレンビーズを含む。たとえば図7A〜7D、図10A〜12Eのいずれかを参照すること。
本発明はまた、上記方法を実施するための1種または複数種の試薬を含むキットであって、場合によっては、1種または複数種の試薬が基体−微小胞複合体およびリンカー物質の1種または複数種を含むキットを提供する。本発明はさらに、方法を実施するための1種または複数種の試薬の使用を提供する。
ある局面において、本発明は、微小胞を可視化する方法を提供する。たとえば図11A〜12Eを参照すること。方法は、（a）微小胞を、微小胞抗原への結合物質と接触させる工程であって、結合物質が標識を含む、工程；（b）接触させた微小胞を走査型電子顕微鏡（SEM）基体に固定する工程；（c）固定された微小胞をスパッターコーティングする工程；および（d）SEMを使用して微小胞および標識を可視化する工程を含む。微小胞は、工程（a）の前に基体に取り付けることができる。微小胞は、共有結合によって基体に取り付けてもよい。微小胞はまた、イムノアフィニティー結合によって基体に取り付けてもよい。たとえば図7A〜7E；図10Bを参照すること。
結合物質は、直接的に標識されることもできるし、または結合物質は、間接的に標識されることもできる。間接標識は、微小胞抗原への結合物質と一緒に複合体を形成する、標識された結合物質を含み得る。任意の有用な結合物質、たとえば抗体、機能性抗体フラグメントまたはアプタマーをこの方法に使用することができる。
微小胞抗原は、関心対象の微小胞を可視化するように選択することができる。いくつかの態様において、抗原は、表3、表4または表26から選択される。たとえば、微小胞抗原は、非限定的にテトラスパニン、CD9、CD63、CD81またはそれらの任意の組み合わせを含む一般的小胞マーカーであることができる。
スパッターコーティングは金および／またはパラジウムコーティングを含み得る。スパッターコーティングは炭素コーティングを含み得る。いくつかの態様において、SEMは、微小胞を可視化するための二次電子（SE）モードおよび／または標識を可視化するための後方散乱電子（BSE）モードを含む。標識は金を含むことができる。
本発明の諸態様において、（i）微小胞は、工程（a）の前に共有結合によって基体に取り付けられ；（ii）微小胞抗原への結合物質は、間接的に標識された抗体であり、間接標識は、微小胞抗原に対する抗体と一緒に複合体を形成する金標識抗体を含み；（iii）微小胞抗原はCD9であり；（iv）スパッターコーティングは炭素コーティングを含み；ならびに（v）SEMは、微小胞を可視化するための二次電子（SE）モードおよび／または標識を可視化するための後方散乱電子（BSE）モードを含む。
本発明はさらに、本発明の方法を実施するための1種または複数種の試薬のキットおよび使用を提供する。1種または複数種の試薬は、非限定的にアプタマーライブラリー、基体、たとえばマイクロビーズまたは平面アレイもしくはウェル、バイオマーカーおよび／または微小胞単離のための試薬、特定の標的に対するアプタマー、バイオマーカー／微小胞集団の検出を容易にするアプタマープール、試薬、たとえば核酸配列決定または増幅のためのプライマー、核酸ハイブリダイゼーションのためのアレイ、検出可能な標識、溶媒またはバッファなど、様々なリンカー、様々なアッセイ構成要素、ブロッカーなどを含む、主題の方法を実施するための任意の有用な試薬を含み得る。1種または複数種の試薬はまた、本発明によって提供される様々な組成物を含んでもよい。
[本発明1001]
（a）表18に記載される、SEQ ID NO: 230900〜230903、230908、230913〜230927、もしくは任意の上記配列の可変配列；または（b）任意の上記配列の機能的断片のいずれかと、少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、または100パーセント相同である核酸配列を含む、微小胞に結合するアプタマー。
[本発明1002]
SEQ ID NO: 230900〜230903、230908、230913〜230927、またはそれらの機能的断片のいずれかを含む、本発明1001のアプタマー。
[本発明1003]
前記機能的断片が、表18に示される「可変配列」領域を含む、前記本発明のいずれかのアプタマー。
[本発明1004]
微小胞が前立腺癌細胞から流出したものである、前記本発明のいずれかのアプタマー。
[本発明1005]
（a）表23に記載される、SEQ ID NO: 231018〜231031もしくはそれらの可変配列；（b）表24に記載される、SEQ ID NO: 231032〜231051もしくはそれらの可変配列；（c）SEQ ID NO: 231032〜241535；または（d）任意の上記配列の機能的断片のいずれかと、少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、または100パーセント相同である核酸配列を含む、微小胞に結合するアプタマー。
[本発明1006]
SEQ ID NO: 231018〜231031またはそれらの機能的断片のいずれかを含む、本発明1005のアプタマー。
[本発明1007]
SEQ ID NO: 231032〜231051またはそれらの機能的断片のいずれかを含む、本発明1005のアプタマー。
[本発明1008]
前記機能的断片が、表23〜24のいずれかに示される「可変配列」領域を含む、本発明1005〜1007のいずれかのアプタマー。
[本発明1009]
微小胞が乳癌細胞から流出したものである、本発明1005〜1008のいずれかのアプタマー。
[本発明1010]
（a）SEQ ID NO: 1〜230810；（b）表11、12、13、15に記載される、SEQ ID NO: 230822〜230899、230904〜230907、230909〜230911、もしくは任意のそれらの可変配列；または（c）任意の上記配列の機能的断片のいずれかと、少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、または100パーセント相同である核酸配列を含む、上皮細胞接着分子（EpCAM）タンパク質に結合するアプタマー。
[本発明1011]
アプタマー4 ($$SEQ ID NO: 1)、オリゴ6 (SEQ ID NO: 230810)、オリゴ4B (SEQ ID NO: 183132)、CAR003 (SEQ ID NO: 230822またはSEQ ID NO: 230823)、CAR016 (SEQ ID NO: 230840)、またはそれらの機能的断片のいずれかを含む、本発明1010のアプタマー。
[本発明1012]
表5、6、7、8、11、12、13、15、16、またはそれらの機能的断片のいずれかに由来する、本発明1010のアプタマー。
[本発明1013]
前記機能的断片が、表11、12、13、15のいずれかに示される「可変配列」領域、またはそれらの機能的断片を含む、本発明1010〜1012のいずれかのアプタマー。
[本発明1014]
インビトロでのEpCAMシグナル伝達を調節する、本発明1010〜1013のいずれかのアプタマー。
[本発明1015]
（a）表20に記載される、SEQ ID NO: 230932〜230935もしくはそれらの可変配列；または（b）任意の上記配列の機能的断片のいずれかと、少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、または100パーセント相同である核酸配列を含む、前立腺特異的膜抗原（PSMA）タンパク質に結合するアプタマー。
[本発明1016]
少なくとも1つの化学修飾を含むようにさらに改変されている、前記本発明のいずれかのアプタマー。
[本発明1017]
前記修飾が、核酸の、糖位置での化学的置換；リン酸位置での化学的置換；および塩基位置での化学的置換からなる群より選択される、本発明1016のアプタマー。
[本発明1018]
前記修飾が、ビオチン化、蛍光標識の取り込み、修飾ヌクレオチドの取り込み、3'キャッピング、アミンリンカーへの結合、高分子量の非免疫原性化合物への結合、親油性化合物への結合、薬物への結合、細胞傷害性部分への結合、および放射性同位体を用いた標識からなる群より選択される、本発明1016のアプタマー。
[本発明1019]
ビオチン化、蛍光標識、または細胞傷害性部分が、前記アプタマーの5'末端に結合している、本発明1018のアプタマー。
[本発明1020]
ビオチン化、蛍光標識、または細胞傷害性部分が、前記アプタマーの3'末端に結合している、本発明1018のアプタマー。
[本発明1021]
細胞傷害性部分がナノ粒子中に封入されている、本発明1018のアプタマー。
[本発明1022]
ナノ粒子が、リポソーム、デンドリマー、および櫛形ポリマーからなる群より選択される、本発明1021のアプタマー。
[本発明1023]
細胞傷害性部分が小分子の細胞傷害性部分を含む、本発明1018のアプタマー。
[本発明1024]
小分子の細胞傷害性部分が、ビンブラスチンヒドラジド、カリチアマイシン、ビンカアルカロイド、クリプトフィシン、ツブリシン、ドラスタチン-10、ドラスタチン-15、アウリスタチンE、リゾキシン、エポチロンB、エポチロンD、タキソイド、メイタンシノイド、ならびにそれらの任意のバリアントおよび誘導体からなる群より選択される、本発明1023のアプタマー。
[本発明1025]
放射性同位体が、イットリウム-90、インジウム-111、ヨウ素-131、ルテチウム-177、銅-67、レニウム-186、レニウム-188、ビスマス-212、ビスマス-213、アスタチン-211、およびアクチニウム-225からなる群より選択される、本発明1018のアプタマー。
[本発明1026]
細胞傷害性部分がタンパク毒素である、本発明1018のアプタマー。
[本発明1027]
タンパク毒素が、ジフテリア毒素、リシン、アブリン、ゲロニン、およびシュードモナス外毒素Aからなる群より選択される、本発明1026のアプタマー。
[本発明1028]
非免疫原性の高分子量化合物がポリアルキレングリコールである、本発明1018のアプタマー。
[本発明1029]
ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである、本発明1028のアプタマー。
[本発明1030]
γ線放出放射性同位体によって標識されている、本発明1016のアプタマー。
[本発明1031]
活性物質が前記アプタマーに結合している、本発明1016のアプタマー。
[本発明1032]
活性物質が治療物質または診断物質を含む、本発明1031のアプタマー。
[本発明1033]
治療物質または診断物質が、チロシンキナーゼ阻害剤、キナーゼ阻害剤、生物学的活性物質、生物学的分子、放射性核種、アドリアマイシン、アンサマイシン系抗生物質、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、カルムスチン、カペシタビン、クロラムブチル、シタラビン、シクロホスファミド、カンプトセシン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エトポシド、エポチロン、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルカプトプリン、メルファラン、メトトレキサート、ラパマイシン（シロリムス）、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニトロソ尿素、パクリタクセル、パミドロナート、ペントスタチン、プリカマイシン、プロカルバジン、リツキシマブ、ストレプトゾシン、テニポシド、チオグアニン、チオテパ、タキサン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、タキソール、コンブレタスタチン、ディスコデルモリド、トランスプラチナ（transplatinum）、抗血管内皮成長因子化合物（「抗VEGF」）、抗上皮細胞成長因子受容体化合物（「抗EGFR」）、5-フルオロウラシルおよび誘導体、放射性核種、ポリペプチド毒素、アポトーシス誘導物質、治療増感物質、酵素またはその活性断片、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される治療物質である、本発明1031〜1032のいずれかの方法。
[本発明1034]
治療的有効量の本発明1001〜1033のいずれかのアプタマーまたはその塩、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、薬学的組成物。
[本発明1035]
それを必要とする対象に本発明1034の組成物を投与する工程を含む、疾患または障害を治療するかまたは寛解させる方法。
[本発明1036]
対象に治療的有効量の前記組成物を投与する工程が以下をもたらす、本発明1035の方法：
（a）活性物質単独の送達と比較した、疾患部位への活性物質の送達の増大；または（b）微小胞クリアランスの増大による、アプタマーの標的となる微小胞の血中濃度の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、もしくは90%の低下；または（c）該アプタマーの標的となる微小胞の生物活性の、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、もしくは90%の低下。
[本発明1037]
微小胞の生物活性が、免疫抑制または遺伝情報の伝達を含む、本発明1036の方法。
[本発明1038]
疾患または障害が、新生物性の、増殖性の、または炎症性の疾患または障害を含む、本発明1035〜1037のいずれかの方法。
[本発明1039]
治療的有効量の本発明1026のアプタマーまたはその塩、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、薬学的組成物。
[本発明1040]
前記本発明のいずれかのアプタマーまたはその薬学的組成物を含む、キット。
[本発明1041]
本発明1001〜1033のいずれかのアプタマーを生物学的試料と接触させる工程および該生物学的試料中の微小胞に対する該アプタマーの結合の有無を検出する工程を含む、方法。
[本発明1042]
生物学的試料が血液または血液成分を含む、本発明1041の方法。
[本発明1043]
アプタマーが、生物学的試料と接触させる工程の前に基体に結合している、本発明1041の方法。
[本発明1044]
基体がビーズを含む、本発明1043の方法。
[本発明1045]
アプタマーが、検出可能な標識に結合している、本発明1041の方法。
[本発明1046]
微小胞集団を含有することが疑われる生物学的試料中の該微小胞集団の存在またはレベルを検出する方法であって、該生物学的試料を、微小胞集団に特異的な1種または複数種の結合物質および本発明1001〜1033のいずれかの1種または複数種のアプタマーと接触させる工程、ならびに、該1種または複数種の結合物質および該1種または複数種のアプタマーの両方によって認識された微小胞を検出する工程であって、それによって該生物学的試料中の該微小胞集団の存在またはレベルを検出する、工程を含む、方法。
[本発明1047]
生物学的試料が、組織試料、細胞培養物、または体液を含む、本発明1046の方法。
[本発明1048]
体液が、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（CSF）、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液もしくは尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、体毛、涙液、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤胞腔液、または臍帯血を含む、本発明1047の方法。
[本発明1049]
体液が、血液、血清、または血漿を含む、本発明1047の方法。
[本発明1050]
1種または複数種の結合物質が、表3、表4、およびそれらの組み合わせから選択される微小胞表面抗原に対する抗体またはアプタマーを含む、本発明1046の方法。
[本発明1051]
1種または複数種の結合物質が、表26中の標的から選択される微小胞表面抗原に対する抗体またはアプタマーを含む、本発明1046の方法。
[本発明1052]
1種または複数種の結合物質が、EpCam、CD9、PCSA、CD63、CD81、PSMA、B7H3、PSCA、ICAM、STEAP、KLK2、SSX2、SSX4、PBP、SPDEF、EGFR、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される微小胞表面抗原に対する抗体またはアプタマーを含む、本発明1046の方法。
[本発明1053]
1種または複数種の結合物質が、EGFR、PBP、EpCAM、KLK2、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される微小胞表面抗原に対する抗体またはアプタマーを含む、本発明1046の方法。
[本発明1054]
1種または複数種の結合物質が、生物学的試料と接触させる工程の前に基体に結合している、本発明1046の方法。
[本発明1055]
1種または複数種のアプタマーが、検出可能な標識に結合している、本発明1054の方法。
[本発明1056]
1種または複数種の結合物質が、検出可能な標識に結合している、本発明1046の方法。
[本発明1057]
1種または複数種のアプタマーが、生物学的試料と接触させる工程の前に基体に結合している、本発明1056の方法。
[本発明1058]
1種または複数種のアプタマーが、生物学的試料と接触させる工程の前に基体に結合している、本発明1046の方法。
[本発明1059]
1種または複数種のアプタマーが、検出可能な標識に結合している、本発明1046の方法。
[本発明1060]
生物学的試料中の微小胞集団の存在またはレベルを検出する工程が、疾患の診断、予後判定、またはセラノーシス（theranosis）を提供する、本発明1046〜1059のいずれかの方法。
[本発明1061]
疾患が癌を含む、本発明1060の方法。
[本発明1062]
癌が、急性リンパ芽球性白血病；急性骨髄性白血病；副腎皮質癌；AIDS関連癌；AIDS関連リンパ腫；肛門癌；虫垂癌；星状細胞腫；非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍；基底細胞癌；膀胱癌；脳幹神経膠腫；脳腫瘍（脳幹神経膠腫、中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、星状細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、上衣腫、髄芽腫、髄上皮種、中間型松果体実質腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、および松果体芽腫を含む）；乳癌；気管支腫瘍；バーキットリンパ腫；原発不明癌；カルチノイド腫瘍；原発不明癌腫；中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍；中枢神経系胚芽腫；子宮頸癌；小児癌；脊索腫；慢性リンパ球性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖性疾患；結腸癌；結腸直腸癌；頭蓋咽頭腫；皮膚T細胞リンパ腫；内分泌膵島細胞腫瘍；子宮内膜癌；上衣芽腫；上衣腫；食道癌；鼻腔神経芽細胞腫；ユーイング肉腫；頭蓋外胚細胞腫瘍；性腺外胚細胞腫瘍；肝臓外胆管癌；胆嚢癌；胃癌；消化管カルチノイド腫瘍；消化管間質細胞腫瘍；消化管間質腫瘍（GIST）；妊娠性絨毛性腫瘍；神経膠腫；毛様細胞性白血病；頭頸部癌；心臓癌；ホジキンリンパ腫；下咽頭癌；眼内黒色腫；膵島腫瘍；カポジ肉腫；腎臓癌；ランゲルハンス細胞組織球症；喉頭癌；口唇癌；肝臓癌；肺癌；悪性線維性組織球腫；骨癌；髄芽腫；髄上皮種；黒色腫；メルケル細胞癌；メルケル細胞皮膚癌；中皮腫；原発不明転移性扁平上皮性頸部癌；口腔癌；多発性内分泌腫瘍症候群；多発性骨髄腫；多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍；菌状息肉腫；骨髄異形成症候群；骨髄増殖性腫瘍；鼻腔癌；鼻咽頭癌；神経芽細胞腫；非ホジキンリンパ腫；非黒色腫皮膚癌；非小細胞肺癌；口腔癌；口腔癌；口腔咽頭癌；骨肉腫；その他の脳および脊髄の腫瘍；卵巣癌；卵巣上皮癌；卵巣胚細胞腫瘍；卵巣低悪性度腫瘍；膵臓癌；乳頭腫症；副鼻腔癌；副甲状腺癌；骨盤癌；陰茎癌；咽頭癌；中間型松果体実質腫瘍；松果体芽腫；下垂体腫瘍；形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫；胸膜肺芽腫；原発性中枢神経系（CNS）リンパ腫；原発性肝細胞肝癌；前立腺癌；直腸癌；腎臓癌；腎細胞（腎臓）癌；腎細胞癌；気道癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；唾液腺癌；セザリー症候群；小細胞肺癌；小腸癌；軟部組織肉腫；扁平上皮癌；頸部扁平上皮癌；胃癌；テント上原始神経外胚葉性腫瘍；T細胞リンパ腫；精巣癌；咽喉癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺癌；移行上皮癌；腎盂尿管移行上皮癌；絨毛性腫瘍；尿管癌；尿道癌；子宮癌；子宮肉腫；膣癌；外陰癌；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；またはウィルムス腫瘍を含む、本発明1061の方法。
[本発明1063]
癌が前立腺癌を含む、本発明1061の方法。
[本発明1064]
癌が乳癌を含む、本発明1061の方法。
[本発明1065]
（a）生物学的試験試料を、本発明1001〜1033のいずれかの1種または複数種のアプタマーと接触させる工程；
（b）工程（a）で形成された、該生物学的試験試料における1種または複数種のアプタマーと該1種または複数種のアプタマーに結合された標的との間の複合体の存在またはレベルを検出する工程；および
（c）工程（b）で検出された存在またはレベルを、生物学的対照試料に由来する参照レベルと比較する工程であって、それによって疾患または障害を特徴決定する、工程
を含む、疾患または障害を特徴決定する方法。
[本発明1066]
生物学的試験試料および生物学的対照試料がそれぞれ、組織試料、細胞培養物、または生物学的流体を含む、本発明1065の方法。
[本発明1067]
生物学的流体が体液を含む、本発明1066の方法。
[本発明1068]
体液が、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（CSF）、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液もしくは尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、体毛、涙液、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤胞腔液、または臍帯血を含む、本発明1067の方法。
[本発明1069]
体液が、血液、血清、または血漿を含む、本発明1067の方法。
[本発明1070]
生物学的流体が微小胞を含む、本発明1066の方法。
[本発明1071]
1種または複数種のアプタマーがポリペプチドまたはその断片に結合する、本発明1065の方法。
[本発明1072]
ポリペプチドまたはその断片が可溶性であるか膜結合性である、本発明1065の方法。
[本発明1073]
ポリペプチドまたはその断片が表3または表4のバイオマーカーを含む、本発明1065の方法。
[本発明1074]
1種または複数種のアプタマーが、生物学的試料中の微小胞表面抗原に結合する、本発明1065または1070の方法。
[本発明1075]
特徴決定が、疾患または障害の診断、予後判定、またはセラノーシスを含む、本発明1065〜1074のいずれかの方法。
[本発明1076]
疾患または障害が、癌、前癌状態、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患もしくは障害、心血管疾患もしくは障害、神経疾患もしくは障害、感染症、および/または疼痛を含む、本発明1075の方法。
[本発明1077]
疾患または障害が癌を含む、本発明1075の方法。
[本発明1078]
癌が、急性リンパ芽球性白血病；急性骨髄性白血病；副腎皮質癌；AIDS関連癌；AIDS関連リンパ腫；肛門癌；虫垂癌；星状細胞腫；非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍；基底細胞癌；膀胱癌；脳幹神経膠腫；脳腫瘍（脳幹神経膠腫、中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、星状細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、上衣腫、髄芽腫、髄上皮種、中間型松果体実質腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、および松果体芽腫を含む）；乳癌；気管支腫瘍；バーキットリンパ腫；原発不明癌；カルチノイド腫瘍；原発不明癌腫；中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍；中枢神経系胚芽腫；子宮頸癌；小児癌；脊索腫；慢性リンパ球性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖性疾患；結腸癌；結腸直腸癌；頭蓋咽頭腫；皮膚T細胞リンパ腫；内分泌膵島細胞腫瘍；子宮内膜癌；上衣芽腫；上衣腫；食道癌；鼻腔神経芽細胞腫；ユーイング肉腫；頭蓋外胚細胞腫瘍；性腺外胚細胞腫瘍；肝臓外胆管癌；胆嚢癌；胃癌；消化管カルチノイド腫瘍；消化管間質細胞腫瘍；消化管間質腫瘍（GIST）；妊娠性絨毛性腫瘍；神経膠腫；毛様細胞性白血病；頭頸部癌；心臓癌；ホジキンリンパ腫；下咽頭癌；眼内黒色腫；膵島腫瘍；カポジ肉腫；腎臓癌；ランゲルハンス細胞組織球症；喉頭癌；口唇癌；肝臓癌；肺癌；悪性線維性組織球腫；骨癌；髄芽腫；髄上皮種；黒色腫；メルケル細胞癌；メルケル細胞皮膚癌；中皮腫；原発不明転移性扁平上皮性頸部癌；口腔癌；多発性内分泌腫瘍症候群；多発性骨髄腫；多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍；菌状息肉腫；骨髄異形成症候群；骨髄増殖性腫瘍；鼻腔癌；鼻咽頭癌；神経芽細胞腫；非ホジキンリンパ腫；非黒色腫皮膚癌；非小細胞肺癌；口腔癌；口腔癌；口腔咽頭癌；骨肉腫；その他の脳および脊髄の腫瘍；卵巣癌；卵巣上皮癌；卵巣胚細胞腫瘍；卵巣低悪性度腫瘍；膵臓癌；乳頭腫症；副鼻腔癌；副甲状腺癌；骨盤癌；陰茎癌；咽頭癌；中間型松果体実質腫瘍；松果体芽腫；下垂体腫瘍；形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫；胸膜肺芽腫；原発性中枢神経系（CNS）リンパ腫；原発性肝細胞肝癌；前立腺癌；直腸癌；腎臓癌；腎細胞（腎臓）癌；腎細胞癌；気道癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；唾液腺癌；セザリー症候群；小細胞肺癌；小腸癌；軟部組織肉腫；扁平上皮癌；頸部扁平上皮癌；胃癌；テント上原始神経外胚葉性腫瘍；T細胞リンパ腫；精巣癌；咽喉癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺癌；移行上皮癌；腎盂尿管移行上皮癌；絨毛性腫瘍；尿管癌；尿道癌；子宮癌；子宮肉腫；膣癌；外陰癌；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；またはウィルムス腫瘍を含む、本発明1077の方法。
[本発明1079]
癌が前立腺癌を含む、本発明1077の方法。
[本発明1080]
癌が乳癌を含む、本発明1077の方法。
[本発明1081]
本発明1041〜1080のいずれかの方法を実施するための試薬を含むキット。
[本発明1082]
本発明1041〜1080のいずれかの方法を実施するための試薬の使用。
[本発明1083]
試薬が本発明1001〜1033のいずれかのアプタマーを含む、本発明1081のキットまたは本発明1082の使用。
[本発明1084]
生物学的試料中に存在する複数の標的に結合することが可能な、SEQ ID NO: 1〜230810、230811〜230899、230900〜230927、または231018〜241535から選択される複数種のオリゴヌクレオチドを含む、組成物。
[本発明1085]
SEQ ID NO: 1〜230810、230811〜230899、230900〜230927、または231018〜241535から選択されるオリゴヌクレオチドを含む、組成物。
[本発明1086]
SEQ ID NO: 231018〜241535に列挙されるオリゴヌクレオチドの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000個、または全てを含む、本発明1084または1085の組成物。
[本発明1087]
SEQ ID NO: 1〜230810に列挙されるオリゴヌクレオチドの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000個、または全てを含む、本発明1084または1085の組成物。
[本発明1088]
生物学的試料中に存在する複数の標的に結合することが可能な、表23〜24のいずれかに記載される1種または複数種のオリゴヌクレオチドを含む、組成物。
[本発明1089]
表23〜24のいずれかに列挙される1種または複数種のオリゴヌクレオチドを含む、組成物。
[本発明1090]
表23または表24に列挙される1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20種のオリゴヌクレオチドを含む、本発明1088または1089の組成物。
[本発明1091]
微小胞試料を、該微小胞試料中に存在する1種または複数種の標的に結合することが可能な複数種のオリゴヌクレオチドと接触させる工程、該試料の状態を特徴決定することが事前に確認されている、該試料との複合体を形成するオリゴヌクレオチドセットを特定する工程であって、それによって試料の状態を特徴決定する、工程を含む、試験試料の状態を特徴決定するための方法。
[本発明1092]
（a）微小胞試料を複数種のオリゴヌクレオチドと接触させ、該微小胞試料との複合体を形成するオリゴヌクレオチドのセットを単離する工程、
（b）工程（a）で微小胞試料との複合体を形成したオリゴヌクレオチドそれぞれの配列および/またはコピー数を決定する工程であって、それによって試験試料に結合したオリゴヌクレオチドのセットを特定する、工程
を含む、試験試料に結合したオリゴヌクレオチドのセットを特定するための方法。
[本発明1093]
微小胞試料を、非癌試料に由来する微小胞と比較して癌試料に由来する微小胞との複合体を優先的に形成することが事前に確認されている複数種のオリゴヌクレオチドと接触させる工程を含む、癌性であるとしてまたは癌性になりやすいとして試料を診断する方法。
[本発明1094]
特定する工程が、全てもしくは一部のオリゴヌクレオチドの配列決定、全てもしくは一部のオリゴヌクレオチドの増幅、および/またはアレイに対する全てもしくは一部のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを実施することを含む、本発明1091の方法。
[本発明1095]
一段階または複数段階のポジティブ選択またはネガティブ選択を通して複数種のオリゴヌクレオチドが事前に選択され、ポジティブ選択が、試験試料と比較して実質的に類似した特徴を有する試料に対するオリゴヌクレオチドの選択を含み、ネガティブ選択が、試験試料と比較して実質的に異なる特徴を有する試料に対するオリゴヌクレオチドの選択を含む、本発明1092または1093の方法。
[本発明1096]
工程（b）が、ハイスループット配列決定、増幅、またはアレイに対するハイブリダイゼーションを実施することを含む、本発明1092の方法。
[本発明1097]
試料が、癌を有することまたは有しやすいことが疑われる対象に由来する、本発明1092の方法。
[本発明1098]
（a）生物学的試験試料を複数種のオリゴヌクレオチドと接触させる工程；
（b）工程（a）で形成された、複数種のオリゴヌクレオチドのメンバーそれぞれと生物学的試験試料との間の複合体の存在またはレベルを検出する工程；および
（c）工程（b）で検出された存在またはレベルを参照レベルと比較する工程であって、それによって疾患または障害を特徴決定する、工程
を含む、疾患または障害を特徴決定する方法。
[本発明1099]
生物学的試験試料および生物学的対照試料がそれぞれ、組織試料、細胞培養物、または生物学的流体を含む、本発明1098の方法。
[本発明1100]
生物学的流体が体液を含む、本発明1099の方法。
[本発明1101]
体液が、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（CSF）、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液もしくは尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、体毛、涙液、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤胞腔液、または臍帯血を含む、本発明1100の方法。
[本発明1102]
体液が、血液、血清、または血漿を含む、本発明1100の方法。
[本発明1103]
生物学的流体が微小胞を含む、本発明1099の方法。
[本発明1104]
生物学的試験試料を、微小胞の単離前に複数種のオリゴヌクレオチドと接触させる、本発明1103の方法。
[本発明1105]
生物学的試験試料が、単離された微小胞を含む、本発明1103の方法。
[本発明1106]
1種または複数種のアプタマーがポリペプチドまたはその断片に結合する、本発明1098の方法。
[本発明1107]
ポリペプチドまたはその断片が可溶性であるか膜結合性である、本発明1098の方法。
[本発明1108]
ポリペプチドまたはその断片が表3または表4のバイオマーカーを含む、本発明1098の方法。
[本発明1109]
1種または複数種のアプタマーが、生物学的試料中の微小胞表面抗原に結合する、本発明1098または1108の方法。
[本発明1110]
特徴決定が、疾患または障害の診断、予後判定、またはセラノーシスを含む、本発明1098〜1109のいずれかの方法。
[本発明1111]
疾患または障害が、癌、前癌状態、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患もしくは障害、心血管疾患もしくは障害、神経疾患もしくは障害、感染症、または疼痛を含む、本発明1110の方法。
[本発明1112]
状態が疾患または障害である、本発明1091の方法。
[本発明1113]
状態が、癌、前癌状態、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患もしくは障害、心血管疾患もしくは障害、神経疾患もしくは障害、感染症、および/または疼痛を含む、本発明1091の方法。
[本発明1114]
複数種のオリゴヌクレオチドが、正常細胞から流出した微小胞よりも、罹患細胞から流出した微小胞に優先的に結合することが可能である、本発明1092の方法。
[本発明1115]
罹患細胞が、癌、前癌状態、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患もしくは障害、心血管疾患もしくは障害、神経疾患もしくは障害、感染症、または疼痛に関連する、本発明1114の方法。
[本発明1116]
癌が、急性リンパ芽球性白血病；急性骨髄性白血病；副腎皮質癌；AIDS関連癌；AIDS関連リンパ腫；肛門癌；虫垂癌；星状細胞腫；非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍；基底細胞癌；膀胱癌；脳幹神経膠腫；脳腫瘍（脳幹神経膠腫、中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、星状細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、上衣腫、髄芽腫、髄上皮種、中間型松果体実質腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、および松果体芽腫を含む）；乳癌；気管支腫瘍；バーキットリンパ腫；原発不明癌；カルチノイド腫瘍；原発不明癌腫；中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍；中枢神経系胚芽腫；子宮頸癌；小児癌；脊索腫；慢性リンパ球性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖性疾患；結腸癌；結腸直腸癌；頭蓋咽頭腫；皮膚T細胞リンパ腫；内分泌膵島細胞腫瘍；子宮内膜癌；上衣芽腫；上衣腫；食道癌；鼻腔神経芽細胞腫；ユーイング肉腫；頭蓋外胚細胞腫瘍；性腺外胚細胞腫瘍；肝臓外胆管癌；胆嚢癌；胃癌；消化管カルチノイド腫瘍；消化管間質細胞腫瘍；消化管間質腫瘍（GIST）；妊娠性絨毛性腫瘍；神経膠腫；毛様細胞性白血病；頭頸部癌；心臓癌；ホジキンリンパ腫；下咽頭癌；眼内黒色腫；膵島腫瘍；カポジ肉腫；腎臓癌；ランゲルハンス細胞組織球症；喉頭癌；口唇癌；肝臓癌；肺癌；悪性線維性組織球腫；骨癌；髄芽腫；髄上皮種；黒色腫；メルケル細胞癌；メルケル細胞皮膚癌；中皮腫；原発不明転移性扁平上皮性頸部癌；口腔癌；多発性内分泌腫瘍症候群；多発性骨髄腫；多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍；菌状息肉腫；骨髄異形成症候群；骨髄増殖性腫瘍；鼻腔癌；鼻咽頭癌；神経芽細胞腫；非ホジキンリンパ腫；非黒色腫皮膚癌；非小細胞肺癌；口腔癌；口腔癌；口腔咽頭癌；骨肉腫；その他の脳および脊髄の腫瘍；卵巣癌；卵巣上皮癌；卵巣胚細胞腫瘍；卵巣低悪性度腫瘍；膵臓癌；乳頭腫症；副鼻腔癌；副甲状腺癌；骨盤癌；陰茎癌；咽頭癌；中間型松果体実質腫瘍；松果体芽腫；下垂体腫瘍；形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫；胸膜肺芽腫；原発性中枢神経系（CNS）リンパ腫；原発性肝細胞肝癌；前立腺癌；直腸癌；腎臓癌；腎細胞（腎臓）癌；腎細胞癌；気道癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；唾液腺癌；セザリー症候群；小細胞肺癌；小腸癌；軟部組織肉腫；扁平上皮癌；頸部扁平上皮癌；胃癌；テント上原始神経外胚葉性腫瘍；T細胞リンパ腫；精巣癌；咽喉癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺癌；移行上皮癌；腎盂尿管移行上皮癌；絨毛性腫瘍；尿管癌；尿道癌；子宮癌；子宮肉腫；膣癌；外陰癌；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；またはウィルムス腫瘍を含む、本発明1097、1111、1113、または1115の方法。
[本発明1117]
前癌状態がバレット食道を含む、本発明1111、1113、または1115の方法。
[本発明1118]
自己免疫疾患が、炎症性腸疾患（IBD）、クローン病（CD）、潰瘍性大腸炎（UC）、骨盤炎症、血管炎、乾癬、糖尿病、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、重症筋無力症、I型糖尿病、関節リウマチ、乾癬、全身性エリテマトーデス（SLE）、橋本甲状腺炎、グレーヴズ病、強直性脊椎炎 シェーグレン病、CREST症候群、強皮症、リウマチ性疾患、臓器拒絶反応、原発性硬化性胆管炎、または敗血症を含む、本発明1111、1113、または1115の方法。
[本発明1119]
心血管疾患が、アテローム性動脈硬化症、うっ血性心不全、不安定プラーク、脳卒中、虚血、高血圧症、狭窄症、血管閉塞、または血栓性事象を含む、本発明1111、1113、または1115の方法。
[本発明1120]
神経疾患が、多発性硬化症（MS）、パーキンソン病（PD）、アルツハイマー病（AD）、統合失調症、双極性障害、うつ病、自閉症、プリオン病、ピック病、認知症、ハンチントン病（HD）、ダウン症候群、脳血管疾患、ラズムッセン脳炎、ウイルス性髄膜炎、神経精神全身性エリテマトーデス（NPSLE）、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト-ヤコブ病、ゲルストマン-ストロイスラー-シャインカー病、伝達性海綿状脳症、虚血再灌流傷害（例えば脳卒中）、脳損傷、微生物感染、または慢性疲労症候群を含む、本発明1111、1113、または1115の方法。
[本発明1121]
疼痛が、線維筋痛症、慢性神経因性疼痛、または末梢性神経因性疼痛を含む、本発明1111、1113、または1115の方法。
[本発明1122]
感染症が、細菌感染、ウイルス感染、酵母菌感染、ウィップル病、プリオン病、肝硬変、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、HIV、HCV、肝炎、梅毒、髄膜炎、マラリア、結核、インフルエンザを含む、本発明1111、1113、または1115の方法。
[本発明1123]
複数種のオリゴヌクレオチドが本発明1084〜1090のいずれかの組成物を含む、本発明1091〜1122のいずれかの方法。
[本発明1124]
（a）微小胞試料を用いて、複数種のオリゴヌクレオチドの少なくとも1回の（i）ネガティブ選択または（ii）1回のポジティブ選択を実施する工程；
（b）複数種のオリゴヌクレオチドのネガティブ結合物質サブセットまたはポジティブ結合物質サブセットを提供するために、オリゴヌクレオチドのセットを取得する工程であって、複数種のオリゴヌクレオチドのネガティブ結合物質サブセットが微小胞試料に結合せず、かつ複数種のオリゴヌクレオチドのポジティブ結合物質サブセットが微小胞試料に結合する、工程；
（c）ネガティブ結合物質サブセットまたはポジティブ結合物質サブセットを試験試料と接触させる工程；
（d）複数種の溶離オリゴヌクレオチドを提供するために、該試験試料に結合したオリゴヌクレオチドを溶離する工程；および
（e）該複数種の溶離オリゴヌクレオチドのメンバーの配列および/またはコピー数を特定するために、該複数種の溶離オリゴヌクレオチドのハイスループット配列決定を実施する工程
を含む、ハイスループット配列決定を実施する方法。
[本発明1125]
（a）標的試料との複合体を形成することが事前に確認されているオリゴヌクレオチドのセットを提供するために、試料用の複数種のオリゴヌクレオチドを富化する工程；
（b）オリゴヌクレオチドと試験試料との複合体を形成させるために、工程（a）の複数種を試験試料と接触させる工程；
（c）オリゴヌクレオチドの回収されたサブセットを提供するために、工程（b）で複合体を形成したオリゴヌクレオチドを回収する工程；および
（d）ハイスループット配列決定、増幅、またはハイブリダイゼーションによって、該オリゴヌクレオチドの回収されたサブセットのプロファイリングを行う工程であって、それによって試験試料に特異的なオリゴヌクレオチドを特定する、工程
を含む、試験試料に特異的なオリゴヌクレオチドを特定するための方法。
[本発明1126]
試験試料が複数種の微小胞を含む、本発明1125の方法。
[本発明1127]
オリゴヌクレオチドが、RNA、DNA、または両方を含む、本発明1125の方法。
[本発明1128]
少なくとも90%の配列同一性を含むオリゴヌクレオチドのサブセットを特定するためにインフォマティクス解析を実施する工程をさらに含む、本発明1125の方法。
[本発明1129]
本発明1091〜1128のいずれかの方法を実施するための試薬を含むキット。
[本発明1130]
本発明1091〜1080のいずれかの方法を実施するための試薬の使用。
[本発明1131]
試薬が本発明1084〜1090のいずれかのアプタマーを含む、本発明1129のキットまたは本発明1130の使用。
[本発明1132]
生物学的試験試料をアプタマー分子のプールと接触させる工程、該プールを対照生物学的試料または参照生物学的試料に接触させる工程、該試験試料中の成分に結合するが対照試料にも参照試料にも結合しない1種または複数種のアプタマーを特定する工程であって、それによって生物学的試験試料についてのアプタマープロファイルを特定する、工程を含む、生物学的試料についての標的特異的アプタマープロファイルを特定する方法。
[本発明1133]
（a）生物学的対照試料をオリゴヌクレオチドのプールと接触させる工程；
（b）該生物学的対照試料に結合しない、該オリゴヌクレオチドのプールの第1のサブセットを単離する工程；
（c）生物学的試験試料を、該オリゴヌクレオチドのプールの第1のサブセットと接触させる工程；および
（d）該生物学的試験試料に結合する、該オリゴヌクレオチドのプールの第2のサブセットを単離する工程であって、それによってアプタマーのプールを選択する、工程
を含む、アプタマーのプールを選択する方法。
[本発明1134]
オリゴヌクレオチドのプールが少なくとも10 7 、10 8 、10 9 、10 10 、10 11 、10 12 、10 13 、10 14 、10 15 、10 16 、10 17 、または少なくとも10 18 種類のオリゴヌクレオチドを含む、本発明1133の方法。
[本発明1135]
工程（a）〜（d）が少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19回、または少なくとも20回繰り返され、各反復において、工程（d）で選択されたアプタマーのプールが工程（a）でのオリゴヌクレオチドのプールとして使用される、本発明1133の方法。
[本発明1136]
生物学的試験試料および生物学的対照試料が微小胞を含む、本発明1133の方法。
[本発明1137]
生物学的試験試料および任意で生物学的対照試料が体液を含む、本発明1133の方法。
[本発明1138]
体液が、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（CSF）、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液、尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、体毛、涙液、嚢胞液、胸膜液、腹膜液、悪性体液（malignant fluid）、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、または他の洗浄液を含む、本発明1137の方法。
[本発明1139]
生物学的試験試料および任意で生物学的対照試料が細胞培地を含む、本発明1133の方法。
[本発明1140]
生物学的試験試料が罹患試料を含み、かつ生物学的対照試料が非罹患試料を含む、本発明1133の方法。
[本発明1141]
（a）アプタマーのプールを第1の試料由来の微小胞の集団に接触させる工程；
（b）第1の試料由来の微小胞の集団に対する親和性を示すアプタマーのサブプールを富化する工程；
（c）該サブプールを第2の試料由来の微小胞の第2の集団に接触させる工程；および
（d）第2の試料由来の微小胞の第2の集団に対する親和性を示すアプタマーの第2のサブプールを枯渇させる工程であって、それによって第1の試料由来の微小胞の集団に対する優先的親和性を有するアプタマーの群を選択する、工程
を含む、アプタマーの群を選択する方法。
[本発明1142]
第1の試料および/または第2の試料が生物学的流体を含み、任意で、該生物学的流体が、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（CSF）、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液、尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、体毛、涙液、嚢胞液、胸膜液、腹膜液、悪性体液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、または他の洗浄液を含む、本発明1141の方法。
[本発明1143]
第1の試料および/または第2の試料それぞれが、プールされた試料を含む、本発明1141の方法。
[本発明1144]
工程（a）〜（d）が少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20回繰り返され、各反復において、工程（d）で選択されたアプタマーの群が工程（a）でのアプタマーのプールとして使用される、本発明1141の方法。
[本発明1145]
第1の試料および/または第2の試料が、工程（a）〜（d）の繰り返しの前に別の試料と置き換えられる、本発明1141の方法。
[本発明1146]
選択されたアプタマーの群のメンバーを特定する工程をさらに含み、任意で、該特定する工程がハイスループット配列決定によって実施される、本発明1141の方法。
[本発明1147]
第1の試料が罹患試料を含み、かつ第2の試料が対照試料を含み、任意で、該対照試料が非罹患試料である、本発明1141の方法。
[本発明1148]
（a）アプタマー候補のプールを、標的分子を含む試料に接触させる工程；
（b）結合していないアプタマー候補を取り除く工程；
（c）該試料を、該標的分子に対するリガンドと接触させる工程；および
（d）該リガンドとの競合によって該標的分子から分離したアプタマー候補を単離する工程であって、それによって該リガンドと同じ標的に結合するアプタマーの群を選択する、工程
を含む、アプタマーの群を選択する方法。
[本発明1149]
標的分子がタンパク質を含む、本発明1148の方法。
[本発明1150]
タンパク質が微小胞表面抗原である、本発明1149の方法。
[本発明1151]
標的分子が基体につながれている、本発明1148の方法。
[本発明1152]
標的分子が微小胞の表面抗原であり、かつ該微小胞が基体につながれている、本発明1148の方法。
[本発明1153]
リガンドが小分子またはタンパク質を含む、本発明1148の方法。
[本発明1154]
リガンドが抗体を含む、本発明1153の方法。
[本発明1155]
工程（a）〜（d）が少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20回繰り返され、各反復において、工程（d）で単離されたアプタマー候補が工程（a）に投入されるアプタマー候補のプールとして使用される、本発明1148の方法。
[本発明1156]
選択されたアプタマーの群のメンバーを特定する工程をさらに含み、任意で、該特定する工程がハイスループット配列決定によって実施される、本発明1148の方法。
[本発明1157]
第1の試料が罹患試料を含み、かつ第2の試料が対照試料を含み、任意で、該対照試料が非罹患試料である、本発明1148の方法。
[本発明1158]
関心対象の標的に結合する1種または複数種のアプタマーを選択する方法であって、
（a）標的枯渇生物学的試料を形成するために、標的を第1の生物学的試料から分離する工程；
（b）分離した標的を基体につなげる工程；
（c）つながれた標的を、干渉生物学的試料と混合する工程；
（d）（c）からの混合物を出発アプタマーライブラリーと接触させる工程；および
（e）該つながれた標的に優先的に結合するアプタマーライブラリーのメンバーを回収する工程であって、それによって、該標的に結合する1種または複数種のアプタマーを選択する、工程
を含む、方法。
[本発明1159]
基体がビーズまたは平面を含む、本発明1158の方法。
[本発明1160]
干渉生物学的試料が、（a）からの標的枯渇生物学的試料を含む、本発明1158の方法。
[本発明1161]
標的が微小胞を含む、本発明1158の方法。
[本発明1162]
標的が関心対象の微小胞を含み、干渉生物学的試料が非標的微小胞を含む、本発明1158の方法。
[本発明1163]
工程（c）の前に、非標的微小胞が、標的微小胞と異なる基体につながれている、本発明1158の方法。
[本発明1164]
基体が磁気ビーズを含み、かつ異なる基体が非磁気ビーズを含むか、または基体が非磁気ビーズを含み、かつ異なる基体が磁気ビーズを含む、本発明1158の方法。
[本発明1165]
第1の生物学的試料および/または干渉生物学的試料が体液を含み、任意で、生物学的流体が、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（CSF）、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液、尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、体毛、涙液、嚢胞液、胸膜液、腹膜液、悪性体液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、または他の洗浄液を含む、本発明1158の方法。
[本発明1166]
第1の生物学的試料が罹患試料を含み、かつ干渉生物学的試料が非罹患試料を含む、本発明1158の方法。
[本発明1167]
第1の生物学的試料が非罹患試料を含み、かつ干渉生物学的試料が罹患試料を含む、本発明1158の方法。
[本発明1168]
（a）参照微小胞集団を、1種または複数種の微小胞表面マーカーに結合することが可能な複数種のリガンドと接触させる工程；
（b）該参照微小胞集団に対する親和性を有しない複数種のリガンドのサブセットを含む複数種の参照リガンドを単離する工程；
（c）1種または複数種の試験微小胞を、該複数種の参照リガンドと接触させる工程；および
（d）該複数種の参照リガンドから、該1種または複数種の試験微小胞上の表面マーカーとの複合体を形成するリガンドのサブセットを特定する工程であって、それによって該複数種の標的リガンドを特定する、工程
を含む、複数種の標的リガンドを特定するための方法。
[本発明1169]
標的微小胞の表面マーカーを特定する工程をさらに含む、本発明1168の方法。
[本発明1170]
複数種のリガンドがアプタマーおよび/または抗体を含む、本発明1168の方法。
[本発明1171]
（a）候補アプタマーのプールを、関心対象の標的を含まない1種または複数種のアッセイ成分と接触させる工程；
（b）（a）で1種または複数種のアッセイ成分に結合しない該候補アプタマーのプールのメンバーを回収する工程；
（c）1種または複数種の交絡する（confounding）標的の存在下で、工程（b）で回収された候補アプタマーのプールのメンバーを関心対象の標的と接触させる工程；および
（d）工程（c）で関心対象の標的に結合する候補アプタマーを回収する工程であって、それによって関心対象の標的に特異的なアプタマーを特定する、工程
を含む、関心対象の標的に特異的なアプタマーを特定する方法。
[本発明1172]
工程（c）が実施される前に、工程（a）〜（b）が少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19回、または少なくとも20回繰り返される、本発明1171の方法。
[本発明1173]
関心対象の標的に特異的なアプタマーを特定する工程の前に、工程（c）〜（d）が少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19回、または少なくとも20回繰り返される、本発明1171の方法。
[本発明1174]
候補アプタマーのプールが少なくとも10 6 、10 7 、10 8 、10 9 、10 10 、10 11 、10 12 、10 13 、10 14 、10 15 、10 16 、10 17 、または少なくとも10 18 種の核酸配列を含む、本発明1171の方法。
[本発明1175]
1種または複数種のアッセイ成分が、基体、ビーズ、平面アレイ、カラム、チューブ、ウェル、またはフィルタの1つまたは複数を含む、本発明1171の方法。
[本発明1176]
関心対象の標的および1種または複数種の交絡する標的がタンパク質を含む、本発明1171の方法。
[本発明1177]
関心対象の標的および1種または複数種の交絡する標的が微小胞を含む、本発明1171の方法。
[本発明1178]
関心対象の標的および1種または複数種の交絡する標的が1種または複数種の微小胞表面抗原を含む、本発明1171の方法。
[本発明1179]
1種または複数種の微小胞表面抗原が、表3、4、および26から選択される、本発明1178の方法。
[本発明1180]
関心対象の標的が、SSX4、SSX2、PBP、KLK2、SPDEFからなる群より選択されたタンパク質であり、1種または複数種の交絡する標的が該群の他のメンバーを含む、本発明1171の方法。
[本発明1181]
1種または複数種の微小胞表面抗原が疾患または障害のバイオマーカーである、本発明1178の方法。
[本発明1182]
疾患が、癌、前癌状態、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患もしくは障害、心血管疾患もしくは障害、神経疾患もしくは障害、感染症、または疼痛を含む、本発明1140、1147、1157、1166、1167、または1178の方法。
[本発明1183]
癌が、急性リンパ芽球性白血病；急性骨髄性白血病；副腎皮質癌；AIDS関連癌；AIDS関連リンパ腫；肛門癌；虫垂癌；星状細胞腫；非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍；基底細胞癌；膀胱癌；脳幹神経膠腫；脳腫瘍（脳幹神経膠腫、中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、星状細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、上衣腫、髄芽腫、髄上皮種、中間型松果体実質腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、および松果体芽腫を含む）；乳癌；気管支腫瘍；バーキットリンパ腫；原発不明癌；カルチノイド腫瘍；原発不明癌腫；中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍；中枢神経系胚芽腫；子宮頸癌；小児癌；脊索腫；慢性リンパ球性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖性疾患；結腸癌；結腸直腸癌；頭蓋咽頭腫；皮膚T細胞リンパ腫；内分泌膵島細胞腫瘍；子宮内膜癌；上衣芽腫；上衣腫；食道癌；鼻腔神経芽細胞腫；ユーイング肉腫；頭蓋外胚細胞腫瘍；性腺外胚細胞腫瘍；肝臓外胆管癌；胆嚢癌；胃癌；消化管カルチノイド腫瘍；消化管間質細胞腫瘍；消化管間質腫瘍（GIST）；妊娠性絨毛性腫瘍；神経膠腫；毛様細胞性白血病；頭頸部癌；心臓癌；ホジキンリンパ腫；下咽頭癌；眼内黒色腫；膵島腫瘍；カポジ肉腫；腎臓癌；ランゲルハンス細胞組織球症；喉頭癌；口唇癌；肝臓癌；肺癌；悪性線維性組織球腫；骨癌；髄芽腫；髄上皮種；黒色腫；メルケル細胞癌；メルケル細胞皮膚癌；中皮腫；原発不明転移性扁平上皮性頸部癌；口腔癌；多発性内分泌腫瘍症候群；多発性骨髄腫；多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍；菌状息肉腫；骨髄異形成症候群；骨髄増殖性腫瘍；鼻腔癌；鼻咽頭癌；神経芽細胞腫；非ホジキンリンパ腫；非黒色腫皮膚癌；非小細胞肺癌；口腔癌；口腔癌；口腔咽頭癌；骨肉腫；その他の脳および脊髄の腫瘍；卵巣癌；卵巣上皮癌；卵巣胚細胞腫瘍；卵巣低悪性度腫瘍；膵臓癌；乳頭腫症；副鼻腔癌；副甲状腺癌；骨盤癌；陰茎癌；咽頭癌；中間型松果体実質腫瘍；松果体芽腫；下垂体腫瘍；形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫；胸膜肺芽腫；原発性中枢神経系（CNS）リンパ腫；原発性肝細胞肝癌；前立腺癌；直腸癌；腎臓癌；腎細胞（腎臓）癌；腎細胞癌；気道癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；唾液腺癌；セザリー症候群；小細胞肺癌；小腸癌；軟部組織肉腫；扁平上皮癌；頸部扁平上皮癌；胃癌；テント上原始神経外胚葉性腫瘍；T細胞リンパ腫；精巣癌；咽喉癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺癌；移行上皮癌；腎盂尿管移行上皮癌；絨毛性腫瘍；尿管癌；尿道癌；子宮癌；子宮肉腫；膣癌；外陰癌；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；またはウィルムス腫瘍を含む、本発明1182の方法。
[本発明1184]
前癌状態がバレット食道を含む、本発明1182の方法。
[本発明1185]
自己免疫疾患が、炎症性腸疾患（IBD）、クローン病（CD）、潰瘍性大腸炎（UC）、骨盤炎症、血管炎、乾癬、糖尿病、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、重症筋無力症、I型糖尿病、関節リウマチ、乾癬、全身性エリテマトーデス（SLE）、橋本甲状腺炎、グレーヴズ病、強直性脊椎炎 シェーグレン病、CREST症候群、強皮症、リウマチ性疾患、臓器拒絶反応、原発性硬化性胆管炎、または敗血症を含む、本発明1182の方法。
[本発明1186]
心血管疾患が、アテローム性動脈硬化症、うっ血性心不全、不安定プラーク、脳卒中、虚血、高血圧症、狭窄症、血管閉塞、または血栓性事象を含む、本発明1182の方法。
[本発明1187]
神経疾患が、多発性硬化症（MS）、パーキンソン病（PD）、アルツハイマー病（AD）、統合失調症、双極性障害、うつ病、自閉症、プリオン病、ピック病、認知症、ハンチントン病（HD）、ダウン症候群、脳血管疾患、ラズムッセン脳炎、ウイルス性髄膜炎、神経精神全身性エリテマトーデス（NPSLE）、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト-ヤコブ病、ゲルストマン-ストロイスラーシャインカー病、伝達性海綿状脳症、虚血再灌流傷害（例えば脳卒中）、脳損傷、微生物感染、または慢性疲労症候群を含む、本発明1182の方法。
[本発明1188]
疼痛が、線維筋痛症、慢性神経因性疼痛、または末梢性神経因性疼痛を含む、本発明1182の方法。
[本発明1189]
感染症が、細菌感染、ウイルス感染、酵母菌感染、ウィップル病、プリオン病、肝硬変、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、HIV、HCV、肝炎、梅毒、髄膜炎、マラリア、結核、インフルエンザを含む、本発明1182の方法。
[本発明1190]
複数種の細胞外微小胞を、ランダムに生成された結合物質のライブラリーと接触させる工程、細胞外微小胞の1種または複数種の成分に対する親和性を有する結合物質のライブラリーのサブセットを特定する工程を含む、結合物質を特定するための方法。
[本発明1191]
結合物質がアプタマーおよび/または抗体を含む、本発明1190の方法。
[本発明1192]
試験生物学的試料を、本発明1158に従属する本発明1158〜1189のいずれかの標的に結合する1種または複数種のアプタマーと接触させる工程を含む、表現型を特徴決定する方法。
[本発明1193]
表現型の特徴決定が、本発明1182〜1189のいずれかの疾患または障害を検出する工程を含む、本発明1192の方法。
[本発明1194]
選択されたアプタマーの1種または複数種の標的を特定する工程をさらに含む、本発明1132〜1191のいずれかの方法。
[本発明1195]
本発明1132〜1194のいずれかの方法を実施するための試薬を含むキット。
[本発明1196]
本発明1132〜1194のいずれかの方法を実施するための試薬の使用。
[本発明1197]
（a）微小胞の表面抗原を含む標的を結合物質と結合させるために、結合物質を該標的と接触させる工程；
（b）標的と結合物質との結合を分断しない条件下で、微小胞を分断する工程；
（c）標的と結合物質との間の複合体を単離する工程；および
（d）結合物質に結合された標的を特定する工程
を含む、結合物質の標的を特定する方法。
[本発明1198]
結合物質が本発明1132〜1194のいずれかの方法によって特定されたアプタマーを含む、本発明1197の方法。
[本発明1199]
結合物質が本発明1190の方法によって特定される、本発明1197の方法。
[本発明1200]
結合物質が本発明1168〜1170のいずれかの方法によって特定されたリガンドを含む、本発明1197の方法。
[本発明1201]
標的が、タンパク質、核酸、脂質、または糖質を含む、本発明1197の方法。
[本発明1202]
工程（b）の前に標的が結合物質に架橋している、本発明1197の方法。
[本発明1203]
架橋が、光架橋、イミドエステル架橋剤、ジメチルスベリミダート、N-ヒドロキシスクシンイミド-エステル架橋剤、ビススルホスクシンイミジルスベラート（BS3）、アルデヒド、アクロレイン、クロトンアルデヒド、ホルムアルデヒド、カルボジイミド架橋剤、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DDC）、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）、1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩（EDCまたはEDAC）、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート（SMCC）およびスルホスクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート（Sulfo-SMCC）、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジル-2-(6-[ビオチンアミド]-2-(p-アジドベンズアミド)-ヘキサノアミド)エチル-1,3'-ジチオプロプリオナート（Sulfo-SBED）、2-[N2-(4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロベンゾイル)-N6-(6-ビオチン-アミドカプロイル)-L-リシニル]エチルメタンチオスルホナート（Mts-Atf-Biotin）、2-{N2-[N6-(4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロベンゾイル-6-アミノ-カプロイル)-N6-(6-ビオチンアミドカプロイル)-L-リシニルアミド]}エチルメタンチオスルホナート（Mts-Atf-LC-Biotin）、光反応性アミノ酸、L-Photo-Leucine、L-Photo-Methionine、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）架橋剤、NHS-アジド試薬、NHS-アジド、NHS-PEG4-アジド、NHS-PEG12-アジド、NHS-ホスフィン試薬、NHS-ホスフィン、スルホ-NHS-ホスフィン、またはこれらの任意の組み合わせもしくは修飾を含む、本発明1202の方法。
[本発明1204]
工程（b）での微小胞の分断が、洗浄剤、界面活性剤、溶解剤、酵素、機械的せん断、ビーズミリング、ホモジネーション、マイクロ流体化、音波処理、フレンチプレス、衝突、コロイドミル、減圧、浸透圧性ショック、熱分解、凍結融解、および乾燥の1つまたは複数の使用を含む、本発明1197の方法。
[本発明1205]
酵素が、リゾチーム、リソスタフィン、ザイモラーゼ、セルラーゼ、ムタノリシン、グリカナーゼ、プロテアーゼ、およびマンナーゼの1つまたは複数を含む、本発明1204の方法。
[本発明1206]
洗浄剤が、オクチルチオグルコシド（OTG）、オクチルβ-グルコシド（OG）、非イオン性洗浄剤、Triton X、Tween 20、脂肪アルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、セトステアリルアルコール、オレイルアルコール、ポリオキシエチレングリコールアルキルエーテル（Brij）、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ポリオキシプロピレングリコールアルキルエーテル、グルコシドアルキルエーテル、デシルグルコシド、ラウリルグルコシド、オクチルグルコシド、ポリオキシエチレングリコールオクチルフェノールエーテル、ポリオキシエチレングリコールアルキルフェノールエーテル、ノノキシノール-9、グリセロールアルキルエステル、グリセリルラウラート、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル、ポリソルベート、ソルビタンアルキルエステル、コカミドMEA、コカミドDEA、ドデシルジメチルアミンオキシド、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのブロックコポリマー、ポロキサマー、ポリエトキシル化タローアミン（POEA）、両性イオン性洗浄剤、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホナート（CHAPS）、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩（LAS）、アルキルフェノールエトキシラート（APE）、コカミドプロピルヒドロキシスルタイン、ベタイン、コカミドプロピルベタイン、レシチン、イオン性洗浄剤、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、臭化セトリモニウム（CTAB）、塩化セチルトリメチルアンモニウム（CTAC）、オクテニジン二塩酸塩、塩化セチルピリジニウム（CPC）、塩化ベンザルコニウム（BAC）、塩化ベンゼトニウム （BZT）、5-ブロモ-5-ニトロ-1,3-ジオキサン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムクロリド、ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド（DODAB）、デオキシコール酸ナトリウム、ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール（TergitolタイプNP-40；NP-40）、ラウリル硫酸アンモニウム、ラウレス硫酸ナトリウム（ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（SLES））、ミレス硫酸ナトリウム、アルキルカルボン酸塩、ステアリン酸ナトリウム、ナトリウムラウロイルサルコシナート、カルボン酸塩をベースにしたフッ素系界面活性剤、ペルフルオロノナン酸、ペルフルオロオクタン酸（PFOAまたはPFO）、および生物系界面活性剤の1つまたは複数を含む、本発明1204の方法。
[本発明1207]
結合物質が基体につながれている、本発明1197の方法。
[本発明1208]
基体がミクロスフェアを含む、本発明1207の方法。
[本発明1209]
基体が平面の基体を含む、本発明1207の方法。
[本発明1210]
結合物質が標識されている、本発明1197の方法。
[本発明1211]
標的と結合物質との間の複合体を単離する工程が、該標識を介して結合物質を捕捉することを含む、本発明1210の方法。
[本発明1212]
標識がビオチン標識を含む、本発明1210の方法。
[本発明1213]
標的がタンパク質を含み、かつ該標的を特定する工程が、質量分析（MS）、ペプチドマスフィンガープリンティング（PMF；タンパク質フィンガープリンティング）、配列決定、N末端アミノ酸解析、C末端アミノ酸解析、エドマン分解、クロマトグラフィー、電気泳動、二次元ゲル電気泳動（2Dゲル）、抗体アレイ、およびイムノアッセイの使用を含む、本発明1197の方法。
[本発明1214]
本発明1197〜1213のいずれかの方法を実施するための試薬を含むキット。
[本発明1215]
1種または複数種の試薬が、本発明1132〜1194のいずれかの方法によって特定されたアプタマーを含む、本発明1214のキット。
[本発明1216]
SEQ ID NO: 230938〜231008のいずれかからなる群より選択された配列に対して少なくとも50、60、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100%相同である配列を含む、核酸。
[本発明1217]
SEQ ID NO: 230938〜231008のいずれかからなる群より選択された配列を含む、核酸。
[本発明1218]
SEQ ID NO: 230938〜231008のいずれかからなる群より選択された配列に対して少なくとも50、60、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100%相同である配列を含む、単離された核酸。
[本発明1219]
SEQ ID NO: 230938〜231008のいずれかからなる群より選択された配列を含む、単離された核酸。
[本発明1220]
少なくとも1つの化学修飾を含むようにさらに改変されている、本発明1216〜1219のいずれかの核酸。
[本発明1221]
前記修飾が、核酸の、糖位置での化学的置換；リン酸位置での化学的置換；および塩基位置での化学的置換からなる群より選択される、本発明1220の核酸。
[本発明1222]
前記修飾が、修飾されたヌクレオチドの取込み、3'のキャッピング、ビオチン化、アミンリンカーへの結合、高分子量の非免疫原性化合物への結合、親油性化合物への結合からなる群より選択される、本発明1220の核酸。
[本発明1223]
非免疫原性の高分子量化合物がポリアルキレングリコールである、本発明1222の核酸。
[本発明1224]
ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである、本発明1223の核酸。
[本発明1225]
本発明1216〜1224のいずれかの核酸を含む組成物。
[本発明1226]
本発明1216〜1225のいずれかの核酸または組成物を含む、キット。
[本発明1227]
基体に結合した非標的結合核酸を含む陰性対照組成物。
[本発明1228]
非標的結合核酸が基体に共有結合している、本発明1227の陰性対照組成物。
[本発明1229]
非標的結合核酸が基体に非共有結合的に結合している、本発明1227の陰性対照組成物。
[本発明1230]
非標的結合核酸が、本発明1216〜1224のいずれかから選択される核酸を含む、本発明1227の陰性対照組成物。
[本発明1231]
非標的結合核酸が、スクランブルされたSEQ ID NO: 1〜241535のいずれかの配列またはこれらの機能的断片を含む、本発明1227の陰性対照組成物。
[本発明1232]
生物学的実体を含むことが疑われる生物学的試料中の該生物学的実体の存在またはレベルを検出する方法であって、
（a）基体および本発明1227〜1230のいずれかの陰性対照組成物を含む組成物を提供する工程であって、該基体が、生物学的実体に対する1種または複数種の結合物質を含む、工程；
（b）生物学的試料を、工程（a）で提供された組成物と接触させる工程；
（c）工程（b）において1種または複数種の結合物質によって認識された生物学的実体の量に対応する標的シグナルを検出する工程；ならびに
（d）工程（c）で検出された標的シグナルを、陰性対照組成物によって生じたシグナルの量に対応する対照シグナルに対して正規化する工程であって、それによって該生物学的試料中の該生物学的実体の存在またはレベルを検出する、工程
を含む、方法。
[本発明1233]
標的シグナルの正規化が、標的シグナルから対照シグナルを差し引くことを含む、本発明1232の方法。
[本発明1234]
1種または複数種の結合物質が抗体またはアプタマーを含む、本発明1232の方法。
[本発明1235]
生物学的実体がタンパク質を含む、本発明1232の方法。
[本発明1236]
生物学的実体が微小胞を含む、本発明1232の方法。
[本発明1237]
1種または複数種の結合物質が微小胞表面抗原に特異的である、本発明1236の方法。
[本発明1238]
微小胞表面抗原が、表3〜4、または26から選択される、本発明1237の方法。
[本発明1239]
微小胞表面抗原が疾患または障害のバイオマーカーである、本発明1237の方法。
[本発明1240]
疾患または障害の診断、予後判定、またはセラノーシスを提供する、本発明1239の方法。
[本発明1241]
本発明1232〜1240のいずれかの方法を実施するための試薬を含むキット。
[本発明1242]
1種または複数種の試薬が、1種または複数種のアプタマーおよび基体を含む、本発明1241のキット。
[本発明1243]
非標的結合核酸を含む、ブロッキング組成物。
[本発明1244]
非標的結合核酸が本発明1216〜1224のいずれかから選択される核酸を含む、本発明1243のブロッキング組成物。
[本発明1245]
ウシ血清アルブミン（BSA）、カゼイン、pepticase、非イオン性界面活性剤、Tween（登録商標）20、Triton（登録商標）X-100、非反応性抗体またはその断片、FSG（魚皮ゼラチン）、純粋なゼラチン、ゼラチンヒドロラーゼ、ポリエチレングリコール（PEG）、非反応性血清、および非反応性タンパク質からなる群より選択される1種または複数種の成分をさらに含む、本発明1243のブロッキング組成物。
[本発明1246]
生物学的実体を含むことが疑われる生物学的試料中の該生物学的実体の存在またはレベルを検出する方法であって、
（a）基体を、本発明1243〜1245のいずれかのブロッキング組成物と接触させる工程であって、該基体が、生物学的実体に対する1種または複数種の結合物質を含む、工程；
（b）生物学的試料を、工程（a）で提供されたブロッキングされた基体と接触させる工程；および
（c）工程（b）で生物学的実体が1種または複数種の結合物質によって認識されたかどうか検出する工程であって、それによって該生物学的試料中の該生物学的実体の存在またはレベルを検出する、工程
を含む、方法。
[本発明1247]
1種または複数種の結合物質が抗体またはアプタマーを含む、本発明1246の方法。
[本発明1248]
生物学的実体がタンパク質を含む、本発明1246の方法。
[本発明1249]
生物学的実体が微小胞を含む、本発明1246の方法。
[本発明1250]
1種または複数種の結合物質が微小胞表面抗原に特異的である、本発明1249の方法。
[本発明1251]
微小胞表面抗原が、表3、4、または26から選択される、本発明1250の方法。
[本発明1252]
微小胞表面抗原が疾患または障害のバイオマーカーである、本発明1250の方法。
[本発明1253]
疾患または障害の診断、予後判定、またはセラノーシスを提供する、本発明1252の方法。
[本発明1254]
本発明1246〜1253のいずれかの方法を実施するための試薬を含むキット。
[本発明1255]
1種または複数種の試薬が、1種または複数種のアプタマーおよび基体を含む、本発明1254のキット。
[本発明1256]
官能基に特異的に結合するアプタマー。
[本発明1257]
官能基が、炭化水素、ハロゲン、酸素を含む基（すなわちC-O結合）、窒素を含む基、硫黄を含む基、リンを含む基、またはホウ素を含む基からなる群より選択される、本発明1256のアプタマー。
[本発明1258]
炭化水素が、アルカン、アルケン、アルキン、ベンゼン誘導体、トルエン誘導体、分枝または環状アルカン、カルボカチオン、およびカルボアニオンからなる群より選択される、本発明1257のアプタマー。
[本発明1259]
ハロゲンが、ハロアルカン、フルオロアルカン、クロロアルカン、ブロモアルカン、およびヨードアルカンからなる群より選択される、本発明1257のアプタマー。
[本発明1260]
酸素を含む基が、アルコール、ケトン、アルデヒド、ハロゲン化アシル、カルボナート、カルボキシラート、カルボン酸、エステル、ヒドロペルオキシド、エーテル、ヘミアセタール、ヘミケタール、アセタール、ケタール、オルトエステル、およびオルトカルボナートからなる群より選択される、本発明1257のアプタマー。
[本発明1261]
窒素を含む基が、アミド、アミン、イミン、イミド、アジド、アゾ化合物、シアナート、ニトラート、ニトリル、ニトライト、ニトロ化合物、ニトロソ化合物、およびピリジン誘導体からなる群より選択される、本発明1257のアプタマー。
[本発明1262]
硫黄を含む基が、チオール、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、硫酸、スルホン酸、チオシアナート、イソチアナート、チオン、およびチアールからなる群より選択される、本発明1257のアプタマー。
[本発明1263]
リンを含む基が、ホスフィン、ホスファン、ホスホン酸、ホスファート、およびホスホジエステルからなる群より選択される、本発明1257のアプタマー。
[本発明1264]
ホウ素を含む基が、ボロン酸、ボロン酸エステル、ボリン酸、およびボリン酸エステルからなる群より選択される、本発明1257のアプタマー。
[本発明1265]
官能基が、アセタール、アシル基、ハロゲン化アシル、アルケニル基、アルコキシド、アルコキシ基、アルキニル基、アミド、アミンオキシド、アミン、カルボジイミド、カルボキシミダート、カルボン酸、シアナミド、シアナート、ジチオカルバマート、エノール、エステル、エーテル、ヒドラジン、ヒドラゾン、ヒドロキサム酸、イミド、イソシアナート、イソシアニド、イソチオシアナート、ケタール、ケテン、ケトン、脱離基、ニトリル、有機ハロゲン化物、有機リン、オルトエステル、オキシム、ホスホノフルオリダート、ホスホノチオアート、ホスホルアミドチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロフルオリダート、ホスホロチオアート、保護基、ピロホスファート、セミカルバジド、セミカルバゾン、スルファマート、スルホン酸エステル、スルホン、スルホン酸、スルホニル基、スルホキシイミン、スルフリル化合物、チオアミド、チオシアナート、チオエステル、チオラート、チオン、チオホスホリル化合物、およびチオスルフィナートからなる群より選択される、本発明1256のアプタマー。
[本発明1266]
官能基が、アセタール、アセトキシ基、アセチリド、酸無水物、活性化基、塩化アシル、ハロゲン化アシル、アシラール、アシロイン、アシルシラン、アルコール、アルデヒド、アルジミン、アルカン、アルケン、アルコキシド、アルキルシクロアルカン、亜硝酸アルキル、アルキン、アレン、アミド、アミジン、アミナール、アミンオキシド、アジド、アジン、アジリジン、アゾキシ、二官能性、ビスチオセミカルバゾン、ビウレット、ボロン酸、カルバマート、カルバミノ、カルバジド、カルベン、カルビノール、炭酸エステル、カルボニル、カルボキサミド、カルボキシミダート、カルボン酸、クロロホルマート、クムレン、シアン酸エステル、シアニミド、シアノヒドリン、不活性化基、デプシド、ジアゾ、ジオール、ジチオカルバマート、エナミン、エンジイン、エノール、エノールエーテル、エノン、エニン、エピスルフィド、エポキシド、エステル、エーテル、フルオロスルホナート、ハロヒドリン、ハロケトン、ヘミアセタール、ヘミアミナール、ヘミチオアセタール、ヒドラジド、ヒドラゾン、ヒドロキサム酸、ヒドロキシル、ヒドロキシルアミン、イミン、イミニウム、イソチオウロニウム、ケテン、ケテンイミン、ケトン、ケチル、ラクタム、ラクトール、ラクトン、メチン、メチル基、ニトラート、ニトリルイリド、ニトリルイミン、ニトロ化合物、ニトロアミン、ニトロナート、ニトロン、ニトロニウムイオン、ニトロソアミン、ニトロソ、オルトエステル、オサゾン、オキサジリジン、オキシム、n-オキソアンモニウム塩、ペルオキシド、ペルオキシ酸、パーシステントカルベン、フェノール、ホスファアルケン、ホスファアルキン、ホスファート、ホスフィナート、ホスフィン、ホスフィンオキシド、ホスフィニト、ホスホナート、ホスホニト、ホスホニウム、ホスホラン、s-ニトロソチオール、シッフ塩基、セレノール、セレノン酸、セロン、セミカルバジド、セミカルバゾン、シリルエノールエーテル、シリルエーテル、スルフェンアミド、スルフェン酸、塩化スルフェニル、スルフィド、スルフィルイミン、スルフィンアミド、スルフィン酸、亜硫酸エステル、スルホンアミド、スルホンアニリド、スルホナート、スルホニル、ハロゲン化スルホニル、スルホキシド、スルフリル、スルトン、テルロール、チアール、チオアセタール、チオアミド、チオカルバマート、チオカルボキシ、チオシアナート、チオエステル、チオエーテル、チオケタール、チオケトン、チオール、チオラクトン、チオ尿素、トシルヒドラゾン、トリアゼン、トリオール、尿素、バニリル、キサンタート、イリド、およびイノラートからなる群より選択される、本発明1256のアプタマー。
[本発明1267]
官能基が、カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシル基、ヒドラジド基、および/またはクロロメチル基を含む、本発明1256のアプタマー。
[本発明1268]
官能基がカルボキシル基を含む、本発明1256のアプタマー。
[本発明1269]
本発明1216〜1224のいずれかから選択される核酸を含む、本発明1256〜1267のアプタマー。
[本発明1270]
本発明1256〜1269のいずれかのアプタマーおよび基体を含む、組成物。
[本発明1271]
基体が平面の基体を含む、本発明1270の組成物。
[本発明1272]
基体がミクロスフェアを含む、本発明1270の組成物。
[本発明1273]
基体が、カルボキシル修飾、アミノ修飾、ヒドロキシル修飾、ヒドラジド修飾、クロロメチル修飾、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される1つまたは複数の修飾を含む、本発明1270の組成物。
[本発明1274]
基体がカルボキシル基を含む、本発明1270の組成物。
[本発明1275]
アプタマーがカルボキシル基に結合している、本発明1273の組成物。
[本発明1276]
基体が結合物質を含む、本発明1270の組成物。
[本発明1277]
結合物質が抗体またはアプタマーを含む、本発明1276の組成物。
[本発明1278]
微小胞をさらに含む、本発明1270の組成物。
[本発明1279]
本発明1256〜1278のいずれかのアプタマーまたは組成物を含む、キット。
[本発明1280]
本発明1256〜1269のいずれかのアプタマーを基体と接触させる工程を含む、方法。
[本発明1281]
基体が平面の基体である、本発明1280の方法。
[本発明1282]
基体がミクロスフェアである、本発明1280の方法。
[本発明1283]
基体が、カルボキシル修飾、アミノ修飾、ヒドロキシル修飾、ヒドラジド修飾、クロロメチル修飾、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される1つまたは複数の修飾を含む、本発明1280の方法。
[本発明1284]
基体がカルボキシル基を含む、本発明1280の方法。
[本発明1285]
アプタマーがカルボキシル基に結合している、本発明1283の方法。
[本発明1286]
基体が結合物質を含む、本発明1280の方法。
[本発明1287]
結合物質が抗体またはアプタマーを含む、本発明1286の方法。
[本発明1288]
基体を結合物質の標的と接触させる工程をさらに含む、本発明1286の方法。
[本発明1289]
本発明1280〜1288のいずれかの方法を実施するための試薬を含み、任意で、1種または複数種のアプタマーおよび基体を含む、キット。
[本発明1290]
生物学的実体を含むことが疑われる生物学的試料中の該生物学的実体の存在またはレベルを検出する方法であって、
（a）カルボキシル化された基体に付着した生物学的実体に特異的な1種または複数種の結合物質を含む組成物を提供する工程であって、該カルボキシル化された基体が、本発明1256〜1269のいずれかのアプタマーと結合している、工程；
（b）生物学的試料を、工程（a）で提供された組成物と接触させる工程；および
（c）工程（b）で生物学的実体が1種または複数種の結合物質によって認識されたかどうかを検出する工程であって、それによって該生物学的試料中の該生物学的実体の存在またはレベルを検出する、工程
を含む、方法。
[本発明1291]
1種または複数種の結合物質が抗体またはアプタマーを含む、本発明1290の方法。
[本発明1292]
生物学的実体がタンパク質を含む、本発明1290の方法。
[本発明1293]
生物学的実体が微小胞を含む、本発明1290の方法。
[本発明1294]
1種または複数種の結合物質が微小胞表面抗原に特異的である、本発明1290の方法。
[本発明1295]
微小胞表面抗原が、表3、4、または26から選択される、本発明1294の方法。
[本発明1296]
微小胞表面抗原が疾患または障害のバイオマーカーである、本発明1294の方法。
[本発明1297]
疾患または障害の診断、予後判定、またはセラノーシスを提供する、本発明1295の方法。
[本発明1298]
本発明1290〜1297のいずれかの方法を実施するための試薬を含むキットであって、任意で、1種または複数種の該試薬が1種または複数種のアプタマーおよび基体を含む、キット。
[本発明1299]
（a）基体を、カルボキシル基に結合することが可能なアプタマーと接触させる工程であって、該基体が、1種または複数種の選択された核酸またはポリペプチド分子も含む、工程；および（b）基体を、該核酸またはポリペプチド分子に結合することが可能な結合物質と接触させる工程であって、それによって、カルボキシル基に結合したアプタマーが、該核酸またはポリペプチド分子に対する結合物質の結合を増強する、工程
を含む、結合を増強するための方法。
[本発明1300]
アプタマーが、本発明1256〜1269のいずれかのアプタマーである、本発明1299の方法。
[本発明1301]
基体が平面の基体である、本発明1299の方法。
[本発明1302]
基体がミクロスフェアである、本発明1299の方法。
[本発明1303]
核酸またはポリペプチドが、アミド結合を介してカルボキシル基に共有結合している、本発明1299の方法。
[本発明1304]
基体が結合物質を含む、本発明1299の方法。
[本発明1305]
本発明1299〜1304のいずれかの方法を実施するための試薬を含むキットであって、任意で、1種または複数種の該試薬が1種または複数種のアプタマーおよび基体を含む、キット。
[本発明1306]
（a）基体-生物学的試料複合体を形成させるために、基体を生物学的試料と接触させる工程；
（b）基体-生物学的試料複合体を複数種の候補結合物質と接触させる工程；および
（c）基体-生物学的試料複合体と結合する複数種の候補結合物質の1つまたは複数のメンバーを特定する工程であって、それによって1種または複数種の結合物質を選択する、工程
を含む、1種または複数種の結合物質を選択する方法。
[本発明1307]
1種または複数種の結合物質が、核酸、DNA分子、RNA分子、抗体、抗体複合体、抗体断片、アプタマー、ペプトイド、zDNA、ペプチド核酸（PNA）、ロックド核酸（LNA）、レクチン、ポリペプチド、ペプチド、デンドリマー、膜タンパク質標識剤、化学物質、またはこれらの組み合わせを含む、本発明1306の方法。
[本発明1308]
生物学的試料が組織試料または細胞培養物試料を含む、本発明1306の方法。
[本発明1309]
生物学的試料が体液を含み、任意で、体液が、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（CSF）、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液もしくは尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、体毛、涙液、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤胞腔液、臍帯血、またはこれらのいずれかの派生物を含む、本発明1306の方法。
[本発明1310]
生物学的試料が、濃縮血漿試料、血清試料、浄化血清試料、または浄化血漿試料を含む、本発明1306の方法。
[本発明1311]
生物学的試料が異種微小胞集団または同種微小胞集団を含む、本発明1306〜1310のいずれかの方法。
[本発明1312]
浄化血清または浄化血漿試料が、非浄化対照試料と比較して低下したレベルの、1種または複数種の高存在量タンパク質を有する、本発明1311の方法。
[本発明1313]
1種または複数種の高存在量タンパク質が血液タンパク質を含む、本発明1312の方法。
[本発明1314]
1種または複数種の高存在量タンパク質が、1種または複数種のアルブミン、IgG、トランスフェリン、フィブリノーゲン、フィブリン、IgA、α2-マクログロブリン、IgM、α1-抗トリプシン、補体C3、ハプトグロブリン、アポリポタンパク質A1、A3、およびB；α1-酸性糖タンパク質、セルロプラスミン、補体C4、C1q、IgD、プレアルブミン（トランスチレチン）、プラスミノーゲン、これらのいずれかの誘導体、およびこれらの組み合わせを含み、1種または複数種の高存在量タンパク質が、1種または複数種のアルブミン、免疫グロブリン、フィブリノーゲン、プレアルブミン、α1抗トリプシン、α1酸性糖タンパク質、α1フェトプロテイン、ハプトグロビン、α2マクログロブリン、セルロプラスミン、トランスフェリン、補体タンパク質C3およびC4、β2ミクログロブリン、βリポタンパク質、γグロブリンタンパク質、C反応性タンパク質（CRP）、リポタンパク質（カイロミクロン、VLDL、LDL、HDL）、他のグロブリン（α、β、およびγ型）、プロトロンビン、マンノース結合レクチン（MBL）、これらのいずれかの誘導体、およびこれらの組み合わせを含み得る、本発明1312の方法。
[本発明1315]
1種または複数種の高存在量タンパク質が、クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、免疫親和性、沈殿、またはこれらの組み合わせによって浄化血清または浄化血漿試料から全体的または部分的に分離される、本発明1312の方法。
[本発明1316]
1種または複数種の高存在量タンパク質が、生物学的試料をトロンボプラスチンと接触させる工程の後に浄化血清または浄化血漿試料から分離される、本発明1312の方法。
[本発明1317]
非浄化対照試料と比較して、1種または複数種の高存在量タンパク質の少なくとも25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%が浄化血清または浄化血漿試料から分離される、本発明1312の方法。
[本発明1318]
基体-生物学的試料複合体が、基体と生物学的試料の成分との間の架橋を含み、任意で、該架橋が、光架橋、イミドエステル架橋剤、ジメチルスベリミダート、脂質架橋剤、N-ヒドロキシスクシンイミド-エステル架橋剤、ビススルホスクシンイミジルスベラート（BS3）、アルデヒド、アクロレイン、クロトンアルデヒド、ホルムアルデヒド、カルボジイミド架橋剤、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DDC）、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）、1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩（EDCまたはEDAC）、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート（SMCC）、スルホスクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート（Sulfo-SMCC）、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジル-2-(6-[ビオチンアミド]-2-(p-アジドベンズアミド)-ヘキサノアミド)エチル-1,3'-ジチオプロプリオナート（Sulfo-SBED）、2-[N2-(4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロベンゾイル)-N6-(6-ビオチン-アミドカプロイル)-L-リシニル]エチルメタンチオスルホナート（Mts-Atf-Biotin）、2-{N2-[N6-(4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロベンゾイル-6-アミノ-カプロイル)-N6-(6-ビオチンアミドカプロイル)-L-リシニルアミド]}エチルメタンチオスルホナート（Mts-Atf-LC-Biotin）、光反応性アミノ酸、L-Photo-Leucine、L-Photo-Methionine、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）架橋剤、NHS-アジド試薬、NHS-アジド、NHS-PEG4-アジド、NHS-PEG12-アジド、NHS-ホスフィン試薬、NHS-ホスフィン、スルホ-NHS-ホスフィン、またはこれらの任意の組み合わせもしくは修飾を含む、本発明1306の方法。
[本発明1319]
基体が、生物学的試料の成分に直接架橋されている、本発明1318の方法。
[本発明1320]
基体が、リンカーを介して生物学的試料の成分に架橋されている、本発明1318の方法。
[本発明1321]
生物学的試料の成分が微小胞を含む、本発明1319または1320の方法。
[本発明1322]
リンカーが微小胞膜中に埋め込まれている、本発明1320に従属する本発明1321の方法。
[本発明1323]
リンカーが、官能化脂質を含み、任意で、該官能化脂質が、16:0ビオチニルPE 1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)（ナトリウム塩）、18:1ビオチニルPE 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)（ナトリウム塩）、16:0ビオチニルキャップPE 1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(キャップビオチニル)（ナトリウム塩）、18:1ビオチニルキャップPE 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(キャップビオチニル)（ナトリウム塩）、またはこれらの組み合わせを含む、本発明1322の方法。
[本発明1324]
リンカーが、ジアシルグリセロール、ジアシルホスホグリセロール（リン脂質）もしくはステロール、ジアルキルグリセロール、ジアルキル-もしくはジアシル-1-アミノ-2,3-ジヒドロキシプロパン、長鎖アルキルもしくはアシル、スフィンゴ脂質、セラミド、リン脂質、グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）膜アンカー配列、糖リン脂質膜アンカー、膜受容体断片、タンパク質結合受容体、金属キレート受容体、免疫グロブリンFc結合受容体、サイトカインもしくは成長因子結合受容体、薬物結合受容体、脂質模倣（lipid mimicking）受容体、膜貫通受容体、合成タンパク質結合受容体、合成金属キレート受容体、合成免疫グロブリンFc結合受容体、合成サイトカインもしくは成長因子結合受容体、合成薬物結合受容体、合成脂質模倣受容体、合成膜貫通受容体、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、スフィンゴ脂質、ステロイド、コレステロール、ジヒドロコレステロール、エルゴステロール、ブラシカステロール、コレステリルアミン、ジヒドロコレステリルアミン、エルゴステリルアミン、ブラシカステリルアミン、3-コレステリルアミン、3-ジヒドロコレステリルアミン、3-エルゴステリルアミン、3-ブラシカステリルアミン 3β-コレステリルアミン、3β-ジヒドロコレステリルアミン、3β-エルゴステリルアミン、3β-ブラシカステリルアミン、またはこれらのいずれかの機能的断片もしくは誘導体を含む、本発明1322の方法。
[本発明1325]
基体が、生物学的試料の成分に対する結合物質と結合している、本発明1318の方法。
[本発明1326]
結合物質が、抗体、アプタマー、またはレクチンを含み、任意で、該レクチンがコンカナバリンA（ConA）を含む、本発明1325の方法。
[本発明1327]
生物学的試料の成分が微小胞を含み、任意で、結合物質が微小胞表面抗原に対する結合物質を含む、本発明1325または1326の方法。
[本発明1328]
1種または複数種の結合物質を特定する工程をさらに含む、本発明1306の方法。
[本発明1329]
基体-微小胞複合体を含み、該基体が合成基体を含む、組成物。
[本発明1330]
基体が、ビーズ、ウェル、または平面の基体を含み、任意で、該ビーズが磁気ビーズ、またはポリスチレンビーズを含む、本発明1329の組成物。
[本発明1331]
本発明1306〜1328のいずれかの方法を実施するための1種または複数種の試薬を含むキットであって、任意で、該1種または複数種の試薬が1種または複数種の基体-微小胞複合体およびリンカー物質を含む、キット。
[本発明1332]
安定した基体-微小胞複合体を作製する方法であって、基体を微小胞と接触させる工程を含み、該基体が、該微小胞の表面上に存在する少なくとも1つの成分に直接結合することが可能な化学基によって官能化されている、方法。
[本発明1333]
基体が、ビーズ、ウェル、マトリックス、または平面の基体を含む、本発明1332の方法。
[本発明1334]
化学基が、ペプトイド、zDNA、ペプチド核酸（PNA）、ロックド核酸（LNA）、レクチン、ペプチド/ポリペプチド、デンドリマー、膜タンパク質標識剤、化学物質、光架橋、イミドエステル架橋剤、ジメチルスベリミダート、脂質架橋剤、N-ヒドロキシスクシンイミド-エステル架橋剤、ビススルホスクシンイミジルスベラート（BS3）、アルデヒド、アクロレイン、クロトンアルデヒド、ホルムアルデヒド、カルボジイミド架橋剤、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DDC）、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）、1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩（EDCまたはEDAC）、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート（SMCC）、スルホスクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート（Sulfo-SMCC）、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジル-2-(6-[ビオチンアミド]-2-(p-アジドベンズアミド)-ヘキサノアミド)エチル-1,3'-ジチオプロプリオナート（Sulfo-SBED）、2-[N2-(4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロベンゾイル)-N6-(6-ビオチン-アミドカプロイル)-L-リシニル]エチルメタンチオスルホナート（Mts-Atf-Biotin）、2-{N2-[N6-(4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロベンゾイル-6-アミノ-カプロイル)-N6-(6-ビオチンアミドカプロイル)-L-リシニルアミド]}エチルメタンチオスルホナート（Mts-Atf-LC-Biotin）、光反応性アミノ酸、L-Photo-Leucine、L-Photo-Methionine、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）架橋剤、NHS-アジド試薬、NHS-アジド、NHS-PEG4-アジド、NHS-PEG12-アジド、NHS-ホスフィン試薬、NHS-ホスフィン、スルホ-NHS-ホスフィン、またはこれらの組み合わせを含む、本発明1332の方法。
[本発明1335]
化学基が、炭化水素、ハロゲン、酸素を含む基（すなわちC-O結合）、窒素を含む基、硫黄を含む基、リンを含む基、ホウ素を含む基、またはこれらの組み合わせを含む、本発明1332の方法。
[本発明1336]
炭化水素が、アルカン、アルケン、アルキン、ベンゼン誘導体、トルエン誘導体、分枝または環状アルカン、カルボカチオン、およびカルボアニオンからなる群より選択される、本発明1335の方法。
[本発明1337]
ハロゲンが、ハロアルカン、フルオロアルカン、クロロアルカン、ブロモアルカン、およびヨードアルカンからなる群より選択される、本発明1335の方法。
[本発明1338]
酸素を含む基が、アルコール、ケトン、アルデヒド、ハロゲン化アシル、カルボナート、カルボキシラート、カルボン酸、エステル、ヒドロペルオキシド、エーテル、ヘミアセタール、ヘミケタール、アセタール、ケタール、オルトエステル、およびオルトカルボナートからなる群より選択される、本発明1335の方法。
[本発明1339]
窒素を含む基が、アミド、アミン、イミン、イミド、アジド、アゾ化合物、シアナート、ニトラート、ニトリル、ニトライト、ニトロ化合物、ニトロソ化合物、およびピリジン誘導体からなる群より選択される、本発明1335の方法。
[本発明1340]
硫黄を含む基が、チオール、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、硫酸、スルホン酸、チオシアナート、イソシアナート、チオン、およびチアールからなる群より選択される、本発明1335の方法。
[本発明1341]
リンを含む基が、ホスフィン、ホスファン、ホスホン酸、ホスファート、およびホスホジエステルからなる群より選択される、本発明1335の方法。
[本発明1342]
ホウ素を含む基が、ボロン酸、ボロン酸エステル、ボリン酸、およびボリン酸エステルからなる群より選択される、本発明1335の方法。
[本発明1343]
化学基が、アセタール、アシル基、ハロゲン化アシル、アルケニル基、アルコキシド、アルコキシ基、アルキニル基、アミド、アミンオキシド、アミン、カルボジイミド、カルボキシミダート、カルボン酸、シアナミド、シアナート、ジチオカルバマート、エノール、エステル、エーテル、ヒドラジン、ヒドラゾン、ヒドロキサム酸、イミド、イソシアナート、イソシアニド、イソチオシアナート、ケタール、ケテン、ケトン、脱離基、ニトリル、有機ハロゲン化物、有機リン、オルトエステル、オキシム、ホスホノフルオリダート、ホスホノチオアート、ホスホルアミドチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロフルオリダート、ホスホロチオアート、保護基、ピロホスファート、セミカルバジド、セミカルバゾン、スルファマート、スルホン酸エステル、スルホン、スルホン酸、スルホニル基、スルホキシイミン、スルフリル化合物、チオアミド、チオシアナート、チオエステル、チオラート、チオン、チオホスホリル化合物、および/またはチオスルフィナートを含む、本発明1332の方法。
[本発明1344]
化学基が、アセタール、アセトキシ基、アセチリド、酸無水物、活性化基、塩化アシル、ハロゲン化アシル、アシラール、アシロイン、アシルシラン、アルコール、アルデヒド、アルジミン、アルカン、アルケン、アルコキシド、アルキルシクロアルカン、亜硝酸アルキル、アルキン、アレン、アミド、アミジン、アミナール、アミンオキシド、アジド、アジン、アジリジン、アゾキシ、二官能性、ビスチオセミカルバゾン、ビウレット、ボロン酸、カルバマート、カルバミノ、カルバジド、カルベン、カルビノール、炭酸エステル、カルボニル、カルボキサミド、カルボキシミダート、カルボン酸、クロロホルマート、クムレン、シアン酸エステル、シアニミド、シアノヒドリン、不活性化基、デプシド、ジアゾ、ジオール、ジチオカルバマート、エナミン、エンジイン、エノール、エノールエーテル、エノン、エニン、エピスルフィド、エポキシド、エステル、エーテル、フルオロスルホナート、ハロヒドリン、ハロケトン、ヘミアセタール、ヘミアミナール、ヘミチオアセタール、ヒドラジド、ヒドラゾン、ヒドロキサム酸、ヒドロキシル、ヒドロキシルアミン、イミン、イミニウム、イソチオウロニウム、ケテン、ケテンイミン、ケトン、ケチル、ラクタム、ラクトール、ラクトン、メチン、メチル基、ニトラート、ニトリルイリド、ニトリルイミン、ニトロ化合物、ニトロアミン、ニトロナート、ニトロン、ニトロニウムイオン、ニトロソアミン、ニトロソ、オルトエステル、オサゾン、オキサジリジン、オキシム、n-オキソアンモニウム塩、ペルオキシド、ペルオキシ酸、パーシステントカルベン、フェノール、ホスファアルケン、ホスファアルキン、ホスファート、ホスフィナート、ホスフィン、ホスフィンオキシド、ホスフィニト、ホスホナート、ホスホニト、ホスホニウム、ホスホラン、s-ニトロソチオール、シッフ塩基、セレノール、セレノン酸、セロン、セミカルバジド、セミカルバゾン、シリルエノールエーテル、シリルエーテル、スルフェンアミド、スルフェン酸、塩化スルフェニル、スルフィド、スルフィルイミン、スルフィンアミド、スルフィン酸、亜硫酸エステル、スルホンアミド、スルホンアニリド、スルホナート、スルホニル、ハロゲン化スルホニル、スルホキシド、スルフリル、スルトン、テルロール、チアール、チオアセタール、チオアミド、チオカルバマート、チオカルボキシ、チオシアナート、チオエステル、チオエーテル、チオケタール、チオケトン、チオール、チオラクトン、チオ尿素、トシルヒドラゾン、トリアゼン、トリオール、尿素、バニリル、キサンタート、イリド、およびイノラートからなる群より選択される、本発明1332の方法。
[本発明1345]
化学基が、カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシル基、ヒドラジド基、および/またはクロロメチル基を含む、本発明1332の方法。
[本発明1346]
化学基がカルボキシル基を含む、本発明1332の方法。
[本発明1347]
少なくとも1つの成分が、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、脂質、糖質、これらの誘導体、またはこれらの組み合わせを含む、本発明1332の方法。
[本発明1348]
基体-微小胞複合体を含み、該基体が合成基体を含む、組成物。
[本発明1349]
不活性基体に直接結合した微小胞を含む、安定化した微小胞組成物。
[本発明1350]
基体が、ビーズ、ウェル、マトリックス、または平面の基体を含み、任意で、該ビーズが磁気ビーズ、またはポリスチレンビーズを含む、本発明1348または1349の組成物。
[本発明1351]
本発明1332〜1347のいずれかの方法を実施するための1種または複数種の試薬を含むキットであって、任意で、該1種または複数種の試薬が1種または複数種の基体-微小胞複合体およびリンカー物質を含む、キット。
[本発明1352]
（a）微小胞を、微小胞抗原に対する結合物質と接触させる工程であって、該結合物質が標識を含む、工程；
（b）走査型電子顕微鏡（SEM）の基体に、該接触させた微小胞を固定する工程；
（c）固定された微小胞をスパッターコーティングする工程；および
（d）SEMを使用して微小胞および標識を可視化する工程
を含む、微小胞を可視化する方法。
[本発明1353]
微小胞が、工程（a）の前に基体に付着している、本発明1352の方法。
[本発明1354]
微小胞が、共有結合を介して基体に付着している、本発明1353の方法。
[本発明1355]
微小胞が、免疫親和性結合を介して基体に付着している、本発明1353の方法。
[本発明1356]
結合物質が直接標識されている、本発明1352の方法。
[本発明1357]
結合物質が間接的に標識されている、本発明1352の方法。
[本発明1358]
結合物質が、抗体、機能的抗体断片、またはアプタマーを含む、本発明1352の方法。
[本発明1359]
間接的な標識が、微小胞抗原に対する結合物質との複合体を形成する標識された結合物質を含む、本発明1357の方法。
[本発明1360]
微小胞抗原が、表3、表4、または表26から選択される、本発明1352の方法。
[本発明1361]
微小胞抗原が、テトラスパニン、CD9、CD63、CD81、またはこれらの任意の組み合わせである、本発明1352の方法。
[本発明1362]
スパッターコーティングが金および/またはパラジウムコーティングを含む、本発明1352の方法。
[本発明1363]
スパッターコーティングが炭素コーティングを含む、本発明1352の方法。
[本発明1364]
SEMが、微小胞を可視化するための二次電子（SE）モード、および/または標識を可視化するための後方散乱電子（BSE）モードを含む、本発明1352の方法。
[本発明1365]
標識が金を含む、本発明1352〜1364のいずれかの方法。
[本発明1366]
i. 微小胞が、工程（a）の前に共有結合を介して基体に付着しており；
ii. 微小胞抗原に対する結合物質が、間接的に標識された抗体であり、該間接的な標識が、微小胞抗原に対する抗体と複合体を形成する金標識抗体を含み；
iii. 微小胞抗原がCD9であり；
iv. スパッターコーティングが炭素コーティングを含み；かつ
v. SEMが、微小胞を可視化するための二次電子（SE）モード、および/または標識を可視化するための後方散乱電子（BSE）モードを含む
、本発明1352の方法。
（図１Ａ〜１Ｆ）微小胞表面抗原のようなバイオマーカーを評価する方法を示す。図1Aは、捕捉物質の標的抗原を発現する小胞を捕捉する捕捉物質、たとえばアプタマーまたは抗体でコートされた平面基体の模式図である。捕捉物質は、罹病細胞から流出した小胞（「疾患小胞」）の表面に発現するタンパク質に結合し得る。同じくアプタマーまたは抗体であってもよい検出物質は、検出可能な標識、ここでは蛍光シグナルを有する。検出物質は、捕捉された小胞に結合し、その蛍光標識によって検出可能なシグナルを提供する。検出物質は、小胞と広く関連しているかまたは起始細胞もしくは疾患、たとえば癌と関連している抗原を、検出することができる。図1Bは、捕捉物質の標的抗原を発現する小胞を捕捉する、捕捉物質にコンジュゲートした粒子ビーズの模式図である。捕捉物質は、罹病細胞から流出した小胞（「疾患小胞」）の表面に発現するタンパク質に結合し得る。同じくアプタマーまたは抗体であってもよい検出物質は、検出可能な標識、ここでは蛍光シグナルを有する。検出物質は、捕捉された小胞に結合し、その蛍光標識によって検出可能なシグナルを提供する。検出物質は、小胞と広く関連しているかまたは起始細胞もしくは疾患、たとえば癌と関連している抗原を、検出することができる。図1Cは、表記バイオマーカーに対する捕捉物質と検出物質との様々な組み合わせを使用して実施することができるスクリーニングスキームの例である。バイオマーカーの組み合わせは、図1A〜1Bに示すようなアッセイを使用して検出することができる。図1D〜1Eは、表現型を特徴決定するために小胞を捕捉し、かつ検出するための例示的スキームを示す。図1Fは、表現型を特徴決定するために小胞ペイロードを評価するための例示的スキームを示す。
（図２Ａ〜２Ｂ）競合アッセイ選択戦略を示す。核酸アプタマー候補のランダムなプール（ライブラリー）が関心対象の標的202と共にインキュベートされる。複数ラウンドの結合を実施することができ、その中で、1）ライブラリーを標的と共にインキュベートし；2）ライブラリー−標的混合物を洗浄して非結合アプタマー候補を除去し；3）結合アプタマー候補を標的から溶離させ；4）溶離させたアプタマー候補を再び標的に加え、結合させる。図2Aは、標的202に結合したアプタマー候補201を示す。次いで、工程i）において、競合抗体203を反応に加える。図2Bは、抗体のエピトープにおいてアプタマー候補201と競合する候補抗体203を示す。アプタマー候補201は、抗体によって置換されたのち、捕集される。
（図３）関心対象の標的に対するアプタマーを同定するための模式図を示す。
（図４）様々な標的濃度の標的EpCAMタンパク質への例示的アプタマー（アプタマーID BTX176881（SEQ ID NO: 98883））の結合親和性を示す、結合アッセイの結果を示す。試験するアプタマーを、ビオチンテールによって基体に固定し、様々な濃度の標的（125、250および500nM）と共にインキュベートする。試験を表面プラズモン共鳴（SPR）機上で実施する。SPR機は、アプタマーと標的との結合および分離を検出する。標的は、結合イベントと分離イベントとが等しくなり、その結果、曲線のプラトーが現れるまで加える。そして、各濃度で曲線を記述する式を使用して、アプタマーのKDを算出することができる（表5を参照）。
（図５Ａ〜５Ｂ）アプタマーヌクレオチド配列および対応する二次構造予測を示す。図5Aは、配列
Figure 0006404822
を有する32量体オリゴヌクレオチド、アプタマー4の二次構造を示す。図中、配列は、6個のチミンヌクレオチドが端部に付加された状態で示されており、これらのチミンヌクレオチドが、ビオチン分子を付着させるためのスペーサーとして働くことができる。この特定のオリゴは、標的EpCAMに対する高い結合親和性を有する（表5を参照）。配列決定されたオリゴのデータベース全体をこのオリゴの二次構造にモデル化することにより、さらなる候補EpCAM結合物質が同定される。図5Bは、図5Aのアプタマーとは異なる二次構造を有する配列
Figure 0006404822
を有するもう一つの32量体オリゴを示す。このアプタマーもまた、6チミンテールを有する状態で示されている。
（図６）標的が特定の疾患と関連するバイオマーカーであるとき、細胞サブトラクション法を使用して標的特異的なアプタマーのセットを生成するプロセスを示す。工程1において、オリゴヌクレオチドのランダムなプールを正常患者由来の生物学的試験試料と接触させる。工程2において、工程1において結合しなかったオリゴを、疾患患者から単離された生物学試料に加える。次いで、この工程からの結合オリゴを溶離させ、そのビオチン結合によって捕捉したのち、再び正常な生物学的試料と合わせる。次いで、非結合オリゴを再び疾患由来生物学的試料に加え、単離する。このプロセスを反復的に繰り返すことができる。最後の溶離アプタマーを患者試料に対して試験して、セットの感度および特異度を計測する。生物学的試料は、血漿もしくは血清を含む血液または循環系の他の成分、たとえば微小胞を含むことができる。
（図７Ａ〜７Ｄ）微小胞を基体に取り付ける方法を示す。図7Aは、小胞表面抗原へのカルボキシル化ミクロスフェアの直接コンジュゲートを示す。図7Bは、ビオチン官能化脂質アンカーを介するミクロスフェアへの微小胞の固定を示す。図7Cは、抗体がカルボキシル化ミクロスフェアとコンジュゲートされる、小胞表面抗原への抗体結合を示す。図7Dは、アプタマーがカルボキシル化ミクロスフェアにコンジュゲートされる、小胞表面抗原へのアプタマー結合を示す。
（図８Ａ〜８Ｂ）ミクロスフェアにコンジュゲートしたVCAP由来微小胞の検出を示す。MagPlexビーズを製造者（Luminex Corp., Austin TX）のプロトコルにしたがって使用して、ビーズにコンジュゲートした小胞を検出した。二つの一般的な微小胞表面タンパク質であるCD9（図8A）またはCD63（図8B）に対するフィコエリスリン（PE）標識抗体を用いて微小胞を検出した。図中のY軸は、検出された微小胞の平均蛍光強度（MFI）を示す。様々な実験条件がX軸に沿って示されている。様々なブロッキング物質（「SBB」：StartingBlock, Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL.；「乳」：粉乳ブロッキングバッファ；「カゼイン（pbs）」：カゼインブロッキングバッファ）を用いて、またはブロッキングなしで（「ブロックなし」）、アッセイを実施した。表記する場合、検出物質なしで対照実験を実施した。
（図９Ａ〜９Ｄ）抗体にコンジュゲートしたミクロスフェアを使用する微小胞の捕捉を示す。図9Aは、Abにコンジュゲートしたビーズに対するVcap由来微小胞力価を示す。MagPlexビーズを、製造者（Luminex Corp., Austin TX）のプロトコルにしたがって、EpCAM、CD63またはCD81に対する抗体とコンジュゲートさせた。一般的な微小胞表面タンパク質であるCD9に対するフィコエリスリン（PE）標識抗体を用いて微小胞を検出した。図中のY軸は、検出された微小胞の平均蛍光強度（MFI）を示す。X軸は、投入されたVCap小胞の量を示す。図9Bは、捕捉の場合にはビーズにコンジュゲートした抗CD63抗体を使用し、検出の場合にはPE標識された抗CD9抗体を使用する、血漿由来の微小胞の捕捉を示す。プロットは、様々な条件下で単離された微小胞：0.1％ Tween 20を用いない、または用いた、ショ糖勾配を用いる超遠心分離後の微小胞（それぞれ「UC-PBS」および「UC-PBST」）、限外ろ過に供された血漿由来の濃縮微小胞（「N3-Conc」）およびExoQuick法を使用して精製された微小胞（「N3-Exo」）に関して示される様々な数のミクロスフェアの検出を示す。「対照（PBS）」試料は微小胞を有しない。図9Cは、患者2名からの血漿由来微小胞を含む投入物を用いた、抗体にコンジュゲートしたミクロスフェアによって捕捉された微小胞の滴定を示す。すべての試料において、5000個のミクロスフェアを検出した。表記のようにビーズにコンジュゲートした抗CD63抗体または抗CD81抗体および検出のためのPE標識抗CD9抗体を使用して微小胞（cMV）を捕捉した。プロットのX軸は試料中の小胞の数を示す。図9Dは、抗体捕捉された微小胞−ミクロスフェア複合体の安定性を示す。3名の患者由来の微小胞（cMV）をExoQuick技術によって精製したのち、ビーズにコンジュゲートした抗CD81抗体および検出のためのPE標識抗CD9抗体を使用して捕捉した。800rpmおよび室温で1時間のビーズ捕捉微小球のインキュベーションの前後で、ビーズ5000個あたり約8.96E＋07の微小胞を検出した。
（図１０Ａ〜１０Ｐ）脂質官能基を有するヘテロ二官能性リンカーを使用する、ミクロスフェアへの微小胞の固定を示す。図10Aは、例示的な脂質アンカー：1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ−3−ホスホエタノールアミン-N-(capビオチニル)（ナトリウム塩）（「16:0ビオチニルCap PE」）を示す。分子量は1053.394である。図10Aは、上が化学構造を示し、下が3D構造を示す。架橋剤はAvanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, Alabamaから市販されている。図10Bは、ミクロスフェアへの微小胞のビオチン官能化脂質固定を示す。図示するように、カルボキシル化ミクロスフェア101がストレプトアビジン102にコンジュゲートしている。架橋剤103がビオチン部分（図10Aを参照）を介してストレプトアビジンに結合している。最後に、脂質リンカー103は微小胞104の脂質二重層膜に埋め込まれている。図10C〜10Eは、図10A〜10Bの脂質アンカーを使用してミクロスフェアに固定されたVCAP微小胞のフローサイトメトリーを示す。微小胞は、PE標識抗CD9および抗CD63抗体を使用して検出した。図10C中、脂質アンカーは使用されなかった。図10Dは、脂質アンカーの付加を除くと、図10Cと同一である。これらのデータは、脂質アンカーを介してミクロスフェアにコンジュゲートした、富化された微小胞を示す。図10Eおよび図10Fは、それぞれ図10Cおよび図10Dの実験の独立した反復を示す。図10Gは、上記のように検出された様々な量の脂質固定小胞の滴定を示す。図10Hは、上記のように検出された様々な量の脂質固定小胞の滴定のもう一つの図を示す。表記量のVCap小胞（cMV）を、対照としてのPE標識抗マウスIgG抗体またはPE標識抗CD9および抗CD63抗体のいずれかを使用して検出した。図10I〜10Jは、脂質部分によるLumAvidinミクロスフェア上へのVCaP EV（40mg/mL）の捕捉を示し、MoFloによって抗CD9-PEおよび抗CD63-PEを用いて（図10I）またはLuminexによって抗CD9-PEを用いて（図10J）検出した。図10K〜10Lは、超遠心分離を使用して血漿試料から単離された小胞の検出を示す。他の点で、実験条件は、それぞれ図10Cおよび図10Dにおけるとおりである。図10Mおよび図10Nは、図10A〜10Bの脂質アンカーを使用してミクロスフェアに固定されたVCAP微小胞の検出を示す。微小胞を、PE標識抗CD9および抗CD63抗体を使用して検出した。図10M中、条件は図10Dおよび図10Fに類似している。しかし、図10Nに示す実験においては、検出の前に30mg/mlヒト血清アルブミン（HSA）を試料に加えた。図10O〜10Pは、−80℃で12日間の貯蔵の前（0日目；図10O）および後（12日目；図10P）の、ミクロスフェアにコンジュゲートした微小胞のMFI値を示す。様々な方法を使用して単離した小胞を、X軸に沿って示す条件：1）ExoQuick（商標）キット（System Biosciences, Inc., Mountain View, CA）ののち限外ろ過；2）超遠心分離；3）超遠心分離ののちExoquick；4）ExoQuickからExoMir（商標）キット（Bioo Scientific Corp., Austin TX）；5）限外ろ過VCAP小胞標本#1；6）限外ろ過VCAP小胞標本#2；および7）限外ろ過ののち超遠心分離、により試験した。
（図１１Ａ〜１１Ｍ）血漿から単離された微小胞をミクロスフェアの表面につなぐための代替プロトコルの評価に使用される電界放出走査型電子顕微鏡（FE-SEM）画像を示す。図11Aは、官能化またはコンジュゲートされていないミクロスフェアを示す。図11Bは、超遠心分離を使用して単離した血漿微小胞の、非磁性ビーズへの直接コンジュゲートを示す。図11Cは、図11Bの指示領域の引伸ばしを示す。矢印が様々な微小胞を指し示す。図11Dおよび図11Eは、ビーズが磁性であることを除き、それぞれ図11Bおよび図11Cに対応する。図11F〜Hは、官能化された磁性ビーズを示す。図11Fは、様々な糖、糖タンパク質および糖脂質中に見られる特定の構造、主として内部および非還元性末端α−D−マンノシルおよびα−D−グルコシル基に特異的に結合するレクチン（すなわち糖質結合タンパク質）であるビオチン化コンカナバリンA（ConA）によって官能化されたアビジンコンジュゲートビーズを示す。図11Gは、ビオチン化脂質アンカーによって官能化されたアビジンコンジュゲートビーズを示す。図11Hは、抗CD9抗体と直接コンジュゲートしたビーズを示す。図11Iは、超遠心分離を使用して単離された血漿微小胞の、ConA官能化ビーズへの捕捉を示す。図11Jは、図11Iの指示領域の引伸ばしを示す。矢印が様々な微小胞を指し示す。図11Kは、超遠心分離を使用して単離された血漿微小胞の、脂質アンカー官能化ビーズへの捕捉を示す。図11Lは、図11Kの指示領域の引伸ばしを示す。矢印が様々な微小胞を指し示す。図11Mは、超遠心分離を使用して単離された血漿微小胞の、脂質アンカー官能化ビーズへの捕捉を示す。図11Nは、図11Mの指示領域の引伸ばしを示す。矢印が様々な微小胞を指し示す。
（図１２Ａ〜１２Ｅ）マイクロビーズにコンジュゲートした微小胞を画像化するためのFE-SEM-ImmunoGoldプロトコルを示す。画像は、微小胞にコンジュゲートしたカルボキシル化ビーズの二次電子画像（SE）および後方散乱電子（BSE）画像を示す。図12A〜12Bは、懸濁液中で標識された10μg/ml抗CD9一次抗体で染色された微小胞を画像化したものである。図12AはSE画像を示し、図12BはBSE画像を示す。図12B中、金ナノ粒子は、矢印で指し示された白く明るい点である。より大きな特徴は、より高密度であり、BSEで見られるため、無機物質（バッファ結晶）または脂質プラークであり得る。図12C〜12Dは、ガラススライド上で標識された10μg/ml抗CD9一次抗体で染色された微小胞を画像化したものである。図12CはSE画像を示し、図12DはBSE画像を示す。図12D中、金ナノ粒子は、矢印で指し示された白く明るい点である。図12Eは、BSE画像（ImmunoGold）をSE画像（微小胞）の上に重ねて示す。金ナノ粒子（10nm）が矢印で示されている。より大きな特徴は、より高密度であり、BSEで見られるため、無機物質（バッファ結晶）または脂質プラークである。
（図１３Ａ〜１３Ｂ）アプタマーライブラリーをスクリーニングして1種または複数種の候補アプタマーを同定するためのスキームを示す。図13Aは、関心対象の標的に対してオリゴヌクレオチドライブラリーをスクリーニングするポジティブおよび場合によってはネガティブなラウンドのスキーム1300を示す。オリゴ候補のライブラリーを提供する（1301）。ポジティブ選択を実施するために、オリゴを関心対象の標的と接触させる（1302）。混合物を洗浄して非結合オリゴを除去したのち、オリゴを、洗浄した混合物から分離させ、捕集する（1303）。捕集したオリゴは、任意の回数（1・・・nと示す）繰り返すことができる新たなラウンドの標的結合への投入物として使用することができる。場合によっては、ポジティブ選択のラウンド間でネガティブ選択を実施し、その中で、オリゴを1種または複数種の非標的実体と接触させる（1304）。ネガティブ選択中、1種または複数種の非標的実体に結合しないオリゴを保持し、新たなラウンドのポジティブ選択1302への投入物として使用する。所望のラウンド数のポジティブ選択1303またはネガティブ選択1304ののち捕集されたオリゴを、関心対象の標的に結合することが示された候補アプタマーとして捕集する（1305）。図13Bは、癌試料対非癌対照試料に対するアプタマーの選択のためのスキームを示す。スキームは、それぞれが個別の試料またはプールされた試料からなる八つの癌試料（Ca1〜Ca8）および七つの対照試料（nCa1〜nCa7）を示す。七つの異なる選択（選択1〜選択7）が並行に実施されている。各選択において、候補アプタマーの投入物プールは、癌試料の一つに対するアプタマーに関して富化され（「ポジティブ選択」）、次いで、対照試料の一つに対するアプタマーを枯渇させられる（「ネガティブ選択」）。このプロセスが指示どおり繰り返される。選択の偏りを避けるため、各選択中、試料の順序は変更される。最終ラウンドのポジティブ選択ののち残るアプタマーは、選択されたアプタマーを含み、それをその後、たとえば癌試料を非癌試料から区別するためのアッセイの一部としてさらに展開することができる。各ラウンド後、アプタマープールを順番に並べて、富化、枯渇、潜在的問題などを追跡することができる。
（図１４）選択されたアプタマー、たとえば上記プロセスによって選択されたアプタマーの標的を同定するための模式図を含む。図は、基体1401につながれた結合物質1402、ここでは例としてアプタマーを示す。結合物質1402は基体1401に共有結合していることができる。結合物質1402はまた、非共有結合的に結合していてもよい。たとえば、結合物質1402は、基体に引き寄せられることができる標識、たとえば基体に共有結合しているアビジン／ストレプトアビジン分子と一緒に複合体を形成することができるビオチン基を含むことができる。結合物質1402は微小胞1404の表面抗原1403に結合する。矢印（i）によって示される工程において、微小胞が分断されるが、結合物質1402と表面抗原1403との複合体は無傷のまま残る。分断された微小胞1405は、矢印（ii）によって示される工程において、たとえば洗浄またはバッファ交換によって除去される。矢印（iii）によって示される工程において、表面抗原1403が結合物質1402から解放される。表面抗原1403を分析してその正体を決定することができる。
（図１５Ａ〜１５Ｂ）表現型を特徴決定する方法におけるアプタマーの使用を示す。図15Aは、関心対象の標的を検出および／または定量するために使用することができるアッセイ構成を示す模式図1500である。図中、捕捉アプタマー1502が基体1501に取り付けられている。関心対象の標的1503が捕捉アプタマー1502と結合している。また、検出アプタマー1504が関心対象の標的1503に結合している。検出アプタマー1504は標識1505を有し、この標識を検出すると、捕捉アプタマー1502を介して基体1501に捕捉された標的を同定することができる。図15Bは、表現型を特徴決定するためのアプタマープールの使用を示す模式図1510である。関心対象の標的に対するアプタマーのプールを提供する（1511）。プールを、特徴決定する試料と接触させる（1512）。混合物を洗浄して非結合アプタマーを除去する。残るアプタマーを分離させ、捕集する（1513）。捕集したアプタマーを同定し、保持されたアプタマーの正体を使用して表現型を特徴決定する（1514）。図15Cは、図15Bの方法の具現化を示す模式図1520である。微小胞集団に結合すると同定されたアプタマーのプールを提供する（1521）。投入試料は、試験試料から単離された（1522）微小胞を含む。プールを、特徴決定すべき単離された微小胞と接触させる（1523）。混合物を洗浄して非結合アプタマーを除去し、残るアプタマーを分離させ、捕集する（1525）。捕集したアプタマーを同定し、保持されたアプタマーの正体を使用して表現型を特徴決定する（1526）。
（図１６Ａ）アプタマー1601の一部分と、平面基体1603に取り付けられたカルボキシル基1602との間の水素結合を示す。
（図１６Ｂ）アプタマー1601の一部分と、ミクロスフェア基体1604に取り付けられたカルボキシル基1602との間の水素結合を示す。カルボキシル基1602はさらに抗体1605にも取り付けられている。
（図１７Ａおよび１７Ｂ）アプタマー1701の一部分と、基体1703に取り付けられたカルボキシル基1702との間の水素結合を示す。また、図17A中、結合物質1704が基体1703に取り付けられている。結合物質は、生物学的実体、たとえばタンパク質、核酸、微小胞、細胞またはそれらのいずれかの一部分であり得る標的1705に対して特異性を有する。また、図17B中、生物学的実体、たとえばタンパク質、核酸、微小胞、細胞またはそれらのいずれかの一部分であり得る標的1705が基体1703に取り付けられている。標的1705は結合物質1704と結合している。
（図１８Ａ〜１８Ｄ）微小胞集団を検出するための抗EpCAMアプタマー（アプタマー4；SEQ ID NO: 1）の使用を示す。表記の微小胞表面抗原：図18A）EGFR；図18B）PBP；図18C）EpCAM；および図18D）KLK2、に対するビーズコンジュゲート抗体を使用して、患者血漿試料中の小胞を捕捉した。蛍光標識されたアプタマー4をマイクロビーズアッセイにおいて検出物質として使用した。図は、各プロット中、三つの癌試料（C1〜C3）および三つの正常試料（N1〜N3）に関する平均蛍光値（MFI値）を示す。各プロット中、試料は、左から右に、C1、C2、C3、N1、N2、N3の順である。
（図１９Ａ〜１９Ｅ）関心対象の抗原に対するアプタマーの選択を示す。実施例9を参照すること。本明細書に記載されるネガティブ選択後の五つのDNAアプタマーライブラリー（1M〜5Mと標識）を、マイクロビーズにコンジュゲートし、かつ磁性ビーズにコンジュゲートしたSPDEF抗原で補足された四つの抗原（SSX2、SSX4、PBP、KLK2）の混合物と共にインキュベートした。本明細書に記載されるポジティブ選択プロトコルにしたがって試料を処理した。磁性ビーズを捕集したのち、結合したDNAアプタマーをビーズから抽出し、再び増幅した。図19A〜19Cは、1ラウンド（図19A）、2ラウンド（図19B）および3ラウンド（図19C）のポジティブ選択後に各出発ライブラリーから回収されたアプタマーを示す。図19D〜19Eは、特定の抗原に対する13ラウンド目のポジティブ選択後の25のアプタマーライブラリー（SSX2、SSX4、PBP、KLK2およびSPDEF抗原それぞれに五つずつのライブラリー）のスクリーニングを示す。このラウンド後のアプタマー選択は、実施例9に記載される交絡する抗原の包含によって変更された（「ラウンド14のポジティブ選択を、以下のように改変した」と題する項）。関心対象のアプタマーにコンジュゲートした磁性ビーズに結合したDNAアプタマーをビーズから抽出し、再び増幅した。回収されたライブラリーが図19Dに示されている。図19Eは、さらなる選択ラウンドおよびストリンジェントな洗浄後のライブラリーを示す。
（図２０Ａ）EPCAMアプタマーCAR003（SEQ ID NO: 230822）の配列を示す。
（図２０Ｂ）−30.00kcal/molの最小自由エネルギー（ΔG）を有するCAR003の最適な二次構造を示す。例示のために、アプタマーは、図20AのDNA配列に対応するRNAアプタマー（SEQ ID NO: 230847）として示されている。
（図２０Ｃ）アプタマープール精製を示す。図は、ゲル上で質をチェックしたのちすべての産物および分画がプール中に割り当てられたFPLCクロマトグラムを含む。
（図２０Ｄ）合成後のCAR003アプタマーの様々なFPLC分画を有するSYBR GOLD染色ゲルを示す。様々な分画を、未完成鎖の量に基づき、高から低の順（プール1〜プール3）でプール中に組み合わせた。プール1〜3は、図20Cに示されたプールに対応する。
（図２０Ｅ〜２０Ｆ）25mM HEPESとPBS-BN（図20E）または25mM HEPESと1mM MgCl2（図20F）中の、EPCAMタンパク質へのCAR003の結合を示す。
（図２０Ｇ）ウシ血清アルブミン（BSA）を添加した表記塩およびウシ血清アルブミン（BSA）を添加していない表記塩中の、EpCAMへのCAR003の結合を示す。
（図２０Ｈ）EPCAMタンパク質へのCAR003結合に対する変性の効果を示す。バー4本の各群中、アプタマーは、左から右に、アプタマー4、CAR003プール1、CAR003プール2、CAR003プール3である。
（図２０Ｉ）EPCAM組み換えタンパク質（一定投入量5μg）に対するアプタマーの滴定を示す。
（図２０Ｊ）EPCAM hisタグ付きタンパク質、BSAおよびHSA（各5μg）に対してCAR003アプタマーを用いたウェスタンブロットを示す。ゲルは、ブロックされた0.5％ F127であり、約50μg/mlのCAR003ビオチン化アプタマー、分画3でプロービングした。ブロットを、NeutrAvidin-HRP、次いでSuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrateによって可視化した。
（図２１Ａ〜２１Ｊ）CAR016（SEQ ID NO: 230840）およびその表記されたバリアントの予測二次構造を示す。
（図２２）組み換え精製PSMAに対するELISAアッセイによって測定された、PSMAタンパク質に対する抗PSMAアプタマー候補CAR050（SEQ ID NO: 230932）およびCAR051（SEQ ID NO: 230933）の結合親和性を示す。
（図２３Ａ〜２３Ｃ）様々な投入試料にコンジュゲートしたマイクロビーズに対する選択されたアプタマーの結合を示す。アプタマーは、乳癌由来の微小胞にコンジュゲートしたマイクロビーズに結合するとして、アプタマーライブラリーから選択されたものである。実験の詳細は実施例20に記載されている。各プロットは、プロットの上に示されたアプタマーを用いて得られた結果を示す。Y軸が結合のレベルを示す。各試料群中、九つの精製されたアプタマー候補の結合が示されている。投入試料が、X軸上、以下のように左から右に示されている：1）癌エキソソーム：乳癌患者由来の血漿試料から単離された微小胞にコンジュゲートしたマイクロビーズに結合するアプタマー；2）癌非エキソソーム：超遠心分離によって微小胞を除去したのち乳癌患者由来の血漿試料にコンジュゲートしたマイクロビーズに結合するアプタマー；3）非癌エキソソーム：正常（すなわち非乳癌）患者由来の血漿試料から単離された微小胞にコンジュゲートしたマイクロビーズに結合するアプタマー；4）非癌非エキソソーム：超遠心分離によって微小胞を除去したのち乳癌患者由来の血漿試料にコンジュゲートしたマイクロビーズに結合するアプタマー。
（図２４Ａ〜２４Ｂ）患者血漿試料中の微小胞の検出を示す。血漿試料由来の微小胞を、関心対象の微小胞抗原に対する抗体にコンジュゲートしたマイクロビーズと共にインキュベートした。ビオチン化抗EpCAMアプタマーおよびストレプトアビジン−フィコエリスリン（SAPE）によってビーズ捕捉微小胞を検出した。Y軸はビーズ捕捉微小胞からの蛍光シグナルを示す。X軸は、前立腺癌患者（c1〜c4）、良性前立腺状態の患者（b1〜b4）およびPBS陰性対照由来の血漿に関するバーを示す。X軸の下に様々な実験条件が示されている。血漿試料とのインキュベーションの前に、抗体にコンジュゲートしたビーズを、標準ブロッキング物質（StartingBlock Blocking Buffers, Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA）によって、標準ブロックおよび濃度1×の本発明のブロッキングアプタマー（主にSEQ ID NO: 230938）によって、または標準ブロックおよび濃度0.5×の本発明のブロッキングアプタマー（主にSEQ ID NO: 230938）によってブロックした。図24A〜24Bは、それぞれが陰性対照として働く二つの非抗原結合アプタマーの場合の結果を示す。二つの非抗原結合アプタマーは：
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である。
発明の詳細な説明
本発明の一つまたは複数の態様の詳細が以下の付随の説明に記載される。本明細書に記載されるものに類似している、または等しい任意の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、ここでは、好ましい方法および材料を記載する。本発明の他の特徴、目的および利点は詳細な説明から明らかになる。本明細書中、別段明らかに指示されない限り、単数形は複数をも含む。別段定義されない限り、本明細書において使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書が優先する。
本明細書に開示されるものは、1種または複数種のバイオマーカーの存在またはレベルを含むことができるバイオマーカープロフィールを評価するために使用することができる組成物および方法である。本発明の組成物および方法は、微小胞表面抗原またはその機能性フラグメントに結合するアプタマーの使用を含む。抗原は、一般にはタンパク質またはポリペプチドを含むが、脂質および／または糖質を含む、微小胞表面上に表示される任意の成分であることができる。概して、開示されるアプタマーは、DNAおよびRNAを含む核酸分子ならびにそれらの変異体である。開示される方法は、本発明の1種または複数種のアプタマーを使用して、関連の微小胞表面抗原またはその機能性フラグメントのレベルまたは存在を決定する診断プロセスおよび技術を含む。または、本発明のアプタマーはまた、細胞、細胞フラグメント、小胞もしくは任意の他のフラグメントまたは表面抗原もしくはその機能性フラグメントを含む複合体を捕捉、単離または富化するための結合物質として使用することもできる。
本発明の組成物および方法は、バイオマーカープロフィールの評価における使用のために同定される個々のアプタマーを含む。本発明はさらに、所与の試料中のバイオマーカープロフィールを検出するために使用することができるアプタマープールの組成物および方法を開示する。
本発明の組成物および方法に開示されるアプタマーおよびアプタマー配列は、本明細書中、DNAまたはRNAの形態で同定され得る。別段指定されない限り、当業者は、アプタマーが概していずれかの形態の核酸として合成され、様々な化学的修飾を有し、本発明の範囲内であり得ることを理解するであろう。
加えて、本発明のアプタマーはまた、インビトロまたはインビボ検出または画像化を提供して、任意の診断読み取り値（たとえば診断、予後判定またはセラノーシス）を提供するために使用することもできる。
それとは別に、本発明のアプタマーはまた、治療のために使用することもできるし、または細胞、組織もしくは臓器を特異的に標的化するための治療剤として使用することもできる。
アプタマー
SELEX法
アプタマーを生成するのに適した方法は、たとえば、1990年6月11日に出願され、今や放棄された米国特許出願第07/536,428号、「Nucleic Acid Ligands」と題する米国特許第5,475,096号および「Nucleic Acid Ligands」と題する米国特許第5,270,163号（WO91/19813も参照）に概して記載されている「Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment」（「SELEX法」）と呼ばれるプロセスを用いる方法である。各SELEX同定核酸リガンド、すなわち各アプタマーは、所与の標的化合物または分子に特異的なリガンドである。SELEXプロセスは、核酸が、多様な二次元および三次元構造を形成するのに十分な能力と、モノマーであるかポリマーであるかを問わず事実上いかなる化学物質とでもリガンドとして働く（すなわち、特異的結合対を形成する）のに十分な、それらのモノマー内で利用可能な化学的融通性とを有するという独自の洞察に基づく。任意のサイズまたは組成の分子が標的として働くことができる。
SELEX法は、出発点として、ランダム化された配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドの大きなライブラリーまたはプールに依存する。オリゴヌクレオチドは、修飾されたまたは非修飾の、DNA、RNAまたはDNA/RNAハイブリッドであることができる。いくつかの例において、プールは、100％ランダムまたは部分的にランダムなオリゴヌクレオチドを含む。他の例において、プールは、ランダム化された配列内に組み込まれた少なくとも一つの固定および／または保存配列を含むランダムまたは部分的にランダムなオリゴヌクレオチドを含む。他の例において、プールは、オリゴヌクレオチドプールのすべての分子によって共有される配列を含み得る少なくとも一つの固定および／または保存配列をその5'および／または3'末端に含むランダムまたは部分的にランダムなオリゴヌクレオチドを含む。固定配列とは、PCRプライマーのためのハイブリダイゼーション部位、RNAポリメラーゼ（たとえばT3、T4、T7およびSP6）のためのプロモーター配列、制限部位またはホモポリマー配列、たとえばポリAもしくはポリTトラクト、触媒コア、アフィニティーカラムへの選択的結合のための部位ならびに関心対象のオリゴヌクレオチドのクローニングおよび／または配列決定を容易にするための他の配列のような配列である。保存配列とは、同じ標的に結合するいくつかのアプタマーによって共有される、前記固定配列以外の配列である。
プールのオリゴヌクレオチドは、好ましくは、ランダム化された配列部分および効率的な増幅に必要な固定配列を含む。一般に、出発プールのオリゴヌクレオチドは、30〜50個のランダムなヌクレオチドの内部領域の側面に位置する固定5'および3'末端配列を含む。ランダム化されたヌクレオチドは、化学合成およびランダムに切断された細胞核酸からのサイズ選択を含むいくつかの方法で生成することができる。また、選択／増幅反復の前または最中に、試験核酸中の配列変異を突然変異誘発によって導入する、または増大させることができる。
オリゴヌクレオチドのランダム配列部分は、任意の長さであることができ、リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドを含むことができ、修飾されたまたは非天然の、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似物を含むことができる。たとえば、米国特許第5,958,691号；米国特許第5,660,985号；米国特許第5,958,691号；米国特許第5,698,687号；米国特許第5,817,635号；米国特許第5,672,695号およびPCT公開公報WO92/07065を参照すること。ランダムオリゴヌクレオチドは、当技術分野において周知の固相オリゴヌクレオチド合成技術を使用して、ホスホジエステル結合ヌクレオチドから合成することができる。たとえば、Froehler et al., Nucl. Acid Res. 14:5399-5467 (1986)およびFroehler et al., Tet. Lett. 27:5575-5578 (1986)を参照すること。ランダムオリゴヌクレオチドはまた、トリエステル合成法のような溶液相法を使用して合成することもできる。たとえば、Sood et al., Nucl. Acid Res. 4:2557 (1977)およびHirose et al., Tet. Lett., 28:2449 (1978)を参照すること。自動DNA合成装置上で実施される一般的な合成は、たいていのSELEX実験には十分な数である1014〜1016個の分子を生じさせる。配列設計中の十分に大きなランダム配列の領域は、合成される各分子が独自の配列を表す可能性を高める。
オリゴヌクレオチドの出発ライブラリーは、DNA合成装置上での自動化学合成によって生成され得る。ランダム化配列を合成するためには、合成プロセス中、各ヌクレオチド添加工程において四つすべてのヌクレオチドの混合物を加えて、ヌクレオチドのランダムな配合を可能にする。上述したように、一つの態様において、ランダムなオリゴヌクレオチドは完全にランダムな配列を含むが、しかし、他の態様において、ランダムなオリゴヌクレオチドは、非ランダムまたは部分的にランダムな配列の部分を含むこともできる。部分的にランダムな配列は、各添加工程において四つのヌクレオチドを異なるモル比で加えることによって創製することができる。
オリゴヌクレオチドの出発ライブラリーは、たとえばRNA、DNAまたはRNA／DNAハイブリッドであり得る。RNAライブラリーが出発ライブラリーとして使用される場合、それは一般に、T7 RNAポリメラーゼまたは修飾T7 RNAポリメラーゼを使用してDNAラブラリーをインビトロで転写することによって産生され、精製される。次いで、結合に好ましい条件下、ライブラリーを標的と混合し、同じ一般的選択スキームを使用して、結合、分割および増幅の工程ごとの反復に供すると、事実上、任意の所望の基準の結合親和性および選択性が達成される。より具体的には、核酸の出発プールを含む混合物から出発して、SELEX法は、（a）結合に好ましい条件下、混合物を標的と接触させる工程；（b）非結合核酸を、標的分子に特異的に結合した核酸から分割する工程；（c）核酸−標的複合体を分離させる工程；（d）核酸−標的複合体から分離させた核酸を増幅して、リガンド富化された核酸混合物を得る工程；および（e）結合、分割、分離および増幅の工程を所望のサイクル数だけ反復して、標的分子に対する高特異性で高親和性の核酸リガンドを得る工程を含む。RNAアプタマーが選択される場合、SELEX法はさらに、（i）工程（d）における増幅の前に、核酸−標的複合体から分離させた核酸を逆転写する工程；および（ii）プロセスを再開する前に、工程（d）からの増幅された核酸を転写する工程を含む。
多数の可能な配列および構造を含む核酸混合物内には、所与の標的に対する広い範囲の結合親和性が存在する。たとえばヌクレオチド20個のランダム化セグメントを含む核酸混合物は、420個の候補の可能性を有することができる。標的に対してより高い親和定数を有するものは標的に非常に結合しやすい。分割、分離および増幅ののち、第二の核酸混合物を生成し、より高い結合親和性の候補に関して富化する。さらなるラウンドの選択が漸進的により良好なリガンドを優先させ、最後に、得られる核酸混合物は主として一つまたはいくつかの配列のみで構成されるようになる。そして、それらをクローニングし、配列決定し、高純度リガンドまたはアプタマーとしての結合親和性に関して個々に試験することができる。
選択および増幅のサイクルは、所望の目的が達成されるまで繰り返される。もっとも一般的な場合、選択／増幅は、サイクルを繰り返しても結合強度の有意な改善が達成されなくなるまで継続される。この方法は一般に、約1014種の異なる核酸種をサンプリングするために使用されるが、約1018種もの異なる核酸種をサンプリングするために使用されることもある。概して、核酸アプタマー分子は、5〜20サイクルの手順において選択される。一つの態様において、不均一性は初回の選択段階のみで導入され、反復プロセス中には生じない。
SELEX法の一つの態様において、選択プロセスは、選択された標的に非常に強く結合する核酸リガンドの単離において非常に効率的であるため、一つの選択・増幅サイクルしか必要とされない。そのような効率的な選択は、たとえば、クロマトグラフィー型プロセスにおいて実施され得、その場合、カラム上に結合した標的と結合できる核酸の能力は、親和性が最高である核酸リガンドの分離および単離をカラムが十分に可能にすることができるような様式で作用する。
多くの場合、一つの核酸リガンドが同定されるまでSELEXの反復工程を実施することは必ずしも望ましくない。標的特異的核酸リガンド溶液は、いくつかの保存配列、および標的に対する核酸リガンドの親和性に有意に影響することなく置換または付加されることができるいくつかの配列を有する、核酸構造またはモチーフのファミリーを含み得る。完了前にSELEXプロセスを終了させることにより、核酸リガンド溶液ファミリーのいくつかのメンバーの配列を決定することが可能である。本発明は、試験試料を特徴決定するためにいっしょに使用することができるアプタマープールの同定およびその使用を提供する。たとえば、アプタマープールを複数ラウンドのポジティブ選択およびネガティブ選択を通して同定して、疾患または病状を示す微小胞を同定することができる。本発明はさらに、試料中のそのような微小胞を検出および／または定量し、それにより、診断、予後判定またはセラノーシスを提供することを可能にするための、そのようなアプタマープールの使用を提供する。
多様な核酸一次、二次および三次構造が存在することが知られている。非ワトソン−クリック型相互作用に非常に一般的に関与することが示された構造またはモチーフは、ヘアピンループ、対称および非対称バルジ、擬似ノットおよびそれらの無数の組合せと呼ばれている。そのようなモチーフのほぼすべての既知のケースが、それらがヌクレオチド30個以下の核酸配列中に形成されることができることを示唆する。この理由のため、多くの場合、隣接するランダム化セグメントを用いるSELEX法は、ヌクレオチド約20〜約50個、いくつかの態様においてはヌクレオチド約30〜約40個のランダム化セグメントを含む核酸配列によって開始されることが好ましい。一例において、5'固定：ランダム：3'固定配列は、ヌクレオチド約30〜約50個のランダム配列を含む。
コアSELEX法は、いくつかの具体的な目的を達成するように改変されている。たとえば、米国特許第5,707,796号は、特定の構造的特徴を有する核酸分子、たとえば、ベントDNAを選択するための、SELEX法とゲル電気泳動法との併用を記載している。米国特許第5,763,177号は、標的分子と結合および／または標的分子に光架橋および／または標的分子を光不活性化することができる光反応性基を含む核酸リガンドを選択するためのSELEXベースの方法を記載している。米国特許第5,567,588号および米国特許第5,861,254号は、標的分子に対して高い親和性を有するオリゴヌクレオチドと、標的分子に対して低い親和性を有するオリゴヌクレオチドとの高効率分割を達成するSELEXベースの方法を記載している。米国特許第5,496,938号は、SELEXプロセスを実施したのち、改善された核酸リガンドを得る方法を記載している。米国特許第5,705,337号は、リガンドをその標的に共有結合させる方法を記載している。
SELEX法はまた、標的分子上の一つより多い部位に結合する核酸リガンドを得るために、また、標的上の特定の部位に結合する非核酸種を含む核酸リガンドを得るために、使用することもできる。SELEX法は、大小の生体分子、たとえば核酸結合タンパク質およびその生物学的機能の一部として核酸と結合することが知られていないタンパク質ならびに補因子および他の小分子を含む、任意の想定可能な標的に結合する核酸リガンドを単離し、同定するための手段を提供する。たとえば、米国特許第5,580,737号は、カフェインおよびその近縁類似物テオフィリンに高い親和性で結合することができる、SELEXによって同定された核酸配列を開示している。
カウンターSELEX法は、1種または複数種の非標的分子に対する交差反応性を有する核酸リガンド配列を除去することによって、標的分子に対する核酸リガンドの特異性を改善する方法である。カウンターSELEX法は、（a）核酸の候補混合物を調製する工程；（b）候補混合物を標的と接触させる工程であって、候補混合物に比べて標的に対して増大した親和性を有する核酸を候補混合物の残りから分割し得る、工程；（c）増大した親和性の核酸を候補混合物の残りから分割する工程；（d）増大した親和性の核酸を標的から分離させる工程；（e）増大した親和性の核酸を1種または複数種の非標的分子と接触させて、非標的分子に対して特異的親和性を有する核酸リガンドを除去する工程；および（f）標的分子のみに対して特異的親和性を有する核酸を増幅して、標的分子への結合のための相対的に高い親和性および特異性を有する核酸配列に関して富化された核酸の混合物を得る工程で構成される。SELEX法に関して上述したように、選択および増幅のサイクルは、所望の目標が達成されるまで必要に応じて繰り返される。
治療剤およびワクチンとしての核酸の使用において遭遇する一つの潜在的な問題が、ホスホジエステル形態のオリゴヌクレオチドが、細胞内および細胞外の酵素、たとえばエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼにより、所望の効果が発現する前に体液中で急速に分解され得ることである。したがって、SELEX法は、改善された特性、たとえば改善されたインビボ安定性または改善された送達特性をリガンドに付与する修飾ヌクレオチドを含む高親和性核酸リガンドの同定を包含する。そのような修飾の例は、リボースおよび／またはホスフェートおよび／または塩基位置における化学的置換を含む。修飾ヌクレオチドを含有するSELEX同定核酸リガンドは、たとえば、リボースの2'位、ピリミジンの5位およびプリンの8位が化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドを記載する米国特許第5,660,985号、様々な2'修飾ピリミジンを含有するオリゴヌクレオチドを記載する米国特許第5,756,703号および2'-アミノ(2'-NH2)、2'-フルオロ(2'-F)および／または2'-O-メチル(2'-OMe)置換基で修飾された1種または複数種のヌクレオチドを含有する高特異性核酸リガンドを記載する米国特許第5,580,737号に記載されている。
本発明において考慮される核酸リガンドの修飾は、さらなる電荷、分極性、疎水性、水素結合、静電気的相互作用および流出性を核酸リガンド塩基または核酸リガンド全体に組み込む他の化学基を提供する修飾を含むが、それらに限定されない。また、耐ヌクレアーゼ性であるオリゴヌクレオチド集団を生成するための修飾は、一つまたは複数の代替ヌクレオチド間結合、修飾糖、修飾塩基またはそれらの組合せを含むことができる。そのような修飾は、2'位糖修飾、5位ピリミジン修飾、8位プリン修飾、環外アミンの修飾、4-チオウリジンの置換、5-ブロモまたは5-ヨードウラシルの置換；主鎖修飾、ホスホロチオエートまたはアリルホスフェート修飾、メチル化および異例の塩基対組合せ、たとえばイソ塩基イソシチジンおよびイソグアノシンを含むが、これらに限定されない。修飾はまた、3'および5'修飾、たとえばキャッピングを含むことができる。
一つの態様においては、P(O)O基が、P(O)S（「チオエート」）、P(S)S（「ジチオエート」）、P(O)NR2（「アミデート」）、P(O)R、P(O)OR'、COもしくはCH2（「ホルムアセタール」）または3'-アミン(-NH-CH2-CH2-)（式中、各RまたはR'は、独立して、Hまたは置換もしくは非置換のアルキルである）によって置換されているオリゴヌクレオチドが提供される。結合基は、-O-、-N-または-S-結合によって隣接ヌクレオチドに取り付けられることができる。オリゴヌクレオチド内のすべての結合が同一である必要はない。本明細書において使用される語「ホスホロチオエート」は、一つまたは複数の硫黄原子によって置換されているホスホジエステル結合中の一つまたは複数の非架橋酸素原子を包含する。
さらなる態様において、オリゴヌクレオチドは、修飾された糖基を含み、たとえば、ヒドロキシル基の一つまたは複数が、ハロゲン、脂肪族基によって置換されている、またはエーテルもしくはアミンとして官能化されている。一つの態様において、フラノース残基の2'位が、O-メチル、O-アルキル、O-アリル、S-アルキル、S-アリルまたはハロ基のいずれかによって置換されている。2'修飾糖の合成法は、たとえば、Sproat, et al., Nucl. Acid Res. 19:733-738 (1991)；Cotten, et al., Nucl. Acid Res. 19:2629-2635 (1991)；およびHobbs, et al., Biochemistry 12:5138-5145 (1973)に記載されている。他の修飾が当業者に公知である。そのような修飾は、SELEXプロセス前の修飾であってもよいし、またはSELEXプロセス後の修飾（以前に同定された非修飾リガンドの修飾）であってもよいし、またはSELEXプロセスへの組み込みによって実施される修飾であってもよい。
SELEXプロセス前の修飾またはSELEXプロセスへの組み込みによって実施される修飾は、それらのSELEX標的に対する特異性および改善された安定性、たとえばインビボ安定性の両方を有する核酸リガンドを生じさせる。核酸リガンドに対して実施されるSELEXプロセス後の修飾は、核酸リガンドの結合能力に悪影響を及ぼすことなく、改善された安定性、たとえばインビボ安定性を生じさせ得る。
SELEX法は、米国特許第5,637,459号および米国特許第5,683,867号に記載されているように、選択されたオリゴヌクレオチドを、他の選択されたオリゴヌクレオチドおよび非オリゴヌクレオチド機能単位と組み合わせることを包含する。SELEX法はさらに、たとえば、米国特許第6,011,020号、米国特許第6,051,698号およびPCT公開公報WO98/18480に記載されているように、選択された核酸リガンドを親油性または非免疫原性高分子量化合物と組み合わせて診断または治療複合体にすることを包含する。これらの特許および出願は、広範な形状および他の性質と、オリゴヌクレオチドの効率的な増幅および複製性ならびに他の分子の望ましい性質との組み合わせを教示している。
また、小さなフレキシブルペプチドに対する核酸リガンドをSELEX法によって同定することが研究されている。小さなペプチドはフレキシブルな構造を有し、通常、溶液中、複数の配座異性体の平衡において存在し、したがって、当初、結合親和性は、フレキシブルペプチドと結合したとき失われる配座エントロピーによって制限され得ると考えられていた。しかし、溶液中の小さなペプチドに対する核酸リガンドを特定する実施可能性が米国特許第5,648,214号において実証された。この特許においては、アミノ酸11個のペプチドであるサブスタンスPに対する高親和性RNA核酸リガンドが同定された。
標的に対して特異性および結合親和性を有する本発明のアプタマーは、本明細書に記載されるSELEX Nプロセスによって選択することができる。SELEXプロセスの一部として、標的に結合するように選択された配列は、その後、場合によっては、所望の結合親和性を有する最小配列を決定するために最小化される。選択された配列および／または最小化された配列は、場合によっては、結合親和性を高める、または配列中のどの位置が結合活性にとって不可欠であるのか決定するために、配列のランダムまたは定方向突然変異誘発を実施することによって最適化される。加えて、選択は、アプタマー分子をインビボでの分解に対して安定化させるための修飾ヌクレオチドを組み込んだ配列を用いて実施することもできる。
2'修飾SELEX法
アプタマーが治療剤としての使用に適するためには、好ましくは、インビボで安全かつ安定に合成することが低廉である。野生型RNAおよびDNAアプタマーは一般に、ヌクレアーゼによる分解を受けやすいため、インビボで安定ではない。ヌクレアーゼ分解に対する耐性は、2'位における修飾基の組み込みによって大きく高めることができる。
フルオロおよびアミノ基がオリゴヌクレオチドプールにうまく組み込まれ、次いで、そのプールからアプタマーが選択されている。しかし、これらの修飾は、得られるアプタマーの合成のコストを大きく増し、場合によっては、修飾オリゴヌクレオチドの分解および、その後の、DNA合成の基体としてのヌクレオチドの使用によって修飾ヌクレオチドが宿主DNA中に再循環される可能性のせいで、安全性の懸念を招くおそれがある。
本明細書に提供される、2'-O-メチル（「2'-OMe」）ヌクレオチドを含有するアプタマーはこれらの欠点の多くを解消し得る。2'-OMeヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは耐ヌクレアーゼ性であり、安価に合成される。2'-OMeヌクレオチドは生物学的系中に遍在するが、天然のポリメラーゼは、生理学的条件下、2'-OMe NTPを基体として受け入れず、したがって、宿主DNA中への2'-OMeヌクレオチドの再循環に関して安全性の懸念はない。2'修飾アプタマーを生成するために使用されるSELEX法は、たとえば、いずれも参照により全体として本明細書に組み入れられる2002年12月3日に出願された米国特許仮出願第60/430,761号、2003年7月15日に出願された米国特許仮出願第60/487,474号、2003年11月4日に出願された米国特許仮出願第60/517,039号、2003年12月3日に出願された米国特許出願第10/729,581号および2004年6月21日に出願された「Method for in vitro Selection of 2'-O-methyl substituted Nucleic Acids」と題する米国特許出願第10/873,856号に記載されている。
方法
バイオマーカー検出および診断
本発明のアプタマーは、生物学的試料中のバイオマーカー、たとえば、タンパク質、核酸または微小胞のような関心対象の生物学的実体の存在またはレベルを評価するための様々な方法において使用することができる。アプタマーは、同族標的分子の存在またはレベルを評価するための結合物質として機能する。したがって、診断、予後判定またはセラノーシスに関する本発明の様々な態様において、本発明の1種または複数種のアプタマーは、本発明の1種または複数種のアプタマーを、選択された生物学的試料と接触させ、1種または複数種のアプタマーがその標的分子と結合する、リガンド−標的ベースのアッセイにおいて構成される。本発明のアプタマーは、評価される生物学的試料および検出されるバイオマーカーに基づいて候補バイオシグネチャーを同定するために使用される。さらなる態様において、アプタマーは、それ自体が特定の病状または疾患のバイオシグネチャーを提供し得る。バイオシグネチャーとは、1種または複数種の関心対象のバイオマーカーの存在、レベルまたは評価することができる他の特徴（非限定的に、配列、突然変異、再配列、転座、欠失、後成的修飾、メチル化、翻訳後修飾、対立遺伝子、活性、複合体パートナー、安定性、半減期などを含む）を含む生物学的試料のバイオマーカープロフィールをいう。バイオシグネチャーは、診断および／または予後判定基準、たとえば疾患の存在、病期決定、疾患モニタリング、疾患層別化または疾患の検出、転移もしくは再発もしくは進行の監視を評価するために使用することができる。たとえば、微小胞表面抗原に対するアプタマーを使用する本発明の方法は、微小胞抗原を含むバイオシグネチャーを選択された病状または疾患と相関させるのに有用である。バイオシグネチャーはまた、治療介入を含む治療モダリティに関する決定を下す際に臨床的に使用することもできる。バイオシグネチャーはさらに、手術を実施するかどうか、または手術と共にどの治療標準を使用すべきかを含む治療の決定を下すために臨床的に使用することもできる（たとえば術前または術後に）。説明のための例として、侵攻型の癌を示す循環バイオマーカーのバイオシグネチャーは、患者を治療するために、より積極的な外科処置および／またはより積極的な治療計画を必要とし得る。
バイオシグネチャーは、本発明に開示される任意の方法において、たとえば、対象が、罹患しているかどうか、疾患を発症する危険にあるかどうかを評価する、または疾患の病期もしくは進行を評価するために使用することができる。たとえば、バイオシグネチャーを使用して、対象が、前立腺癌、結腸癌または本明細書に記載される他の癌を有するかどうかを評価することができる。さらに、バイオシグネチャーを使用して、結腸癌のような疾患または病状の病期を決定することができる。微小胞を含むバイオシグネチャー／バイオマーカープロフィールは、微小胞内のペイロードの評価を含むことができる。たとえば、本発明の1種または複数種のアプタマーを使用して微小胞集団を捕捉し、それにより、微小胞抗原の読み取り値を提供したのち、捕捉された微小胞内のペイロード内容物を評価し、それにより、ペイロード内容物のさらなるバイオマーカー読み取り値を提供することができる。
表現型を特徴決定するためのバイオシグネチャーは、任意の数の有用な基準を含み得る。以下さらに説明するように、本明細書において使用される語「表現型」は、バイオシグネチャー／バイオマーカープロフィールに帰される任意の特性または特徴を意味することができる。表現型は、本発明の組成物および／または方法を使用して部分的または全体的に検出または同定することができる。いくつかの態様においては、バイオマーカーごとに少なくとも一つの基準が使用される。いくつかの態様においては、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90または少なくとも100の基準が使用される。たとえば、癌を特徴決定する場合、対象を癌と診断するとき、多数の異なる基準を使用することができる：1）対象由来の試料中のマイクロRNAの量が基準値よりも高い場合；2）細胞型特異的小胞（すなわち、特定の組織または臓器に由来する小胞）内のマイクロRNAの量が基準値よりも高い場合；または3）1種または複数種の癌特異的バイオマーカーを有する小胞内のマイクロRNAの量が基準値よりも高い場合。マイクロRNAの量が基準以下である場合にも、同様な規則を適用することができる。方法はさらに、試料が品質管理尺度を満たす場合に対象に関する結果が提供されるような品質管理尺度を含むことができる。いくつかの態様において、基準は満たされるが、品質管理が疑わしい場合、対象は再評価される。
セラノーシス
バイオシグネチャーは、治療関連の診断において、疾患を診断するのに有用な試験を提供する、または正しい治療計画を選択する、たとえばセラノーシスを提供するために使用することができる。セラノーシスは、罹病状態の治療法または治療に影響する能力を提供する診断試験を含む。セラノーシス試験は、診断または予後判定試験がそれぞれ診断または予後判定を提供するのと同様なやり方でセラノーシスを提供する。本明細書において使用されるセラノーシスは、予測的医療、個別化医療、統合医療、薬理診断学およびDx/Rxパターニングを含む、任意の所望の形態の治療関連の試験を包含する。治療関連の試験は、個々の対象における薬物応答を予測および評価する、すなわち、個別化医療を提供するために使用することができる。薬物応答の予測は、たとえば対象が暴露される、または他のやり方で治療される前にその対象が候補治療物質に対して応答者である可能性が高いのか、非応答者である可能性が高いのかを決定することであることができる。薬物応答の評価は、薬物に対する応答をモニターすること、たとえば治療の開始後、時間経過と共に対象の改善またはその欠如をモニターすることであることができる。治療関連の試験は、治療から恩恵を受ける可能性が特に高い対象をその治療に選択する、または個々の対象において治療効能の早期的かつ客観的指示を提供するのに有用である。このように、本明細書に開示されるバイオシグネチャーは、より有望な治療を選択するために治療を変更すべきであることを示し、それにより、有益な治療を遅らせる多大な損失を避け、効果のない薬物を投与する金銭的および罹患率の犠牲を避け得る。
本発明の組成物および方法は、非限定的に心血管疾患、癌、感染症、敗血症、神経学的疾患、中枢神経系関連の疾患、血管内関連の疾患および自己免疫関連の疾患を含む選択された疾患および障害と関連するバイオシグネチャーを同定または検出するために使用することができる。治療関連の診断はまた、薬物毒性、薬物耐性または薬物応答の予測に役立つ。治療関連の試験は、非限定的にたとえば免疫組織化学的試験、臨床化学、イムノアッセイ法、細胞ベースの技術、核酸試験または全身画像診断法を含む任意の適当な診断試験形式において展開されてもよい。治療関連の試験はさらに、治療の決定を支援する試験、治療毒性をモニターする試験または治療に対する応答の試験を含むことができるが、これらに限定されない。したがって、バイオシグネチャーを使用して、治療に対する対象の応答を予測またはモニターすることができる。バイオシグネチャーは、特定の治療を開始、排除または変更した後の様々な時点で対象ごとに判定することができる。
いくつかの態様において、本発明の組成物および方法は、バイオシグネチャーの1種または複数種の成分（すなわち、関心対象のマイクロRNA、小胞および／またはバイオマーカー）の量の変化、特定のバイオシグネチャーの1種または複数種の成分の量または成分に関して検出されるバイオシグネチャーに基づいて下される、対象が治療に応答しているかどうかの決定または予測を提供する。もう一つの態様において、対象の病状は、様々な時点でバイオシグネチャーを判定することによってモニターされる。病状の進行、後退または再発が判定される。また、時間経過と共に治療に対する応答を計測することもできる。したがって、本発明は、対象由来の生物学的試料からバイオシグネチャーを単離または検出する工程、特定のバイオシグネチャーの成分の全量を検出する工程、または1種または複数種の成分のバイオシグネチャー（たとえばバイオマーカーの存在、非存在または発現レベル）を検出する工程を含む、対象における疾患または他の病状の状態をモニターする方法を提供する。バイオシグネチャーは、疾患または病状の状態をモニターするために使用される。
また、小胞の1種または複数種の新規なバイオシグネチャーを同定することもできる。たとえば、ある薬物治療または治療計画に応答する対象から1種または複数種の小胞を単離し、それを基準、たとえばその薬物治療または治療計画に応答しない別の対象と比較することができる。バイオシグネチャー間の差を判定し、使用して、他の対象を、特定の薬物または治療計画に対する応答者または非応答者として同定することができる。
いくつかの態様において、バイオシグネチャーは、特定の疾患または病状が薬物に耐性であるかどうかを判定するために使用され、該疾患または病状が薬物耐性であるならば、医師は、そのような薬物治療のせいで貴重な時間を無駄にする必要はない。薬物選択または治療計画の早期確認を得るために、対象から得られた試料に関してバイオシグネチャーが判定される。そのバイオシグネチャーを使用して、特定の対象の疾患が薬物耐性と関連したバイオマーカーを有するかどうかを評価する。そのような判定は、医師が重要な時間および患者の財源を有効な治療に充てることを可能にする。
バイオシグネチャーは、癌を患う対象が、特定の癌治療に対して応答者である可能性が高いのか、非応答者である可能性が高いのかを同定するなど、癌のセラノーシスに使用することができる。主題の方法は、本明細書中、たとえば上記「表現型」の項で列挙されたものを含む癌のセラノーシスに使用することができる。癌は、非限定的に、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌（小細胞癌腫（燕麦細胞癌）、混合小細胞／大細胞癌腫および複合小細胞癌腫を含む）、結腸癌、乳癌、前立腺癌、肝臓癌、膵臓癌、脳癌、腎臓癌、卵巣癌、胃癌、黒色腫、骨癌、胃癌、乳癌、神経膠腫、神経膠芽腫、肝細胞癌腫、乳頭状腎臓癌腫、頭頸部扁平上皮細胞癌腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫または他の固形腫瘍を含む。
癌を患う対象由来の試料中の生物学的試料（たとえば細胞、細胞フラグメント、細胞由来細胞外小胞）中に存在する成分と結合したマーカーを含む循環バイオマーカーのバイオシグネチャーは、対象のための候補治療を選択するために使用することができる。バイオシグネチャーは、本明細書に提示される発明の方法にしたがって判定することができる。いくつかの態様において、候補治療は癌のための標準治療を含む。治療は、癌治療、たとえば放射線、外科手術、化学療法またはそれらの組み合わせであることができる。癌治療は、抗癌剤のような治療剤および化学療法計画であることができる。本発明の態様において使用されるさらなる薬物関連および規則は、いずれも参照により全体として本明細書に組み入れられる2010年2月12日出願の米国特許出願12/658,770；2010年2月11日出願のPCT国際特許出願PCT/US2010/000407；2010年10月27日出願のPCT国際特許出願PCT/US2010/54366；および2010年12月28日出願の米国特許仮出願61/427,788に見られる。たとえば、PCT/US2010/54366の「Table 4: Rules Summary for Treatment Selection」を参照すること。
バイオマーカー検出
本発明の組成物および方法は、生物学的試料と関連する表現型を特徴決定するために生物学的試料中の任意の有用なバイオマーカーを評価するために使用することができる。そのようなバイオマーカーは、すべての種類の生物学的実体、たとえばタンパク質、核酸、脂質、糖質、それらのいずれかの複合体および微小胞を含む。微小胞表面と結合した、または微小胞内に包含された様々な分子（本明細書においては「ペイロード」と呼ぶ）がバイオマーカーとして働くことができる。微小胞はまた、それ自体をバイオマーカーとして使用することもできる。
本発明のアプタマーは、微小胞集団のレベルまたは存在を評価するために使用することができる。たとえば図15B〜15Cを参照すること。本発明のアプタマーはまた、それらの特異的標的分子のレベルまたは存在を評価するために使用することもできる。たとえば図15Aを参照すること。加えて、本発明のアプタマーは、存在するアプタマーの標的分子を有する生物学的試料中に存在する成分を捕捉または単離するために使用される。たとえば、所与の微小胞表面抗原が細胞、細胞フラグメントまたは細胞由来細胞外小胞上に存在する場合。非限定的に本発明によって提供されるアプタマーを含む、バイオマーカーへの結合物質は、細胞、細胞フラグメントまたは細胞由来細胞外小胞を捕捉または単離するために使用されてもよい。たとえば図1A〜1B、1D〜1Eを参照すること。そのような捕捉または単離された実体をさらに特徴決定して、存在するさらなる表面抗原または内部「ペイロード」分子（すなわち、核酸分子、脂質、糖、ポリペプチドもしくはそれらの機能性フラグメントまたはバイオマーカーとして使用され得る、細胞環境中に存在する他の何か）を評価してもよく、その場合、1種または複数種のバイオマーカーが、所望の表現型、たとえば疾患または病状を評価するためのバイオシグネチャーを提供する。たとえば図1Fを参照すること。したがって、本発明のアプタマーは、関心対象の1種または複数種の微小胞表面抗原を評価するためだけでなく、生物学的試料中に存在する成分を分離するためにも使用され、その場合、その成分そのものをさらに評価して候補バイオシグネチャーを同定することができる。
本発明の方法は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75または100の異なるバイオマーカーの多重化分析を含むことができる。たとえば、示差的に標識された複数の粒子を用いて、小胞異種集団のアッセイを実施することができる。少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75または100個の示差的に標識された粒子があることができる。粒子は、たとえばタグにより、外部的に標識されてもよいし、または内在的に標識されてもよい。示差的に標識された各粒子を小胞のための捕捉物質、たとえば結合物質に結合させて、小胞を捕捉することができる。関心対象の表現型を特徴決定するために、一般的小胞バイオマーカー、起始細胞特異的バイオマーカーおよび疾患バイオマーカーに対する捕捉物質を含む複数の捕捉物質を選択することができる。そして、捕捉された小胞の1種または複数種のバイオマーカーを複数の結合物質によって検出することができる。結合物質は、検出を容易にするために直接標識されることができる。または、結合物質は二次的物質によって標識される。たとえば、結合物質は、小胞上のバイオマーカーに対する抗体であり得、その場合、結合物質はビオチンに結合する。二次的物質は、レポーターに結合したストレプトアビジンを含み、かつバイオマーカーを検出するために添加されることができる。いくつかの態様において、捕捉された小胞は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75または100の異なるバイオマーカーに関してアッセイされる。たとえば、複数の検出物質、すなわち、捕捉された小胞または小胞集団の複数のバイオマーカーの検出は、得られるシグナルを増大させて、感度、特異度または両方の増大およびより少量の試料の使用を可能にすることができる。検出は、非限定的に表3に示すような一つより多い一般的小胞マーカーを含む一つより多いバイオマーカーを用いて実施することができる。
イムノアッセイベースの方法（たとえばサンドイッチアッセイ法）を使用して、小胞のバイオマーカーを検出することができる。例はELISA法を含む。結合物質をウェルに結合することができる。たとえば、小胞の抗原に対するアプタマーまたは抗体のような結合物質をウェルに取り付けることができる。捕捉された小胞上のバイオマーカーを、本明細書に記載される方法に基づいて検出することができる。図1Aは、サンドイッチタイプのイムノアッセイ法の例示的模式図を示す。捕捉物質は、関心対象の小胞抗原、たとえば一般的小胞バイオマーカー、起始細胞マーカーまたは疾患マーカーに対する捕捉物質であることができる。図中、捕捉された小胞は、関心対象の小胞抗原に対する蛍光標識された結合物質（検出物質）を使用して検出される。複数の捕捉結合物質を、たとえばアレイ上の区別可能なアドレスまたはイムノアッセイプレートの異なるウェルにおいて使用することができる。検出結合物質は、捕捉結合物質と同じ抗原に対するものであることもできるし、または他のマーカーに対して向けられたものであることもできる。捕捉結合物質は、任意の有用な結合物質、たとえばつながれたアプタマー、抗体またはレクチンであることができ、および／または、検出抗体は、たとえば検出可能な（たとえば標識された）アプタマー、抗体、レクチンまたは他の結合タンパク質もしくは実体で同様に置換されていることもできる。ある態様において、一般的小胞バイオマーカー、起始細胞マーカーおよび／または疾患マーカーに対する一つまたは複数の捕捉物質が、一般的小胞バイオマーカー、たとえば、非限定的にCD9、CD63およびCD81の一つまたは複数を含むテトラスパニン分子または本明細書の表3の他のマーカーに対する検出物質と共に使用される。微小胞表面抗原の例は、本明細書中、たとえば表3または4に開示されているか、または当技術分野において公知であり、本発明の方法および組成物に有用な例は、「Circulating Biomarkers for Disease」と題する、2011年4月6日に出願された国際特許出願PCT/US2011/031479に開示されている。
図1Dは、本発明の方法にしたがって小胞を分析するための例示的模式図を示す。捕捉物質を使用して小胞を捕捉し、検出物質を使用して捕捉された小胞を検出し、捕捉され、検出された微小胞のレベルまたは存在を使用して表現型を特徴決定する。捕捉物質、検出物質および表現型の特徴決定は、本明細書に記載されるもののいずれかであることができる。たとえば、捕捉物質は、関心対象の小胞抗原を認識する基体につながれた抗体またはアプタマーを含み、検出物質は、関心対象の抗原に対する標識された抗体またはアプタマーを含み、表現型の特徴決定は、疾患の診断、予後判定またはセラノーシスを含む。図1Dのi）に示すスキームにおいては、一般的小胞バイオマーカー（100）に対する一つまたは複数の捕捉物質によって小胞の集団を捕捉する。次いで、捕捉された小胞を、起始細胞バイオマーカー（101）および／または疾患特異的バイオマーカー（102）に対する検出物質で標識する。起始細胞検出物質のみが使用されるならば（101）、表現型を特徴決定する（103）ために使用されるバイオシグネチャーは、一般的小胞マーカー（100）および起始細胞バイオマーカー（101）を含むことができる。疾患検出物質のみが使用されるならば（102）、表現型を特徴決定する（103）ために使用されるバイオシグネチャーは、一般的小胞マーカー（100）および疾患バイオマーカー（102）を含むことができる。あるいはまた、検出物質を使用して起始細胞バイオマーカー（101）および疾患特異的バイオマーカー（102）の両方を検出する。この場合、表現型を特徴決定する（103）ために使用されるバイオシグネチャーは、一般的小胞マーカー（100）、起始細胞バイオマーカー（101）および疾患バイオマーカー（102）を含むことができる。バイオマーカーの組み合わせは、関心対象の表現型を特徴決定するように選択され、かつ本明細書中、たとえば表3または4に記載されるバイオマーカーおよび表現型から選択することができる。
図1Dのii）に示すスキームにおいては、起始細胞バイオマーカー（110）および／または疾患バイオマーカー（111）に対する一つまたは複数の捕捉物質によって小胞集団を捕捉する。次いで、捕捉された小胞を、一般的小胞バイオマーカー（112）に対する検出物質を使用して検出する。起始細胞捕捉物質のみが使用されるならば（110）、表現型を特徴決定する（113）ために使用されるバイオシグネチャーは、起始細胞バイオマーカー（110）および一般的小胞マーカー（112）を含むことができる。疾患バイオマーカー捕捉物質のみが使用されるならば（111）、表現型を特徴決定する（113）ために使用されるバイオシグネチャーは、疾患バイオマーカー（111）および一般的小胞バイオマーカー（112）を含むことができる。あるいはまた、一つまたは複数の起始細胞バイオマーカー（110）および一つまたは複数の疾患特異的バイオマーカー（111）に対する捕捉物質を使用して小胞を捕捉する。この場合、表現型を特徴決定する（113）ために使用されるバイオシグネチャーは、起始細胞バイオマーカー（110）、疾患バイオマーカー（111）および一般的小胞マーカー（113）を含むことができる。バイオマーカーの組み合わせは、関心対象の表現型を特徴決定するように選択され、かつ本明細書に記載されるバイオマーカーおよび表現型から選択することができる。
本発明の方法は、有用なバイオマーカーの任意の組み合わせを使用する、関心対象の微小胞の捕捉および検出を含む。たとえば、起始細胞、疾患特異的または一般的小胞マーカーの任意の所望の組み合わせに対する1種または複数種の結合物質を使用して微小胞集団を捕捉することができる。そして、起始細胞、疾患特異的または一般的小胞マーカーの任意の所望の組み合わせに対する1種または複数種の結合物質を使用して、捕捉された微小胞を検出することができる。図1Eは、そのような構成の流れ図を表す。起始細胞バイオマーカー（140）、疾患バイオマーカー（141）および一般的小胞バイオマーカー（142）の任意の一つまたは複数を使用して微小胞集団を捕捉する。その後、起始細胞バイオマーカー（143）、疾患バイオマーカー（144）および一般的小胞バイオマーカー（145）の任意の一つまたは複数を使用して、捕捉された微小胞集団を検出する。そして、捕捉され、検出された微小胞のバイオシグネチャーを使用して表現型を特徴決定する。バイオマーカー組み合わせは、関心対象の表現型を特徴決定するように選択され、かつ本明細書に記載されるバイオマーカーおよび表現型から選択することができる。
微小胞ペイロード分子をバイオシグネチャーパネルのメンバーとして評価することができる。ペイロード分子は、細胞、細胞フラグメントまたは小胞膜内に含まれる生物学的実体のいずれかを含む。これらの実体は、非限定的に、核酸、たとえばmRNA、マイクロRNAまたはDNAフラグメント；タンパク質、たとえば可溶性および膜関連タンパク質；糖質；脂質；代謝産物；および様々な小分子、たとえばホルモンを含む。ペイロードは、細胞環境中に小胞が形成されるとき封じ込められる細胞環境の一部であることができる。本発明のいくつかの態様においては、小胞表面抗原を検出することに加えて、ペイロードを分析する。特異的小胞集団を上記のように捕捉したのち、捕捉された小胞中のペイロードを使用して表現型を特徴決定することができる。たとえば、基体上に捕捉された小胞をさらに単離して、その中のペイロードを評価することができる。あるいはまた、捕捉することなく試料中の小胞を検出し、ソートする。そのように検出された小胞をさらに単離して、その中のペイロードを評価することができる。ある態様においては、小胞集団をフローサイトメトリーによってソートし、ソートされた小胞中のペイロードを分析する。図1Fのiii）に示すスキームにおいては、起始細胞バイオマーカー（120）、疾患バイオマーカー（121）および／または一般的小胞マーカー（122）の一つまたは複数を使用して小胞集団を捕捉および／または検出する（120）。単離された小胞のペイロードを評価する（123）。ペイロード内で検出されたバイオシグネチャーを使用して表現型を特徴決定することができる（124）。非限定的な例においては、一つまたは複数の関心対象の小胞抗原に対する抗体を使用して、患者由来の血漿試料中の小胞集団を分析することができる。抗体は、所望の小胞集団を単離するために基体につながれた捕捉抗体であることができる。あるいはまた、抗体を直接標識し、標識された小胞をフローサイトメトリーによるソートによって単離することができる。単離された小胞集団から抽出されるマイクロRNAまたはmRNAの存在またはレベルを使用してバイオシグネチャーを検出することができる。そして、そのバイオシグネチャーは、患者の診断、予後判定またはセラノーシスのために使用される。
他の態様においては、小胞または細胞ペイロードを、はじめに小胞の部分集団を捕捉または検出することなく、集団（たとえば細胞または小胞）中で分析する。たとえば、細胞または細胞外小胞集団は一般に、遠心分離法、ろ過法、クロマトグラフィー法または本明細書に記載され、当技術分野において公知である他の技術を使用して、試料から単離することができる。その後、そのような試料成分のペイロードを分析して、バイオシグネチャーを検出し、表現型を特徴決定することができる。図1Fのv）に示すスキームにおいては、小胞集団を単離し（130）、単離された小胞のペイロードを評価する（131）。ペイロード内で検出されたバイオシグネチャーを使用して表現型を特徴決定することができる（132）。非限定的な例においては、サイズ排除および膜ろ過を使用して、患者由来の血漿試料から小胞集団を単離する。小胞集団から抽出されたマイクロRNAまたはmRNAの存在またはレベルを使用してバイオシグネチャーを検出する。そして、そのバイオシグネチャーは、患者の診断、予後判定またはセラノーシスのために使用される。
小胞集団を検出するために使用されるバイオマーカーは、関心対象の微小胞集団、たとえば、非限定的に癌、前癌状態、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患もしくは障害、心臓血管疾患もしくは障害、神経学的疾患もしくは障害、感染症または疼痛を含む選択された病状または疾患の診断、予後判定またはセラノーシスを提供する微小胞の集団を検出するように選択されることができる。さらなる詳細に関しては、本明細書の「表現型」の項を参照すること。ある態様において、バイオマーカーは、EpCam（上皮細胞接着分子）、CD9（テトラスパニンCD9分子）、PCSA（前立腺細胞表面抗原、Rokhlin et al., 5E10: a prostate-specific surface-reactive monoclonal antibody. Cancer Lett. 1998 131:129-36を参照）、CD63（テトラスパニンCD63分子）、CD81（テトラスパニンCD81分子）、PSMA（FOLH1、葉酸ヒドロラーゼ（前立腺特異的膜抗原）1）、B7H3（CD276分子）、PSCA（前立腺幹細胞抗原）、ICAM（細胞間接着分子）、STEAP（STEAP1、前立腺の6回膜貫通上皮抗原1）、KLK2（カリクレイン関連ペプチダーゼ2）、SSX2（滑膜肉腫、Xブレイクポイント2）、SSX4（滑膜肉腫、Xブレイクポイント4）、PBP（前立腺結合タンパク質）、SPDEF（ets転写因子を含むSAM標的化ドメイン）、EGFR（上皮細胞成長因子受容体）およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。これらのマーカーの一つまたは複数は、非限定的に癌腫、前立腺癌、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、卵巣癌、黒色腫、脳癌または本明細書に開示される他のタイプの癌を含む癌を検出する場合のような特定の病状のためのバイオシグネチャーを提供することができる。ある態様においては、これらのマーカーの一つまたは複数への結合物質を使用して微小胞集団を捕捉し、本発明のアプタマーを使用して、本明細書に記載されるような捕捉小胞の検出を支援する。他の態様においては、本発明のアプタマーを使用して微小胞集団を捕捉し、これらのマーカーの一つまたは複数への結合物質を使用して、本明細書に記載されるような捕捉小胞の検出を支援する。結合物質は、本明細書に開示される、または当技術分野において公知であるような任意の有用な結合物質、たとえば抗体またはアプタマーであることができる。
表現型を特徴決定する方法は、関心対象の生物学的試料中に存在する成分または成分の集団を評価するための技術の組み合わせを用いることができる。たとえば、本発明のアプタマーを使用して、一つの細胞もしくは一つの細胞外小胞または細胞集団もしくは小胞集団を評価することができる。試料は、それぞれが別々に分析されるいくつかのアリコットに分割され得る。たとえば、一つまたは複数のアリコットのタンパク質含量を測定し、一つまたは複数の他のアリコットのマイクロRNA含量を測定する。タンパク質含量とマイクロRNA含量とを組み合わせて表現型を特徴決定することができる。もう一つの態様においては、関心対象の生物学的試料中に存在する成分を単離し、その中のペイロードを評価する（たとえば、本発明のアプタマーを使用して小胞の集団または部分集団を捕捉し、単離された小胞中に存在する核酸またはタンパク質をさらに評価する）。
一つの態様において、微小胞表面マーカーへの結合物質を使用することにより、所与の表面マーカーを有する小胞の集団を単離することができる。たとえば図1A、1B、15Aを参照すること。結合物質は、本発明の方法を使用して微小胞表面マーカーを標的化することが同定されたアプタマーであることができる。単離された小胞は、さらなるバイオマーカー、たとえば表面含有物またはペイロードに関して評価されるが、それは、アプタマー特異的標的の検出と同時に実施することもできるし、アプタマー特異的標的検出の前または後で実施することもできる。
バイオシグネチャーは、本明細書に開示されるように、循環バイオマーカー、たとえばマイクロRNA、タンパク質、小胞または他のバイオマーカーの存在、レベルまたは濃度を検出することによって定性的または定量的に検出することができる。これらのバイオシグネチャー成分は、当業者には公知のいくつかの技術を使用して検出することができる。たとえば、バイオマーカーは、マイクロアレイ解析、ポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）（PCRベースの方法、たとえばリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応法（RT-PCR）、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応法（Q-PCR/qPCR）などを含む）、対立遺伝子特異的プローブとのハイブリダイゼーション、酵素的突然変異検出、ライゲーション連鎖反応法（LCR）、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ法（OLA）、フローサイトメトリーヘテロ二本鎖解析法、ミスマッチの化学的切断、質量分析法、核酸配列決定法、一本鎖コンフォメーション長多型解析法（SSCP）、変性勾配ゲル電気泳動法（DGGE）、温度勾配ゲル電気泳動法（TGGE）、制限断片長多型解析法、連続的遺伝子発現解析法（SAGE）またはそれらの組み合わせによって検出することができる。核酸のようなバイオマーカーは、検出前に増幅することができる。バイオマーカーはまた、イムノアッセイ法、免疫ブロット法、免疫沈降法、酵素結合免役吸着アッセイ法（ELISA；EIA）、ラジオイムノアッセイ法（RIA）、フローサイトメトリー法または電子顕微鏡（EM）によって検出することもできる。
バイオシグネチャーは、本明細書に記載されるような、捕捉物質および検出物質のいずれとしても機能する本発明のアプタマーを使用して検出することができる。捕捉物質は、抗体、アプタマー、またはバイオマーカーを認識しかつバイオマーカーを捕捉するために使用することができる他の実体を含むことができる。捕捉することができるバイオマーカーは、循環バイオマーカー、たとえば体液中に溶解したタンパク質、核酸、脂質または生物学的複合体を含む。同様に、捕捉物質は、小胞を捕捉するために使用することもできる。検出物質は、抗体、またはバイオマーカーを認識しかつバイオマーカー小胞を検出するために使用することができる他の実体、もしくは小胞を認識しかつ小胞を検出するのに有用である他の実体を含むことができる。いくつかの態様において、検出物質は標識され、その標識が検出され、それにより、バイオマーカーまたは小胞が検出される。検出物質は、結合物質、たとえば抗体またはアプタマーであることができる。他の態様において、検出物質は、膜タンパク質標識物質のような小分子を含む。たとえば、Alroyらの米国特許公開公報US2005/0158708に開示された膜タンパク質標識物質を参照すること。ある態様においては、本明細書に記載されるように小胞が単離または捕捉され、その小胞を検出するために一つまたは複数の膜タンパク質標識物質が使用される。多くの場合、捕捉および検出物質によって認識される抗原または他の小胞部分は互換可能である。
非限定的な態様において、起始細胞特異的抗原を表面に有し、癌特異的抗原を表面に有する小胞は、細胞特異的抗原に特異的である結合物質を使用して、たとえば捕捉抗体またはアプタマーを基体につなぐことによって捕捉され、次いで、その小胞は、疾患特異的抗原への結合物質を使用して、たとえば検出に使用される結合物質を蛍光色素で標識し、その色素によって放出される蛍光放射線を検出することによって検出される。
結合物質（たとえば本発明のアプタマー）の標的分子が病状または疾患の評価に関して情報提供的である場合、その同じ結合物質は、標的分子（たとえば関心対象の微小胞表面抗原）を含む成分を捕捉するために使用されることもできるし、標的分子、たとえば結合物質1−抗原−結合物質2*を検出するために、検出可能な標識を含むように改変されることもできることが当業者には明らかであろう（ここで、*は検出可能な標識を示し；結合物質1および結合物質2は、同じ結合物質であってもよいし、または異なる結合物質であってもよい（たとえば同じアプタマーまたは異なるアプタマー））。加えて、結合物質1および結合物質2は、全く異なるカテゴリーの結合物質（たとえば、抗体、アプタマー、合成抗体、ペプチド−核酸分子またはその標的分子と特異的に結合するように構成されている任意の分子）から選択することができる。そのような結合分子は、標的分子に対するそれらの結合特異性のみに基づいて選択することができる。
本発明のアプタマーを使用してバイオマーカーを検出する、または試料成分を捕捉する技術は、平面基体、たとえばアレイ（たとえばバイオチップまたはマイクロアレイ）を、特定のバイオシグネチャーの検出を容易にする捕獲物質として基体に固定化された分子と共に使用することを含む。アレイは、一つまたは複数のバイオマーカーをアッセイするためのキットの一部として提供することができる。本発明の組成物および方法において有用である上記結合物質のさらなる例が、参照により全体として本明細書に組み入れられる「Circulating Biomarkers for Disease」と題する2011年4月6日出願の国際特許出願PCT/US2011/031479に開示されている。本発明のアプタマーは、前駆症状的疾患を含む疾患の検出および診断のためのアレイに含められることができる。いくつかの態様において、アレイは、関心対象のバイオマーカーを特異的に同定するように選択された生体分子を含むカスタムアレイを含む。カスタマイズされたアレイは、統計的性能を高めるバイオマーカー、たとえばバイオシグネチャーを同定するさらなる生体分子を検出するように修正されることができ、それが、多変量予測モデル（たとえばロジスティック回帰、弁別分析または回帰木モデル）における交差確認エラー率の改善につながる。いくつかの態様において、カスタマイズされたアレイは、疾患、病状または徴候の生物学を研究し、所定の生理学的状態においてバイオシグネチャーをプロファイリングするように構成される。カスタマイズされたアレイに含まれるマーカーは、統計的基準、たとえば、表現型または生理学的状態を区別する際に所望のレベルの統計的有意性を有することに基づいて選択される。いくつかの態様において、マイクロアレイ上の生体分子を排除または包含するために、p値＝0.05の標準有意性が選択される。p値は、複数の比較に関して補正することができる。説明のための例として、有疾患対象または無疾患対象由来の試料から抽出された核酸を、何千もの遺伝子配列に結合する高密度マイクロアレイにハイブリダイズさせることができる。有疾患試料または無疾患試料の間でレベルが有意に異なる核酸を、試料を有疾患または無疾患として区別するためのバイオマーカーとして選択することができる。選択されたバイオマーカーを検出するために、カスタマイズされたアレイを構成することができる。いくつかの態様において、カスタマイズされたアレイは、比較的少ない数、たとえば何千ではなく何十または何百のアドレス指定可能な結合物質を有するアレイをいう低密度マイクロアレイを含む。低密度アレイは基体上に形成されることができる。いくつかの態様において、カスタマイズ可能な低密度アレイは、プレートウェル中のPCR増幅、たとえばTaqMan（登録商標）Gene Expression Assays（Applied Biosystems by Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA）を使用する。
本発明のアプタマーまたは他の有用な結合物質は、固い表面もしくは基体に直接的に結合してもよいし、または間接的に結合してもよい。たとえば図1A〜1B、14、15Aを参照すること。固い表面または基体は、非限定的に、マイクロアレイおよびウェルによって提供される面、粒子、たとえばビーズ、カラム、光ファイバ、ワイプ、ガラスおよび修飾または官能化ガラス、石英、雲母、ジアゾ化膜（紙またはナイロン）、ポリホルムアルデヒド、セルロース、酢酸セルロース、紙、セラミックス、金属、メタロイド、半導体、量子ドット、コートされたビーズまたは粒子、他のクロマトグラフィー材料、磁性粒子；プラスチック（アクリル樹脂、ポリスチレン、スチレンまたは他の材料のコポリマー、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、Teflon材料などを含む）、多糖類、ナイロンもしくはニトロセルロース、樹脂、シリカもしくはシリカ系材料、たとえばシリコンおよび変性シリコン、炭素、金属、無機ガラス、プラスチック、セラミックス、導電性ポリマー（ポリピロールおよびポリインドールのようなポリマーを含む）；ミクロもしくはナノ構造化面、たとえば核酸タイリングアレイ、ナノチューブ、ナノワイヤもしくはナノ粒子状装飾面；または多孔質面もしくはゲル、たとえばメタクリレート、アクリルアミド、糖ポリマー、セルロース、シリケートまたは他の繊維状もしくはストランド状ポリマーを含む、結合物質を直接的または間接的に取り付けることができる任意の物理的に分離可能な固体であることができる。加えて、当技術分野において公知であるように、基体は、パッシブまたは化学的誘導体化コーティングを使用して、デキストラン、アクリルアミド、ゼラチンまたはアガロースのようなポリマーを含む任意の数の材料でコートされてもよい。そのようなコーティングは、生物学的試料とのアレイの使用を容易にすることができる。
以下の実施例に提供されるように、アプタマーまたは他の有用な結合物質は、検出可能な実体または標識にコンジュゲートさせることができる。適切な標識は、非限定的に、磁気標識、蛍光部分、酵素、化学発光プローブ、金属粒子、非金属コロイド粒子、高分子色素粒子、顔料分子、顔料粒子、電気化学的活性種、半導体ナノ結晶または量子ドットもしくは金粒子を含む他のナノ粒子、フルオロフォア、量子ドットまたは放射性標識を含む。タンパク質標識は、以下に記すような、緑色蛍光タンパク質（GFP）およびそのバリアント（たとえばシアン色蛍光タンパク質および黄色蛍光タンパク質）；および発光タンパク質、たとえばルシフェラーゼを含む。放射性標識は、非限定的に、放射性同位体（放射性核種）、たとえば3H、11C、14C、18F、32P、35S、64Cu、68Ga、86Y、99Tc、111In、123I、124I、125I、131I、133Xe、177Lu、211Atまたは213Biを含む。蛍光標識は、非限定的に、とりわけ、希土類キレート（たとえばユーロピウムキレート）、ローダミン；非限定的にFITC、5-カルボキシフルオレセイン、6-カルボキシフルオレセインを含むフルオレセインタイプ；非限定的にTAMRAを含むローダミンタイプ；ダンシル；リサミン；シアニン；フィコエリスリン；テキサスレッド；Cy3、Cy5、ダポキシル、NBD、カスケードイエロー、ダンシル、PyMPO、ピレン、7-ジエチルアミノクマリン-3-カルボン酸および他のクマリン誘導体、マリーナブルー（商標）、パシフィックブルー（商標）、カスケードブルー（商標）、2-アントラセンスルホニル、PyMPO、3,4,9,10-ペリレン-テトラカルボン酸、2,7-ジフルオロフルオレセイン（オレゴングリーン（商標）488-X）、5-カルボキシフルオレセイン、テキサスレッド-X（商標）、Alexa Fluor 430、5−カルボキシテトラメチルローダミン（5-TAMRA）、6-カルボキシテトラメチルローダミン（6-TAMRA）、BODIPY FL、ビマンおよびAlexa Fluor 350、405、488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、647、660、680、700および750ならびにそれらの誘導体を含む。たとえば「The Handbook--A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies」第10版（インターネット上、probes(dot)invitrogen(dot)com/handbookで入手可能）を参照すること。蛍光標識は、FAM、dRHO、5-FAM、6FAM、dR6G、JOE、HEX、VIC、TET、dTAMRA、TAMRA、NED、dROX、PET、BHQ、Gold540およびLIZの一つまたは複数であることができる。
従来技術を使用して、アプタマーは直接的または間接的に標識されることができ、たとえば、標識はビオチン−ストレプトアビジンを介してアプタマーに取り付けられる（たとえば、ビオチン化アプタマーを合成すると、それがストレプトアビジン分子に結合することができ、そのストレプトアビジン分子そのものが、検出可能な標識にコンジュゲートする；非限定的な例は、ストレプトアビジン、フィコエリスリンにコンジュゲートされている（SAPE））。多工程手法を使用する化学結合の方法は、ビオチン化、たとえばこれらの化合物のスクシンイミドエステルを使用するトリニトロフェノール（TNP）またはジゴキシゲニンの結合を含む。ビオチン化は、たとえば、D-ビオチニル-N-ヒドロキシスクシンイミドの使用によって達成することができる。スクシンイミド基は、7を超えるpHでアミノ基と効果的に反応し、約pH8.0〜約pH8.5で優先的に反応する。または、アプタマーは標識されず、後で二次抗体と接触させられ、第一の抗体が関心対象の抗原と結合したのち、その二次抗体が標識される。
また、様々な酵素−基体標識を本発明の組成物または方法と共に使用し得る。そのような酵素−基体標識は市販されている（たとえば米国特許第4,275,149号）。酵素は概して、様々な技術を使用して計測することができる色素生成基体の化学的変化を触媒する。たとえば、酵素は、基体における変色を触媒し得、それを分光測光的に計測することができる。または、酵素は、基体の蛍光または化学発光を変化させ得る。酵素標識の例は、ルシフェラーゼ（たとえばホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ；米国特許第4,737,456号）、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、たとえばセイヨウワサビワサビペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリホスファターゼ（AP）、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類オキシダーゼ（たとえばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環オキシダーゼ（たとえばウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどを含む。酵素−基体組み合わせの例は、セイヨウワサビワサビペルオキシダーゼ（HRP）と基体としての水素ペルオキシダーゼ（水素ペルオキシダーゼが色素前駆体（たとえばオルトフェニレンジアミン（OPD）または3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン塩酸塩（TMB））を酸化させる）；アルカリホスファターゼ（AP）と色素生成基体としてのp−ニトロフェニルホスフェート；およびβ-D-ガラクトシダーゼ（β-D-Gal）と色素生成基体（たとえばp-ニトロフェニル-β-D-ガラクトシダーゼ）または蛍光生成基体4−メチルウンベリフェニル-β-D-ガラクトシダーゼを含むが、それらに限定されない。
アプタマーは、平面基体のような基体に結合することができる。平面アレイは概して、アレイフォーマットにある生体分子のアドレス指定可能位置（たとえばパッド、アドレスまたは微小位置）を含む。アレイのサイズはアレイの組成および最終用途に依存する。2個の異なる分子から何千個もの分子までを含むアレイを製造することができる。概して、アレイは、アレイの最終用途および製造方法に依存して、2個から100,000個以上までの分子を含む。本発明と共に使用するためのマイクロアレイは、関心対象のバイオシグネチャー中に存在するバイオマーカー、たとえばマイクロRNAまたはそのバイオシグネチャーを構成する他の生体分子もしくは小胞を同定または捕捉する少なくとも一つの生体分子を含む。いくつかのアレイにおいては、異なる組成または同一組成のいずれかの複数の基体が使用される。したがって、平面アレイは、より小さい複数の基体を含み得る。
本発明は、バイオマーカー、たとえば関心対象のバイオシグネチャーと結合したバイオマーカーを検出するための多くのタイプのアレイを利用することができる。有用なアレイまたはマイクロアレイは、非限定的に、DNAマイクロアレイ、たとえばcDNAマイクロアレイ、オリゴヌクレオチドマイクロアレイおよびSNPマイクロアレイ、マイクロRNAアレイ、タンパク質マイクロアレイ、抗体マイクロアレイ、組織マイクロアレイ、細胞マイクロアレイ（トランスフェクションマイクロアレイとも呼ばれる）、化学物質マイクロアレイおよび糖質アレイ（グリコアレイ）を含む。これらのアレイは上記でさらに詳細に説明されている。いくつかの態様において、マイクロアレイは、バイオマーカー結合が間接的に（たとえば蛍光を介して）モニターされる、認識分子（たとえばアプタマーまたは抗体）の高密度固定化アレイを提供するバイオチップを含む。
バイオシグネチャーの一つまたは複数のバイオマーカーを検出するために使用することができ、かつ1種または複数種のアプタマーを含むアレイまたはマイクロアレイは、いずれも参照により全体として本明細書に組み入れられる米国特許第6,329,209号；第6,365,418号；第6,406,921号；第6,475,808号；および第6,475,809号ならびに米国特許出願第10/884,269号に記載されている方法にしたがって製造することができる。本明細書に記載されるバイオマーカーのセットの特定の選択を検出するためのカスタムアレイは、これらの特許に記載されている方法を使用して製造することができる。また、非限定的にAffymetrix（Santa Clara, CA）、Illumina（San Diego, CA）、Agilent（Santa Clara, CA）、Exiqon（Denmark）またはInvitrogen（Carlsbad, CA）から市販されているものを含む市販のマイクロアレイを使用して本発明の方法を実施することもできる。カスタムおよび／または市販のアレイは、本明細書に記載されるような、タンパク質、核酸ならびに他の生物学的分子および実体（たとえば細胞、小胞、ビリオン）の検出のためのアレイを含む。
いくつかの態様においては、複数の捕捉分子、たとえばタンパク質、ペプチドまたはさらなる核酸分子がアレイ上に配置される。特定の態様において、タンパク質は、タンパク質の変性を最小限にする、タンパク質の活性の変化を最小限にする、またはタンパク質とタンパク質が固定化される表面との間の相互作用を最小限にする方法および材料を使用して固定化される。捕捉分子は、本発明の1種または複数種のアプタマーを含むことができる。一つの態様において、アレイは、アプタマーのプールのハイブリダイゼーションのために構成される。そして、アレイは、試料に結合するプールメンバーを同定するために使用されることができ、それにより、表現型の特徴決定を容易にする。さらなる詳細に関しては、図15B〜15Cおよび関連の開示を参照すること。
有用なアレイ表面は、任意の所望の形、形態またはサイズであり得る。表面の非限定的な例は、チップ、連続面、曲面、フレキシブル面、フィルム、プレート、シートまたはチューブを含む。表面は、約1平方ミクロンから約500cm2までの範囲の面積を有することができる。表面の面積、長さおよび幅は、実施されるアッセイの要件にしたがって異なり得る。考慮される要素は、たとえば、取り扱い易さ、表面を形成している材料の制限、検出システムの要件、付着システム（たとえばアレイヤ）の要件などを含み得る。
特定の態様においては、結合アイランドまたは固定化生体分子の群またはアレイを分離するための物理的手段を用いることが望ましく、そのような物理的分離は、様々な関心対象溶液への様々な群またはアレイの暴露を容易にする。したがって、特定の態様において、アレイは、任意の数のウェルを有するマイクロウェルプレート内に配置される。そのような態様においては、ウェルの底がアレイ形成のための面として働いてもよいし、またはアレイが他の面に形成されたのち、ウェルの中に配置されてもよい。ウェルを有しない面が使用されるような特定の態様においては、結合アイランドが形成されてもよいし、または分子を表面に固定化し、アイランドまたは生体分子に対応するように空間的に配設された穴を有するガスケットがその表面に配置されてもよい。そのようなガスケットは好ましくは液密である。ガスケットは、アレイを製造するプロセスの任意の時点で表面に配置され得、群またはアレイの分離がもはや不要であるならば、取り除かれてもよい。
いくつかの態様において、固定化された分子は、その固定化された分子と接触する生物学的試料中に存在する一つまたは複数のバイオマーカーまたは小胞に結合することができる。いくつかの態様において、固定化された分子は、その固定化された分子と接触する一つまたは複数の小胞中に存在する分子を修飾する、またはその分子によって修飾される。試料を接触させることは一般に、試料をアレイの上に重ねることを含む。
溶液中の分子またはアレイ上に固定化された分子の修飾または結合は、当技術分野において公知の検出技術を使用して検出することができる。そのような技術の例は、免疫学的技術、たとえば競合的結合アッセイ法およびサンドイッチアッセイ法；共焦点スキャナ、共焦点顕微鏡またはCCDベースのシステムのような機器および蛍光、蛍光偏光（FP）、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）、全内反射蛍光（TIRF）、蛍光相関分光法（FCS）のような技術を使用する蛍光検出法；比色／分光分析技術；表面で吸着される物質の質量の変化を計測する表面プラズモン共鳴法；従来の放射性同位体結合およびシンチレーション近接アッセイ法（SPA）を含む、放射性同位体を使用する技術；質量分析法、たとえばマトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析法（MALDI）およびMALDI飛行時間（TOF）型質量分析法；タンパク質フィルムの厚さを計測する光学的方法である偏光解析法；表面に吸着する物質の質量を計測するための非常に高感度の方法である水晶結晶板微量天秤法（QCM）；走査型プローブ顕微鏡法、たとえば原子間力顕微鏡法（AFM）、走査力顕微鏡法（SFM）または走査型電子顕微鏡法（SEM）；ならびに電気化学、インピーダンス、音響、マイクロ波およびIR／ラマン検出のような技術を含む。たとえば、いずれも参照により全体として本明細書に組み入れられるMere L, et al., "Miniaturized FRET assays and microfluidics: key components for ultra-high-throughput screening," Drug Discovery Today 4(8):363-369 (1999)およびその中に引用されている参照文献；Lakowicz J R, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd Edition, Plenum Press (1999)またはJain KK: Integrative Omics, Pharmacoproteomics, and Human Body Fluids. In: Thongboonkerd V, ed., ed. Proteomics of Human Body Fluids: Principles, Methods and Applications. Volume 1: Totowa, N. J.: Humana Press, 2007を参照すること。
マイクロアレイ技術は、質量分析法（MS）および他のツールと組み合わせることができる。質量分析計へのエレクトロスプレーインタフェースをマイクロ流体装置中の毛管と一体化させることができる。たとえば、一つの市販のシステムは、固有かつ明確な電気泳動移動度を有する蛍光標識であるeTagレポーターを含み；各標識が切断可能な結合を介して生物学的または化学的プローブに結合している。各eTagレポーターの明確な移動度アドレスが、これらのタグの混合物が毛管電気泳動によって速やかに逆重畳積分され、定量化されることを可能にする。このシステムは、同じ試料からの同時並行的な遺伝子発現、タンパク質発現およびタンパク質機能分析を可能にする。参照により全体として本明細書に組み入れられるJain KK: Integrative Omics, Pharmacoproteomics, and Human Body Fluids. In: Thongboonkerd V, ed., ed. Proteomics of Human Body Fluids: Principles, Methods and Applications. Volume 1: Totowa, N. J.: Humana Press, 2007。
バイオチップは、マイクロ流体またはナノ流体アッセイのための構成要素を含むことができる。マイクロ流体装置は、バイオマーカーを単離または分析する、たとえばバイオシグネチャーを決定するために使用することができる。マイクロ流体システムは、小胞を単離、捕捉または検出し、マイクロRNAを検出し、循環バイオマーカーを検出し、バイオシグネチャーを検出するための一つまたは複数のプロセスまたは他のプロセスの小型化および区画化を可能にする。マイクロ流体装置は、システムの少なくとも一つの局面において一つまたは複数の検出試薬を使用することができ、そのような検出試薬を使用して一つまたは複数のバイオマーカーを検出することができる。一つの態様において、装置は、単離または結合した小胞上のバイオマーカーを検出する。様々なプローブ、抗体、タンパク質または他の結合物質を使用して、マイクロ流体システム内のバイオマーカーを検出することができる。検出物質は、マイクロ流体装置の様々な区画中に固定化されてもよいし、または装置の様々なチャネルを通してハイブリダイゼーションまたは検出反応に導入されてもよい。
マイクロ流体装置中の小胞を溶解させ、その内容物、たとえばタンパク質または核酸、たとえばDNAまたはRNA、たとえばmiRNAまたはmRNAをマイクロ流体装置内で検出することができる。核酸は、マイクロ流体装置内で、検出前に増幅されてもよいし、または直接検出されてもよい。したがって、マイクロ流体システムはまた、様々なバイオマーカーの検出を多重化するために使用することもできる。ある態様においては、小胞がマイクロ流体装置内で捕捉され、捕捉された小胞が溶解され、小胞ペイロード由来のマイクロRNAのバイオシグネチャーが判定される。バイオシグネチャーはさらに、小胞を捕捉するために使用される捕捉物質を含むことができる。
新規なナノ加工技術が、高密度の精密アレイ、たとえば不均一ナノアレイとしても知られるヌクレオチドベースのチップおよびタンパク質アレイの加工に依存するバイオセンシング用途の可能性を開拓している。ナノ流体工学が、マイクロチップ中の流体分析対象物の量をナノリットルレベルまでさらに減らすことを可能にし、ここで使用されるチップがナノチップと呼ばれる。たとえば、参照により全体として本明細書に組み入れられるUnger M et al., Biotechniques 1999; 27(5): 1008-14、Kartalov EP et al., Biotechniques 2006; 40(1):85-90を参照すること。現在、市販のナノチップは、試料を試薬と合わせ、混合し、反応をモニターすることによって実施することができる簡単な一工程アッセイ、たとえば総コレステロール、総タンパク質またはグルコースアッセイを提供する。液クロマトグラフィー（LC）およびナノLC分離に基づくゲルフリーの分析法（いずれも参照により全体として本明細書に組み入れられるCutillas et al. Proteomics, 2005; 5:101-112およびCutillas etal., Mol Cell Proteomics 2005; 4:1038-1051）をナノチップと組み合わせて使用することもできる。
疾患、病状、症候群または生理学的状態を同定するのに適したアレイはキットに含まれることができる。キットは本発明のアプタマーを含むことができ、非限定的な例としてアレイの結合アイランドまたは区域の上への固定化のために分子を調製するのに有用な1種または複数種の試薬、固定化された分子への小胞の結合を検出するのに有用な試薬ならびに取り扱い説明を含むことができる。
さらに本明細書に提供されるものは、生物学的試料中の特定のバイオシグネチャーの検出を容易にする高速検出装置である。装置は、チップ上で生物学的試料調製をポリメラーゼ連鎖反応（PCR）と統合することができる。装置は、生物学的試料中の小胞の特定のバイオシグネチャーの検出を容易にすることができ、ある例が、参照により全体として本明細書に組み入れられるPipper et al., Angewandte Chemie, 47(21), p. 3900-3904 (2008)に記載されているように提供されている。バイオシグネチャーは、参照により全体として本明細書に組み入れられるLi et al., Adv Dent Res 18(1):3-5 (2005)に記載されているように、診断用途のために、マイクロ／ナノエレクトロケミカルシステム（MEMS/NEMS）センサおよび口腔液を使用して組み込むことができる。
アッセイにおいて関心対象の標的のための結合物質として働くことに加えて、本発明の特定のアプタマー、たとえば官能基結合アプタマーおよび／またはブロッキングアプタマーは、本明細書に開示される、または当技術分野において公知である様々なバイオマーカー検出技術の性能を高めるために使用することができる。以下さらに説明するように、そのようなアプタマーは、基体を利用するアッセイ法において使用することができ、その場合、アプタマーは基体への非特異的結合を弱める。
粒子アッセイ法
平面アレイに代わるものとして、粒子またはミクロフェアを使用するアッセイ法、たとえばビーズベースのアッセイ法もまた、本発明のアプタマーを使用することができる。アプタマーおよび抗体のような結合物質は市販のビーズと容易にコンジュゲートする。たとえば、Srinivas et al. Anal. Chem. 2011 Oct. 21, Aptamer functionalized Microgel Particles for Protein Detectionを参照すること。また、治療物質および診断物質としてのアプタマーに関するレビュー文献、Brody and Gold, Rev. Mol. Biotech. 2000, 74:5-13を参照すること。
高感度オートメーションと合致した特定の活性を有する同族リガンドおよびレポーター分子によるビーズコーティングを使用するマルチパラメーターアッセイ法または他のハイスループット検出アッセイ法を使用することができる。ビーズベースのアッセイシステムにおいては、バイオマーカーまたは小胞のための結合物質、たとえば捕捉物質（たとえば捕捉抗体）をアドレス指定可能なミクロスフェア上に固定化することができる。個々の結合アッセイそれぞれのための各結合物質を別個のタイプのミクロスフェア（すなわちマイクロビーズ）に結合することができ、図1Bに示すように、アッセイ反応がそのミクロスフェアの表面で起こる。小胞のための結合物質は、ビーズに結合した捕捉抗体であることができる。別々の蛍光強度を有する染色されたミクロスフェアは、それらの適切な結合物質または捕捉プローブを別々に付加される。必要に応じて、異なる結合物質を有する異なるビーズセットをプールしてカスタムビーズアレイを生成することができる。そして、ビーズアレイを試料と共に一つの反応容器中でインキュベートしてアッセイを実施する。本発明のいくつかの態様において、微小胞はビーズに直接コンジュゲートされる。たとえば図7A〜7Dを参照すること。ビーズにコンジュゲートした小胞を使用して、微小胞に結合するアプタマーを富化することができる。たとえば図28〜33を参照すること。
また、ビーズベースのアッセイ法を本発明の1種または複数種のアプタマーと共に使用することもできる。ビーズ基体が、アプタマーを含む1種または複数種の結合物質を取り付けるためのプラットフォームを提供することができる。多重化の場合、複数の異なるビーズセット（たとえばIllumina, Luminex）が、異なる結合物質（異なる標的分子に特異的）を有することができる。たとえば、ビーズは、関心対象の抗原の存在を検出する（定量的または定性的に）ために使用される結合物質、たとえば本発明のアプタマーにコンジュゲートさせることもできるし、または選択された生物学的試料中に存在する成分（たとえば、アプタマーが結合するように構成されている標的分子を含む細胞、細胞フラグメントまたは小胞）を単離するために使用することもできる。市販のキットの使用を通して、有機起源の任意の分子をポリスチレンビーズにうまくコンジュゲートさせることができる。
一つまたは複数の本発明のアプタマーは、非限定的に磁気捕捉法、蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）またはレーザーサイトメトリーを含む任意のビーズベースの基体と共に使用することができる。磁気捕捉法は、磁気活性化細胞ソーター（MACS）マイクロビーズまたは磁気カラムの使用を含むことができるが、それらに限定されない。本発明のアプタマーを使用するように修正することができるビーズまたは粒子ベースの方法の例は、米国特許第4,551,435号、第4,795,698号、第4,925,788号、第5,108,933号、第5,186,827号、第5,200,084号または第5,158,871号；第7,399,632号；第8,124,015号；第8,008,019号；第7,955,802号；第7,445,844号；第7,274,316号；第6,773,812号；第6,623,526号；第6,599,331号；第6,057,107号；第5,736,330号；国際特許出願PCT/US2012/42519；PCT/US1993/04145に記載されている方法およびビーズシステムを含む。
フローサイトメトリー法
生物学的試料由来の循環バイオマーカ、たとえばタンパク質抗原またはバイオマーカ包含細胞、細胞フラグメントもしくは小胞の単離または検出はまた、サイトメトリープロセスにおいて本発明のアプタマーを使用して達成されてもよい。非限定的な例として、本発明のアプタマーは、ビーズまたはミクロスフェアのような粒子の使用を含むアッセイ法において使用することができる。本発明は、粒子にコンジュゲートし得るアプタマーを結合物質として提供する。流体流中に懸濁した微視的粒子をソートするためにはフローサイトメトリー法を使用することができる。粒子が通過するとき、粒子は選択的に荷電され、出るとき、別々の流路の中にそらされることができる。したがって、元の混合物、たとえば生物学的試料から高い精度および速度で集団を分離することが可能である。フローサイトメトリー法は、光学／電子検出装置の中を流れる単一細胞の物理的および／または化学的特徴の同時マルチパラメータ分析を可能にする。一つの波長（色）の光ビーム、通常はレーザービームが流体力学的に集束した流体流に向けて送られる。いくつかの検出器：光ビームと平行である一つの検出器（前方散乱またはFSC）、それに対して垂直であるいくつかの検出器（側方散乱またはSSC）および一つまたは複数の蛍光検出器が、流れが光ビームを通過する点に照準を定めている。
ビーム中を通過する各懸濁粒子は光を何らかのやり方で散乱させ、粒子中の蛍光化学物質が励起されると、光源よりも低い周波数の光を放出し得る。散乱光と蛍光とのこの組み合わせが検出器によって捕捉され、各検出器（蛍光放出ピークごとに一つ）における明るさの変動を分析することにより、個々の粒子それぞれの物理的および化学的構造に関する様々な事実を演繹することが可能である。FSCは細胞サイズと相関し、SSCは、粒子の内部複雑さ、たとえば核の形状、細胞質顆粒の量およびタイプまたは膜の粗さに依存する。いくつかのフローサイトメーターは蛍光の必要性を除いており、光散乱だけを計測に使用する。
フローサイトメーターは、毎秒数千個の粒子を「リアルタイム」で分析することができ、指定された性質を有する粒子をアクティブに分別し、単離することができる。フローサイトメーターは、各分析期間中、多数の単一細胞に関する設定パラメータのハイスループット自動化定量および分離を提供する。フローサイトメーターは複数のレーザーおよび蛍光検出器を有し、それにより、多数の標識を使用してそれらの表現型により標的集団をより正確に特定することが可能になる。したがって、フローサイトメーター、たとえばマルチカラーフローサイトメーターを使用して、複数の蛍光標識または色を有する一つまたは複数の小胞を検出することができる。いくつかの態様において、フローサイトメーターはまた、様々な小胞集団を、たとえばサイズごとに、または異なるマーカーごとに、ソートまたは単離することもできる。
フローサイトメーターは、一つまたは複数のレーザー、たとえば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはより多くのレーザーを有し得る。いくつかの態様において、フローサイトメーターは、一つより多い色または蛍光標識、たとえば少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20の異なる色または蛍光標識を検出することができる。たとえば、フローサイトメーターは、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個の蛍光検出器を有することができる。
一つまたは複数の小胞を検出または分析し、異なる小胞集団をソートまたは分離するために使用することができる市販のフローサイトメーターの例は、MoFlo（商標）XDP Cell Sorter（Beckman Coulter, Brea, CA）、MoFlo（商標）Legacy Cell Sorter（Beckman Coulter, Brea, CA）、BD FACSAria（商標）Cell Sorter（BD Biosciences, San Jose, CA）、BD（商標）LSRII（BD Biosciences, San Jose, CA）およびBD FACSCalibur（商標）（BD Biosciences, San Jose, CA）を含むが、これらに限定されない。以下さらに説明するように、小胞の多重分析には、マルチカラーまたはマルチ蛍光サイトメーターを使用することができる。いくつかの態様において、フローサイトメーターは、一つまたは複数の特徴に基づいて一つより多い小胞集団をソートし、それにより、捕集またはソートすることができる。たとえば、二つの小胞集団はサイズが異なり、各集団内の小胞は、類似したサイズ範囲を有し、示差的に検出またはソートすることができる。もう一つの態様において、二つの異なる小胞集団は示差的に標識される。
フローサイトメーターから得られるデータは、ヒストグラムを生成するために一次元にプロットすることもできるし、または二次元でドットプロットとして見ることもできるし、またはより新規なソフトウェアを用いて三次元で見ることもできる。これらのプロット上の領域は、ゲートと呼ばれる一連のサブセット抽出によって順次に分けることができる。特に血液学に関する診断および臨床目的のためには特定のゲート制御プロトコルが存在する。プロットは、多くの場合、対数目盛において作成される。異なる蛍光色素の放出スペクトルは重なり合うため、検出器におけるシグナルは電子的かつ計算的に補正されなければならない。バイオマーカーを標識するための蛍光体は、参照により本明細書に組み入れられるOrmerod, Flow Cytometry 2nd ed., Springer-Verlag, New York (1999)およびNida et al., Gynecologic Oncology 2005; 4 889-894に記載されたものを含み得る。非限定的にフローサイトメトリー法を含む多重化アッセイ法においては、一つまたは複数の異なる標的分子を評価することができる。いくつかの態様において、標的分子の少なくとも一つは、本発明のアプタマーを使用して評価されるバイオマーカー、たとえば微小胞表面抗原である。
マイクロ流体工学
本発明の1種または複数種のアプタマーは、任意の有用な平面またはビーズ基体にコンジュゲートさせる、または他のやり方でその上に配置することができる。本発明の一つの局面において、本発明の1種または複数種のアプタマーは、マイクロ流体装置上に配置され、それにより、関心対象のポリペプチド抗原またはその機能性フラグメントを含む生物学的試料の成分の評価、特徴決定または単離を容易にする。たとえば、循環抗原またはその抗原を含む細胞、細胞フラグメントもしくは細胞由来の小胞は、本発明の1種または複数種のアプタマーを使用して（または、さらなる結合物質と共に）評価することができる。また、「Lab-on-a-Chip」システム、バイオメディカルマイクロエレクトロメカニカルシステム（Bio-MEM）またはマルチコンポーネント集積システムとも呼ばれ得るマイクロ流体装置を小胞の単離および分析のために使用することができる。そのようなシステムは、小胞の結合、バイオシグネチャーの検出および他のプロセスを可能にするプロセスを小型化し、区画化する。
マイクロ流体装置はまた、サイズ差別選択またはアフィニティー選択による小胞の単離に使用することもできる。たとえば、マイクロ流体装置は、サイズに基づいてまたは生物学的試料から小胞を単離するための一つもしくは複数の結合物質を使用することによって生物学的試料から小胞を単離するための、一つまたは複数のチャネルを使用することができる。生物学的試料は、小胞の通過を選択的に可能にする一つまたは複数のマイクロ流体チャネルに導入することができる。選択は、小胞の性質、たとえば小胞のサイズ、形状、変形性またはバイオシグネチャーに基づくことができる。
一つの態様においては、異種小胞集団をマイクロ流体装置に導入することができ、一つまたは複数の異なる同種小胞集団を得ることができる。たとえば、異なるチャネルが、異なる小胞集団を選択するための異なるサイズ選択または結合物質を有することができる。したがって、マイクロ流体装置は複数の小胞を単離することができ、その場合、その複数の小胞の少なくとも一つのサブセットが、その複数の小胞の別のサブセットとは異なるバイオシグネチャーを含む。たとえば、マイクロ流体装置は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90または100の異なる小胞サブセットを単離することができ、その場合、小胞の各サブセットが異なるバイオシグネチャーを含む。
いくつかの態様において、マイクロ流体装置は、小胞のさらなる富化または選択を可能にする一つまたは複数のチャネルを含むことができる。第一のチャネルを通過した後の富化された小胞集団を第二のチャネルに導入することができ、その第二のチャネルが、所望の小胞または小胞集団の通過が第二のチャネル中に存在する1種または複数種の結合物質などによってさらに富化されることを可能にする。
アレイベースのアッセイ法およびビーズベースのアッセイ法をマイクロ流体装置と共に使用することができる。たとえば、結合物質をビーズに結合することができ、マイクロ流体装置中でビーズと小胞との間の結合反応を実施することができる。また、マイクロ流体装置を使用して多重化を実施することもできる。異なる区画が異なる小胞集団のための異なる結合物質を含むことができ、各集団は異なる起始細胞特異的小胞集団である。一つの態様において、各集団は異なるバイオシグネチャーを有する。ミクロスフェアと小胞との間のハイブリダイゼーション反応をマイクロ流体装置中で実施することができ、反応混合物を検出装置に送ることができる。検出装置、たとえばデュアルまたはマルチレーザー検出システムは、マイクロ流体システムの一部であることができ、かつレーザーを使用して各ビーズまたはミクロスフェアをそのカラーコーディングによって同定することができ、かつ別のレーザーが、各ビーズと関連するハイブリダイゼーションシグナルを検出することができる。
任意の適切なマイクロ流体装置を本発明の方法に使用することができる。小胞と共に使用され得る、または小胞との使用に適合され得るマイクロ流体装置の例は、それぞれ参照により全体として本明細書に組み入れられる米国特許第7,591,936号、第7,581,429号、第7,579,136号、第7,575,722号、第7,568,399号、第7,552,741号、第7,544,506号、第7,541,578号、第7,518,726号、第7,488,596号、第7,485,214号、第7,467,928号、第7,452,713号、第7,452,509号、第7,449,096号、第7,431,887号、第7,422,725号、第7,422,669号、第7,419,822号、第7,419,639号、第7,413,709号、第7,411,184号、第7,402,229号、第7,390,463号、第7,381,471号、第7,357,864号、第7,351,592号、第7,351,380号、第7,338,637号、第7,329,391号、第7,323,140号、第7,261,824号、第7,258,837号、第7,253,003号、第7,238,324号、第7,238,255号、第7,233,865号、第7,229,538号、第7,201,881号、第7,195,986号、第7,189,581号、第7,189,580号、第7,189,368号、第7,141,978号、第7,138,062号、第7,135,147号、第7,125,711号、第7,118,910号、第7,118,661号、第7,640,947号、第7,666,361号、第7,704,735号；および国際特許公開公報WO2010/072410に記載されているものを含むが、それらに限定されない。本明細書に開示される方法と共に使用するためのもう一つの例が、Chen et al., "Microfluidic isolation and transcriptome analysis of serum vesicles," Lab on a Chip, Dec. 8, 2009 DOI:10.1039/b916199fに記載されている。
本発明と共に使用するための他のマイクロ流体装置は、非限定的に、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,376,252号、第6,408,878号、第6,645,432号、第6,719,868号、第6,793,753号、第6,899,137号、第6,929,030号、第7,040,338号、第7,118,910号、第7,144,616号、第7,216,671号、第7,250,128号、第7,494,555号、第7,501,245号、第7,601,270号、第7,691,333号、第7,754,010号、第7,837,946号；米国特許出願第2003/0061687号、第2005/0084421号、第2005/0112882号、第2005/0129581号、第2005/0145496号、第2005/0201901号、第2005/0214173号、第2005/0252773号、第2006/0006067号；ならびに欧州特許第0527905号および第1065378号に開示されているものを含む、エラストマー層、弁およびポンプを含む装置を含む。いくつかの場合、装置の大部分またはすべてはエラストマー材料で構成されている。特定の装置は、装置を通過する溶液流量を調整するための一つまたは複数のエラストマー弁を含む装置によって熱サイクリング反応（たとえばPCR）を実施するように設計されている。装置は、反応部位のアレイを含むことができ、それにより、複数の反応を実施することを可能にする。したがって、装置は、小胞から単離されたマイクロRNAを含む循環マイクロRNAを多重的に評価するために使用することができる。ある態様において、マイクロ流体装置は、（a）エラストマー基体中に形成された第一の複数の流路；（b）第一の複数の流路と交差して反応部位のアレイを画定する、エラストマー基体中に形成された第二の複数の流路であって、各反応部位が、第一および第二の流路の一つの交点に位置する、第二の複数の流路；（c）各反応部位内の溶液を他の反応部位の溶液から単離するように作動させることができる、第一および第二の複数の流路に沿って配置され、反応部位の間で離間した複数の単離弁であって、それぞれが流路の一つまたは複数にかぶさり、それと交差する一つまたは複数の制御チャネルを含む単離弁；および（d）反応部位を互いから単離するための弁を同時に作動させるための手段を含む。装置の基本構造への様々な変更が本発明の範囲内で想定される。マイクロRNAは、PCR法を使用することにより、各反応部位の中で検出することができる。たとえば、方法は、（i）マイクロ流体装置を提供する工程であって、マイクロ流体装置が、第一の流体チャネルを介して互いに流体的に連絡した第一端および第二端を有する第一の流体チャネル；それぞれが末端壁で終端する複数の流路であって；各流路が第一の流体チャネルから分岐し、それと流体的に連絡しており、該第一の流体チャネルから流路の一つに入る水性流体が第一の流体チャネルを通ってのみ流路から出ることができる、複数の流路；および試料流体を導入するための、第一の流体チャネルと流体的に連絡した入口を含み；各流路が、閉じたとき流路の一端を第一の流体チャネルから隔離し、それにより、弁と末端壁との間に隔離された反応部位が形成されるようにする弁と関係し；制御チャネル；各弁が、作動力が制御チャネルに加えられたとき、弁と関連する流路の中へと撓み、それにより、弁を閉じる可撓性の膜であり；作動力が制御チャネルに加えられたとき、各流路中の弁が閉じられて、各流路中に隔離された反応部位を製造する、工程；（ii）試料流体を入口に導入する工程であって、試料流体が流路を満たす、工程；（iii）弁を作動させて、流路内で試料流体を別々の部分へと分離する工程；（iv）試料流体中の核酸を増幅する工程；（v）試料流体の部分を分析して、増幅が反応を生じさせたかどうかを判定する工程を含むことができる。試料流体は、増幅可能な核酸標的、たとえばマイクロRNAを含むことができ、条件は、PCR産物の形成を生じさせるようなポリメラーゼ連鎖反応（PCR）条件であることができる。
マイクロ流体装置は、チャネル中の表面に付いた、またはチャネル中に存在する1種または複数種の結合物質を有することができる。たとえば、マイクロチャネルは、一つまたは複数の捕捉物質、たとえば、表3における一つまたは複数の一般的微小胞抗原または非限定的にEpCam、CD9、PCSA、CD63、CD81、PSMA、B7H3、PSCA、ICAM、STEAP、KLK2、SSX2、SSX4、PBP、SPDEFおよびEGFRを含む、表4における起始細胞もしくは癌関連抗原のための捕捉物質を有することができる。捕捉物質は、本発明の方法によって選択されたアプタマーであり得る。また、チャネルの表面を本発明のブロッキングアプタマーと接触させることもできる。一つの態様において、マイクロチャネル表面をアビジンで処理し、ビオチン化された捕捉物質、たとえば抗体をチャネルに注入してアビジンと結合させることができる。他の態様において、捕捉物質は、マイクロ流体装置のチャンバーまたは他の構成要素の中に存在する。捕捉物質はまた、マイクロ流体チャネル中で動かすように操作することができるビーズに取り付けることもできる。一つの態様において、捕捉物質は磁性ビーズに取り付けられる。ビーズは、磁石を使用して操作することができる。
生物学的試料は、少なくとも毎分約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45または50μl、たとえば毎分約1〜50、5〜40、5〜30、3〜20または5〜15μlの速度でマイクロ流体装置またはマイクロチャネル中に流すことができる。一つまたは複数の小胞をマイクロ流体装置中で捕捉し、直接検出することができる。または、分析の前に、捕捉された小胞を解放し、マイクロ流体装置から出してもよい。もう一つの態様においては、一つまたは複数の捕捉された小胞をマイクロチャネル中で溶解させ、その溶解産物を分析して、たとえば小胞内のペイロードを検査することもできる。溶解バッファをチャネル中に流し、捕捉された小胞を溶解させることができる。たとえば、溶解バッファは、少なくとも毎分約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、26、27、28、29、30、35、40、45または50μl、たとえば毎分約1〜50、5〜40、10〜30、5〜30または10〜35μlの速度で装置またはマイクロチャネル中に流すことができる。溶解産物を捕集し、たとえばRT-PCR、PCR、質量分析、ウエスタンブロットまたは他のアッセイを実施することによって分析して、小胞の一つまたは複数のバイオマーカーを検出することができる。
表現型
本明細書に開示されるものは、本発明の方法および組成物を使用して表現型を特徴決定するための生成物およびプロセスである。本明細書において使用される語「表現型」は、本発明の組成物および／または方法を部分的または完全に使用して同定されるバイオマーカープロフィールに帰される任意の特性または特徴を意味することができる。たとえば、表現型は、対象から得られた試料に関して特徴決定されたバイオマーカープロフィールに基づく診断、予後判定またはセラノーシスであることができる。表現型は、任意の観測可能な特徴または特性、たとえば疾患もしくは病状、病期もしくは病状期、疾患もしくは病状に対する感受性、病期もしくは病状の予後、生理学的病状または治療剤に対する応答／潜在的応答であることができる。表現型は、対象の遺伝的構成ならびに環境要因の影響および二つの間の相互作用ならびに核酸配列に対する後成的修飾から生じることができる。
対象における表現型は、対象から生物学的試料を取得し、本発明の組成物および／または方法を使用してその試料を分析することによって特徴決定することができる。たとえば、対象または個体の表現型の特徴決定は、疾患または病状を検出すること（前駆症状早期検出を含む）、疾患または病状の予後、診断またはセラノーシスを判定すること、または疾患または病状の病期または進行を決定することを含むことができる。表現型の特徴決定はまた、特定の疾患、病状、病期および病状期に適切な治療または治療効能を同定すること、疾患進行、特に疾患再発、転移拡散または疾患回帰の予測および尤度分析を含むこともできる。表現型はまた、病状または疾患の臨床的に明確なタイプまたはサブタイプ、たとえば癌または腫瘍であることもできる。表現型決定はまた、生理学的病状の判定または移植後のような臓器窮迫もしくは臓器拒絶反応の評価であることもできる。本明細書に記載される組成物および方法は、個体ベースにおける対象の評価を可能にし、それが、治療におけるより効率的かつ経済的な決定の恩典を提供することができる。
ある局面において、本発明は、疾患または病状の診断、予後判定および／またはセラノーシスを提供するための、微小胞のようなバイオマーカーの分析に関する。セラノーシスは、疾患または疾患状態の治療法または治療に影響する能力を提供する診断試験を含む。セラノーシス試験は、診断または予後判定試験がそれぞれ診断または予後判定を提供するのと同様なやり方でセラノーシスを提供する。本明細書において使用されるセラノーシスは、予測的医療、個別化医療、統合医療、薬理診断学およびDx/Rxパターニングを含む、任意の所望の形態の治療関連の試験を包含する。治療関連の試験は、個々の対象における薬物応答を予測および評価する、すなわち、個別化医療を提供するために使用することができる。薬物応答の予測は、たとえば対象が暴露される、または他のやり方で治療される前にその対象が候補治療物質に対して応答者である可能性が高いのか、非応答者である可能性が高いのかを決定することであることができる。薬物応答の評価は、薬物に対する応答をモニターすること、たとえば治療の開始後、時間経過と共に対象の改善またはその欠如をモニターすることであることができる。治療関連の試験は、治療から恩恵を受ける可能性が特に高い対象をその治療に選択する、または個々の対象において治療効能の早期的かつ客観的指示を提供するのに有用である。したがって、本発明の組成物および方法を使用する分析は、より有望な治療を選択するために治療を変更すべきであることを示し、それにより、有益な治療を遅らせる多大な損失を避け、効果のない薬物を投与する金銭的および罹病率の犠牲を避け得る。
したがって、本発明の組成物および方法は、対象が疾患または障害に対する治療に応答する可能性があるかどうかを予測するのに役立ち得る。表現型の特徴決定は、対象の応答者／非応答者状態を予測することを含み、応答者は疾患に対する治療に応答し、非応答者はその治療に応答しない。微小胞などのバイオマーカーを対象において解析し、治療に応答するかまたは応答しないことが知られている以前の対象のそれに対して比較することができる。対象におけるバイオマーカープロファイルが、治療に応答することが知られている以前の対象のバイオマーカープロファイルとより密接に合致するならば、その対象を、その治療に対する応答者として特徴決定または予測することができる。同様に、対象におけるバイオマーカープロファイルが、治療に応答しなかった以前の対象のバイオマーカープロファイルとより密接に合致するならば、その対象を、その治療に対する非応答者として特徴決定または予測することができる。治療は、本明細書で開示されたものを非限定的に含む任意の適切な疾患、障害または他の病態に対する治療であることができる。
いくつかの態様において、表現型は、表1に記載されたもののような疾患または病態を含む。たとえば、表現型は、腫瘍、新生物または癌の存在またはそれらを発生させる可能性の検出、あるいは、腫瘍、新生物または癌の特徴決定（例えば病期、悪性度、侵攻性、転移または再発の可能性など）を含むことができる。本明細書に記載される方法または組成物によって検出または評価することのできる癌は、乳癌、卵巣癌、肺癌、結腸癌、過形成性ポリープ、腺腫、結腸直腸癌、高度異形成、低度異形成、前立腺肥大症、前立腺癌、黒色腫、膵臓癌、脳癌（たとえば神経膠芽腫など）、血液悪性腫瘍、肝細胞癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、食道癌、消化管間質腫瘍（GIST）、腎細胞癌（RCC）または胃癌を含むが、これらに限定されない。結腸直腸癌はCRCデュークスBまたはデュークスC〜Dであり得る。血液悪性腫瘍は、B細胞慢性リンパ球性白血病、B細胞リンパ腫DLBCL、B細胞リンパ腫DLBCL胚中心様、B細胞リンパ腫DLBCL活性化B細胞様およびバーキットリンパ腫であり得る。
表現型は、前癌状態、たとえば光線角化症、萎縮性胃炎、白板症、紅色肥厚症、リンパ腫様肉芽腫症、前白血病、線維症、頸部異形成、子宮頸部異形成、色素性乾皮症、バレット食道、結腸直腸ポリープまたは悪性腫瘍に発展する可能性がある他の異常な組織増殖もしくは病変であることができる。悪性転換性ウイルス感染症、たとえばHIVおよびHPVもまた、本発明にしたがって評価することができる表現型を提示する。
本発明の方法によって特徴決定することができる癌は、非限定的に、癌腫、肉腫、リンパ腫もしくは白血病、胚細胞腫、芽細胞腫または他の癌を含むことができる。癌腫は、非限定的に、上皮新生物、扁平上皮新生物、扁平上皮癌腫、基底細胞新生物、基底細胞癌腫、移行上皮乳頭腫および癌腫、腺腫および腺癌腫（腺）、腺腫、腺癌腫、形成性胃組織炎インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、ビポーマ、胆管癌腫、肝細胞癌、腺様嚢胞癌腫、虫垂カルチノイド腫、プロラクチノーマ、好酸性顆粒細胞腫、ヒュルトレ細胞腺腫、腎細胞癌腫、グラビッツ腫、多発性内分泌腺腫、子宮内膜腺腫、付属器および皮膚付属器新生物、粘膜表皮新生物、嚢胞、粘液および漿液新生物、嚢胞腺腫、腹膜偽粘液腫、管、小葉および髄質新生物、腺房細胞新生物、複合上皮新生物、ウォーシン腫、胸線腫、特定化生殖腺新生物、性索間質腫、きょう膜腫、顆粒膜細胞腫、男性胚細胞腫、セルトリライディッヒ細胞腫、グロムス腫、傍神経節腫、褐色細胞腫、グロムス腫、母斑および黒色腫、メラノサイト母斑、悪性黒色腫、黒色腫、結節性黒色腫、異形成母斑、悪性黒子黒色腫、表在拡大型黒色腫および悪性末端性ほくろ性黒色腫を含む。肉腫は、非限定的に、アスクン腫瘍、ブドウ状肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性血管内皮腫、悪性神経鞘腫、骨肉腫、軟部組織肉腫、たとえば胞巣状軟部肉腫、血管肉腫、葉状嚢肉腫、皮膚線維肉腫、デスモイド腫、線維形成性小円形細胞腫、類上皮肉腫、骨外性軟骨肉腫、骨外性骨肉腫、線維肉腫、血管外皮腫、血管肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、リンパ肉腫、悪性線維性組織球腫、神経線維肉腫、横紋筋肉腫および滑膜肉腫を含む。リンパ腫および白血病は、非限定的に、慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫、B細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫（たとえばワルデンストロームのマクログロブリン血症）、脾臓辺縁帯リンパ腫、形質細胞性骨髄腫、形質細胞腫、モノクローナル免疫グロブリン沈着症、重鎖病、maltリンパ腫とも呼ばれる節外性辺縁帯B細胞リンパ腫、結節辺縁帯B細胞リンパ腫（nmzl）、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型B細胞リンパ腫、血管内大細胞型B細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、バーキットリンパ腫／白血病、T細胞前リンパ球性白血病、T細胞大顆粒リンパ球性白血病、活性NK細胞白血病、成人T細胞白血病／リンパ腫、節外性NK/T細胞リンパ腫、鼻型腸症型T細胞リンパ腫、肝脾T細胞リンパ腫、芽球NK細胞リンパ腫、菌状息肉腫／セザリー症候群、原発性皮膚CD30陽性T細胞リンパ増殖性疾患、原発性皮膚未分化大細胞リンパ腫、リンパ腫様丘疹症、血管免疫芽細胞T細胞リンパ腫、末梢性T細胞リンパ腫、不特定の未分化大細胞リンパ腫、古典的ホジキンリンパ腫（結節性硬化症、混合細胞充実度、リンパ球豊富、リンパ球枯渇または非枯渇）および結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫を含む。胚細胞腫は、非限定的に、胚細胞腫、未分化胚細胞腫、精上皮腫、非胚細胞腫、胎児性癌腫、内胚葉洞腫、絨毛癌腫、奇形腫、多胚腫および生殖腺芽細胞腫を含む。芽細胞腫は、非限定的に、腎芽腫、髄芽腫および網膜芽細胞腫を含む。他の癌は、非限定的に、口唇癌腫、喉頭癌腫、下咽頭癌腫、舌癌腫、唾液腺癌腫、胃癌腫、腺癌腫、甲状腺癌腫（髄様および甲状腺乳頭癌腫）、腎癌腫、腎実質癌腫、子宮頸癌腫、子宮内膜癌腫、子宮内膜癌腫、絨毛癌腫、精巣癌腫、泌尿器癌腫、黒色腫、脳腫瘍、たとえば神経膠芽腫、星状細胞腫、髄膜腫、髄芽腫および末梢神経外胚葉性腫瘍、胆嚢癌腫、気管支癌腫、多発性骨髄腫、基底細胞腫、奇形腫、網膜芽細胞腫、脈絡膜黒色腫、精上皮腫、横紋筋肉腫、頭蓋咽頭腫、骨肉腫、軟骨肉腫、筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、ユーイング肉腫および形質細胞腫を含む。
さらなる態様において、解析される癌は、非小細胞肺癌および小細胞肺癌を含む肺癌（小細胞癌腫（燕麦細胞癌）、混合小細胞／大細胞癌腫および複合小細胞癌腫を含む）、結腸癌、乳癌、前立腺癌、肝臓癌、膵臓癌、脳癌、腎臓癌、卵巣癌、胃癌、皮膚癌、骨癌、胃癌、乳癌、膵臓癌、神経膠腫、神経膠芽腫、肝細胞癌、乳頭状腎臓癌腫、頭頸部扁平上皮細胞癌腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫または固形腫瘍であってもよい。
複数の態様において、癌は、急性リンパ芽球性白血病；急性骨髄性白血病；副腎皮質癌；AIDS関連癌；AIDS関連リンパ腫；肛門癌；虫垂癌；星状細胞腫；非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍；基底細胞癌；膀胱癌；脳幹神経膠腫；脳腫瘍（脳幹神経膠腫、中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、星状細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、上衣腫、髄芽腫、髄上皮種、中間型松果体実質腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、および松果体芽腫を含む）；乳癌；気管支腫瘍；バーキットリンパ腫；原発不明癌；カルチノイド腫瘍；原発不明癌腫；中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍；中枢神経系胚芽腫；子宮頸癌；小児癌；脊索腫；慢性リンパ球性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖性疾患；結腸癌；結腸直腸癌；頭蓋咽頭腫；皮膚T細胞リンパ腫；内分泌膵島細胞腫瘍；子宮内膜癌；上衣芽腫；上衣腫；食道癌；鼻腔神経芽細胞腫；ユーイング肉腫；頭蓋外胚細胞腫瘍；性腺外胚細胞腫瘍；肝臓外胆管癌；胆嚢癌；胃癌；消化管カルチノイド腫瘍；消化管間質細胞腫瘍；消化管間質腫瘍（GIST）；妊娠性絨毛性腫瘍；神経膠腫；毛様細胞性白血病；頭頸部癌；心臓癌；ホジキンリンパ腫；下咽頭癌；眼内黒色腫；膵島腫瘍；カポジ肉腫；腎臓癌；ランゲルハンス細胞組織球症；喉頭癌；口唇癌；肝臓癌；悪性線維性組織球腫；骨癌；髄芽腫；髄上皮種；黒色腫；メルケル細胞癌；メルケル細胞皮膚癌；中皮腫；原発不明転移性扁平上皮性頸部癌；口腔癌；多発性内分泌腫瘍症候群；多発性骨髄腫；多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍；菌状息肉腫；骨髄異形成症候群；骨髄増殖性腫瘍；鼻腔癌；鼻咽頭癌；神経芽細胞腫；非ホジキンリンパ腫；非黒色腫皮膚癌；非小細胞肺癌；口腔癌；口腔癌；口腔咽頭癌；骨肉腫；その他の脳および脊髄の腫瘍；卵巣癌；卵巣上皮癌；卵巣胚細胞腫瘍；卵巣低悪性度腫瘍；膵臓癌；乳頭腫症；副鼻腔癌；副甲状腺癌；骨盤癌；陰茎癌；咽頭癌；中間型松果体実質腫瘍；松果体芽腫；下垂体腫瘍；形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫；胸膜肺芽腫；原発性中枢神経系（CNS）リンパ腫；原発性肝細胞肝癌；前立腺癌；直腸癌；腎臓癌；腎細胞（腎臓）癌；腎細胞癌；気道癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；唾液腺癌；セザリー症候群；小細胞肺癌；小腸癌；軟部組織肉腫；扁平上皮癌；頸部扁平上皮癌；胃癌；テント上原始神経外胚葉性腫瘍；T細胞リンパ腫；精巣癌；咽喉癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺癌；移行上皮癌；腎盂尿管移行上皮癌；絨毛性腫瘍；尿管癌；尿道癌；子宮癌；子宮肉腫；膣癌；外陰癌；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；またはウィルムス腫瘍を含む。本発明の方法は、これらおよび他の癌を特徴決定するために使用することができる。したがって、表現型の特徴決定は、本明細書に開示される癌のいずれかの診断、予後判定またはセラノーシスを提供することであることができる。
いくつかの態様において、癌は、急性骨髄性白血病（AML）、乳癌、胆管癌、結腸直腸腺癌、肝外胆管腺癌、女性生殖器悪性腫瘍、胃腺癌、食道腺癌、消化管間質腫瘍（GIST）、神経膠芽腫、頭頸部扁平上皮癌、白血病、肝臓肝細胞癌、低悪性度の神経膠腫、肺細気管支肺胞上皮癌（BAC）、肺非小細胞肺癌（NSCLC）、肺小細胞癌（SCLC）、リンパ腫、男性生殖器悪性腫瘍、胸膜の悪性孤立線維性腫瘍（MSFT）、黒色腫、多発性骨髄腫、神経内分泌腫瘍、結節びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、非上皮性卵巣癌（非EOC）、卵巣表面上皮癌、膵臓腺癌、下垂体癌、乏突起膠腫、前立腺腺癌、後腹膜もしくは腹膜癌、後腹膜もしくは腹膜肉腫、小腸悪性腫瘍、軟部組織腫瘍、胸腺癌、甲状腺癌またはブドウ膜黒色腫を含む。本発明の方法は、これらおよび他の癌を特徴決定するために使用することができる。したがって、表現型の特徴決定は、本明細書に開示される癌の一つの診断、予後判定またはセラノーシスを提供することであることができる。
該表現型はまた、炎症性疾患、免疫疾患、または自己免疫疾患であり得る。例えば、該疾患は、炎症性腸疾患（IBD）、クローン病（CD）、潰瘍性大腸炎（UC）、骨盤炎症、血管炎、乾癬、糖尿病、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、重症筋無力症、I型糖尿病、関節リウマチ、乾癬、全身性エリテマトーデス（SLE）、橋本甲状腺炎、グレーブス病、強直性脊椎炎、シェーグレン病、CREST症候群、強皮症、リウマチ性疾患、臓器拒絶反応、原発性硬化性胆管炎、または敗血症であり得る。
該表現型はまた、アテローム性動脈硬化症、うっ血性心不全、不安定プラーク、脳卒中、または虚血等の心血管疾患を含み得る。該心血管疾患または病態は、高血圧症、狭窄、血管閉塞、または血栓性事象であり得る。
該表現型はまた、多発性硬化症（MS）、パーキンソン病（PD）、アルツハイマー病（AD）、統合失調症、双極性障害、うつ病、自閉症、プリオン病、ピック病、認知症、ハンチントン病（HD）、ダウン症候群、脳血管疾患、ラスムッセン脳炎、ウイルス性髄膜炎、神経精神全身性エリテマトーデス（NPSLE）、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、伝達性海綿状脳症、虚血性再灌流障害（例えば、脳卒中）、脳損傷、微生物感染、または慢性疲労症候群等の神経系疾患を含み得る。該表現型はまた、線維筋痛症、慢性神経因性疼痛、または末梢性神経因性疼痛等の病態であり得る。
該表現型はまた、細菌、ウイルス、または酵母菌感染症等の感染症を含み得る。例えば、該疾患もしくは病態は、ウィップル病、プリオン病、肝硬変、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、HIV、肝炎、梅毒、髄膜炎、マラリア、結核、またはインフルエンザであり得る。HIVまたはHCV様粒子等のウイルスタンパク質は、ウイルスの状態を特徴決定するために、小胞中で評価され得る。
該表現型はまた、周産期または妊娠に関連した病態（例えば、子癇前症もしくは早産）、鉄代謝に関連する代謝性疾患もしくは病態等の代謝性疾患もしくは病態を含み得る。例えば、ヘプシジンは、鉄分不足を特徴決定するために、小胞中で評価され得る。該代謝性疾患または病態はまた、糖尿病、炎症、または周産期の病態であり得る。
本発明の組成物および方法は、バイオマーカーにより評価され得るこれらならびに他の疾患および障害を特徴決定するために使用され得る。したがって、表現型の特徴決定は、本明細書に開示される疾患および障害のうち1つの診断、予後判定、またはセラノーシスを提供することが可能である。
対象
対象の1つ以上の表現型を、対象から得られる生体試料中の小胞などの一つまたは複数の小胞を分析することによって決定することができる。対象または患者としては、ウシ、トリ、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタ、または霊長類動物（ヒトおよび非ヒト霊長類を含む）等の哺乳動物を挙げることができるが、これらに限定されない。対象はまた、シベリアトラ等の絶滅の危機に瀕しているために重要な哺乳動物、ヒトによって消費用に農場で育てられる動物等の経済的に重要な哺乳動物、またはペットとして、または動物園で飼育されている動物等の、ヒトにとって社会的に重要な動物が含まれ得る。このような動物の例としては、ネコおよびイヌ等の肉食動物、ブタ（pig）、雄ブタ、およびイノシシを含むブタ（swine）、ウシ、雄ウシ、ヒツジ、キリン、シカ、ヤギ、バイソン、およびラクダ、またはウマ等の反芻動物または有蹄動物が挙げられるが、これらに限定されない。また、絶滅の危機に瀕したトリ、または、動物園で飼育されるトリ、ならびに家禽（fowl）、さらに具体的には、家畜化された家禽、すなわち、シチメンチョウ、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ホロホロチョウ等の家禽類（poultry）も含まれる。また、家畜化されたブタおよびウマ（競争馬を含む）も含まれる。加えて、農業および水産、ならびに他の活動と関係がある動物等の、商業活動と関係がある任意の動物種も含まれ、ここで、疾患のモニタリング、診断、および治療の選択は、経済的生産性および／または食物連鎖の安全性のため、畜産において通常の業務である。
該対象は、癌等の既存の疾患もしくは病態を有し得る。あるいは、該対象は、いかなる既知の既存の病態を有していなくてもよい。該対象はまた、癌の治療等の、現行または過去の治療に対し非応答性であり得る。
試料
本発明の組成物および方法によって使用および／または評価される試料は、非限定的に組織切片、たとえば外科的もしくは他の処置の間に除去された生検材料もしくは組織、体液、検死試料、組織学的目的に採取された凍結切片および細胞培養物を含む、バイオマーカー評価に使用することができる任意の適切な生物学的試料を含む。そのような試料は、血液および血液分画または産物（たとえば血清、バフィーコート、血漿、血小板、赤血球など）、痰、悪性浸出液、頬細胞組織、培養細胞（たとえば初代培養物、外植片および形質転換細胞）、糞便、尿、他の生物学的または体液（たとえば前立腺液、胃液、腸液、腎臓液、肺液、脳脊髄液など）などを含む。試料は、新鮮な凍結ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）ブロックである、ホルマリン固定パラフィン包埋されている、またはRNA保存液＋ホルマリン固定液内にある生物学的材料を含むことができる。患者ごとに一つより多いタイプの一つより多い試料を使用することができる。
本明細書に記載される方法において使用される試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）試料であることができる。FFPE試料は、固定組織、非染色スライド、骨髄コアまたはクロット、コア針生検材料、悪性液および微細針吸引液（FNA）の一つまたは複数であることができる。ある態様において、固定組織は、手術または生検からの腫瘍含有ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）ブロックを含む。もう一つの態様において、非染色スライドは、パラフィンブロックからの非染色荷電アンベークドスライドを含む。もう一つの態様において、骨髄コアまたはクロットはカルシウム除去コアを含む。ホルマリン固定コアおよび／またはクロットはパラフィン包埋されていることができる。さらに別の態様において、コア針生検材料は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはより多くの、たとえば3〜4個のパラフィン包埋生検試料を含む。18ゲージ針生検を使用することができる。悪性流体は、5×5×2mmの細胞ペレットを生成するのに十分な量の新鮮な胸／腹水を含むことができる。流体は、パラフィンブロック中でホルマリン固定されることができる。ある態様において、コア針生検材料は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはより多くの、たとえば4〜6のパラフィン包埋吸引液を含む。
試料は、当業者によって理解される技術にしたがって処理され得る。試料は、非限定的に、新鮮な、凍結された、または固定された細胞または組織であることができる。いくつかの態様において、試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織、新鮮な組織または新鮮凍結（FF）組織を含む。試料は、対象試料由来の一次または不死化細胞系を含む培養細胞を含むことができる。試料はまた、対象由来の試料からの抽出物をいうこともできる。たとえば、試料は、組織または体液から抽出されたDNA、RNAまたはタンパク質を含むことができる。そのような目的のために多くの技術および市販のキットが利用可能である。個体由来の新鮮な試料は、さらなる処理、たとえば細胞溶解および抽出の前に、RNAを保存するための薬剤で処理することができる。試料は、他の目的のための捕集された凍結試料を含むことができる。試料は、関連する情報、たとえば年齢、性別および対象中に存在する臨床症候；試料の出所；ならびに試料の捕集および貯蔵の方法と関連させることができる。試料は一般的に対象から得られる。
生検は、診断または予後評価のために、および組織標本そのものに組織試料を取り出すプロセスを含む。当技術分野において公知の任意の生検技術を本発明の分子プロファイリング法に適用することができる。適用される生検技術は、とりわけ、評価される組織タイプ（たとえば結腸、前立腺、腎臓、膀胱、リンパ節、肝臓、骨髄、血液細胞、肺、乳房など）、腫瘍のサイズおよびタイプ（たとえば固形または懸濁状態、血液または腹水）に依存することができる。代表的な生検技術は、切除生検、切開生検、針生検、外科的生検および骨髄生検を含むが、これらに限定されない。「切除生検」とは、腫瘍塊全体をそれを包囲する正常組織の小さな縁と共に取り出す生検をいう。「切開生検」とは、腫瘍の断面直径を含むくさび状組織の取り出しをいう。分子プロファイリングは、腫瘍塊の「コア針生検」または概して腫瘍塊内から細胞の懸濁液を得る「微細針吸引生検」を使用することができる。生検技術は、たとえばHarrison's Principles of Internal Medicine, Kasper, et al., eds., 16th ed., 2005, Chapter 70およびPart V全体で詳述されている。
概して、参照により本明細書に組み入れられるSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989)およびPerbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, New York (1988)およびWatson et al., Recombinant DNA, Scientific American Books, New York and in Birren et al (eds) Genome Analysis: A Laboratory Manual Series, Vols. 1-4 Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)ならびに米国特許第4,666,828号；第4,683,202号；第4,801,531号；第5,192,659号および第5,272,057号におけるような、当技術分野において公知であり、具体的には説明されない標準的分子生物学的技術が踏襲される。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、概してPCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)におけるように実施することができる。
本発明の組成物および方法を用いて評価される生物学的試料は任意の有用な体液または生物学的液体であることができ、たとえば、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（CSF）、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液（前立腺液を含む）、カウパー腺液もしくは尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、体毛、涙液、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、他の洗浄液、細胞、細胞培養物、または細胞培養上清を含むがこれらに限定されない。生物学的試料はまた、胎児もしくは母体起源であってもよい胚盤胞腔液、臍帯血または母体循環物を含むこともある。生物学的試料はまた、小胞および他の循環バイオマーカーを得ることができる、細胞培養物、組織試料、または生検材料であってもよい。たとえば、関心対象の細胞を培養し、培養物から小胞を単離することができる。様々な態様において、本明細書に開示されるバイオマーカーまたはより具体的にはバイオシグネチャーは、様々な方法、たとえば血液、血漿、血清または前記生物学的試料のいずれかからの核酸分子の抽出、ポリペプチド（または機能性フラグメント）バイオマーカーを同定するためのタンパク質または抗体アレイの使用ならびに核酸およびポリペプチド分子の同定および評価のための当技術分野において公知の他のアレイ、配列決定、PCRおよびプロテオミック技術を使用して、そのような生物学的試料から直接評価することができる（たとえば、核酸もしくはポリペプチドバイオマーカーまたはそれらの機能性フラグメントの存在またはレベルの同定）。加えて、そのような試料中に存在する1つまたは複数の成分をまず単離または富化して、選択されたバイオマーカーの存在またはレベルを評価するため、所与のバイオシグネチャーを評価するために、さらに処理することができる。（例えば、微小胞を試料から単離した後に、タンパク質および/または核酸バイオマーカーに関してプロファイリングする）。
表1は、本発明の方法による解析のために使用され得る、疾患、病態または生物学的状態と対応する生物学的試料との非限定的なリストを示す。
（表１）様々な疾患、病態または生物学的状態に対する生物学的試料の例
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本発明の方法は、血液試料または血液由来物を使用して表現型を特徴決定するために使用することができる。血液由来物は血漿および血清を含む。血漿は、全血の液体成分であり、全血量の約55％までを構成する。血漿は、主に水ならびに小量のミネラル、塩、イオン、栄養素および溶解状態のタンパク質で構成されている。全血中、赤血球、白血球および血小板が血漿内に懸濁している。血清とは、フィブリノーゲンまたは他の凝固因子を有しない血漿（すなわち、全血から血球および凝固因子を差し引いたもの）をいう。
生物学的試料は、生物学的試料の直接評価によるのか、生物学的試料から得られる一つまたは複数の小胞のプロファイリングによるのかにかかわらず、バイオマーカーの解析を実施しない当事者のような第三者を通して得ることができる。たとえば、試料は、試料が由来する対象の臨床医、医師または他の健康管理者を通して得ることができる。または、生物学的試料は、小胞を解析する同じ当事者によって得ることもできる。加えて、アッセイされる生物学的試料は、保管（たとえば凍結）されるか、または他の様式で保存条件下に貯蔵される。
さらに、生物学的試料は、起始細胞に由来しかつ対象の生物学的液体において細胞外でまたは細胞外環境で利用可能である、小胞または細胞膜断片を含むことができる。
本発明の方法は、一つまたは複数の小胞を評価する工程、例えば小胞集団を評価する工程を含むことができる。本明細書において使用される小胞とは、細胞から流出した膜小胞である。小胞または膜小胞は、非限定的に、循環微小胞（cMV）、微小胞、エキソソーム、ナノ小胞、デキソソーム、ブレブ、小水疱、プロスタソーム、微粒子、内腔内小胞、膜フラグメント、内腔内エンドソーム小胞、エンドソーム様小胞、エキソサイトーシスビヒクル、エンドソーム小胞、エンドソーマル小胞、アポトーシス体、多胞体、分泌小胞、リン脂質小胞、リポソーム小胞、アルゴソーム、テキサソーム、セクレソーム、トレロソーム、メラノソーム、オンコソームまたはエキソサイトーシスビヒクルを含む。さらに、小胞は、様々な細胞プロセスによって産生され得るが、本発明の方法は、そのような小胞が生物学的試料中に存在し、本明細書に開示される方法によって特徴決定することができる限り、任意の一つの機構に限定されない、または依存しない。断りない限り、ある種の小胞を使用する方法を他の種類の小胞に適用することができる。小胞は、ペイロードとも呼ばれる可溶性成分を含むことができる内部区画を包囲する細胞膜に類似した脂質二重層を有する球形構造を含む。いくつかの態様において、本発明の方法は、直径約40〜100nmの小さな分泌小胞であるエキソソームを使用する。種類および特徴の決定を含む膜小胞の考察に関しては、Thery et al., Nat Rev Immunol. 2009 Aug; 9(8):581-93を参照すること。様々な種類の小胞のいくつかの性質は表2におけるものを含む。
（表２）小胞の性質
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略号:ホスファチジルセリン（PPS）、電子顕微鏡（EM）
小胞は、原形質膜または内部膜に由来する流出膜結合粒子または「微粒子」を含む。小胞は、細胞から細胞外環境に放出され得る。小胞を放出する細胞は、非限定的に、外胚葉、内胚葉または中胚葉から生じるかまたはそれらに由来する、細胞を含む。細胞は、遺伝子的、環境的および／または他の変動または変更を有することもある。たとえば、細胞は腫瘍細胞であり得る。小胞は、ソース細胞における任意の変化を反映し、それにより、発生する細胞、たとえば様々な遺伝子突然変異を有する細胞における変化を反映することができる。一つの機構において、小胞は、細胞膜のセグメントが自発的に陥入し、最終的に開口分泌されるとき、細胞内に生成される（たとえば、Keller et al., Immunol. Lett. 107(2):102-8 (2006)を参照すること）。小胞はまた、原形質膜の部分の脱出膨出（ブレブ形成）分離および封止から生じるか、または腫瘍起源の種々の膜結合タンパク質を含有する任意の細胞内膜に画定された小胞構造の輸送から生じる、脂質二重膜によって画定された細胞由来構造も含み、これには、腫瘍由来マイクロRNAまたは細胞内タンパク質を非限定的に含む、小胞内腔中に含有される分子とともに腫瘍由来タンパク質に選択的に結合する宿主循環に由来する表面結合分子を含む。ブレブおよびブレブ形成は、Charras et al., Nature Reviews Molecular and Cell Biology, Vol. 9, No. 11, p. 730-736 (2008)にさらに記載されている。腫瘍細胞から循環または体液中に流出した小胞は「腫瘍由来循環小胞」と呼ばれることもある。そのような小胞がエキソソームである場合、それは腫瘍由来循環エキソソーム（CTE）と呼ばれることもある。場合によっては、小胞は、特定の起始細胞に由来することもできる。CTEは一般に、起始細胞特異的小胞と同様に、ときには特異的な様式で、たとえば体液からのCTEまたは起始細胞特異的小胞の単離を可能にする一つまたは複数の固有のバイオマーカーを有する。たとえば、細胞または組織特異的マーカーは、起始細胞を同定するために使用される。そのような細胞または組織特異的マーカーの例は本明細書に開示されており、さらに、bioinfo.wilmer.jhu.edu/tiger/で入手可能なTissue-specific Gene Expression and Regulation（TiGER）データベース、Liu et al. (2008) TiGER: a database for tissue-specific gene expression and regulation. BMC Bioinformatics. 9:271、genome.dkfz-heidelberg.de/menu/tissue_db/index.htmlで入手可能なTissueDistributionDBsにおいてアクセスすることもできる。
小胞は、約10nm、20nmまたは30nmよりも大きい直径を有することができる。小胞は、40nm、50nm、100nm、200nm、500nm、1000nm、1,500nm、2,000nmよりも大きい、または10,000nmよりも大きい直径を有することができる。小胞は、約20〜2000nm、約20〜1500nm、約30〜1000nm、約30〜800nm、約30〜200nmまたは約30〜100nmの直径を有することができる。いくつかの態様において、小胞は、10,000nm、2000nm、1500nm、1000nm、800nm、500nm、200nm、100nm、50nm、40nm、30nm、20nm未満または10nm未満の直径を有する。本明細書において数値に関して使用される「約」という用語は、その数値の上下10％の変動が、指定された値に帰される範囲内であることを意味する。様々な種類の小胞の一般的なサイズが表2に示されている。小胞を評価して、一つの小胞またはいくつかの小胞の直径を計測することができる。たとえば、小胞集団の直径の範囲または小胞集団の平均直径を測定することができる。小胞直径は、当技術分野において公知の方法、たとえば電子顕微鏡法のような画像化技術を使用して評価することができる。ある態様において、一つまたは複数の小胞の直径は、光学粒子検出を使用して測定される。たとえば、「Optical Detection and Analysis of Particles」と題する2010年7月6日発行の米国特許第7,751,053号および「Optical Detection and Analysis of Particles」と題する2010年7月15日発行の米国特許第7,399,600号を参照すること。
いくつかの態様において、本発明の方法は、たとえば、生物学的試料の事前の単離、精製または濃縮なしに生物学的試料において、小胞を直接評価する工程を含む。たとえば、試料中の小胞の量それ自体が、診断、予後判定またはセラノーシス用の決定を提供するバイオシグネチャーを提供することができる。または、試料中の小胞は、解析の前に試料から単離、捕捉、精製または濃縮することもできる。前記のように、本明細書において使用される単離、捕捉または精製は、試料中の他の成分からの、部分的単離、部分的捕捉または部分的精製を含む。小胞単離は、本明細書に記載されるような様々な技術、たとえばクロマトグラフィー、ろ過法、遠心分離法、フローサイトメトリー、アフィニティー捕捉（たとえば平面またはビーズへの）および／またはマイクロ流体工学を使用して実施することができる。図15B〜15Cは、アプタマープールを用いて微小胞を評価するための本発明の方法の概要を示す。
小胞特徴を参照と比較することによって表現型特徴決定を提供するために、エキソソームのような小胞を評価することができる。いくつかの態様においては、小胞の表面抗原が評価される。表面抗原は、小胞の解剖学的起源および／または細胞ならびに他の表現型情報、たとえば腫瘍の状態の指標を提供することができる。たとえば、患者試料、たとえば血液、血清または血漿のような体液中に見られる小胞は、結腸直腸起源および癌の存在を示す表面抗原に関して評価される。表面抗原は、表面タンパク質、脂質、糖質および他の膜成分を非限定的に含む、小胞膜表面上で検出することができる、情報をもたらす任意の生物学的実体を含み得る。たとえば、腫瘍抗原を発現する結腸由来の小胞の陽性検出は、患者が結腸直腸癌を有していることを示すことができる。このように、本発明の方法を使用して、たとえば、対象から得られた一つまたは複数の小胞の疾患特異的および細胞特異的バイオマーカーを評価することにより、解剖学的または細胞起源と関連する任意の疾患または病態を特徴決定することができる。
もう一つの態様において、本発明の方法は、表現型特徴決定を提供するために一つまたは複数の小胞ペイロードを評価する工程を含む。小胞のペイロードは、小胞内に封じ込められた状態で検出することができる情報をもたらす任意の生物学的実体を含み、タンパク質および核酸、たとえばゲノムもしくはcDNA、mRNAまたはそれらの機能性フラグメントおよびマイクロRNA（miR）を非限定的に含む。加えて、本発明の方法は、小胞表面抗原（小胞ペイロードに加えて、またはそれを除いて）を検出して表現型特徴決定を提供することに関する。たとえば、小胞は、小胞表面抗原に特異的である結合物質（たとえば抗体またはアプタマー）を使用して特徴決定することができ、結合した小胞をさらに評価して、本明細書に開示される一つまたは複数のペイロード成分を同定することができる。本明細書に記載されるように、関心対象の表面抗原または関心対象のペイロードを有する小胞のレベルを参照と比較して表現型を特徴決定することができる。たとえば、試料中の癌関連表面抗原または小胞ペイロード、たとえば腫瘍関連mRNAまたはマイクロRNAの、参照に比べた場合の過剰発現は、その試料中の癌の存在を示すことができる。評価されるバイオマーカーは、所望の標的試料の選択および所望の参照試料と標的試料との比較に基づいて、存在しても存在しなくてもよく、増加していても減少していてもよい。標的試料の非限定的な例は、疾患、治療／非治療、長期的研究におけるような様々な時点を含み、参照試料の非限定的な例は、非疾患、正常、様々な時点および候補治療に対する感受性または耐性を含む。
バイオマーカー
本明細書に記載されるように、本発明の方法および組成物は、一つまたは複数の関心対象のバイオマーカーの存在またはレベルを検出するためのアッセイにおいて使用することができる。バイオマーカーは、本明細書に開示される、または当技術分野において公知である任意の有用なバイオマーカーであることができる。ある態様において、バイオマーカーはタンパク質またはポリペプチドを含む。本明細書において使用される「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、別段述べられない限り、互換可能に使用される。バイオマーカーは、本明細書に開示される、または当技術分野において公知であるような、DNA、RNAおよびそれらのいずれかの様々な亜種を含む核酸であることができる。バイオマーカーは脂質を含むことができる。バイオマーカーは糖質を含むことができる。バイオマーカーはまた、複合体、たとえばタンパク質、核酸、脂質および／または糖質を含む複合体であることができる。いくつかの態様において、バイオマーカーは微小胞を含む。ある態様において、本発明は、アプタマーのプールを使用して、プールの各メンバーによって標的化される正確な微小胞抗原を知ることなく、関心対象の微小胞集団の存在および／またはレベルを評価する方法を提供する。たとえば図15B〜Cを参照すること。他の場合、微小胞と結合したバイオマーカーが本発明の方法にしたがって評価される。たとえば図1A〜1F；図15Aを参照すること。
一つより多いバイオマーカーを含むバイオシグネチャーは、一つのタイプのバイオマーカーまたは複数のタイプのバイオマーカーを含むことができる。非限定的な例として、バイオシグネチャーは、複数のタンパク質、複数の核酸、複数の脂質、複数の糖質、複数のバイオマーカー複合体、複数の微小胞またはそれらのいずれかの組み合わせを含むことができる。たとえば、バイオシグネチャーは、1種または複数種の微小胞、1種または複数種のタンパク質および1種または複数種のマイクロRNAを含み得、その場合、1種または複数種のタンパク質および／あるいは1種または複数種のマイクロRNAは、場合によっては適宜、表面抗原および／またはペイロードとして微小胞と結合している。
いくつかの態様において、小胞は、小胞表面抗原を使用して検出される。一般的に発現される小胞表面抗原は、「ハウスキーピングタンパク質」または一般的小胞バイオマーカーと称され得る。バイオマーカーは、CD63、CD9、CD81、CD82、CD37、CD53、Rab-5b、アネキシンV、またはMFG-E8であってよい。四つの膜貫通ドメインを有する膜タンパク質のファミリーであるテトラスパニンを一般的小胞バイオマーカーとして使用することができる。テトラスパニンはCD151、CD53、CD37、CD82、CD81、CD9およびCD63を含む。TSPAN1（TSP-1）、TSPAN2（TSP-2）、TSPAN3（TSP-3）、TSPAN4（TSP-4、NAG-2）、TSPAN5（TSP-5）、TSPAN6（TSP-6）、TSPAN7（CD231、TALLA-1、A15）、TSPAN8（CO-029）、TSPAN9（NET-5）、TSPAN10（オキュロスパニン）、TSPAN11（CD151様）、TSPAN12（NET-2）、TSPAN13（NET-6）、TSPAN14、TSPAN15（NET-7）、TSPAN16（TM4-B）、TSPAN17、TSPAN18、TSPAN19、TSPAN20（UP1b、UPK1B）、TSPAN21（UP1a、UPK1A）、TSPAN22（RDS、PRPH2）、TSPAN23（ROM1）、TSPAN24（CD151）、TSPAN25（CD53）、TSPAN26（CD37）、TSPAN27（CD82）、TSPAN28（CD81）、TSPAN29（CD9）、TSPAN30（CD63）、TSPAN31（SAS）、TSPAN32（TSSC6）、TSPAN33およびTSPAN34を含む、哺乳動物において同定された30種類超のテトラスパニンが存在する。他の一般的に認められた小胞マーカーは、表3に記載されたものを含む。1つまたは複数のこれらのタンパク質は、本発明の方法および組成物を使用した表現型の特徴決定のために有用なバイオマーカーであり得る。
（表３）複数の細胞型由来の小胞中に認められるタンパク質
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本明細書に記載されるタイプのバイオマーカーのいずれかを主題の方法および組成物によって使用および／または評価することができる。例示的なバイオマーカーは非限定的に表4におけるバイオマーカーを含む。マーカーは、自由に循環している、または他の生物学的分子との複合体であることができるタンパク質としてまたはmRNAとして検出することができる。表4におけるマーカーはまた、適宜、本明細書に開示されるような表現型の特徴決定のための小胞の捕捉および／または検出に使用することもできる。いくつかの場合、複数の捕捉および／または検出物質を使用して特徴決定を増強する。たとえば図1C〜1Eを参照すること。マーカーは、小胞表現抗原および／または小胞ペイロードとして検出することができる。「例示的クラス」は、マーカーが既知のマーカーであるところの適応症を示す。当業者は、特定の場合、マーカーを代替設定において使用することもできることを理解するであろう。たとえば、一つのタイプの疾患を特徴決定するために使用することができるマーカーを、適宜、別の疾患を特徴決定するために使用してもよい。様々な系統の腫瘍のバイオマーカーとして使用することができる腫瘍マーカーの非限定的な例を考えてみる。表4におけるバイオマーカー参考例は、当技術分野において一般に使用されているものである。遺伝子の別名および記述は、GeneCards（登録商標）（www.genecards.org）、HUGO Gene Nomenclature（www.genenames.org）、Entrez Gene（www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=gene）、UniProtKB/Swiss-Prot（www.uniprot.org）、UniProtKB/TrEMBL（www.uniprot.org）、OMIM（www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=OMIM）、GeneLoc（genecards.weizmann.ac.il/geneloc/）およびEnsembl（www.ensembl.org）を含む多様なオンラインデータベースを使用して見いだすことができる。概して、以下の遺伝子記号および名称は、HUGOによって承認されたものに対応し、タンパク質名は、UniProtKB/Swiss-Protによって推奨されるものである。また、一般的な代替が提供されている。いくつかの場合、バイオマーカーは、「ENSG」の後に番号が続く形態であるEnsembl参照番号、たとえばLAMP2に対応するENSG00000005893によって参照される。表4において、簡潔に示すためだけに、「ENSG00000」を表すために「E.」が使用されることがある。たとえば、「E.005893」は「ENSG00000005893」を表す。タンパク質名が前駆体を示す場合、その成熟タンパク質が同じく暗示される。本出願を通じて、遺伝子およびタンパク質記号は互換可能に使用され得、意味は、必要に応じて文脈から導き出すことができる。
（表４）例示的なバイオマーカー
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本発明の方法および組成物に組み込むことができるさらなるバイオマーカーの例は、非限定的に、2012年6月14日に出願された国際特許出願PCT/US2012/042519（弁理士整理番号37901-797.601）および2012年8月8日に出願された国際特許出願PCT/US2012/050030（弁理士整理番号37901-797.602）に開示されているものを含む。
本発明の様々な態様において、本明細書に開示される病状または疾患のいずれかを検出または評価するために使用されるバイオマーカーまたはバイオシグネチャーは、いくつかの異なるマーカーカテゴリーの一つに入る一つまたは複数のバイオマーカーを含むことができ、その場合、カテゴリーは、非限定的に、1）疾患特異的バイオマーカ；2）細胞または組織特異的バイオマーカー；3）小胞特異的バイオマーカー（たとえば一般的小胞バイオマーカー）；4）血管形成特異的バイオマーカー；および5）免疫調節バイオマーカーの、一つまたは複数を含む。そのようなマーカーの例が本明細書に開示され、当業者に公知である。さらには、特定の疾患または病状において役割を有することが特徴として決定されている当技術分野において公知のバイオマーカーを、本発明の組成物および方法における標的としての使用に適合させることもできる。さらなる態様において、小胞と結合しているそのようなバイオマーカーは、すべてが小胞表面バイオマーカーであることもできるし、または小胞表面マーカーと小胞ペイロードマーカー（すなわち、小胞によって包囲された分子）との組み合わせであることもできる。評価されるバイオマーカーは、供給源の組み合わせに由来することができる。たとえば、疾患または障害は、タンパク質、核酸、小胞、循環バイオマーカー、組織試料由来のバイオマーカーなどの組み合わせを評価することによって検出または特徴決定され得る。加えて、本明細書に記されるように、評価される生物学的試料は、任意の生物学的流体であることもできるし、またはそのような生物学的流体内に存在する個々の成分（たとえば小胞、核酸、タンパク質またはそれらの複合体）を含むことができる。
EpCAMは、多くの腫瘍細胞上に発現するpan-上皮分化抗原である。これは、カドヘリン−カテニン経路、ひいては細胞内シグナル伝達および極性を担う基本的WNT経路と複雑に関連している。これは、胃腸、泌尿器および他の癌腫の治療において免疫治療標的として使用されている（Chaudry MA, Sales K, Ruf P, Lindhofer H, Winslet MC (April 2007). Br. J. Cancer 96 (7): 1013-9）。これは非分化多能性幹細胞中に発現する。EpCAMは、少なくとも二つのタイプI膜タンパク質を含み、かつ、ホモタイプカルシウム非依存性細胞接着分子として機能するファミリーのメンバーである。この遺伝子における突然変異が先天性タフティング腸疾患を生じさせる。EpCAMは、様々な系統の癌細胞由来の微小胞の表面に観測されている。EpCAMは、本明細書の様々な例において例示的な表面抗原として使用される。当業者は、EpCAMを使用する様々な態様および例を、他の微小胞表面抗原を含む他のバイオマーカーにも適用することができることを理解するであろう。
治療
本明細書において使用される「治療有効量」とは、哺乳動物における疾患または病状の一つまたは複数の症候を軽減する組成物の量（ある程度、熟練した医療実施者の判断による）をいう。加えて、組成物の「治療有効量」とは、疾患または病状と関連する、またはその原因となる生理学的または生化学的パラメータを部分的または完全のいずれかに正常に戻す量を意味する。医療当業者は、たとえば静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、経口投与または吸入によって投与されたとき特定の病状または障害を治療または予防するために、組成物の治療有効量を決定することができる。治療的に有効であるために求められる組成物の正確な量は、数多くの要因、たとえば有効薬剤の比活性、用いられる送達装置、薬剤の物理的特徴、投与の目的、さらには多くの患者固有の考慮事項に依存する。しかし、治療有効量の決定は、本明細書に記載される開示を考慮すると、通常の医療当業者の技能の範囲内である。
本明細書において使用される語「治療する」、「治療」、「治療法」および「治療処置」は治癒的治療または予防的治療をいう。「予防的治療」の例は、標的の疾患（たとえば癌または他の増殖性疾患）またはそれに関連する病状の可能性の予防または軽減である。治療を必要とする者は、すでに疾患または病状を有する者ならびに予防される疾患または病状を有しやすい者を含む。本明細書において使用される語「治療する」、「治療」、「治療法」および「治療処置」はまた、疾患または関連の病状と戦うための哺乳動物の管理および看護をも指し、かつ疾患、病状の症候、副作用または他の合併症を緩和するための組成物の投与を含む。癌の治療処理は、手術、化学療法、放射線療法、遺伝子療法および免疫療法を含むが、それらに限定されない。
本明細書において使用される語「薬剤」または「薬」または「治療物質」とは、化学物質、化学物質の混合物、生物学的高分子または治療的性質を有することが疑われる生物学的材料、たとえばバクテリア、植物、真菌もしくは動物（特に哺乳動物）細胞または組織から作られる抽出物をいう。薬剤または薬は、精製、実質的に精製または部分的に精製されることができる。本発明の「薬剤」はまた、放射線治療剤または「化学療法剤」を含む。
本明細書において使用される語「診断物質」とは、罹病組織、たとえば腫瘍の画像化に使用される任意の化学物質をいう。
本明細書において使用される語「化学療法剤」とは、癌、新生物性および／もしくは増殖性疾患に対して活性を有する、または癌細胞を直接死滅させる能力を有する薬剤をいう。
本明細書において使用される「薬学的製剤」とは、有意な毒物学的有害作用を有しない、ヒトおよび獣医学的用途のための製剤を含む。本明細書において使用される「薬物学的に許容される製剤」とは、本発明の核酸分子をその所望の活性にとってもっとも適した物理的位置で効果的に分散させることができる組成物または製剤をいう。
本明細書において使用される語「薬学的に許容される担体」は、薬学的投与と適合性であるあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを含むことを意図する。薬学的に有効な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は当技術分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が有効成分化合物と不適合性である場合を除き、組成物におけるその使用は考慮される。
癌治療剤としてのアプタマー−毒素コンジュゲート
これまでの広範な研究が、一定範囲の適応症のための、主に癌の治療に向けられ、第一に血液腫瘍に焦点を当てた潜在的治療としての抗体−毒素コンジュゲート（「免疫コンジュゲート」）の概念を広く展開している。タンパク質毒素、高効力小分子細胞毒、放射性同位体およびリポソーム封入薬物を含む、標的化送達のための多様な異なるペイロードが前臨床および臨床試験において試験されている。これらの努力は血液腫瘍のための三つのFDA承認治療を生み出すことに成功したが、クラスとしての免疫コンジュゲート（特に固形腫瘍のための）は、歴史的に、非ヒト化抗体に対する中和抗体応答を発生させる傾向、固形腫瘍への限られた浸透、毒素コンジュゲートの結果としての標的結合親和性の損失および全体的治療指数を制限する抗体半減期と毒素コンジュゲート半減期との不均衡を含む抗体の複数の異なる性質に帰すことができる、失望させる結果しかもたらしていない（Reff and Heard, Critical Reviews in Oncology/Hematology, 40 (2001):25-35によって考察されている）。
アプタマーは、その吸収、分布、代謝および排泄（「ADME」）の性質が本質的に異なり、概して、概して抗体と関連する免疫エフェクター機能（たとえば抗体依存的細胞傷害性、補体依存的細胞傷害性）の多くを欠くことを除き、機能的には抗体に類似している。先に記載したアプタマーおよび抗体の性質の多くを比較する中で、いくつかの要因が、アプタマーを介する毒素送達が、抗体を用いる送達に対していくつかの具体的な利点を提供し、最終的には、治療としてより高い潜在能力をそれらに与えることを示唆する。抗体を介する毒素送達に対するアプタマーを介する毒素送達の利点のいくつかの例は以下のとおりである。
1）アプタマー−毒素コンジュゲートは完全に化学合成される。化学合成は、コンジュゲートの性質に対してより多大な制御を提供する。たとえば、化学量論比（アプタマーに対する毒素の比）および取り付けの部位を正確に定めることができる。様々なリンカー化学物質を容易に試験することができる。アプタマーフォールディングの可逆性は、コンジュゲート中の活性の損失が起こりにくく、かつコンジュゲート条件の調節においてより多くのフレキシビリティーを提供して収率を最大化することを意味する。
2）より小さなサイズがより良好な腫瘍への浸透を可能にする。固形腫瘍への抗体の不十分な浸透が、コンジュゲート手法の効能を制限する要因としてしばしば挙げられている。Colcher, D., Goel, A., Pavlinkova, G., Beresford, G., Booth, B., Batra, S. K. (1999) "Effects of genetic engineering on the pharmacokinetics of antibodies," Q. J. Nucl. Med., 43:132-139を参照すること。非PEG化抗テナシンCアプタマーの性質を対応する抗体と比較した研究が、腫瘍中への効率的な吸収（腫瘍：血液比によって決定される）を実証し、腫瘍に限局化されたアプタマーが予想外に長命である（t1/2＞12時間）ことを証明している（Hicke, B. J., Stephens, A. W., "Escort aptamers: a delivery service for diagnosis and therapy", J. Clin. Invest., 106:923-928 (2000)）。
3）調節可能PK。ペイロードの性質に合致するようにアプタマー半減期／代謝を容易に調節して、全身的暴露を最小限にしながらも毒素を腫瘍に送達する能力を最適化することができる。アプタマー主鎖の適切な修飾および高分子量PEGの付加がアプタマーの半減期をコンジュゲート毒素／リンカーの固有の半減期に合致させることを可能にし、非機能性毒素担持代謝産物への全身的暴露を最小限にし（t1/2（アプタマー）＜＜t1/2（毒素）の場合に予想される）、持続性の非コンジュゲートアプタマーがコンジュゲートアプタマーの吸収を機能的にブロックする可能性を下げる（t1/2（アプタマー）＞＞t1/2（毒素）の場合に予想される）。
4）相対的に低い材料要求基準。投薬レベルが細胞傷害性ペイロードに固有の毒性によって制限されることがあり得る。そのようなものとして、一つの治療過程がおそらく相対的に小さな量（＜100mg）のアプタマーしか必要とせず、オリゴヌクレオチド合成のコストがアプタマーベースの治療の障害となる可能性を減らす。
5）この適応症の場合には非経口投与が好ましい。患者／医師受諾を促すために代替の剤形を開発する特別な必要性はない。
アプタマー同定法
核酸配列は、二次および三次モチーフ、特にそれらのヌクレオチド配列へとフォールディングする。これらのモチーフは、配列が標的分子、たとえばタンパク質および他のアミノ酸配列上の特定の位置に結合することを可能にする位置において核酸配列に正および負の電荷を配置する。これらの結合配列は当技術分野においてアプタマーとして知られている。相対的に短いヌクレオチドの伸長（たとえば10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39または40個のヌクレオチド）においてさえ何兆もの特有のヌクレオチド配列が可能であるせいで、多様なモチーフを生成して、ほぼいかなる所望のタンパク質または他の標的のためのアプタマーも得ることができる。
アプタマーは、特定の長さ、一般には20〜80塩基対長、たとえば20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79または80塩基対長のオリゴヌクレオチドをランダムに生成することによって創製される。そして、これらのランダムなヌクレオチドを関心対象のタンパク質標的と共にインキュベートする。いくつかの洗浄工程ののち、標的に結合するオリゴヌクレオチドを捕集し、増幅する。そして、増幅されたアプタマーを標的に加え、プロセスを多くの場合15〜20回繰り返す。このプロセスの一般的なバージョンが当業者にSELEX法として知られている。
最終結果は、標的に対して高い親和性を有する1種または複数種のアプタマーを含む。本発明は、所望の特徴を提供するために使用することができる、そのような得られたアプタマーのさらなる処理：1）所望のエピトープに対するアプタマーを同定するための競合的結合アッセイ；2）高親和性結合アプタマーをインシリコで同定するためのモチーフ分析；および3）特定の疾患を検出するために使用することができるアプタマーを同定するための、微小胞ベースのアプタマー選択アッセイ、を提供する。本発明はまた、関心対象の標的を検出する、たとえば生物学的実体、たとえばタンパク質、核酸または微小胞を検出するためのアプタマーの使用を提供する。本発明のアプタマーは、ブロッキング物質、陰性対照などとして使用するための関心対象の官能基、たとえばカルボキシル基に結合し得る。方法は、以下、実施例においてさらに詳細に説明される。
本発明はさらに、本発明の方法によって発見される配列と相同性が高いアプタマー配列を考慮する。「高い相同性」とは、一般に、ポリヌクレオチド配列と参照配列との間で40％以上、好ましくは60％以上、より好ましくは80％以上、よりさらに好ましくは85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはより高い相同性をいう。ある態様において、参照配列は、本明細書に提供される1種または複数種のアプタマーの配列を含む。相同率（同一率とも呼ばれる）は一般に、二つの最適に整列させた配列の間で実施される。比較のために配列を整列させる方法は当技術分野において周知である。配列の最適な整列および比較は、たとえば"Wilbur and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 80: 726-30 (1983)"中のアルゴリズムを使用して実施することができる。また、相同性算出は、BLASTを使用して実施することができる。BLASTは、NCBIサーバー：www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/（Altschul S F, et al, Nucleic Acids Res. 1997; 25(17):3389-402；Altschul S F, et al, J Mol. Biol. 1990; 215(3):403-10）で見いだすことができる。参照配列、たとえば本明細書の方法によって同定された配列よりも長い、または長さがそれに等しい単離されたポリヌクレオチドの場合、比較は、参照配列の完全長を用いて実施される。単離されたポリヌクレオチドが参照配列よりも短い、たとえば本明細書の方法によって同定された配列よりも短い場合、比較は、参照配列のうち同じ長さのセグメント（相同性算出によって求められる任意のループは除外する）に対して実施される。
本発明はさらに、本発明の方法によって見いだされる配列の機能性フラグメントであるアプタマー配列を考慮する。アプタマー配列に関連して、アプタマー配列の「機能性フラグメント」は、完全長配列と同じ標的に結合する配列を含み得る。いくつかの場合、候補アプタマー配列は、5'リーダー配列および／または3'テール配列を含むライブラリーのメンバーからの配列である。そのようなリーダー配列またはテール配列は、増幅または捕捉などのためのプライマー結合を容易にするように働き得る。これらの態様において、完全長配列の機能性フラグメントは、リーダーおよび／またはテール配列を有しない、候補アプタマー配列の部分配列を含み得る。
競合的抗体付加
公知のアプタマー製造法は、結合したすべてのアプタマーを標的配列から溶離させる工程を含み得る。いくつかの場合、これは、所望のアプタマー配列を同定するのに十分ではない。たとえば、アッセイ中に抗体を交換しようとするとき、交換される抗体の特定のエピトープに結合するアプタマーだけを捕集することが望ましい場合もある。本発明は、抗体エピトープに結合するアプタマーの選択的捕集を可能にするために、交換される抗体をアプタマー／標的反応に付加する工程を含む方法を提供する。ある態様において、方法は、ランダムに生成されたオリゴヌクレオチドを含む反応混合物を関心対象の標的と共にインキュベートする工程、標的に結合しない非結合アプタマーを反応混合物から除去する工程、関心対象のエピトープに結合する抗体を反応混合物に加える工程、および抗体によって置換されるアプタマーを捕集する工程を含む。標的はタンパク質であることができる。
図2A〜2Bは競合アッセイ選択戦略を示す。核酸アプタマー候補のランダムなプール（ライブラリー）を関心対象の標的202と共にインキュベートする。複数ラウンドの結合を実施することができ、その中で、1）ライブラリーを標的と共にインキュベートし；2）ライブラリー−標的混合物を洗浄して非結合アプタマー候補を除去し；3）結合アプタマー候補を標的から溶離させ；4）溶離させたアプタマー候補を再び標的に加え、結合させる。図2Aは、標的202に結合したアプタマー候補201を示す。次いで、工程i）において、競合する抗体203を反応に加える。図2Bは、抗体のエピトープにおいてアプタマー候補201と競合する候補抗体203を示す。アプタマー候補201は、抗体によって置換されたのち、捕集される。
競合的結合
本明細書に記載されるように、アプタマーは、関心対象の標的に対して同定することができる。図3に概説するように、競合的結合スキーム30を使用して、関心対象の標的に対するアプタマーを同定することができる。分析対象物、たとえばタンパク質または微小胞のような生物学的実体を基体に捕捉する（31）。基体は、たとえば平面基体またはビーズであることができる。分析対象物は、共有結合的または非共有結合的に捕捉することができ、たとえば、分析対象物は、抗体、アプタマーまたはストレプトアビジン−ビオチン結合を使用して捕捉することができる。捕捉された分析対象物をオリゴヌクレオチドアプタマー候補のプールと接触させる（32）。ある態様において、プールは、ランダムに生成されたオリゴヌクレオチド、たとえば少なくとも10、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1023、1015、1016、1017、1018、1019個または少なくとも1020個のオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、分析対象物、基体、捕捉物質（たとえば抗体（Ab）、アプタマーなど）、反応チューブまたはウェル、壊死組織片などを含む、混合物中の様々な成分に結合する（33）。分析対象物に結合するオリゴヌクレオチドは、関心対象の標的に対するアプタマー候補を含む（34）。非結合オリゴヌクレオチドを洗浄によって除去する（35）。この工程ののち、反応混合物は、アプタマー候補と結合した捕捉分析対象物を含む。特定のエピトープを認識するリガンド、たとえば抗体を反応混合物と接触させる（37）。リガンドは、エピトープを求める競合により、リガンドと同じエピトープに結合したアプタマー候補を分離させる（38）。分離させたアプタマー候補を捕集し、増幅する（39）。工程32〜39を一定の回数n、たとえば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20回繰り返して、リガンドと同じエピトープに結合するアプタマー候補をさらに富化する。反復サイクルののち、残るアプタマーを配列決定および本明細書に記載される他の特徴決定によって評価する（310）。
対照スクリーニングを上記方法と同時並行に実施する。対照スクリーニングによって同定された任意のアプタマーは捨てられる。対照分析対象物は、非限定的に、分析対象物と共にインキュベートされた裸の基体、分析対象物を有しない裸の基体および対照リガンド、たとえば関心対象の標的に結合しない抗体で実施された方法を含む。
リガンドは、関心対象のバイオマーカーに対する抗体であることができる。方法は、生物学的アッセイにおいて抗体に代わるためのアプタマーを同定するために使用され得る。たとえば、アプタマーは、同等な抗体よりも再現可能かつ効率的に製造され得る。バイオマーカーは、非限定的に表3または4におけるバイオマーカーを含む任意の有用なバイオマーカーであり得る。ある態様において、バイオマーカーは、表3または4から選択される微小胞表面抗原である。
ある態様において、本発明は、（a）アプタマー候補のプールを、標的分子を含む試料と接触させる工程；（b）非結合アプタマー候補を除去する工程；（c）試料を標的分子に対するリガンドと接触させる工程；および（d）リガンドとの競合によって標的分子から分離したアプタマー候補を単離し、それにより、リガンドと同じ標的に結合するアプタマーの群を選択する工程を含む、アプタマーの群を選択する方法を提供する。標的分子はタンパク質であり得る。タンパク質は微小胞表面抗原であることができる。表面抗原は、微小胞から単離されてもよいし、または微小胞膜内に埋め込まれたままであってもよい。標的分子は、直接的または間接的に基体につながれてもよい。たとえば、標的分子は、基体表面上の抗体またはアプタマーと結合しているタンパク質であることができる。もう一つの例において、標的分子は微小胞の表面抗原であり、微小胞は基体につながれている。
アプタマー候補を置換するために使用されるリガンドは小分子またはタンパク質を含み得る。いくつかの態様において、リガンドは抗体を含む。したがって、方法は、抗体と同じエピトープに結合するアプタマーを同定するために使用することができる。
本明細書に記載されるように、工程（a）〜（d）は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20回繰り返すことができ、各反復において、工程（d）において単離されたアプタマー候補が工程（a）に投入されるアプタマー候補のプールとして使用される。この反復プロセスは、リガンドと同じ標的に結合するアプタマー候補でアプタマー候補のプールをさらに富化するために使用される。
選択されたアプタマー群のメンバーをさらなる特徴決定のために同定し得る。いくつかの態様において、同定はハイスループット配列決定法（HTS)によって実施される。HTSは次世代配列決定法であることができる。
モチーフ分析
大部分のアプタマー実験においては、標的に結合する複数のアプタマー配列が同定される。これらのアプタマーは様々な結合親和性を有する。これら多くのアプタマーをそれぞれの親和性を評価するのに十分な量で生成するには時間と労力を要する。大きなサブセットを物理的にスクリーニングすることなく最高の親和性を有する多数のアプタマーを同定するために、本発明は、関心対象の標的に対する一つまたは複数の高親和性アプタマーの二次元構造の分析を含む方法を提供する。ある態様において、方法は、類似した二次元構造、すなわちモチーフを有するが、必ずしも類似した一次配列を有するわけではないアプタマーを求めてデータベースをスクリーニングする工程を含む。ある態様において、方法は、本明細書に開示される、または当技術分野において公知であるような従来の方法（たとえば表面プラズモン共鳴結合アッセイ法、たとえば図4を参照）を使用して高親和性アプタマーを同定する工程、高親和性アプタマーの二次元構造を近似する工程、および高親和性アプタマーに類似した二次元構造を有すると予測されるアプタマーを配列のプールから同定する工程を含む。これにより、方法は、関心対象の標的にも結合する候補のプールを提供する。オリゴの二次元構造は、当技術分野において公知の方法を使用して、たとえば、内容が参照により全体として本明細書に組み入れられるMathews, D., Sabina, J., Zucker, M. & Turner, H. Expanded sequence dependence of thermodynamic parameters provides robust prediction of RNA secondary structure. J. Mol. Biol. 288, 911-940 (1999)；Hofacker et al., Monatshefte f. Chemie 125: 167-188 (1994)；およびHofacker, I. L. Vienna RNA secondary structure server. Nucleic Acids Res. 31, 3429-3431 (2003)に記載されているように、市販のソフトウェアプログラム、たとえばViennaまたはmFoldを使用して実施される自由エネルギー（ΔG）算出によって予測することができる。図5A〜5Bを参照すること。配列のプールは、ランダムに生成されたアプタマー候補のプールから、ハイスループット配列決定プラットフォーム、たとえばLife Technologiesのイオントレントプラットフォームを使用して配列決定することができる。高親和性アプタマーに類似した二次元構造を有すると予測されるアプタマーを配列のプールから同定する工程は、得られた配列を好みのソフトウェアプログラムにロードして、高親和性アプタマーと同様な二次元構造を有する配列プールのメンバーを同定する工程を含み得る。そして、配列のプールの親和性をインサイチューで、たとえば表面プラズモン共鳴結合アッセイ法などで測定することができる。
アプタマーサブトラクション法
疾患、たとえば癌を検出するためのアッセイ法を開発するためには、一般に、正常および疾患患者由来の既知のバイオマーカーの大きな集団をスクリーニングして、疾患と相関するマーカーを同定する。このプロセスは、弁別マーカーがすでに記載されている場合しかうまく行かない。この問題に対処するために、本発明は、はじめに非標的微小胞または細胞と共にインキュベートすることにより、大きなアプタマープールから非弁別アプタマーを減じる工程を含む方法を提供する。非標的細胞は、正常な細胞または正常な細胞から流出した微小胞であることができる。そして、正常な微小胞または細胞に結合しなかったアプタマーを罹病微小胞または細胞と共にインキュベートする。そして、罹病微小胞または細胞に結合するが、正常細胞には結合しなかったアプタマーが、疾患を検出するためのアッセイ法にとって可能な候補である。このプロセスは、疾患試料中の特定のマーカーの存在を知ることからは独立している。
サブトラクション法は、所望の標的集団を優先的に認識するアプタマーを同定するために使用することができる。ある態様において、サブトラクション法は、対照（たとえば正常または非疾患）集団由来の標的よりも疾患標的集団由来の標的を優先的に認識するアプタマーを同定するために使用される。疾患標的集団は、疾患個体由来の小胞の集団であり得、一方で、対照集団は非疾患個体由来の小胞を含む。疾患は、癌または本明細書に開示される、または当技術分野において公知である他の疾患であることができる。したがって、方法は、対照標的よりも疾患標的を優先的に同定するアプタマーを提供する。
対照血漿、たとえば、関心対象の疾患を有しない、たとえば癌を有しない「正常」個体由来の血漿から循環微小胞を単離する。血漿中の微小胞を、本明細書に開示される、または当技術分野において公知である方法を使用して単離する。たとえば、小胞は、以下の方法：ろ過法、ExoQuick試薬、分子クラウディング試薬（たとえばLife TechnologiesのTEXIS）を使用する超遠心分離、アフィニティー単離法、アフィニティー選択法またはこれらの方法のいずれかの組み合わせの一つにより、血漿から単離することができる。各場合に単離された微小胞は、微小胞タイプの混合物であり、エキソソームサイズの小胞を生成する傾向を有する超遠心分離法の場合を除き、様々なサイズを有する。ランダムに生成されたオリゴヌクレオチドライブラリー（たとえば、以下の実施例1に記載されるように製造される）を、単離した正常な小胞と共にインキュベートする。これらの小胞に結合しないアプタマーは、たとえば小胞をスピンダウンし、非結合アプタマーを含む上清を捕集することによって単離する。そして、これらの非結合アプタマーを、疾患患者から単離された小胞と接触させて（たとえば上記と同じ方法を使用して）、アプタマーに疾患小胞を認識させる。次に、疾患小胞に結合したアプタマーを捕集する。ある態様において、小胞は、単離したのち、カオトロピック剤（たとえばSDSまたは類似した洗浄剤）を使用して溶解させ、その後、溶解混合物をアフィニティーカラムに通すことによってアプタマーを捕捉する。アフィニティーカラムは、ビオチンにコンジュゲートしたアプタマープールの場合には、ストレプトアビジンビーズを含み得る。その後、単離したアプタマーを増幅する。そして、このプロセスを、たとえば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20回またはそれ以上、繰り返すことができる。
本発明の一つの局面においては、関心対象の生物学的試料を特徴決定するために使用することができるアプタマープロフィールを同定する。ある態様においては、ランダムに生成されたオリゴヌクレオチド、たとえば少なくとも10、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019個または少なくとも1020個のオリゴヌクレオチドのプールを、対照集団由来の関心対象の生物学的成分または標的と接触させる。対照集団由来の関心対象の生物学的成分または標的に結合しないオリゴヌクレオチドを単離したのち、試験集団由来の関心対象の生物学的成分または標的と接触させる。試験集団由来の関心対象の生物学的成分または標的に結合するオリゴヌクレオチドを保持する。保持されたオリゴヌクレオチドを使用して、保持されたオリゴヌクレオチドを対照集団由来の関心対象の生物学的成分または標的と接触させ、対照集団由来の関心対象の生物学的成分または標的に結合しない保持されたオリゴヌクレオチドを単離し、それらの単離されたオリゴヌクレオチドを試験集団由来の関心対象の生物学的成分または標的と再び接触させ、結合するオリゴヌクレオチドを単離することにより、プロセスを繰り返すことができる。「成分」または「標的」は、オリゴヌクレオチドが結合することができる、試料中に存在する任意のもの（たとえばポリペプチド、ペプチド、核酸分子、糖質、脂質など）であることができる。そして、プロセスを、たとえば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10回またはより多くの回数、繰り返す。得られるオリゴヌクレオチドは、対照集団に対して試験集団を示差的に検出することができるアプタマーを含む。これらのアプタマーはアプタマープロフィールを提供し、アプタマープロフィールは、1種または複数種のアプタマーを使用して判定されるバイオシグネチャー、たとえば、1種または複数種のアプタマーを使用して検出される成分または標的の存在またはレベルを含むバイオシグネチャーを含む。
例示的なプロセスが図6に示されており、これは対照としての正常（非癌）個体からの小胞を使用して、癌小胞を優先的に認識するアプタマーを同定する方法を実証する。図中、エキソソームが例示されているが、当業者は、他の微小胞を同じやり方で使用することができることを理解するであろう。得られるアプタマーは、正常な小胞から癌小胞を示差的に検出することができるプロフィールを提供することができる。当業者は、同じ工程を使用して、関心対象の任意の疾患または病状を特徴決定するためのアプタマープロフィールを導出することができることを理解するであろう。
ある態様において、本発明は、上記方法によって同定された単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明はさらに、上記方法によって同定されたヌクレオチド配列と少なくとも60％同一であるヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチドを提供する。より好ましくは、単離された核酸分子は、上記方法によって同定されたヌクレオチド配列と少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはより多く同一である。参照配列、たとえば上記方法によって同定された配列よりも長い、または長さがそれに等しい単離されたポリヌクレオチドの場合、比較は、参照配列の完全長を用いて実施される。単離されたポリヌクレオチドが参照配列よりも短い、たとえば上記方法によって同定された配列よりも短い場合、比較は、参照配列のうち同じ長さのセグメント（相同性算出によって求められる任意のループは除外する）に対して実施される。
関連の局面において、本発明は、アプタマープロフィールを使用して生物学的表現型を特徴決定する方法を提供する。アプタマープロフィールは、上記方法を使用して決定することができる。アプタマープロフィールは、試験試料に関して決定し、対照アプタマープロフィールと比較することができる。表現型は、癌のような疾患または障害であり得る。表現型の特徴決定は、非限定的に、診断、予後判定またはセラノーシスを提供することを含むことができる。したがって、アプタマープロフィールは、試料が採取された対象に関する診断、予後判定および／またはセラノーシス読み取り値を提供することができる。
もう一つの態様において、アプタマープロフィールは、アプタマー分子のプールを試験試料と接触させ、同じアプタマープールを対照試料と接触させ、試験試料中の成分または標的に示差的に結合するが、対照試料中の成分または標的には示差的に結合しない（またはその反対）1種または複数種のアプタマー分子を同定することにより、試験試料に関して決定される。生物学的試験試料または対照試料に関して使用される「成分」または「標的」は、アプタマーが結合することができる、試料中に存在する任意のものであることができる（たとえばポリペプチド、ペプチド、核酸分子、糖質、脂質など）。たとえば、試料が血漿または血清試料であるならば、アプタマー分子は、無疾患対象に比べて疾患状態においてのみ発現する、または示差的に発現（過剰または過少発現）するポリペプチドバイオマーカーに結合し得る。試験試料中のアプタマープロフィールと対照試料中のアプタマープロフィールとの比較は、アプタマー結合の定性的および定量的尺度に基づき得る（たとえば、結合と非結合または試験試料中の結合レベルと参照対照試料中の異なる結合レベル）。
ある局面において、本発明は、生物学的試験試料をアプタマー分子のプールと接触させる工程、プールを対照生物学的試料と接触させる工程、前記試験試料中の成分に結合するが、対照試料には結合しない1種または複数種のアプタマーを同定し、それにより、前記生物学的試験試料のアプタマープロフィールを同定する工程を含む、標的特異的アプタマープロフィールを同定する方法を提供する。ある態様において、アプタマーのプールは、疾患試料に対して選択され、参照試料と比較され、疾患試料中の成分に結合するが、参照試料中の成分には結合しないサブセット中のアプタマーを従来の配列決定技術によって配列決定して、結合するサブセットを同定し、それにより、特定の疾患試料のアプタマープロフィールを同定することができる。このようにして、アプタマープロフィールは、スクリーニングされる他の試料中の疾患を検出するための個別化プラットフォームを提供する。さらには、適切な参照または対照試料を選択することにより、アプタマープロフィールは、試験試料が採取された対象に関する診断、予後判定および／またはセラノーシス読み取り値を提供することができる。
関連の局面において、本発明は、（a）生物学的対照試料をオリゴヌクレオチドのプールと接触させる工程；（b）生物学的対照試料に結合しない、オリゴヌクレオチドのプールの第一のサブセットを単離する工程；（c）生物学的試験試料をオリゴヌクレオチドのプールの第一のサブセットと接触させる工程；および（d）生物学的試験試料に結合するオリゴヌクレオチドのプールの第二のサブセットを単離し、それにより、アプタマーのプールを選択する工程を含む、アプタマーのプールを選択する方法を提供する。オリゴヌクレオチドのプールは任意の数の所望の配列を含み得、たとえば、少なくとも10、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019個または少なくとも1020個のオリゴヌクレオチドが出発プール中に存在し得る。工程（a）〜（d）は、アプタマーのプールをさらに磨くために繰り返されてもよい。ある態様において、これらの工程は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19回または少なくとも20回繰り返される。
本明細書に記載されるように、生物学的試験試料および生物学的対照試料は微小胞を含み得る。ある態様において、生物学的試験試料および場合によっては生物学的対照試料は体液を含む。体液は、非限定的に、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（CSF）、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液、尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、毛髪、涙液、嚢胞液、胸膜液、腹膜液、悪性流体、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液または他の洗浄液を含み得る。生物学的試験試料および場合によっては生物学的対照はまた、腫瘍試料、たとえば腫瘍または腫瘍組織由来の細胞を含み得る。他の態様において、生物学的試験試料および場合によっては生物学的対照試料は細胞培地を含む。諸態様において、生物学的試験試料は疾患試料を含み、生物学的対照試料は非疾患試料を含む。したがって、アプタマーのプールを使用して、疾患の診断、予後判定および／またはセラノーシス読み取り値を提供し得る。
前記のように、本発明は、微小胞を評価するために使用することができる。微小胞は、複数の情報を含む一つの生物学的実体を提供するため、強力なバイオマーカーである。記載したような例の場合、小胞は、それぞれが相補的な情報を提供する複数の表面抗原を有することができる。癌マーカーおよび組織特異的マーカーを考えてみる。両マーカーが試料中に個々に存在するならば、たとえば両方が循環タンパク質または核酸であるならば、癌マーカーおよび組織特異的マーカーが同じ解剖学的部位に由来するかどうかを確かめることができない場合がある。しかし、癌マーカーおよび組織特異的マーカーの両方が一つの微小胞上の表面抗原であるならば、小胞そのものが二つのマーカーを連結し、かつ疾患（癌マーカーによって）および疾患の起源（組織特異的マーカーによって）の指示を提供する。さらに、小胞は、評価することができる任意の数の表面抗原およびペイロードを有することができる。したがって、本発明は、複数の細胞外微小胞を、ランダムに生成された結合物質のライブラリーと接触させる工程、細胞外微小胞の一つまたは複数の成分に対して親和性を有する結合物質のライブラリーのサブセットを同定する工程を含む、結合物質を同定する方法を提供する。結合物質は、アプタマー、抗体および／または本明細書に開示される、または当技術分野において公知である任意の他の有用なタイプの結合物質を含み得る。
関連の局面において、本発明は、（a）参照微小胞集団を、1種または複数種の微小胞表面マーカーに結合することができる複数のリガンドと接触させる工程、（b）複数の参照リガンドを単離する工程であって、複数の参照リガンドが、参照微小胞集団に対して親和性を有しない複数のリガンドのサブセットを含む、工程；（c）1種または複数種の試験微小胞を複数の参照リガンドと接触させる工程；および（d）複数の参照リガンドから、1種または複数種の試験微小胞上の表面マーカーと一緒に複合体を形成するリガンドのサブセットを同定し、それにより、複数の標的リガンドを同定する工程を含む、複数の標的リガンドを同定する方法を提供する。語「リガンド」は、別の化学的実体に結合してより大きな複合体を形成する分子または分子群を指すことができる。したがって、結合物質はリガンドを含む。複数のリガンドが、アプタマー、抗体および／または本明細書に記載される、または当技術分野において公知である他の有用な結合物質を含み得る。
本発明はさらに、上記方法を実施するための1種または複数種の試薬を含むキットを提供する。ある態様において、1種または複数種の試薬は、アプタマー、抗体および本明細書に記載される、または当技術分野において公知である他の有用な結合物質の一つまたは複数を含む潜在的結合物質のライブラリーを含む。
基体−試料複合体
本発明は、試料中に存在する標的分子に特異的である、またはそれに結合する結合物質を同定する方法の複数の変形を考慮する。結合物質は、本明細書の態様のいずれに関しても、所望の標的分子に結合することができる任意の分子であることができる。そのような結合物質の例が、本明細書中、以下に開示される。本明細書の態様のいずれも、試験される生物学的試料中に存在する一つまたは複数の成分に結合することができる様々なタイプの結合物質を同定する方法を含むことができる。さらなる態様において、結合物質が結合する特定の標的が上記のように特徴決定される。
ある局面において、本発明は、（a）基体を生物学的試料と接触させて、基体−生物学的複合体の形成を可能にする工程；（b）複合体を複数の候補結合物質と接触させる工程；および（c）複合体と結合する1種または複数種の結合物質を同定し、それにより、1種または複数種の結合物質を選択する工程を含む、方法を提供する。
本明細書の態様のいずれにおいても、結合物質は、本明細書に記載されるもの、たとえば核酸、DNA分子、RNA分子、抗体、抗体フラグメント、アプタマー、ペプトイド、zDNA、ペプチド核酸（PNA）、ロックド核酸（LNA）、レクチン、ペプチド、デンドリマー、膜タンパク質標識物質、化学物質またはそれらの組み合わせを含む、任意の適切な結合物質であることができる。ある態様において、結合物質は、抗体、抗体コンジュゲート、抗体フラグメントおよび／またはアプタマーを含む。いくつかの態様において、結合物質は、ポリペプチド、ペプチドまたは核酸分子を含む。たとえば、結合物質はアプタマーであることができる。ポリペプチドは、抗体またはその機能性フラグメントであることができる。
生物学的試料は、評価のために単離することができる組織試料もしくは細胞培養物試料、体液または動物もしくはヒト対象の任意の成分を含み得る。本明細書の態様のいずれにおいても、体液は、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（CSF）、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液もしくは尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、毛髪、涙液、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胞胚腔液、臍帯血またはそれらのいずれかの由来物を含む。これらまたは他の起源の生物学的試料は、異種微小胞集団または同種微小胞集団を含み得る。
いくつかの態様において、生物学的試料は、濃縮血漿試料、血清試料、浄化血清試料または浄化血漿試料を含む。これらまたは他の起源の生物学的試料は異種微小胞集団または同種微小胞集団を含み得る。微小胞に関連して使用される語「異種」とは、微小胞集団が、本明細書に詳述されるように、異なる細胞または組織を起源とする、異なる生物学的または細胞機構を通して産生される、および／または異なるサイズの微小胞を含む微小胞を含み得ることをいう。微小胞に関連して使用される語「同種」とは、非限定的に微小胞集団が、本明細書に詳述されるように、同じ細胞または組織を起源とする、同じ生物学的または細胞機構を通して産生される、および／または同じサイズ範囲の微小胞を含む微小胞を含むことをいう。非限定的な例において、同種微小胞集団は、異種微小胞集団をアフィニティー単離またはサイズ排除法に供することにより、異種微小胞集団から得ることができる。
本明細書において使用される「浄化」血清または「浄化」血漿試料は、非浄化試料に比べて低下したレベルの1種または複数種の高存在量タンパク質を有する。そのような場合、1種または複数種の高存在量タンパク質は血液タンパク質を含む。たとえば、1種または複数種の高存在量タンパク質は、アルブミン、IgG、トランスフェリン、フィブリノーゲン、フィブリン、IgA、α2-マクログロブリン、IgM、α1-アンチトリプシン、補体C3、ハプトグロブリン、アポリポタンパク質A1、A3およびB；α1-酸糖タンパク質、セルロプラスミン、補体C4、C1q、IgD、プレアルブミン（トランスチレチン）、プラスミノーゲン、それらのいずれかの由来物およびそれらの組み合わせの一つまたは複数を含み得る。1種または複数種の高存在量タンパク質は、アルブミン、免疫グロブリン、フィブリノーゲン、プレアルブミン、α1抗トリプシン、α1酸糖タンパク質、α1フェトタンパク質、ハプトグロビン、α2マクログロブリン、セルロプラスミン、トランスフェリン、補体タンパク質C3およびC4、β2ミクログロブリン、βリポタンパク質、γグロブリンタンパク質、C反応性タンパク質（CRP）、リポタンパク質（カイロミクロン、VLDL、LDL、HDL）、他のグロブリン（α、βおよびγ型）、プロトロンビン、マンノース結合レクチン（MBL）、それらのいずれかの由来物およびそれらの組み合わせの一つまたは複数を含み得る。
1種または複数種の高存在量タンパク質は、当技術分野において公知である、または本明細書に開示される方法を使用して枯渇させることができる。たとえば、高存在量タンパク質は、クロマトグラフィー法（サイズ排除、イオン交換、免疫アフィニティーなど）、免疫アフィニティー法、沈降法またはそれらの組み合わせによって全体的または部分的に分離することができる。いくつかの態様において、1種または複数種の高存在量タンパク質を選択的に枯渇させる工程は、生物学的試料をトロンボプラスチンと接触させる工程を含む。この工程は、フィブリノーゲンを沈降させ、それにより、その除去を容易にするように働くことができる。
1種または複数種の高存在量タンパク質は、好ましくは、下流側の処理工程の性能が改善されるレベルまで枯渇させる。たとえば、生物学的試料から1種または複数種の高存在量タンパク質を選択的に枯渇させる工程は、1種または複数種の高存在量タンパク質の少なくとも25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％または100％を枯渇させる工程を含み得る。
基体−生物学的試料複合体は、基体と試料の成分との間の結合を含むことができる。本明細書に開示される、または当技術分野において公知である任意の有用な架橋法を使用することができる。本明細書の態様のいずれにおいても、結合は架橋を含むことができる。本明細書に開示される、または当技術分野において公知である任意の有用な架橋法を使用し得る。ある態様において、架橋は、光架橋、イミドエステル架橋剤、ジメチルスベリミデート、脂質架橋剤、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル架橋剤、ビススルホスクシンイミジルスベレート（BS3）、アルデヒド、アクロレイン、クロトンアルデヒド、ホルムアルデヒド、カルボジイミド架橋剤、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DDC）、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）、1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩（EDCまたはEDAC）、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレート（SMCC）、スルホスクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート（スルホ-SMCC）、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジル-2-(6-[ビオチンアミド]-2-(p-アジドベンズアミド)ヘキサノアミド)エチル-1,3'-ジチオプロピオネート（スルホ-SBED）、2-[N2-(4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロベンゾイル)-N6-(6-ビオチンアミドカプロイル)-L-リジニル]エチルメタンチオスルホネート（Mts-Atf-ビオチン；Thermo Fisher Scientific Inc, Rockford IL.から市販）、2-{N2-[N6-(4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロベンゾイル-6-アミノカプロイル)-N6-(6-ビオチンアミドカプロイル)-L-リジニルアミド]}エチルメタンチオスルホネート（Mts-Atf-LC-ビオチン；Thermo Fisher Scientific Inc.から市販）、光反応性アミノ酸（たとえばL-フォトロイシンおよびL-フォトメチオニン、たとえば、Suchanek, M., et al. (2005). Photo-leucine and photo-methionine allow identification of protein-protein interactions. Nat. Methods 2:261-267を参照）、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）架橋剤、NHS-アジド試薬（たとえばNHS-アジド、NHS-PEG4-アジド、NHS-PEG12-アジド；いずれもThermo Fisher Scientific, Inc.から市販）、NHS-ホスフィン試薬（たとえばNHS-ホスフィン、スルホ-NHS-ホスフィン；いずれもThermo Fisher Scientific, Inc.から市販）またはそれらの任意の組み合わせもしくは変形を含む。
本明細書の態様のいずれにおいても、基体は試料成分、たとえば微小胞に直接的に架橋する。微小胞の表面上の任意の有用な部分、たとえば表面タンパク質、糖質または脂質部分が結合の標的であることができる。他の態様において、基体はリンカーを介して微小胞と結合する。
本明細書の態様のいずれにおいても、基体および試料は、官能性結合を提供するさらなる成分を含むリンカーを介して結合し得、その場合、たとえば、リンカーは、同じ成分または二つの異なる成分を各端に有する（たとえばX−リンカー−XまたはX−リンカー−Y）。ここで、「X」および「Y」は、基体および生物学的試料中に存在する成分と結合するように構成されている官能性部分を表す。したがって、場合によって、XおよびYは、同じ官能性部分または異なる官能性部分であることが明白になる。所望の標的部分と結合、架橋またはインターキレートするためのそのような官能性部分の非限定的な例が本明細書に開示されている。リンカーは核酸またはペプチド分子であり得る（たとえば、立体障害を減らす、または防ぐアームを提供する）。リンカーはまた、化学的主鎖であってもよく、この化学的主鎖は、それ自体、選択された基体（たとえばビーズ）および選択された試料（たとえば微小胞）上に存在する特定の化学基への共有結合に利用可能である官能基で終端する。リンカーは官能化脂質を含むことができる。有用な官能化脂質は、非限定的に、16:0ビオチニルPE 1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)（ナトリウム塩）、18:1ビオチニルPE 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)（ナトリウム塩）、16:0ビオチニルCap PE 1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(capビオチニル)（ナトリウム塩）または18:1ビオチニルCap PE 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(capビオチニル)（ナトリウム塩）、ビオチンスフィンゴシン、ビオチンS1P、12:0ビオチニルMG、18:1−12:0ビオチンDG、12:0 N-ビオチニル脂肪酸、18:1−12:0ビオチンPS、18:1−12:0ビオチンPA、18:1−12:0ビオチンPE、18:1−12:0ビオチンPC、18:1−12:0ビオチンCA、12:0ビオチニルLPA、18:1−12:0ビオチンPIP3、12:0ビオチニル補酵素Aを含み、これらはすべてAvanti Polar Lipids, Inc.（Alabaster, Alabama）から市販されている。官能性脂質は脂質または膜アンカーとして働き得る。
例示として、X−リンカー−Yの例において、Xは、基体（たとえばビーズ、プレート、アレイ）に強く結合することができる部分であり、Yは、生物学的試料の成分、たとえば細胞、微小胞などに結合することができる部分である。Xは、従来の架橋剤、たとえば本明細書に記載される、または当技術分野において公知であるアミン／カルボニル特異的化合物であることができる。Yもまた、従来の架橋剤、たとえば本明細書に記載される、または当技術分野において公知であるアミン／カルボニル特異的化合物であることができる。他の態様において、Yは脂質膜特異的部分である。Yは、小胞、細胞または他の生物学的実体の脂質膜内に埋め込まれるように構成されてもよい。
上記官能性脂質に加えて、他の有用な膜アンカー実体は、非限定的に、ジアシルグリセロール、ジアシルホスホグリセロール（リン脂質）およびステロール、ジアルキルグリセロール、ジアルキルもしくはジアシル-1-アミノ-2,3-ジヒドロキシプロパン、炭素原子8〜25個の長鎖アルキルもしくはアシル、スフィンゴ脂質、セラミド、リン脂質、グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）膜アンカー配列、糖リン脂質膜アンカー、膜受容体フラグメント、タンパク質結合受容体、金属キレート受容体、免疫グロブリンFc結合受容体、サイトカインもしくは成長因子結合受容体、薬物結合受容体、脂質模倣受容体、膜貫通受容体、合成タンパク質結合受容体、合成金属キレート受容体、合成免疫グロブリンFc結合受容体、合成サイトカインもしくは成長因子結合受容体、合成薬物結合受容体、合成脂質模倣受容体、合成膜貫通受容体、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、リン脂質、スフィンゴ脂質、ステロイド、コレステロール、ジヒドロコレステロール、エルゴステロール、ブラシカステロール、コレステリルアミン、ジヒドロコレステリルアミン、エルゴステリルアミン、ブラシカステリルアミン、3-コレステリルアミン、3-ジヒドロコレステリルアミン、3-エルゴステリルアミン、3-ブラシカステリルアミン、3β-コレステリルアミン、3β-ジヒドロコレステリルアミン、3β-エルゴステリルアミン、3β-ブラシカステリルアミンおよびそれらのいずれかの誘導体を含む。語「誘導体」は、分子を脂質膜に挿入することを可能にする部分を少なくとも含む分子を指すために使用され得る。コレステロールの誘導体の例はコレステリルエステルおよびコレステリルカルバメートを含む。3β-コレステリルアミンの誘導体の例は、非限定的に、N-アルキル、N-アリールおよびN-アシル3β-コレステリルアミンを含む。さらに他の有用な膜固定部分および使用方法が、いずれも参照により全体として本明細書に組み入れられる以下の参考文献に記載されている：Nizard et al., "Anchoring Antibodies to Membranes Using a Diphtheria Toxin T Domain-ZZ Fusion Protein as a pH Sensitive Membrane Anchor," FEBs Letters 433:83-88, 1998；Nizard et al., "Prolonged Display or Rapid Internalization of the IgG-Binding Protein ZZ Anchored to the Surface of Cells Using the Diphtheria Toxin T Domain, "Protein Engineering 14(6):439-446, 2001；Caras et al., "Signal peptide for protein secretion directing glycophospholipid membrane anchor attachment", Science, vol. 243:1196-1198 (1989)；Lin et al., "Expression of T Cell Antigen Receptor Heterodimers in a Lipid-Linked Form, "Science Reports, 1990; 249:677-679；Hussey, Stephen L., et al., "A Synthetic Membrane-Anchored Antigen Efficiently Promotes Uptake of Antifluorescein Antibodies and Associated Protein a by Mammalian Cells", J. Am. Chem. Soc., 2001, vol. 123, pp. 12712-12713；米国特許出願2006/0068388A1；米国特許第7,083,958号、第7,160,856号、第7,288,368号、第7,371,404号、第7,407,947号、第7,514,400号、第7,611,863号、第7,858,117号、第7,947,647号、第8,013,131号、第8,048,448号、第8,088,601号、第8,198,230号；PCT特許出願PCT/US98/15124（WO99/05255）、WO00/59474、PCT/NZ02/00214（WO03/034074）、PCT/NZ03/00059（WO03/087346）。
本発明はさらに、本明細書の方法によって同定される結合物質の同定を含む。生物学的実体を同定する方法は当技術分野において公知である。たとえば、核酸を配列決定によって同定することができる（Sanger、NextGenなど）。
もう一つの局面において、本発明は、基体−微小胞複合体を含む組成物を提供し、ここで、基体は合成基体である。基体−微小胞複合体に関して使用される語「合成」とは、基体が人造であることをいう。基体は、ビーズ（たとえば磁性ビーズ、ポリスチレンビーズなど）、平面基体または本明細書に開示される、もしくは当技術分野において公知である他の有用な基体であることができる。組成物は、結合物質を同定するために上記に方法において使用することができる。組成物はまた、基体を含むアッセイ法において正規化を提供するために使用することもできる。非限定的な例として、微小胞に結合したビーズを使用して、ビーズを使用して生物学的試料中の微小胞を捕捉し、かつ検出するアッセイ法において正規化を提供することができる。
ある態様において、試料は、基体に結合した微小胞を含む。そして、方法を使用して、たとえば非限定的に微小胞表面抗原を含む、微小胞に結合するアプタマーおよび／または他の結合物質を同定することができる。微小胞は、様々な方法、たとえば1）直接コンジュゲート；2）脂質固定；3）抗体結合；および4）アプタマー結合、を使用して基体に結合させることができる。図7A〜Dの模式図を参照すること。図7Aは、小胞表面抗原へのカルボキシル化ミクロスフェアの直接コンジュゲートを示す。図7Bは、ビオチン官能化脂質アンカーを介するミクロスフェアへの微小胞の固定を示す。図7Cは、抗体がカルボキシル化ミクロスフェアにコンジュゲートされる、小胞表面抗原への抗体結合を示す。図7Dは、アプタマーがカルボキシル化ミクロスフェアにコンジュゲートされる、小胞表面抗原へのアプタマー結合を示す。本方法によって製造される基体付着微小胞を使用して、本明細書に記載されるように、微小胞に対してアプタマーライブラリーをスクリーニングすることができる。図8〜10は、アプタマーライブラリーをスクリーニングするための微小胞−基体複合体の使用を示す。図11〜12は、マイクロビーズにコンジュゲートした微小胞の画像を示す。
ある局面において、本発明は、基体を微小胞と接触させる工程を含み、基体が、微小胞の表面上に存在する少なくとも一つの成分に直接結合することができる化学基で官能化されている、安定な基体−微小胞複合体を製造する方法を提供する。基体は、ビーズ、ウェル、マトリックス、たとえばカラム中のゲルマトリックスまたは平面基体であり得る。化学基は、上記のような、微小胞をビーズに結合することができる任意の有用な化学基を含むことができる。たとえば、化学基は、非限定的に、ペプトイド、zDNA、ペプチド核酸（PNA）、ロックド核酸（LNA）、レクチン、ペプチド／ポリペプチド、デンドリマー、膜タンパク質標識物質、化学物質、光架橋、イミドエステル架橋剤、ジメチルスベリミデート、脂質架橋剤、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル架橋剤、ビススルホスクシンイミジルスベレート（BS3）、アルデヒド、アクロレイン、クロトンアルデヒド、ホルムアルデヒド、カルボジイミド架橋剤、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DDC）、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）、1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩（EDCまたはEDAC）、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート（SMCC）、スルホスクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート（スルホ-SMCC）、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジル-2-(6-[ビオチンアミド]-2-(p-アジドベンズアミド)ヘキサノアミド)エチル-1,3'-ジチオプロピオネート（スルホ-SBED）、2-[N2-(4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロベンゾイル)-N6-(6-ビオチンアミドカプロイル)-L-リジニル］エチルメタンチオスルホネート（Mts-Atf-ビオチン；Thermo Fisher Scientific Inc, Rockford IL.から市販）、2-{N2-[N6-(4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロベンゾイル-6-アミノ-カプロイル)-N6-(6-ビオチンアミドカプロイル)-L-リジニルアミド]}エチルメタンチオスルホネート（Mts-Atf-LC-ビオチン；Thermo Fisher Scientific Incから市販）、光反応性アミノ酸（たとえばL-フォトロイシンおよびL-フォトメチオニン、たとえばSuchanek, M., et al. (2005). Photo-leucine and photo-methionine allow identification of protein-protein interactions. Nat. Methods 2:261-267を参照）、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）架橋剤、NHS−アジド試薬（たとえばNHS-アジド、NHS−PEG4−アジド、NHS−PEG12-アジド；いずれもThermo Fisher Scientific, Inc.から市販）、NHS-ホスフィン試薬（たとえばNHS−ホスフィン、スルホ-NHS-ホスフィン；いずれもThermo Fisher Scientific, Inc.から市販）またはそれらの組み合わせを含み得る。化学基は抗体またはアプタマーを含まなくてもよい。化学基は、非限定的に炭化水素、ハロゲン、酸素含有基（すなわちC−O結合）、窒素含有基、硫黄含有基、リン含有基、ホウ素含有基、カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシル基、ヒドラジド基、クロロメチル基またはそれらの組み合わせを含む、本明細書に開示されるような官能基を含み得る。少なくとも一つの成分は、非限定的にペプチド、ポリペプチド、タンパク質、脂質、糖質、それらの由来物またはそれらの組み合わせを含む、本明細書に開示されるような任意の有用な生物学的成分を含み得る。
関連の局面において、本発明は、生物学的試料を、微小胞と一緒に複合体を形成することができる脂質部分と共に配置された基体と接触させる工程、形成された任意の複合体を試料から分割し、それにより、微小胞を単離する工程を含む、試料から微小胞を単離する方法を提供する。本発明はまた、図10Bにおけるように微小胞と複合体化した脂質部分に直接結合した合成基体を含む、単離された複合体を提供する。本発明の一つの局面は、のちに生物学的試料供給源から微小胞を分離または単離するための試薬として使用される固定基体、たとえば平面シートまたはスフェア中への脂質部分（「脂質アンカー」とも呼ばれる）の組み込みである（図10B）。基体は、直接的な共有結合によって（たとえばアミド結合によって）脂質アンカーに結合している、または脂質アンカーが、たとえばストレプトアビジンまたはアビジンを使用することによって間接的に基体に結合するように官能化されている（図10B）。本発明の方法に使用される生物学的試料は、非限定的に血液、血漿、血清、細胞培地（粗または浄化）を含む、対象または細胞培養物由来の任意の生物学的液体であることができる。本発明の方法の実施または本発明の組成物の製造に組み込むことができる脂質アンカーの例は、本明細書または以下の参照番号：2013/0035371、2012/0264810、2012/0101148、2012/0027803を有する米国特許出願公開公報；または米国特許第6,986,902号に開示されているものを含み、これらそれぞれの明細書は参照により全体として本明細書に組み入れられる。
本発明はさらに、上記方法を実施するための1種または複数種の試薬を含むキットを提供する。ある態様において、1種または複数種の試薬は、アプタマー、抗体および本明細書に記載される、または当技術分野において公知である他の有用な結合物質の一つまたは複数を含む潜在的結合物質のライブラリーを含む。もう一つの態様において、1種または複数種の試薬は、上記方法によって同定されたアプタマーを含む。さらに別の態様において、1種または複数種の試薬は、基体−微小胞複合体および／またはそのような複合体の一部である試薬、たとえば本明細書に記載されるようなリンカーもしくは架橋剤を含む。キットは、様々な方法によって、たとえば直接コンジュゲート、脂質固定、抗体結合および／またはアプタマー結合を介して微小胞−基体複合体を形成するのに有用な、本明細書に開示される成分を含み得る。
ネガティブおよびポジティブアプタマー選択
アプタマーは、結合物質に依存する数多くのタイプのアッセイを含む様々な生物学的アッセイにおいて使用することができる。たとえば、アプタマーは、免疫ベースアッセイにおいて抗体の代わりに、または抗体と共に使用することができる。本発明は、アッセイ工程を通じていかなる面（基体、チューブ、フィルター、ビーズ、他の抗原など）にも結合せず、関心対象の抗原に特異的に結合するアプタマーを同定するアプタマースクリーニング法を提供する。アッセイは、ネガティブ選択に依存して、最終アッセイの非標的抗原成分に結合するアプタマーを除去する。ネガティブ選択に続きポジティブ選択を実施して、所望の抗原に結合するアプタマーを同定する。
ある局面において、本発明は、（a）候補アプタマーのプールを一つまたは複数のアッセイ成分と接触させる工程であって、アッセイ成分が関心対象の標的を含まない、工程；（b）（a）において一つまたは複数のアッセイ成分に結合しない、候補アプタマーのプールのメンバーを回収する工程；（c）（b）において回収された候補アプタマーのプールのメンバーを、1種または複数種の交絡する標的の存在下、関心対象の標的と接触させる工程；および（d）工程（c）において関心対象の標的に結合する候補アプタマーを回収し、それにより、関心対象の標的に特異的なアプタマーを同定する工程を含む、関心対象の標的に特異的なアプタマーを同定する方法を提供する。本方法において、工程（a）および（b）は、非標的実体に結合するアプタマーを除去するためのネガティブ選択を提供する。逆に、工程（c）および（d）は、関心対象の標的に結合するが、他の交絡する標的、たとえば関心対象の標的を含む生物学的試料中に存在し得る他の抗原には結合しないアプタマーを同定することによるポジティブ選択を提供する。候補アプタマーのプールは、少なくとも10、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019または少なくとも1020の核酸配列を含み得る。方法を実施するための一つの手段が実施例9に詳細に示されている。
いくつかの態様において、工程（a）〜（b）は任意選択である。他の態様において、工程（a）〜（b）は、工程（c）におけるポジティブ選択が実施される前に、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19回または少なくとも20回繰り返される。ポジティブ選択もまた、複数のラウンドで実施することができる。工程（c)〜(d）は、関心対象の標的に特異的なアプタマーを同定する前に、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19回または少なくとも20回繰り返すことができる。複数のラウンドが改善された選択のストリンジェンシーを提供し得る。
いくつかの態様において、ネガティブ選択中にアプタマープールと接触させる一つまたは複数のアッセイ成分は、基体、ビーズ、平面アレイ、カラム、チューブ、ウェルまたはフィルターの一つまたは複数を含む。当業者は、アッセイ成分が、生物学的アッセイの一部であり得る任意の物質を含むことができることを理解するであろう。
関心対象の標的は、アプタマーによって認識されたとき検出することができる任意の適切な実体であることができる。ある態様において、関心対象の標的はタンパク質またはポリペプチドを含む。本明細書において使用される「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、別段述べられない限り、互換可能に使用される。関心対象の標的は、DNA、RNAおよび本明細書に開示される、または当技術分野において公知であるようなそれらのいずれかの様々な亜種を含む核酸であることができる。関心対象の標的は脂質を含むことができる。関心対象の標的は糖質を含むことができる。関心対象の標的はまた、複合体、たとえばタンパク質、核酸、脂質および／または糖質を含む複合体であることができる。いくつかの態様において、関心対象の標的は微小胞を含む。そのような場合、アプタマーは、微小胞表面抗原、たとえばタンパク質への結合物質であることができる。一般的な微小胞表面抗原は、テトラスパニン、CD9、CD63、CD81、CD63、CD9、CD81、CD82、CD37、CD53、Rab-5b、アネキシンVおよびMFG-E8を含む。さらなる一般的な微小胞表面抗原が本明細書の表3に提供されている。
微小胞表面抗原はまた、疾患または障害のバイオマーカーであることができる。そのような場合、アプタマーを使用して、疾患または障害の診断、予後判定またはセラノーシスを提供し得る。たとえば、一つまたは複数のタンパク質は、PSMA、PCSA、B7H3、EpCam、ADAM-10、BCNP、EGFR、IL1B、KLK2、MMP7、p53、PBP、SERPINB3、SPDEF、SSX2およびSSX4の一つまたは複数を含み得る。これらのマーカーは、前立腺癌を検出するために使用することができる。さらなる微小胞表面抗原が本明細書の表3〜4に提供されている。
1種または複数種の交絡する標的は、関心対象の標的以外の抗原であることができる。たとえば、交絡する標的は、アッセイされる試料中に存在し得る別の実体であることができる。非限定的な例として、評価される試料が個体由来の血漿試料である例を考えてみる。関心対象の標的は、試料中に存在するタンパク質、たとえば微小胞表面抗原であり得る。この場合、交絡する標的は、血漿試料中に存在する可能性が高い任意の他の抗原から選択することもできる。したがって、ポジティブ選択は、関心対象の標的を認識するが交絡する標的とはするとしても最小限しか相互作用しない、候補アプタマーを提供するであろう。いくつかの態様において、関心対象の標的および1種または複数種の交絡する標的は、同じタイプの生物学的実体、たとえばすべてのタンパク質、すべての核酸、すべての糖質またはすべて脂質を含む。非限定的な例として、関心対象の標的は、SSX4、SSX2、PBP、KLK2、SPDEFおよびEpCAMからなる群より選択されるタンパク質であることができ、1種または複数種の交絡する標的はこの群の他のメンバーを含む。他の態様において、関心対象の標的および1種または複数種の交絡する標的は、様々なタイプの生物学的実体、たとえばタンパク質、核酸、糖質および脂質の任意の組み合わせを含む。1種または複数種の交絡する標的もまた、様々なタイプの生物学的実体、たとえばタンパク質、核酸、糖質および脂質の任意の組み合わせを含み得る。
ある態様において、本発明は、上記方法によって同定された単離されたポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを提供する。本発明はさらに、上記方法によって同定されたヌクレオチド配列と少なくとも60％同一であるヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチドを提供する。より好ましくは、単離された核酸分子は、上記方法によって同定されたヌクレオチド配列と少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはより多く同一である。参照配列、たとえば上記方法によって同定された配列よりも長い、または長さがそれに等しい単離されたポリヌクレオチドの場合、比較は、参照配列の完全長とで実施される。単離されたポリヌクレオチドが参照配列よりも短い、たとえば上記方法によって同定された配列よりも短い場合、比較は、参照配列のうち同じ長さのセグメント（相同性算出によって求められる任意のループは除外する）に対して実施される。
関連の局面において、本発明は、（a）アプタマーのプールを、第一の試料由来の微小胞の集団と接触させる工程；（b）第一の試料由来の微小胞の集団に対して親和性を示すアプタマーのサブプールを富化する工程；（c）サブプールを、第二の試料由来の微小胞の第二の集団と接触させる工程；および（d）第二の試料由来の微小胞の第二の集団に対して親和性を示すアプタマーの第二のサブプールを枯渇させ、それにより、第一の試料由来の微小胞の集団に対して優先的親和性を有するアプタマーの群を選択する工程を含む、アプタマーの群を選択する方法を提供する。
第一の試料および／または第二の試料は、本明細書に開示されるような生物学的流体を含み得る。たとえば、生物学的流体は、非限定的に、血液、血液由来物、血漿、血清または尿を含み得る。第一の試料および／または第二の試料はまた、細胞培養物由来であってもよい。
ある態様において、第一の試料は癌試料を含み、第二の試料は対照試料、たとえば非癌試料を含む。第一の試料および／または第二の試料はそれぞれプールされた試料を含み得る。たとえば、第一の試料および／または第二の試料は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100人、または100人より多くの個体からの体液を含むことができる。そのような場合、プールのメンバーは、所望の表現型を代表するように選択され得る。非限定的な例において、第一の試料プールのメンバーは癌患者由来であり得、第二の試料プールのメンバーは非癌対照由来であり得る。
工程（a）〜（d）は、第一の試料由来の微小胞の集団に対して優先的親和性を有するアプタマーでプールをさらに富化するために所望の回数、繰り返すことができる。たとえば、工程（a）〜（d）は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20回、または20回より多く繰り返すことができる。工程（d）からの産出物を、繰り返される工程（a）への投入物として使用することができる。態様において、工程（a）〜（d）を繰り返す前に、第一の試料および／または第二の試料を異なる試料と交換する。非限定的な例において、第一の試料プールのメンバーは癌患者由来であり得、第二の試料プールのメンバーは非癌対照由来であり得る。工程（a）〜（d）の後続の反復中、第一の試料プールは、それ以前のラウンドとは異なる癌患者由来の試料を含み得る。同様に、第二の試料プールは、それ以前のラウンドとは異なる対照由来の試料を含み得る。
方法はさらに、選択されたアプタマー群のメンバーを、たとえばDNA配列決定によって同定する工程を含み得る。配列決定は、所望により、次世代配列決定によって実施されてもよい。
方法はまた、選択されたアプタマー群の標的を同定する工程を含み得る。アプタマー標的を同定する方法は本明細書に開示されている。
図13Aは、関心対象の標的に対してオリゴヌクレオチドライブラリーをスクリーニングするポジティブおよび場合によってはネガティブラウンドのスキーム1300を示す。オリゴ候補のライブラリープールを提供する（1301）。オリゴ候補アプタマーのプールは、任意の数の所望のメンバー、たとえば少なくとも10、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019または少なくとも1020の核酸配列を含み得る。ポジティブ選択を実施するために、オリゴを関心対象の標的と接触させる（1302）。関心対象の標的は、アプタマーによって認識されたとき検出することができる任意の適切な実体であることができる。関心対象の標的はタンパク質もしくはポリペプチド、DNA、RNAおよびそれらの様々な亜種を含む核酸、脂質、糖質、複合体、たとえばタンパク質、核酸、脂質および／または糖質を含む複合体を含み得る。いくつかの態様において、関心対象の標的は微小胞を含む。標的は、本明細書に開示される（たとえば実施例28〜31を参照）または当技術分野において公知である方法を使用して基体上に固定化され得る。混合物を洗浄して非結合オリゴを除去したのち、オリゴを、洗浄した混合物から分離させ、捕集する（1303）。捕集したオリゴは、任意の回数（1・・・nと示す）繰り返すことができる新たなラウンドの標的結合への投入物として使用することができる。たとえば、ポジティブ選択は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20回または20回より多く繰り返すことができる。場合によっては、ポジティブ選択のラウンド間でネガティブ選択を実施し、その中で、オリゴを一つまたは複数の非標的実体と接触させる（1304）。非標的実体は、非限定的に他の生物学的実体、非疾患特異的標的および様々なアッセイ成分（基体、チューブなど）を含む、関心対象の標的に対する得られるアプタマーの特異的結合に干渉し得る任意の実体であることができる。ネガティブ選択中、一つまたは複数の非標的実体に結合しないオリゴを保持し、かつ新たなラウンドのポジティブ選択1302への投入物として使用する。この工程は、非標的実体に対して親和性を有するオリゴを除去するように働く。所望のラウンド数のポジティブ選択1303および／またはネガティブ選択1304ののち捕集されたオリゴを、関心対象の標的に結合することが示された候補アプタマーとして捕集する（1305）。
図13Bは、癌試料対非癌対照試料に対するアプタマーの選択のための一つのそのようなスキームを示す。スキームは、それぞれが個別の試料またはプールされた試料からなる八つの癌試料（Ca1〜Ca8）および七つの対照試料（nCa1〜nCa7）を示す。七つの異なる選択（選択1〜選択7）が並行に実施されている。各選択において、候補アプタマーの投入物プールは、癌試料の一つに対するアプタマーに関して富化され（「ポジティブ選択」）、次いで、対照試料の一つに対するアプタマーを枯渇させられる（「ネガティブ選択」）。このプロセスが指示どおり繰り返される。選択の偏りを避けるため、各選択中、試料の順序は変更される。最終ラウンドのポジティブ選択ののち残るアプタマーが選択されたアプタマーを含み、それを、たとえば癌試料を非癌試料から区別するためのアッセイの一部としてさらに展開することができる。各ラウンド後、アプタマープールを順番に並べて、富化、枯渇、潜在的問題などを追跡することができる。
アプタマー標的同定
上記方法およびキットは、二つのバイオマーカー集団を区別する結合物質を同定するために使用することができる。本発明はさらに、この項に記載されるように、結合物質の標的を同定する方法を提供する。たとえば、方法はさらに、結合物質によって認識される標的微小胞の表面マーカーを同定する工程を含み得る。
ある態様において、本発明は、（a）結合物質を標的と接触させて標的を結合物質と結合させる工程であって、標的が微小胞の表面抗原を含む、工程；（b）標的と結合物質との結合を分断しない条件下で、微小胞を分断する工程；（c）標的と結合物質との複合体を単離する工程；および（d）結合物質によって結合した標的を同定する工程を含む、結合物質の標的を同定する方法を提供する。結合物質は、上記方法によって同定された結合物質、たとえばアプタマー、リガンド、抗体または二つのバイオマーカー集団を区別することができる他の有用な結合物質であることができる。
方法を実施するための例示的模式図が図14に示されている。図は、基体1401につながれた結合物質1402、ここでは例としてアプタマーを示す。結合物質1402は基体1401に共有結合していることができる。結合物質1402はまた、非共有結合的に結合していてもよい。たとえば、結合物質1402は、基体に引き寄せることができる標識、たとえば基体に共有結合しているアビジン／ストレプトアビジン分子と一緒に複合体を形成することができるビオチン基を含むことができる。これにより、溶液中にある間にアプタマーと微小胞との間で複合体を形成させることができ、その後、ビオチン標識を使用してアプタマーが捕捉される。結合物質1402は微小胞1404の表面抗原1403に結合する。矢印（i）によって示される工程において、微小胞は分断されるが、一方で、結合物質1402と表面抗原1403との複合体は無傷のまま残る。分断された微小胞1405は、矢印（ii）によって示される工程において、たとえば洗浄またはバッファ交換によって除去される。矢印（iii）によって示される工程において、表面抗原1403が結合物質1402から解放される。本明細書に開示される、および／または当技術分野において公知である方法を使用して表面抗原1403を分析してその正体を決定することができる。方法の標的は、微小胞と結合した任意の有用な生物学的実体であることができる。たとえば、標的は、タンパク質、核酸、脂質もしくは糖質または本明細書に開示される、または当技術分野において公知である他の生物学的実体を含み得る。
方法のいくつかの態様において、微小胞を分断する前に、標的を結合物質と架橋させる。理論によって拘束されることなく、この工程は、微小胞が分断される間、結合物質と標的との複合体を維持することを支援し得る。本明細書に開示される、または当技術分野において公知である任意の有用な架橋法を使用することができる。諸態様において、架橋は、光架橋、イミドエステル架橋剤、ジメチルスベリミデート、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル架橋剤、ビススルホスクシンイミジルスベレート（BS3）、アルデヒド、アクロレイン、クロトンアルデヒド、ホルムアルデヒド、カルボジイミド架橋剤、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DDC）、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）、1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩（EDCまたはEDAC）、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレート（SMCC）、スルホスクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート（スルホ-SMCC）、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジル-2-(6-[ビオチンアミド]-2-(p-アジドベンズアミド)ヘキサノアミド)エチル-1,3'-ジチオプロピオネート（スルホ-SBED）、2-[N2-(4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロベンゾイル)-N6-(6-ビオチンアミドカプロイル)-L-リジニル]エチルメタンチオスルホネート（Mts-Atf-ビオチン；Thermo Fisher Scientific Inc, Rockford IL.から市販）、2-{N2-[N6-(4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロベンゾイル-6-アミノカプロイル)-N6-(6-ビオチンアミドカプロイル)-L-リジニルアミド]}エチルメタンチオスルホネート（Mts-Atf-LC-ビオチン；Thermo Fisher Scientific Incから市販）、光反応性アミノ酸（たとえばL-フォトロイシンおよびL-フォトメチオニン、たとえば、Suchanek, M., et al. (2005). Photo-leucine and photo-methionine allow identification of protein-protein interactions. Nat. Methods 2:261-267を参照）、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）架橋剤、NHS−アジド試薬（たとえばNHS−アジド、NHS-PEG4-アジド、NHS-PEG12-アジド；いずれもThermo Fisher Scientific, Inc.から市販）、NHS-ホスフィン試薬（たとえばNHS-ホスフィン、スルホ-NHS-ホスフィン；いずれもThermo Fisher Scientific, Inc.から市販）またはそれらの任意の組み合わせもしくは変形を含む。
微小胞を分断するために多様な方法を使用することができる。たとえば、微小胞膜は、機械的力、化学物質またはそれらの組み合わせを使用して分断することができる。諸態様において、微小胞の分断は、洗浄剤、界面活性剤、溶媒、酵素またはそれらの任意の有用な組み合わせの一つ又は複数の使用を含む。酵素は、リゾチーム、リソスタフィン、ザイモラーゼ、セルラーゼ、ムタノリシン、グリカナーゼ、プロテアーゼおよびマンナーゼの一つまたは複数を含み得る。洗浄剤または界面活性剤は、オクチルチオグルコシド（OTG）、オクチルβ-グルコシド（OG）、非イオン洗浄剤、Triton X、Tween 20、脂肪アルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、セトステアリルアルコール、オレイルアルコール、ポリオキシエチレングリコールアルキルエーテル（Brij）、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ポリオキシプロピレングリコールアルキルエーテル、グルコシドアルキルエーテル、デシルグルコシド、ラウリルグルコシド、オクチルグルコシド、ポリオキシエチレングリコールオクチルフェノールエーテル、ポリオキシエチレングリコールアルキルフェノールエーテル、ノノキシノール-9、グリセロールアルキルエステル、グリセリルラウレート、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル、ポリソルベート、ソルビタンアルキルエステル、コカミドMEA、コカミドDEA、ドデシルジメチルアミンオキシド、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのブロックコポリマー、ポロキサマー、ポリエトキシ化獣脂アミン（POEA）、両性イオン洗浄剤、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート（CHAPS）、直鎖アルキルベンゼンスルホネート（LAS）、アルキルフェノールエトキシレート（APE）、コカミドプロピルヒドロキシスルタイン、ベタイン、コカミドプロピルベタイン、レシチン、イオン洗浄剤、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、臭化セトリモニウム（CTAB）、塩化セチルトリメチルアンモニウム（CTAC）、オクテニジン二塩酸塩、塩化セチルピリジニウム（CPC）、塩化ベンザルコニウム（BAC）、塩化ベンゼトニウム（BZT）、5-ブロモ-5-ニトロ-1,3-ジオキサン、塩化ジメチルジオクタデシルジメチルアンモニウム、臭化ジオクタデシルジメチルアンモニウム（DODAB）、デオキシコール酸ナトリウム、ノニルフェノキシポリエトキシエタノール（TergitolタイプNP-40；NP-40）、ラウリル硫酸アンモニウム、ラウレス硫酸ナトリウム（ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（SLES））、ミレス硫酸ナトリウム、アルキルカルボキシレート、ステアリン酸ナトリウム、ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、カルボキシレート系フッ素系界面活性剤、ペルフルオロノナノエート、ペルフルオロオクタノエート（PFOAまたはPFO）およびバイオサーファクタントの一つまたは複数を含み得る。使用することができる機械的分断法は、非限定的に、機械的剪断、ビーズミリング、ホモジネーション、マイクロ流体化、音波処理、フレンチプレス、衝突、コロイドミル、減圧、浸透圧性ショック、加熱分解、凍結融解、乾燥またはそれらの任意の組み合わせを含む。
図14に示すように、結合物質は基体につながれてもよい。結合物質は、結合物質と標的との複合体が形成される前または形成された後でつなぐことができる。基体は、本明細書に開示される、または当技術分野において公知であるような任意の有用な基体であることができる。ある態様において、基体はミクロスフェアを含む。もう一つの態様において、基体は平面基体を含む。結合物質はまた、標識されることもできる。標的と結合物質との複合体を単離する工程は、標識を介して結合物質を捕捉する工程を含み得る。たとえば、標識はビオチン標識であることができる。そのような場合、結合物質は、ビオチン−アビジン結合イベントによって基体に取り付けることができる。
結合物質からの解放ののち標的を同定する方法は関心対象の標的のタイプに依存する。たとえば、標的がタンパク質を含む場合、標的を同定する工程は、質量分析法（MS）、ペプチドマスフィンガープリンティング法（PMF；タンパク質フィンガープリンティング法）、配列決定法、N末端アミノ酸分析法、C末端アミノ酸分析法、エドマン分解法、クロマトグラフィー法、電気泳動法、二次元ゲル電気泳動法（2Dゲル）、抗体アレイおよびイムノアッセイ法の使用を含み得る。核酸は、配列決定法によって同定することができる。
当業者は、この方法を使用して、小胞と結合していないものを含む任意の適切な標的を同定することができることを理解するであろう。たとえば、図14に関連して、矢印（i）によって示される工程（すなわち、微小胞を分断する工程）を除くすべての工程は、循環する標的、たとえばタンパク質、核酸、脂質、糖質またはそれらの組み合わせに関して実施することもできる。
試料特徴決定
本発明のアプタマーは、生物学的試料を特徴決定するために使用することができる。たとえば、アプタマーを使用して、試料中のバイオマーカーに結合させることができる。結合したバイオマーカーの存在またはレベルは、例の特徴、たとえば試料に関連する疾患または障害の診断、予後判定またはセラノーシスを示すことができる。
ある局面において、本発明は、（a）生物学的試験試料を本発明の1種または複数種のアプタマーと接触させる工程；（b）工程（a）において形成された、1種または複数種のアプタマーと、生物学的試験試料中の1種または複数種のアプタマーと結合した標的との複合体の存在またはレベルを検出する工程；（c）生物学的対照試料を1種または複数種のアプタマーと接触させる工程；（d）工程（c）において形成された、1種または複数種のアプタマーと、生物学的対照試料中の1種または複数種のアプタマーと結合した標的との複合体の存在またはレベルを検出する工程；および（e）工程（b）および（d）において検出された存在またはレベルを比較し、それにより、疾患または障害を特徴決定する工程を含む、疾患または障害を特徴決定する方法を提供する。1種または複数種のアプタマーは、疾患または障害を特徴決定するのに有用な任意のアプタマー、たとえば、本明細書のSEQ ID NO: 1〜241535のいずれかを含むアプタマー、その有用な改変物または機能性フラグメントを含むことができる。
生物学的試験試料および生物学的対照試料はそれぞれ組織試料、細胞培養物または生物学的流体を含むことができる。いくつかの態様において、生物学的試験試料および生物学的対照試料は同じ試料タイプを含み、たとえば、いずれも組織試料である、またはいずれも流体試料である。他の態様においては、異なる試料タイプが試験試料および対照試料に使用されてもよい。たとえば、対照試料は、作り変えられた、または他のやり方で人造的な試料を含み得る。
生物学的流体は体液を含み得る。体液は、非限定的に、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（CSF）、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液もしくは尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、毛髪、涙液、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胞胚腔液または臍帯血の一つまたは複数を含み得る。いくつかの態様において、体液は血液、血清または血漿を含む。
生物学的流体は微小胞を含み得る。たとえば、生物学的流体は、組織、細胞培養物または試料中の細胞から放出された微小胞を含む体液であることができる。微小胞は循環微小胞であることができる。
1種または複数種のアプタマーは標的バイオマーカー、たとえば試料を特徴決定するのに有用なバイオマーカーに結合することができる。バイオマーカーは、ポリペプチドもしくはそのフラグメントまたは本明細書に記載される、または当技術分野において公知である他の有用なバイオマーカー（脂質、糖質、複合体、核酸など）を含み得る。諸態様において、ポリペプチドまたはそのフラグメントは可溶性または膜結合状態である。膜結合状態のポリペプチドは細胞表面抗原または微小胞表面抗原を含み得る。バイオマーカーは、表3または表4から選択されるバイオマーカーであることができる。
特徴決定は、疾患または障害の診断、予後判定またはセラノーシスを含むことができる。本発明の組成物および方法を使用して、非限定的に癌、前癌状態、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患もしくは障害、心臓血管疾患もしくは障害、神経学的疾患もしくは障害、感染症および／または疼痛を含む様々な疾患および障害を特徴決定することができる。さらなる詳細に関しては、本明細書の「表現型」の項を参照すること。諸態様において、疾患または障害は増殖性または新生物性疾患または障害を含む。たとえば、疾患または障害は癌であることができる。いくつかの態様において、癌は、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、結腸直腸癌、黒色腫または脳癌を含む。
図15Aは、本発明の1種または複数種のアプタマーを使用して関心対象の標的を検出および／または定量するために使用することができるアッセイ構成を示す模式図1500である。捕捉アプタマー1502が基体1501に取り付けられている。基体は、平面基体、ウェル、マイクロビーズまたは本明細書に開示される、または当技術分野において公知であるような他の有用な基体であることができる。関心対象の標的1503が捕捉アプタマー1502と結合している。関心対象の標的は、アプタマーまたは他の結合物質によって認識されたとき検出されることができる任意の適切な実体であることができる。関心対象の標的はタンパク質もしくはポリペプチド、DNA、RNAおよびそれらの様々な亜種を含む核酸、脂質、糖質、複合体、たとえばタンパク質、核酸、脂質および／または糖質を含む複合体を含み得る。いくつかの態様において、関心対象の標的は微小胞を含む。標的の関心対象は微小胞表面抗原であることができる。関心対象の標的は、表3または4における小胞関連バイオマーカーを含むバイオマーカーであり得る。投入された微小胞は、本明細書に記載される様々な技術、たとえばクロマトグラフィー法、ろ過法、遠心分離法、フローサイトメトリー法、アフィニティー捕捉法（たとえば平面、カラムまたはビーズへの）および／またはマイクロ流体工学を使用して試料から単離することができる。また、検出アプタマー1504が関心対象の標的1503に結合している。検出アプタマー1504は標識1505を有し、この標識を検出すると、捕捉アプタマー1502を介して基体1501に捕捉された標的を同定することができる。標識は、蛍光、放射性標識、酵素または本明細書に開示されるような他の検出可能な標識であることができる。捕捉アプタマー1502または検出アプタマー1504のいずれかが別の検出物質、たとえば抗体で置換されることができる。たとえば、標的は、抗体で捕捉され、アプタマーで検出されてもよいし、その逆であってもよい。関心対象の標的が複合体を含む場合、捕捉および検出物質（アプタマー、抗体など）は同じまたは異なる標的を認識することができる。たとえば、標的が微小胞であるとき、捕捉物質が一つの微小胞表面抗原を認識し得、一方で、検出物質が別の微小胞表面抗原を認識する。あるいはまた、捕捉物質および検出物質が同じ表面抗原を認識することもできる。
上記構成は、ELISAまたはマイクロビーズアッセイのようなイムノアッセイフォーマットを含み得る「サンドイッチ」アッセイフォーマットを含む。他の態様において、関心対象の標的1503は基体に捕捉されず、溶液中で検出される。そのような場合、検出アプタマー1504を関心対象の標的と接触させ、たとえばフローサイトメトリーアッセイなどを使用して溶液中で直接検出することができる。
試料を特徴決定するためのアプタマープール
ある局面において、本発明は、試料を様々なアプタマーのプールと接触させ、プール中の様々なアプタマーが試料に結合する頻度を測定することによって、試料を特徴決定する方法を提供する。たとえば、非癌患者由来の微小胞に比べて癌患者由来の微小胞に優先的に結合するアプタマーのプールを同定する。たとえば癌を有することが疑われる患者由来の試験試料を捕集し、アプタマーのプールと接触させる。試験試料に結合するアプタマーを試験試料から溶離させ、捕集し、同定し、結合したアプタマーの組成を、癌試料に結合することが知られているものと比較する。溶離したアプタマーを同定するために、様々な配列決定、増幅およびハイブリダイゼーション技術を使用することができる。大きなアプタマープールが使用される場合、アプタマー同定は、ハイスループット配列決定またはハイブリダイゼーションによって実施されてもよい。試験試料がアプタマープールによって同様なやり方で癌患者由来の微小胞に結合しているならば（たとえばバイオインフォマティックス分類法によって判定）、試料は同じく癌を示す。この方法を使用すると、アプタマープールの各メンバーの正確な標的を必ずしも知ることなく、1種または複数種の微小胞抗原に結合するアプタマープールを使用して試料を特徴決定することができる。本明細書の実施例23〜24は本発明の態様を示す。
ある局面において、本発明は、微小胞試料を、前記微小胞試料中に存在する1種または複数種の標的に結合することができる複数のオリゴヌクレオチドアプタマーと接触させる工程、試料と一緒に複合体を形成するオリゴヌクレオチドのセットを同定する工程であって、ここで、該セットが、試料の状態を特徴決定することが事前に確認されており、それにより試料の状態を特徴決定する、工程を含む、試験試料の状態を特徴決定する方法を提供する。
関連の局面において、本発明は、（a）微小胞試料を複数のオリゴヌクレオチドと接触させて、微小胞試料と一緒に複合体を形成するオリゴヌクレオチドのセットを同定する工程、（b）オリゴヌクレオチドそれぞれの配列および／またはコピー数を決定し、それにより、試験試料と結合したオリゴヌクレオチドのセットを同定する工程を含む、試験試料と結合したオリゴヌクレオチドアプタマーのセットを同定する方法を提供する。
さらに別の関連の局面において、本発明は、微小胞試料を、非癌試料由来の微小胞に比べて癌試料由来の微小胞と一緒に優先的に複合体を形成することが事前に確認されている複数のオリゴヌクレオチドアプタマーと接触させる工程を含む、試料を癌性試料または癌の素因を有する試料として診断する方法を提供する。
オリゴヌクレオチドは、配列決定法、たとえばダイターミネーター（Sanger）配列決定法またはハイスループット法によって同定することができる。ハイスループット法は、次世代技術、たとえばMPSS（Massively parallel signature sequencing）法；Polony配列決定法；454パイロ配列決定法；Illumina（Solexa）配列決定法；SOLiD配列決定法；イオントレント半導体配列決定法；DNAナノボール配列決定法；Heliscope単分子配列決定法；単分子リアルタイム（SMRT）配列決定法または他の方法、たとえばナノポアDNA配列決定法；トンネル電流DNA配列決定法；ハイブリダイゼーションによる配列決定法；質量分析による配列決定法；マイクロ流体Sanger配列決定法；顕微鏡ベースの技術；RNAP配列決定法；インビトロウイルスハイスループット配列決定法を含む、多数の核酸を高速で配列決定するための技術を含むことができる。オリゴヌクレオチドはまた、ハイブリダイゼーション技術によって同定され得る。たとえば、プールの様々なメンバーとハイブリダイズし、それにより、プールの様々なメンバーを検出するためのアドレス指定可能な場所を有するマイクロアレイを使用することができる。
複数またはプールのオリゴヌクレオチドアプタマーは、試料の特徴決定を可能にするための任意の所望の数のオリゴヌクレオチドアプタマーを含むことができる。様々な態様において、プールは、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000または少なくとも10000の異なるオリゴヌクレオチドメンバーを含む。
複数のオリゴヌクレオチドアプタマーは、一段階または複数段階のポジティブ選択またはネガティブ選択を通して事前に選択することができ、ここで、ポジティブ選択は、試験試料に比べて実質的に類似した特徴を有する試料に対するオリゴヌクレオチドの選択を含み、およびネガティブ選択は、試験試料に比べて実質的に異なる特徴を有する試料に対するオリゴヌクレオチドの選択を含む。実質的に類似した特徴とは、ポジティブ選択に使用される試料が関心対象の一つまたは複数の特徴において試験試料に典型的であることをいう。たとえば、ポジティブ選択に使用される試料は癌患者または細胞系由来であることができ、試験試料は、癌を有する、または癌を有することが疑われる患者由来の試料であることができる。実質的に異なる特徴とは、ネガティブ選択に使用される試料が関心対象の一つまたは複数の特徴において試料とは異なることをいう。たとえば、ネガティブ選択に使用される試料は、癌を有しない個体または細胞系由来であることができ（たとえば「正常」またはそうでなければ「対照」試料）、試験試料は、癌を有する、または癌を有することが疑われる患者由来の試料であることができる。癌は、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、結腸直腸癌、黒色腫、脳癌または他の癌であることができる。
検出および／または区別する所望の表現型に典型的な試料を選択することにより、特徴決定は、任意の数の疾患または障害の診断、予後判定またはセラノーシスを含むことができる。本発明の組成物および方法を使用して、非限定的に癌、前癌状態、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患もしくは障害、心臓血管疾患もしくは障害、神経学的疾患もしくは障害、感染症および／または疼痛を含む様々な疾患および障害を特徴決定することができる。さらなる詳細に関しては、本明細書の「表現型」の項を参照すること。諸態様において、疾患または障害は増殖性または新生物性疾患または障害を含む。たとえば、疾患または障害は癌であることができる。いくつかの態様において、癌は、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、結腸直腸癌、黒色腫または脳癌を含む。
図15Bは、上記のような、試料の表現型を特徴決定するためのアプタマープールの使用を示す模式図1510である。関心対象の標的に対するアプタマーのプールを提供する（1511）。たとえば、アプタマーのプールは、1種または複数種の微小胞に関して富化されることができる。プールのメンバーは、1種または複数種の微小胞上に存在する様々な標的（たとえば微小胞表面抗原）または同じ標的の様々なエピトープに結合し得る。プールを、特徴決定する試験試料と接触させる（1512）。たとえば、試験試料は、所与の疾患または障害を有する、または有することが疑われる個体由来の生物学的試料であり得る。混合物を洗浄して非結合アプタマーを除去する。残るアプタマーを試料から溶離させる、または他のやり方で分離させ、捕集する（1513）。捕集したアプタマーを、たとえば配列決定またはハイブリダイゼーションによって同定する。同定されたものの存在および／またはコピー数を使用して表現型を特徴決定する（1514）。たとえば、アプタマーのプールは、癌細胞から流出した微小胞を優先的に認識するアプタマーとして選択され得る。この方法を使用すると、試料が、癌関連微小胞に結合するアプタマーを保持するかどうかを検出し、それにより、試料を癌またはそうではないと特徴決定することができる。
図15Cは、図15Bの方法の具現化を示す模式図1520である。微小胞集団に結合するものと同定されたアプタマーのプールを提供する（1521）。微小胞集団は、本明細書に記載される様々な技術、たとえばクロマトグラフィー法、ろ過法、限外ろ過法、遠心分離法、超遠心分離法、フローサイトメトリー法、アフィニティー捕捉法（たとえば平面、カラムまたはビーズへの）および／またはマイクロ流体工学を使用して試料から単離することができる。投入試料は、試験試料から単離された（1522）微小胞を含む。たとえば、試験試料は、所与の疾患または障害を有する、または有することが疑われる個体由来の生物学的試料であり得る。プールを、特徴決定する、単離された微小胞と接触させる（1523）。混合物を洗浄して非結合アプタマーを除去し、残るアプタマーを試料から溶離させる、または他のやり方で分離させ、捕集する（1524）。捕集したアプタマーを同定し（1525）、保持されたアプタマーの存在および／またはコピー数を使用して、上記のように表現型を特徴決定する（1526）。
図15Cの代替態様においては、アプタマーのプール1520を、微小胞を含む、または含むことが予想される生物学的試料と直接接触させる。その後、微小胞を試料から単離し、混合物を洗浄して非結合アプタマーを除去し、残るアプタマーを分離させ、捕集する（1524）。以後の工程は上記のように実施される。この代替構成の例として、生物学的試料、たとえば血液、血清または血漿試料をアプタマーのプールと直接接触させる。そして、非限定的に超遠心分離法、限外ろ過法、フローサイトメトリー法、アフィニティー単離法などを含む、本明細書に開示される様々な技術によって微小胞を単離する。そして、残るアプタマーを、たとえば配列決定、ハイブリダイゼーションまたは増幅によって同定する。
関連の局面において、本発明は、表現型を特徴決定するためのアプタマープールの使用を含む方法を実施するために使用することができる、複数のオリゴヌクレオチドを含む、組成物を提供する。複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1〜241535の一つまたは複数を含む、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドのいずれかを含むことができる。いくつかの態様において、複数のオリゴヌクレオチドはSEQ ID NO: 1〜230810から選択される。さらに他の態様において、複数のオリゴヌクレオチドはSEQ ID NO: 230811〜230899から選択される。複数のオリゴヌクレオチドはSEQ ID NO: 230900〜230927またはSEQ ID NO: 231018〜241535から選択することができる。組成物はこれらの配列のいずれか一つを含み得る。選択されたオリゴヌクレオチドは、生物学的試料中に存在する複数の標的に結合し得る。本発明のいくつかの態様において、組成物は、SEQ ID NO: 231018〜241535に列挙されたオリゴヌクレオチドの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000またはすべてを含む。組成物は、SEQ ID NO: 231018〜241535に列挙されたオリゴヌクレオチドの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000またはすべてを含み得る。組成物はまた、生物学的試料中に存在する複数の標的に結合することができる、表23〜24のいずれかに記載された1種または複数種のオリゴヌクレオチドを含み得る。たとえば、組成物は、表23または24に列挙されたオリゴヌクレオチドの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20を含み得る。オリゴヌクレオチドは、非限定的に乳癌試料または前立腺癌試料を含む癌試料を特徴決定するために主題の方法において使用され得る。
関連の局面において、本発明は、微小胞試料を用いて複数のオリゴヌクレオチドの、少なくとも1回の（i）ネガティブ選択または（ii）1回のポジティブ選択を実施する工程；オリゴヌクレオチドのセットを取得して、複数のオリゴヌクレオチドのネガティブ結合物質サブセットまたはポジティブ結合物質サブセットを提供する工程であって、複数のオリゴヌクレオチドのネガティブ結合物質サブセットが微小胞試料に結合せず、複数のオリゴヌクレオチドのポジティブ結合物質サブセットが微小胞試料に結合する、工程；ネガティブ結合物質サブセットまたはポジティブ結合物質サブセットを試験試料と接触させる工程；試験試料に結合したオリゴヌクレオチドを溶離させて、複数の溶離物オリゴヌクレオチドを提供する工程；および複数の溶離物オリゴヌクレオチドのハイスループット配列決定を実施して、複数の溶離物オリゴヌクレオチドのメンバーの配列および／またはコピー数を同定する工程を含む、ハイスループット配列決定を実施する方法を提供する。微小胞試料を使用する複数のオリゴヌクレオチドのネガティブ選択およびポジティブ選択は、本明細書に開示されるように実施することができる。複数の溶離物オリゴヌクレオチドのメンバーの配列および／またはコピー数によって明らかにされるアプタマープロフィールは、本明細書に記載されるように試験試料の表現型を特徴決定するために使用することができる。
類似した局面において、本発明は、試験試料に特異的なオリゴヌクレオチドを同定する方法を提供する。方法は、（a）試料としての複数のオリゴヌクレオチドを富化して、標的試料と一緒に複合体を形成することが事前に確認されているオリゴヌクレオチドのセットを提供する工程；（b）（a）における複数を試験試料と接触させて、オリゴヌクレオチドと試験試料との複合体の形成を可能にする工程；（c）（b）において複合体を形成したオリゴヌクレオチドを回収して、回収されたオリゴヌクレオチドのサブセットを提供する工程；および（d）回収されたオリゴヌクレオチドのサブセットをハイスループット配列決定またはハイブリダイゼーションによってプロファイリングし、それにより、試験試料に特異的なオリゴヌクレオチドを同定する工程を含む。試験試料は複数の微小胞を含み得る。オリゴヌクレオチドはRNA、DNAまたは両方を含み得る。いくつかの態様において、方法はさらに、インフォマティクス解析を実施して、標的試料と一緒に複合体を形成することが事前に確認されているオリゴヌクレオチドと少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または少なくとも99％の配列同一性を含むオリゴヌクレオチドのサブセットを同定する工程を含む。
本発明はさらに、表現型を特徴決定するためのアプタマープールの使用を容易にするためのキットを提供する。キットは、主題の方法を実施するための試薬を含み得る。関連して、本発明は、そのような方法を実施するための試薬の使用を提供する。試薬は、アプタマー、アプタマーのプールまたは上記のようなアプタマーを含む組成物を含み得る。
核酸陰性対照
もう一つの局面において、本発明は、非標的結合核酸および基体を含む陰性対照組成物を提供する。非標的結合核酸は、本発明の上記選択法によって提供することができ、核酸は非標的結合アプタマーとして同定される。たとえば、非標的結合アプタマーは、ポジティブ選択中に非標的結合アプタマーとして同定することができる。いくつかの態様において、非結合アプタマーは、存在するとしても最小限の二次構造しか有しないと予測される。核酸配列を同定したならば、その二次元フォールディング構造を推定するためのソフトウェアプログラムを使用してその配列を分析することができる。モチーフ同定のための周知の配列整合プログラムおよびアルゴリズムを使用して、配列モチーフを同定し、大きな配列データセットの次元数をも減らすことができる。さらに、Viennaおよびmfoldのようなソフトウェアプログラムがアプタマー選択の当業者に周知であり、それを使用して、二次構造モチーフ（共有形状）に基づいて配列をさらに分類することができる。
非標的結合核酸は基体と結合していることができる。結合は共有結合または非共有結合的結合であることができる。いくつかの態様において、非標的結合核酸は基体にコンジュゲートしている。本明細書に記載される、または当技術分野において公知であるような検出アッセイは、組成物を陰性対照として使用することによって実施することができる。陰性対照は任意の適切なやり方で使用することができる。たとえば、マイクロタイタープレートまたは平面アレイを使用する場合（たとえば図1Aを参照）、アレイのウェルまたは区域を非標的結合核酸と接触させることができる。アッセイを実施することができ、非標的結合核酸と接触したアレイの区域から得られる任意のシグナルを、標的から導出されたアッセイシグナルから減じることができる。同様に、マイクロビーズアレイをアッセイに使用するとき（たとえば図1Bを参照）、非標的結合核酸と接触するビーズの一部をアッセイに含めることができる。アッセイを実施することができ、非標的結合核酸と接触したビーズから得られる任意のシグナルを、標的から導出されたアッセイシグナルから減じることができる。前記のように、非標的結合核酸は、所望により、基体にコンジュゲートしていてもよいし、またはコンジュゲートしていなくてもよい。
ある態様において、本発明の非標的結合陰性対照核酸は、SEQ ID NO: 230938〜231008のいずれかからなる群より選択される配列に対して少なくとも50、55，60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100％相同である配列を有する核酸を含む。たとえば、核酸は、SEQ ID NO: 230938〜231008のいずれかからなる群より選択される配列に対して少なくとも91、92、93、94、95、96、97、98、99または100％相同である配列を有することができる。核酸は、SEQ ID NO: 230938〜231008のいずれか、たとえばSEQ ID NO: 230938の配列を有することができる。核酸は、本発明の方法および組成物にしたがって陰性対照核酸として使用することができる。
関連の局面において、本発明は、生物学的実体を含有することが疑われる生物学的試料中の該生物学的実体の存在またはレベルを検出する方法であって、（a）上記のような基体および陰性対照組成物を含む組成物を提供する工程であって、基体が、生物学的実体への1種または複数種の結合物質を含む、工程；（b）該生物学的試料を、工程（a）において提供された組成物と接触させる工程；（c）工程（b）において1種または複数種の結合物質によって認識された生物学的実体の量に対応する標的シグナルを検出する工程；および（d）工程（c）において検出された標的シグナルを、陰性対照組成物によって生成されたシグナルの量に対応する対照シグナルに正規化し、それにより、生物学的試料中の生物学的実体の存在またはレベルを検出する工程を含む、方法を提供する。前記のように、標的シグナルを正規化する工程は、標的シグナルから対照シグナルを減じる工程を含み得る。
1種または複数種の結合物質は抗体、アプタマーまたは本明細書に開示される、または当技術分野において公知である他の適切な結合物質であり得る。同様に、生物学的実体は、本明細書に開示される、または当技術分野において公知である任意の適切なバイオマーカーであることができる。ある態様において、生物学的実体はタンパク質を含む。もう一つの態様において、生物学的実体は微小胞を含む。そのような場合、1種または複数種の結合物質は微小胞表面抗原に特異的であることができる。微小胞表面抗原は、本明細書中、たとえば表3〜4に開示された抗原であり得る。いくつかの態様において、微小胞表面抗原は疾患または障害のバイオマーカーである。したがって、方法は、疾患または障害の診断、予後判定またはセラノーシスを提供し得る。
ある態様において、本発明は、上記方法によって同定された単離されたポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを提供する。本発明はさらに、上記方法によって同定されたヌクレオチド配列と少なくとも60％同一であるヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチドを提供する。より好ましくは、単離された核酸分子は、上記方法によって同定されたヌクレオチド配列と少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはより多く同一である。参照配列、たとえば上記方法によって同定された配列よりも長い、または長さがそれに等しい単離されたポリヌクレオチドの場合、比較は、参照配列の完全長を用いて実施される。単離されたポリヌクレオチドが参照配列よりも短い、たとえば上記方法によって同定された配列よりも短い場合、比較は、参照配列のうち同じ長さのセグメント（相同性算出によって求められる任意のループは除外する）に対して実施される。
ある局面において、本発明は、アプタマー配列が標的結合核酸のスクランブルバージョンを含む陰性対照アプタマーを提供する。たとえば、タンパク質（たとえばEpCAM、PSMA）または微小胞（たとえば前立腺および乳癌微小胞）に結合するアプタマーが本明細書に開示される。標的結合アプタマーのいずれかの陰性対照は、そのランダムにスクランブルされた配列であることができる。
本発明はさらに、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。以下さらに説明するように、キットは、方法を実施するための1種または複数種の試薬を含み得る。特定の態様において、1種または複数種の試薬は、非標的結合、陰性対照核酸または陰性対照組成物を含む。キットは、基体および／または関心対象の標的への結合物質を含み得る。陰性対照組成物は、結合物質と関心対象の標的との結合によって生成されるシグナルを正規化するために使用され得る。
ブロッキングアプタマー
いくつかの態様において、本発明の核酸は基体のためのブロッキング物質として働く。基体と所望の分子または実体、たとえば結合物質との間のカップリング反応ののち、ブロッキング物質を基体に適用して、コートされた基体と非標的分子との間の非特異的相互作用を最小限にすることができる。ブロッキング物質は、非特異的相互作用を最小限にするが、任意の所望の相互作用、たとえば基体にコンジュゲートした関心対象の分子と試験溶液中の別の関心対象の分子との間の特異的相互作用には干渉しないように選択することができる。一般に使用されるブロッカーは、BSA（ウシ血清アルブミン）、カゼイン（乳タンパク質）、pepticase（加水分解カゼイン）、非イオン界面活性剤（たとえばTween（登録商標）20およびTriton（登録商標）X-100）、非反応性抗体またはそのフラグメント（たとえばオフ種）、FSG（フィッシュスキンゼラチン）、高純度ゼラチンまたはゼラチンヒドロラーゼ、PEG（ポリエチレングリコール）、非反応性血清、非反応性タンパク質および当業者に公知の様々な市販のブロッカーを含む。非反応性タンパク質とは、するとしても最小限しかアッセイの成分と相互作用しないタンパク質をいう。
図16A〜16Bは、基体上の非コンジュゲートカルボキシル基をブロックするためのアプタマーの使用を例示する。図16Aは、アプタマー1601の一部分と、平面基体1603に取り付けられたカルボキシル基1602との間の水素結合を示す。図16Bは、アプタマー1601の一部分と、ミクロスフェア基体1604に取り付けられたカルボキシル基1602との間の水素結合を示す。カルボキシル基1602はさらに抗体1605にも取り付けられている。グアニンが、二つの水素結合を形成することができる唯一のヌクレオチドである。
ある局面において、本発明は非結合核酸を提供する。非結合核酸は、関心対象のアッセイの成分とするとしても最小限しか相互作用しないように選択することができる。たとえば、非結合核酸は、関心対象のアッセイの標的分子とするとしても最小限しか相互作用できない。しかし、ブロッキングアプタマーは、他のアッセイ成分、たとえば基体、チューブ、ビーズなどに結合し、それにより、標的分子と、標的分子に特異的な結合物質以外の任意のアッセイ成分との間の相互作用を最小限にし得る。本発明はまた、非結合核酸と、BSA（ウシ血清アルブミン）、カゼイン（乳タンパク質）、pepticase（加水分解カゼイン）、非イオン界面活性剤（たとえばTween（登録商標）20、Triton（登録商標）X-100）、非反応性抗体またはそのフラグメント（たとえばオフ種）、FSG（フィッシュスキンゼラチン）、高純度ゼラチンまたはゼラチンヒドロラーゼ、PEG（ポリエチレングリコール）、非反応性血清、非反応性タンパク質および当業者に公知の様々な市販のブロッカーからなる群より選択される一つまたは複数のブロッキング成分とを含むブロッキング組成物を提供する。
ある態様において、非結合核酸は、SEQ ID NO: 230938〜231008のいずれかからなる群より選択される配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100％相同である配列を含む。たとえば、核酸は、SEQ ID NO: 230938〜231008のいずれかからなる群より選択される配列に対して少なくとも91、92、93、94、95、96、97、98、99または100％相同である配列を有することができる。核酸は、SEQ ID NO: 230938〜231008のいずれか、たとえばSEQ ID NO: 230938の配列を有することができる。
関連の局面において、本発明は、非結合核酸を基体と接触させて基体をブロックする工程、生物学的試料をブロックされた基体と接触させる工程、および基体への一つまたは複数の生物学的実体の結合を検出する工程を含む方法を提供する。非結合核酸は、上記に提供されたブロッキング組成物に含まれることができる。基体はまた、非限定的に平面基体またはミクロスフェアを含む、本明細書の記載されるような基体であることができる。そのようなブロッキングは、望まれない結合イベントを完全または部分的に阻害することができる。
本発明はさらに、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。以下さらに説明するように、キットは、方法を実施するための1種または複数種の試薬を含み得る。特定の態様において、1種または複数種の試薬は非結合核酸またはブロッキング組成物を含む。キットは、基体および／または関心対象の標的への結合物質を含み得る。非結合核酸またはブロッキング組成物は、基体をブロックするために使用され得る。
ある態様において、本発明は、上記方法によって同定された単離されたポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを提供する。本発明はさらに、上記方法によって同定されたヌクレオチド配列と少なくとも60％同一であるヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチドを提供する。より好ましくは、単離された核酸分子は、上記方法によって同定されたヌクレオチド配列と少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはより多く同一である。参照配列、たとえば上記方法によって同定された配列よりも長い、または長さがそれに等しい単離されたポリヌクレオチドの場合、比較は、参照配列の完全長を用いて実施される。単離されたポリヌクレオチドが参照配列よりも短い、たとえば上記方法によって同定された配列よりも短い場合、比較は、参照配列のうち同じ長さのセグメント（相同性算出によって求められる任意のループは除外する）に対して実施される。
いくつかの態様において、ブロッキングアプタマーは、官能基、たとえば生物学的アッセイの一つまたは複数の成分上に存在する官能基に結合するように選択される。そのような官能基結合アプタマーを以下さらに詳細に説明する。
官能基結合アプタマー
ある局面において、本発明は、関心対象の官能基に結合することができるアプタマーを提供する。本明細書において使用される官能基とは、分子の特徴的な化学反応の原因である、それらの分子内の原子または結合の群である。同じ官能基は、それが一部を成す分子のサイズにかかわらず、同一または類似の化学反応を受ける。しかし、その相対的反応性は近くの官能基によって変化することができる。「部分」は、官能基であることもできるし、または一つまたは複数の官能基で構成されることもできる。
官能基の原子は、互いおよび分子の残りに共有結合によって結合している。共有結合した原子の群が正味電荷を有するとき、その群を多原子イオンまたは錯イオンと呼ぶことができる。また、化合物の原子の任意の部分群はラジカルと呼ばれ得、共有結合がホモリシス的に切断されるならば、得られる断片的ラジカルはフリーラジカルと呼ばれる。
本発明のアプタマーは様々な関心対象の官能基に対することができる。官能基は、非限定的に、炭化水素、ハロゲン、酸素含有基（すなわちC-O結合）、窒素含有基、硫黄含有基、リン含有基またはホウ素含有基を含み得る。例示的な炭化水素は、非限定的に、アルカン、アルケン、アルキン、ベンゼン誘導体、トルエン誘導体、分岐鎖状または環式アルカン、カルボカチオンおよびカルボアニオンを含む。例示的なハロゲンは、非限定的に、ハロアルカン、フルオロアルカン、クロロアルカン、ブロモアルカンおよびヨードアルカンを含む。例示的な酸素含有基は、非限定的に、アルコール、ケトン、アルデヒド、ハロゲン化アシル、カーボネート、カルボキシレート、カルボン酸、エステル、ヒドロペルオキシド、エーテル、ヘミアセタール、ヘミケタール、アセタール、ケタール、オルトエステルおよびオルトカーボネートを含む。例示的な窒素含有基は、非限定的に、アミド、アミン、イミン、イミド、アジド、アゾ化合物、シアネート、ニトレート、ニトリル、ニトライト、ニトロ化合物、ニトロソ化合物およびピリジン誘導体を含む。例示的な硫黄含有基は、非限定的に、チオール、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、硫酸、スルホン酸、チオシアネート、イソシアネート、チオンおよびチアールを含む。例示的なリン含有基は、非限定的に、ホスフィン、ホスファン、ホスホン酸、ホスフェートおよびホスホジエステルを含む。例示的なホウ素含有基は、非限定的に、ボロン酸、ボロン酸エステル、ボリン酸およびボリン酸エステルを含む。
本発明のアプタマーは、アセタール、アシル基、ハロゲン化アシル、アルケニル基、アルコキシド、アルコキシ基、アルキニル基、アミド、アミンオキシド、アミン、カルボジイミド、カルボキシミデート、カルボン酸、シアナミド、シアネート、ジチオカルバメート、エノール、エステル、エーテル、ヒドラジン、ヒドラゾン、ヒドロキサム酸、イミド、イソシアネート、イソシアニド、イソチオシアネート、ケタール、ケテン、ケトン、脱離基、ニトリル、有機ハロゲン化物、有機リン、オルトエステル、オキシム、ホスホノフルオリデート、ホスホノチオエート、ホスホラミドチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロフルオリデート、ホスホロチオエート、保護基、ピロホスフェート、セミカルバジド、セミカルバゾン、スルファメート、スルホン酸エステル、スルホン、スルホン酸、スルホニル基、スルホキシミン、スルフリル化合物、チオアミド、チオシアネート、チオエステル、チオレート、チオン、チオホスホリル化合物およびチオスルフィネートからなる群より選択される一つまたは複数の官能基に向けられることができる。
本発明のアプタマーは、アセタール、アセトキシ基、アセチリド、酸無水物、活性化基、塩化アシル、ハロゲン化アシル、アシラール、アシロイン、アシルシラン、アルコール、アルデヒド、アルジミン、アルカン、アルケン、アルコキシド、アルキルシクロアルカン、亜硝酸アルキル、アルキン、アレン、アミド、アミジン、アミナール、アミンオキシド、アジド、アジン、アジリジン、アゾキシ、二官能性ビスチオセミカルバゾン、ビウレット、ボロン酸、カルバメート、カルバミノ、カルバジド、カルベン、カルビノール、炭酸エステル、カルボニル、カルボキサミド、カルボキシミデート、カルボン酸、クロロホルメート、クムレン、シアン酸エステル、シアニミド、シアノヒドリン、不活性化基、デプシド、ジアゾ、ジオール、ジチオカルバメート、エナミン、エンジイン、エノール、エノールエーテル、エノン、エンイン、エピスルフィド、エポキシド、エステル、エーテル、フルオロスルホネート、ハロヒドリン、ハロケトン、ヘミアセタール、ヘミアミナール、ヘミチオアセタール、ヒドラジド、ヒドラゾン、ヒドロキサム酸、ヒドロキシル、ヒドロキシルアミン、イミン、イミニウム、イソチオウロニウム、ケテン、ケテンイミン、ケトン、ケチル、ラクタム、ラクトール、ラクトン、メチン、メチル基、ニトレート、ニトリルイリド、ニトリルイミン、ニトロ化合物、ニトロアミン、ニトロネート、ニトロン、ニトロニウムイオン、ニトロソアミン、ニトロソ、オルトエステル、オサゾン、オキサジリジン、オキシム、n-オキソアンモニウム塩、ペルオキシド、過酸、持続性カルベン、フェノール、ホスファアルケン、ホスファアルキン、ホスフェート、ホスフィネート、ホスフィン、ホスフィンオキシド、ホスフィナイト、ホスホネート、ホスホナイト、ホスホニウム、ホスホラン、s-ニトロソチオール、シッフ塩基、セレノール、セレノン酸、セロン、セミカルバジド、セミカルバゾン、シリルエノールエーテル、シリルエーテル、スルフェンアミド、スルフェン酸、塩化スルフェニル、スルフィド、スルフィルイミン、スルフィンアミド、スルフィン酸、亜硫酸エステル、スルホンアミド、スルホンアニリド、スルホネート、スルホニル、ハロゲン化スルホニル、スルホキシド、スルフリル、スルトン、テルロール、チアール、チオアセタール、チオアミド、チオカルバメート、チオカルボキシ、チオシアネート、チオエステル、チオエーテル、チオケタール、チオケトン、チオール、チオラクトン、チオ尿素、トシルヒドラゾン、トリアゼン、トリオール、尿素、バニリル、キサンテート、イリドおよびイノラートからなる群より選択される一つまたは複数の官能基に向けられることができる。
官能基は、基体の表面への他の分子の共有結合を容易にするために基体の表面につながれることができる。たとえば、基体は、カルボキシル修飾、アミノ修飾、ヒドロキシル修飾、ヒドラジド修飾および／またはクロロメチル修飾されていてもよい。
ある態様において、アプタマーはカルボキシル基と結合する。アプタマーは、高いGC含量、たとえば50％、60％、70％、80％、90％、95％超またはより多くのGC含量を有することができる。アプタマーの核酸配列は、SEQ ID NO: 230938〜231008のいずれかからなる群より選択される配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100％相同である配列を有する核酸であり得る。たとえば、核酸は、SEQ ID NO: 230938〜231008のいずれかからなる群より選択される配列に対して少なくとも91、92、93、94、95、96、97、98、99または100％相同である配列を有することができる。核酸は、SEQ ID NO: 230938〜231008のいずれか、たとえばSEQ ID NO: 230938の配列を有することができる。
いくつかの態様において、アプタマーはさらに、少なくとも一つの化学的修飾を含むように改変されている。化学的修飾は、糖位置の化学的置換；リン酸位置の化学的置換；および核酸の塩基位置の化学的置換からなる群より選択することができる。化学的修飾はまた、修飾されたヌクレオチドの組み込み、3'キャッピング、アミンリンカーへのコンジュゲート、高分子量非免疫原性化合物へのコンジュゲート、親油性化合物へのコンジュゲート、薬物へのコンジュゲート、細胞傷害性部分へのコンジュゲートおよび放射性同位体による標識からなる群より選択することができる。細胞傷害性部分は、アプタマーの5'末端にコンジュゲートさせることもできるし、アプタマーの3'末端にコンジュゲートさせることもできるし、または細胞傷害性部分は、アプタマーの両端にコンジュゲートさせることもできる。いくつかの態様において、細胞傷害性部分は、ナノ粒子、たとえばリポソーム、デンドリマーおよび／または櫛型ポリマー中に封入される。他の態様において、細胞傷害性部分は小分子細胞傷害性部分を含む。小分子細胞傷害性部分は、ビンブラスチンヒドラジド、カリケアマイシン、ビンカアルカロイド、クリプトフィシン、チューブリシン、ドラスタチン10、ドラスタチン15、アウリスタチンE、リゾキシン、エポチロンB、エピチロンD、タキソイド、マイタンシノイドならびにそれらのいずれかのバリアントおよび誘導体からなる群より選択することができる。細胞傷害性部分はまた、タンパク質毒素であることもできる。諸態様において、タンパク質毒素は、ジフテリア毒素、リシン、アブリン、ゲロニンおよびシュードモナス外毒素Aからなる群より選択される。放射性同位体は、イットリウム90、インジウム111、ヨウ素131、ルテチウム177、銅67、レニウム186、レニウム188、ビスマス212、ビスマス213、アスタチン211およびアクチニウム225からなる群より選択することができる。非免疫原性高分子量化合物は、ポリアルキレングリコール、たとえばポリエチレングリコールであることができる。
もう一つの局面において、本発明は、たとえば上記のような本発明のアプタマーおよび基体を含む組成物を提供する。本明細書に記載されるように、基体は、非限定的にマイクロアレイおよびウェルによって提供される面、粒子、たとえばビーズ、カラム、光ファイバ、ワイプ、ガラスおよび修飾または官能化ガラス、石英、雲母、ジアゾ化膜（紙またはナイロン）、ポリホルムアルデヒド、セルロース、酢酸セルロース、紙、セラミックス、金属、メタロイド、半導体材料、量子ドット、コートされたビーズもしくは粒子、他のクロマトグラフィー材料、磁性粒子；プラスチック（アクリル樹脂、ポリスチレン、スチレンまたは他の材料のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、Teflon材料などを含む）、多糖類、ナイロンもしくはニトロセルロース、樹脂、シリカもしくはシリカ系材料、たとえばシリコンおよび変性シリコン、炭素、金属、無機ガラス、プラスチック、セラミックス、導電性ポリマー（ポリピロールおよびポリインドールのようなポリマーを含む）；ミクロもしくはナノ構造化面、たとえば核酸タイリングアレイ、ナノチューブ、ナノワイヤもしくはナノ粒子状装飾面；または多孔質面もしくはゲル、たとえばメタクリレート、アクリルアミド、糖ポリマー、セルロース、シリケートもしくは他の繊維状もしくはストランド状ポリマーを含む、結合物質を直接的または間接的に取り付けることができる任意の物理的に分離可能な固体であることができる。加えて、当技術分野において公知であるように、基体は、パッシブまたは化学的誘導体化コーティングを使用して、デキストラン、アクリルアミド、ゼラチンまたはアガロースのようなポリマーを含む任意の数の材料でコートされてもよい。基体はまた、任意の所望の分子の表面への共有結合を容易にするために、官能基でコートされることもできる。そのようなコーティングは、生物学的試料とのアレイの使用を容易にすることができる。基体は、任意の有用な形態にあることができる。ある態様において、基体は平面基体である。たとえば、基体は、プレートのウェル、すなわちマイクロアレイであることができる。もう一つの態様において、基体はミクロスフェアである。たとえば、基体は、磁気または蛍光標識されたミクロスフェアまたはビーズであることができる。
ある態様において、組成物の基体はカルボキシル基を含む。たとえば、基体の表面は、カルボキシル基のような官能基でコートされることができる。アプタマーはカルボキシル基と結合することができる。ある態様において、アプタマーは水素結合を介してカルボキシル基と結合する。
いくつかの態様において、アプタマーは基体のためのブロッキング物質として働く。基体と所望の分子または実体、たとえば結合物質との間のカップリング反応ののち、ブロッキング物質を基体に適用して、コートされた基体と非標的分子との間の非特異的相互作用を最小限にすることができる。ブロッキング物質は、非特異的相互作用を最小限にするが、任意の所望の相互作用、たとえば基体にコンジュゲートした関心対象の分子と試験溶液中の別の関心対象の分子との間の特異的相互作用には干渉しないように選択することができる。一般に使用されるブロッカーは、BSA（ウシ血清アルブミン）、カゼイン（乳タンパク質）、pepticase（加水分解カゼイン）、非イオン界面活性剤（たとえばTween（登録商標）20およびTriton（登録商標）X-100）、非反応性抗体またはそのフラグメント（たとえばオフ種）、FSG（フィッシュスキンゼラチン）、高純度ゼラチンまたはゼラチンヒドロラーゼ、PEG（ポリエチレングリコール）、非反応性血清および当業者に公知の様々な市販のブロッカーを含む。
ある態様において、基体は結合物質を含む。結合物質は、核酸、タンパク質または関心対象の標的、たとえば生物学的実体に結合することができる他の分子であることができる。好ましい態様において、結合物質は、関心対象の標的に対して特異性を有する。結合物質は、DNA、RNA、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、Fab、Fab'、単鎖抗体、合成抗体、アプタマー（DNA/RNA）、プトイド、zDNA、ペプチド核酸（PNA）、ロックド核酸（LNA）、レクチン、合成または天然化学物質（薬物、標識試薬を含むが、それらに限定されない）、デンドリマーまたはそれらの組み合わせを含むことができる。たとえば、結合物質は抗体またはアプタマーであることができる。本発明の態様において、結合物質は膜タンパク質標識物質を含む。たとえば、Alroyらの米国特許公開公報US2005/0158708に開示されている膜タンパク質標識物質を参照すること。
組成物はさらなる実体を含むことができる。諸態様において、組成物は生物学的実体を含む。たとえば、生物学的実体は、核酸／ポリヌクレオチド、タンパク質または微小胞であることができる。ある態様において、タンパク質は微小胞と結合している。たとえば、タンパク質は微小胞表面抗原であることができる。タンパク質はまた、微小胞ペイロードであることができる。微小胞表面抗原および／またはペイロードは、本明細書中、たとえば表3〜4に開示されたバイオマーカーであり得る。
本発明の組成物の例示的な構成が図17Aに示されている。図17Aは、アプタマー1701の一部分と、基体1703に取り付けられたカルボキシル基1702との間の水素結合を示す。また、結合物質1704が基体1703に取り付けられている。結合物質は、本明細書に記載される、または当技術分野において公知である任意の適切な生物学的実体、たとえばタンパク質、核酸、微小胞、細胞またはそれらのいずれかの一部分であり得る標的1705に対して特異性を有する。理論によって拘束されることなく、アプタマー1701は、基体1703への、標的1705または任意の他の分子もしくは実体のいくらかまたはすべての望まれない結合をブロックするように働き得る。図17Bは、関心対象の生物学的実体が基体1703に結合する代替構成を示す。
以下さらに説明するように、本発明は、上記のような本発明のアプタマーまたは組成物を含むキットを提供する。
さらに別の局面において、本発明は、本発明のアプタマーを基体と接触させる工程を含む方法を提供する。アプタマーは上記のような本発明のアプタマーであることができる。基体もまた、平面基体またはミクロスフェアを含む、上記のような基体であることができる。基体はカルボキシル基を含み得る。たとえば、基体の表面はカルボキシル部分で官能化されることができる。諸態様において、アプタマーはカルボキシル基と結合している。アプタマーは、水素結合を介してカルボキシル基と結合していることができる。理論によって拘束されることなく、アプタマーは、基体上のカルボキシル基を望まれない結合イベントからブロックするように働き得る。
ある態様において、基体は結合物質を含む。結合物質は、共有結合または非共有結合的結合を介して基体に取り付けることができる、本明細書に開示される、または当技術分野において公知である任意の結合物質であることができる。いくつかの態様において、結合物質は抗体またはアプタマーを含む。
本発明のアプタマーを基体と接触させる方法はさらに、基体を、結合物質の標的を含む試料と接触させる工程を含み得る。方法の一つの可能な構成が図17Aに示されている。図17Aに示すように、標的1705は結合物質1704によって認識され、一方、カルボキシル基1702はアプタマー1701によって隠蔽されている。諸態様において、基体1703の表面は、基体への結合物質1704の共有結合を容易にするために、カルボキシル基1702によって覆われている。結合物質1704を基体1703に取り付けたのち、アプタマー1701を任意の非コンジュゲートカルボキシル基1702に適用することができる。最後に、ブロックされた基体1703を、標的1705を含む試料と接触させることができる。方法は、結合物質1704と標的1705との間の結合イベントを検出する能力を高め得る。たとえば、アプタマーによるブロッキングは、結合物質1704と標的1705との間の特異的結合に干渉することもできる、基体1703との任意の非特異的結合イベントを減らし得る。あるいはまた、アプタマーによるブロッキングは、標的1705と基体1703との間の任意の非特異的結合イベントを減らし得る。当業者は、両機構が同時に作用し得ることを理解するであろう。図17Bは、関心対象の生物学的実体が基体1703に結合している代替構成を示す。
ある態様において、本発明は、上記方法によって同定された単離されたポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを提供する。本発明はさらに、上記方法によって同定されたヌクレオチド配列と少なくとも60％同一であるヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチドを提供する。より好ましくは、単離された核酸分子は、上記方法によって同定されたヌクレオチド配列と少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはより多く同一である。参照配列、たとえば上記方法によって同定された配列よりも長い、または長さがそれに等しい単離されたポリヌクレオチドの場合、比較は、参照配列の完全長と実施される。単離されたポリヌクレオチドが参照配列よりも短い、たとえば上記方法によって同定された配列よりも短い場合、比較は、参照配列のうち同じ長さのセグメント（相同性算出によって求められる任意のループは除外する）に対して実施される。
本発明はさらに、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。以下さらに説明するように、キットは、方法を実施するための1種または複数種の試薬を含み得る。特定の態様において、1種または複数種の試薬はアプタマーおよび／または基体を含む。
もう一つの局面において、本発明は、生物学的実体を含有することが疑われる生物学的試験試料中の該生物学的実体の存在またはレベルを検出する方法を提供する。方法は、（a）カルボキシル化基体に付着した生物学的実体に特異的な1種または複数種の結合物質を含む組成物を提供する工程であって、カルボキシル化基体が本発明によって提供されるアプタマーに結合している、工程；（b）該生物学的試料を、工程（a）において提供された組成物と接触させる工程；および（c）工程（b）において生物学的実体が1種または複数種の結合物質によって認識されるかどうかを検出し、それにより、生物学的試料中の生物学的実体の存在またはレベルを検出する工程を含む。方法の一つの可能な構成が図17Aに示されている。図17Aに示すように、標的1705は結合物質1704によって認識され、一方、カルボキシル基1702はアプタマー1701によって隠蔽されている。諸態様において、基体1703の表面は、基体への結合物質1704の共有結合を容易にするために、カルボキシル基1702によって覆われている。結合物質1704を基体1703に取り付けたのち、アプタマー1701を任意の非コンジュゲートカルボキシル基1702に適用することができる。最後に、ブロックされた基体1703を、標的1705を含む試料と接触させることができる。方法は、結合物質1704と標的1705との間の結合イベントを検出する能力を高め得る。たとえば、アプタマーによるブロッキングは、結合物質1704と標的1705との間の特異的結合に干渉することもできる、基体1703との任意の非特異的結合イベントを減らし得る。あるいはまた、アプタマーによるブロッキングは、標的1705と基体1703との間の任意の非特異的結合イベントを減らし得る。当業者は、両機構が同時に作用し得ることを理解するであろう。図17Bは、関心対象の生物学的実体が基体1703に結合している代替構成を示す。
生物学的実体は、結合物質によって認識されたとき検出することができる任意の適切な実体であることができる。ある態様において、生物学的実体はタンパク質またはポリペプチドを含む。本明細書において使用される「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、別段述べられない限り、互換可能に使用される。生物学的実体は、DNA、RNAおよび本明細書に開示される、または当技術分野において公知であるようなそれらのいずれかの様々な亜種を含む核酸であることができる。生物学的実体は脂質を含むことができる。生物学的実体は糖質を含むことができる。生物学的実体はまた、複合体、たとえばタンパク質、核酸、脂質および／または糖質を含む複合体であることができる。いくつかの態様において、生物学的実体は微小胞を含む。そのような場合、結合物質は、微小胞表面抗原、たとえばタンパク質への結合物質であることができる。一般的な微小胞表面抗原は、テトラスパニン、CD9、CD63、CD81、CD63、CD9、CD81、CD82、CD37、CD53、Rab-5b、アネキシンVおよびMFG-E8を含む。さらなる一般的な微小胞表面抗原が本明細書の表3に提供されている。
微小胞表面抗原はまた、疾患または障害のバイオマーカーであることができる。方法は、疾患または障害の診断、予後判定またはセラノーシスを提供し得る。たとえば、一つまたは複数のタンパク質は、PSMA、PCSA、B7H3、EpCam、ADAM-10、BCNP、EGFR、IL1B、KLK2、MMP7、p53、PBP、SERPINB3、SPDEF、SSX2およびSSX4の一つまたは複数を含み得る。これらのマーカーは、前立腺癌を検出するために使用することができる。さらなる微小胞表面抗原が本明細書の表3〜4に提供されている。
本発明はさらに、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。以下さらに説明するように、キットは、方法を実施するための1種または複数種の試薬を含み得る。特定の態様において、1種または複数種の試薬は、アプタマー、基体および／または結合物質を含む。キットは、カルボキシル基でコートされた基体、関心対象の結合物質を基体にコンジュゲートするための取り扱い説明、およびアプタマーを含み得る。アプタマーは、任意の非コンジュゲートカルボキシル基をブロックするために使用され得る。
関連の局面において、本発明は、（a）基体を、カルボキシル基と結合することができるアプタマーと接触させる工程であって、基体がまた、1種または複数種の選択された核酸またはポリペプチド分子を含む、工程；および（b）基体を、核酸またはポリペプチド分子に結合することができる結合物質と接触させる工程を含み、それによりカルボキシル基と結合するアプタマーが、核酸またはポリペプチド分子への結合物質の結合を高める、結合を高める方法を提供する。アプタマーは、本発明のアプタマー、たとえばSEQ ID NO: 230938〜231008から選択される配列を有するアプタマーであることができる。基体は、平面基体またはミクロスフェア／ビーズを含む、本明細書に記載される、または当技術分野において公知であるような基体であることができる。例示的な模式図が図17Aおよび図17Bに示されている。図17Aを参照すると、基体1703は、この図においては抗体を表す1種または複数種の選択された核酸またはポリペプチド分子1704を含む。アプタマー1701は、基体1703の表面上のカルボキシル基1702と結合する状態で示されている。結合物質1705は、1種または複数種の選択された核酸またはポリペプチド分子1704と結合する分子または実体である。図17Bを参照すると、基体1703は、この図においては標的実体、たとえばタンパク質または微小胞を表す1種または複数種の選択された核酸またはポリペプチド分子1705を含む。アプタマー1701は、基体1703の表面上のカルボキシル基1702と結合する状態で示されている。結合物質1704は、1種または複数種の選択された核酸またはポリペプチド分子1705に特異的な抗体である。当業者は、本明細書に開示される、または当技術分野において公知であるような様々な結合物質を使用することができることを理解するであろう。
核酸またはポリペプチドは、アミド結合を介してカルボキシル基に共有結合することができる。アミド結合またはペプチド結合とは、一方の分子のカルボキシル基が他方の分子のアミノ基と反応して水分子の解放を生じさせるとき、それら二つの分子の間に形成される化学的共有結合である。
本発明のアプタマーは、任意の有用な選択法を使用して同定することができる。たとえば、アプタマーは、その刊行物が参照により全体として本明細書に組み入れられるPan and Clawson, Primer-free aptamer selection using a random DNA library. Methods Mol Biol. 2010;629:369-85に記載されているようなSELEX法またはその変形を使用して同定することができる。アプタマーは、本明細書に記載されるようなネガティブ選択法およびポジティブ選択法を使用して同定することができる。アプタマーは、その刊行物が参照により全体として本明細書に組み入れられるMei, H, et al. Functional-group specific aptamers indirectly recognizing compounds with alkyl amino group. Anal Chem. 2012 Sep 4;84(17):7323-9. Epub 2012 Aug 21によって記載されている方法を使用して同定することができる。
キット
本発明はまた、本発明の方法を実施するための1種または複数種の試薬を含むキットを提供する。たとえば、1種または複数種の試薬は、1種または複数種のアプタマー、バッファ、ブロッカー、酵素またはそれらの組み合わせであることができる。1種または複数種の試薬は、非限定的にアプタマーライブラリー、基体、たとえばマイクロビーズまたは平面アレイもしくはウェル、バイオマーカーおよび／または微小胞単離のための試薬、特定の標的に対するアプタマー、バイオマーカー／微小胞集団の検出を容易にするアプタマープール、核酸配列決定または増幅のためのプライマーのような試薬、核酸ハイブリダイゼーションのためのアレイ、検出可能な標識、溶媒またはバッファなど、様々なリンカー、様々なアッセイ成分、ブロッカーなどを含む、主題の方法を実施するための任意の有用な試薬を含み得る。1種または複数種の試薬はまた、本発明によって提供される様々な組成物を含み得る。ある態様において、1種または複数種の試薬は本発明の1種または複数種のアプタマーを含む。1種または複数種の試薬は、基体、たとえば平面基体、カラムまたはビーズを含むことができる。キットは、1種または複数種の試薬を使用して様々なアッセイを実施するための取り扱い説明を含むことができる。
ある態様において、キットは、本明細書に提供されるアプタマーまたは組成物を含む。キットは、本明細書に提供される方法を実施するように構成されることができる。たとえば、キットは、本発明のアプタマー、基体または本発明のアプタマーおよび基体の両方を含むことができる。
ある態様において、キットは、アッセイを実施するように構成されている。たとえば、キットは、1種または複数種の試薬および生物学的試料中の生物学的実体の存在またはレベルを検出するための取り扱い説明を含むことができる。そのような場合、キットは、関心対象の生物学的実体への1種または複数種の結合物質を含むことができる。1種または複数種の結合物質は基体に結合していることができる。
ある態様において、キットは、生物学的試料の特定のアプタマープロフィールを提供するアプタマーのセットを含む。アプタマープロフィールは、非限定的に、特定の疾患または障害を特徴決定するために使用することができるプロフィールを含むことができる。たとえば、疾患または障害は、非限定的に癌を含む増殖性疾患または障害であることができる。
実施例1：標的に結合するDNAオリゴヌクレオチドの特定
標的を、スライドガラスまたは磁気ビーズなどの固体基体に付着させる。磁気ビーズの調製のためには、ビーズを、0.1〜1 mg/mlの範囲の濃度の標的タンパク質とインキュベーションする。特定のビーズ製造業者により提供される化学に従って、標的タンパク質をビーズに結合させる。典型的には、これは、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）官能基プロセスを介したカップリングを含む。占有されていないNHS基を、標的との結合後に不活性にする。
ある特定の長さ、例えば32塩基対の長さのランダムに生成されたオリゴヌクレオチド（オリゴ）を、安定化された標的を保持する容器に添加する。各オリゴは、5'末端または3'末端のいずれかに6個のチミンヌクレオチド（チミンテール）を、チミンテールが結合した単一分子のビオチンと共に含有する。ビオチンの追加的な分子を付加することができる。各オリゴはまた、PCR用の増幅プライマー（「プライマーテール」）に対応する、各末端上のヌクレオチドの短いストレッチ（5〜10塩基対の長さ）と共に製造される。32マーのアプタマーの大きなプールの配列を、SEQ ID NO: 1〜230810に示す。配列は、チミンテールまたはプライマーテールがない状態で示す。
オリゴヌクレオチドを、特定の温度および時間で、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で、摂氏37度で500マイクロリットルの反応容積において、標的とインキュベーションする。
結合していないオリゴを除去するために、標的／オリゴの組み合わせを、緩衝液で1〜10回洗浄する。洗浄の回数は、（以下で言及するように）プロセスの各々の反復と共に増大する。
標的に結合したオリゴを、7M尿素または1％ SDSなどのカオトロピック剤を含有する緩衝液を用いて溶出し、ビオチンタグを用いて収集する。オリゴのランダム化領域に付加された5'配列および3'配列に特異的なプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応を用いて、オリゴを増幅する。増幅されたオリゴを、別のラウンドの選択のために、再び標的に添加する。結合富化を観察するために必要に応じて、このプロセスを繰り返す。
実施例2：競合アッセイ
抗体などの、標的に対する公知のリガンドを、結合したオリゴ種を溶出するために使用する（カオトロピック剤とは対照的に、またはカオトロピック剤に加えて）以外は、上記の実施例1におけるようにプロセスを行う。この場合は、Santa Cruz Biotechnology, Inc.由来の抗EpCAM抗体を、標的EpCAMからアプタマーを溶出するために使用した。
実施例3：スクリーニングおよび親和性解析
上述の結合アッセイから生成されたアプタマーを、Life Technologies由来のIon Torrentなどのハイスループット配列決定プラットフォームを用いて、配列決定する。
ライブラリーの調製 - 製造業者のプロトコルに従ってバーコードとアダプター配列とをライゲーションした後に（Life Technologies）、アプタマーをプールした。簡潔に言うと、アプタマーの等モルのプールを、以下の工程を用いて作製した：各ライブラリーのアリコートを、最終のライブラリー濃度に適切なように、Bioanalyzer（商標）機器およびAgilent DNA 1000 KitまたはAgilent High Sensitivity Kitで解析した。各アンプリコンライブラリーのモル濃度（nmol/L）を、市販されているソフトウェア（Agilent）を用いて測定した。
ライブラリーの等モルのプールを、可能な最高濃度で調製した。
プールされたライブラリーストックの合わせた濃度を算出した。
ライブラリープールの鋳型希釈係数を、以下の方程式を用いて決定した：鋳型希釈係数＝（ライブラリープール濃度 [pM]）／26 pM）。
鋳型の調製-新しく希釈されたライブラリーを用いて、上記で提供された結合アッセイに由来するアプタマープールを、従来の配列決定プロトコルを用いて配列決定した。望ましいように、ハイスループット（NextGen）配列決定法を使用することができる。アプタマープールの配列は、SEQ ID NO: 1〜230810に特定されている。
20個のアプタマーを、（上述のような）EpCAMへの結合を評価する直接アッセイまたは競合アッセイに基づいて選択した。選択された配列については、実施例7および表8を参照されたい。
親和性の測定-これらの20個のアプタマーを、次に、インビトロの結合プラットフォームを用いて結合親和性について試験した。この工程については、以下のように、SPR、例えば、T200コントロールソフトウェアを用いたBiacore SPR機を使用することができる。
抗原を32 nMの濃度に希釈する。
32nMから開始して0.5nMまで抗原の2倍希釈液を調製し、速度論のために必要な希釈液を調製する。
Biacore 200コントロールソフトウェアを、以下の条件でプログラミングする：溶液：HBS-EP+緩衝液；サイクル数：3；接触時間：120秒；流速：30μl/分；解離時間：300秒；溶液：グリシン-HCl pH 2.5；接触時間：120秒；流速：20μl/分；安定化期間：0秒。これらのアプタマーの結合親和性を、次に、上記のSPRアッセイ、または望ましい機能についてアプタマーを評価する代わりのインビトロアッセイを用いて測定する。
図4は、アプタマーBTX176881（SEQ ID NO: 98883）についてのSPRデータを示す。図は、示された濃度（nM）でのEpCAMタンパク質に対するビオチン化アプタマーの1:1フィッティングモデルの結合および解離のグラフを含む。表5は、図4に示されているSPR測定値から算出されたKd値を示す。さらに、表5は、BTX187269（SEQ ID NO: 109271）およびアプタマー4（SEQ ID NO: 1）についてのSPRデータおよび算出されたKd値を示す。
（表５）SPR測定値から算出されたKD値
Figure 0006404822
＊単一参照法のためのグローバルフィッティングによるKd、R2およびChi2の値
実施例4：モチーフ解析
上記の実施例におけるプロセスに続いて、関心対象の標的に対する高親和性アプタマーを特定する。ひとたび高親和性アプタマーを特定すると、その配列を、次に、その二次元フォールディング構造を推定するためにソフトウェアプログラムを用いて解析する。周知の配列アラインメントプログラムおよびモチーフ特定のためのアルゴリズムを、配列モチーフを特定するため、および配列の一様な大きなデータセットの次元を低減させるために使用することができる。さらに、Viennaおよびmfoldなどのソフトウェアプログラムが、アプタマー選択の当業者に周知であり、二次構造モチーフ（共有される形状）に基づいてさらに配列をグループ化するために使用することができる。例となる構造予測については、図5A〜図5Bを参照されたい。共有される二次構造は、当然、同一の三次元構造を保証するものではない。従って、1セットのインシリコのツールではまだ、アプタマー候補のセットの中で最適なアプタマーを正確に予測することができないため、アプタマーの「ウェットラボ」評定が、依然として有用である。
同じソフトウェアを用いて、候補アプタマーのプール（上記の実施例1に記載されているように生成された）のハイスループット配列決定において生成された配列を、高親和性アプタマーに類似した構造モチーフについて解析する。構造の比較は、Viennaを用いて行われる自由エネルギー計算値に基づく。表6および表7は、それぞれ、アプタマー4（SEQ ID NO: 1）およびオリゴ6（SEQ ID NO: 230810）に対して高い同一性を有すると算出された上位の20個のライブラリーメンバーについての自由エネルギー計算値の例示的な選択を示す。表6および表7において、「同一性」という縦列は、示されたライブラリー配列に対するアプタマー4の同一のアラインメント比率を示す。同一性の値は、アラインメント中のヌクレオチドの数で割ったペアのアラインメントの結果を含む。「mfeコード」という縦列は、Vienna 2.0.7からの「ドット-ブラケット表記法」出力を含む。シュードノットを含まない二次構造が、Vienna RNAパッケージを通して使用される空間効率のよいドット-ブラケット表記法において表わされ得る。簡潔に言うと、長さnの配列上の構造は、ブラケットおよびドットをマッチさせることからなる一連の同等の長さにより表される。塩基iとjとの間の塩基対は、位置iの「(」および位置jの「)」により表され、不対塩基は、ドットにより表される。mfeコードのドット-ブラケット表記法についてのさらなる情報は、rna.tbi.univie.ac.at/help.htmlで入手可能である。表6および表7における「mfe値」という縦列は、デフォルトパラメータファイルを有するVienna 2.0.7で算出されるような最小自由エネルギー計算値を提供する。
（表６）アプタマー4に対する同一性および二次構造の比較
Figure 0006404822
Figure 0006404822
合計880個の配列が、アプタマー4と比較した際に0.65またはそれより高い同一性スコアを有していた。アプタマー4に対する同一性により高から低へ順番に並べられたこれらの配列のSEQ ID NOは、以下である：
Figure 0006404822
Figure 0006404822
。
（表７）オリゴ6に対する同一性および二次構造の比較
Figure 0006404822
Figure 0006404822
合計548個の配列が、オリゴ6と比較した際に0.65またはそれより高い同一性スコアを有していた。オリゴ6に対する同一性により高から低へ順番に並べられたこれらの配列のSEQ ID NOは、以下である：
Figure 0006404822
Figure 0006404822
。
類似したモチーフを有するアプタマーを選択し、オリゴ合成機を用いて製造する。有望な候補の親和性を、実施例3におけるようなSPRを用いて測定する。
実施例5：微小胞ベースのアプタマーサブトラクションアッセイ
本実施例は、生物学的試料において見出されるバイオマーカーを認識するアプタマーのアプタマープールを枯渇させるプロセスを示す。方法は、健康な個体由来の微小胞を認識するアプタマーを枯渇させるために使用することができる。枯渇させたアプタマーは、罹患した個体由来の微小胞に対してスクリーニングすることができ、それにより健康に対して疾患を優先的に認識するアプタマーを特定する、アプタマーのプールを提供する。
アプタマープールサブトラクション
循環微小胞を、以下の方法のうちの1つを用いて正常血漿（例えば、癌を有さない個体由来）から単離する：1）製造業者のプロトコルに従う、ExoQuick試薬を用いる単離；2）50,000〜150,000gでの1〜20時間のスピンを含み、その後沈殿物をPBSに再懸濁する、超遠心分離；3）製造業者のプロトコルに従う、Life Technologies由来のTEXIS試薬を用いた単離；ならびに4）濾過方法論。濾過法を、より詳細に以下に記載する：
7 ml 150K MWCOオープンカラム（Pierce concentrators, 150K MWCO（分子量カットオフ）7 ml。パート番号: 89922）上に、シリンジおよびフィルター（1.2μm Acrodisc Syringe Filter Versapor Membrane Non-Pyrogenic Ref: 4190, Pall Life Sciences）を置く。シリンジの開口端を、滅菌の分子グレードの水において調製した、5.2 mlの濾過した1×PBSで満たす。
患者の血漿（900〜1000μl）を、シリンジ中のPBSにピペットで移し、2回、ピペット操作で混合する。
血漿を、7 ml 150K MWCOカラム中に濾過する。
7 ml 150K MWCOカラムを、2000×g、20℃（16℃〜24℃）で1時間、遠心分離する。
1時間のスピン後、フロースルーを10％漂白剤中に注いで、廃棄する。
試料容積を、目視検証する。血漿濃縮物が、濃縮機チューブ上の8.5 mlの目盛より上の場合には、血漿濃縮物が8.0〜8.5 mlになるまで、10分刻みで、2000×g、20℃（16℃〜24℃）で血漿試料をスピンし続け、各スピン後に容積を確認する。
カラム上で最低6回、ゆっくりピペット操作で混合し、ピペットを調整して血漿濃縮物容積を測定する。容積が、100μlと標的容積の間である場合は、血漿濃縮物を、事前に標識したコポリマー1.5 mlチューブに移す。容積が依然として標的容積より多い場合は、上記の遠心分離工程を繰り返す。
次の工程における使用のために、滅菌の分子グレードの水において調製した、約45mlの濾過した1×PBSを、50 mlコニカルチューブ中に注ぐ。
適切な量の濾過した1×PBSを添加して、試料を標的容積に再構成する。
単離法の任意を用いて生じた微小胞は、小胞タイプの混合物を含み、エキソソームを単離する傾向にある超遠心分離法を除いて、種々のサイズであろう。
ランダムに生成されたオリゴヌクレオチド（上記の実施例1に記載されているように生じた）を、単離された正常小胞とPBS中で一晩、室温でまたは摂氏4度でインキュベーションする。
これらの小胞に結合しないアプタマーを、50,000〜150,000×gで1〜20時間、小胞をスピンダウンし、上清を収集することにより単離する。
アプタマーオリゴヌクレオチドを、ストレプトアビジンコーティングビーズを含有するカラムに混合物を通すことにより、上清から回収する。これらのアプタマーを次に、（上記と同じ方法を用いて）罹患した患者から単離された小胞に添加し、一晩PBS中で、室温でまたは摂氏4度でインキュベーションする。
小胞をその後、50,000〜150,000×gで1〜20時間スピンし、上清を廃棄する。小胞をPBS中に再懸濁し、SDSまたはいくつかの類似した界面活性剤を用いて溶解する。
アプタマーをその後、ストレプトアビジンコーティングビーズのカラムに溶解混合物を通すことにより捕捉する。単離されたアプタマーを次に、1ラウンドのPCRに供して産物を増幅する。
プロセスをその後、設定の回数、例えば、5回またはそれより多く繰り返す。残ったアプタマープールは、「正常」血漿において見出される微小胞を認識するアプタマーが枯渇している。従って、この方法は、癌小胞を認識するアプタマーにおいてプールを富化するために使用することができる。図6を参照されたい。
実施例6：アプタマー標的の特定
上記の実施例は、疾患特異的アプタマーを特定する方法を示す。本実施例はさらに、疾患特異的アプタマーの標的を特定する方法を示す。
実施例5の方法に従って特定されたアプタマーを、マイクロビーズにつなげる。アプタマーは、対照に対して癌小胞を優先的に認識する能力を示している。マイクロビーズを、アプタマーが癌微小胞表面上の抗原に結合でき、認識するような条件下で、癌小胞を含む生物学的試料とインキュベーションする。ひとたび複合体が形成すると、アプタマーを抗原に光架橋する。小胞を次に、表面活性剤を用いて破壊し、それによりアプタマー-標的複合体をマイクロビーズにつなげる。マイクロビーズを洗浄し、回収する。架橋を破壊し、それにより標的を溶液中に放出する。ビーズを溶液からスピンし、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて標的をさらに濃縮および単離する。精製された標的を、特定のために質量分析に供する。例証となる概略図については図14を参照されたい。
実施例7：例証となるアプタマー配列
以下の表は、本発明の例証となるアプタマーを含む。アプタマーは、実施例1に記載されているランダムアプタマーのプールの一部であった。表8に開示されているヌクレオチド配列は、得られた修飾が開示配列に対して約50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、および99パーセントの相同性を有するアプタマーをもたらしかつEpCAM抗原またはその機能断片に対する結合機能を保持する程度まで改変され得ることが、理解される。任意の定義された数値単位の文脈において使用される際、「約」という用語は、その数値単位の10％上または下、およびその間のすべての単位の変動を意味する。表8に示されている修飾は、アプタマー配列の結合を可能にするために、アプタマープールに対してなされた。チミンテールまたは類似した部分は、アプタマーのいずれの末端にも結合し得ることを、当業者は理解するであろう。
（表８）例証となるEpCAMアプタマー
Figure 0006404822
Figure 0006404822
実施例8：抗EpCAMアプタマーを用いた微小胞の検出
アプタマーを、バイオマーカーを検出するための結合剤として使用することができる。本実施例においては、アプタマーを、微小胞と会合したEpCAMタンパク質を検出するための結合剤として使用する。
図18A〜図18Dは、血漿試料中の微小胞集団を検出するための抗EpCAMアプタマー（アプタマー4；SEQ ID NO: 1）の使用を示す。血漿試料を、前立腺癌を有する3人の男性および前立腺癌を有さない3人の男性（対照または正常と呼ばれる）から取得した。以下の関心対象の微小胞表面タンパク質抗原に対する抗体を、マイクロビーズ（Luminex Corp, Austin, TX）に結合させた：A）EGFR（上皮成長因子受容体）；B）PBP（前立腺結合タンパク質；PEBP1（ホスファチジルエタノールアミン結合タンパク質1）としても知られる）；C）EpCAM（上皮細胞接着分子）；およびD）KLK2（カリクレイン関連ペプチダーゼ2）。血漿試料中の微小胞を、ビーズ結合抗体を用いて捕捉した。蛍光標識されたアプタマー4を、マイクロビーズアッセイにおいて検出物質として使用した。図18A〜図18Dは、ビーズで捕捉されかつアプタマー4で検出された微小胞について検出された平均中央蛍光値（MFI値）を示す。各プロットは、3種の癌試料（C1〜C3）および3種の正常試料（N1〜N3）を個々に示す。これらのデータは、平均して、前立腺癌試料が、正常よりも高いレベルの、標的タンパク質を含有する微小胞を有することを示す。
実施例9：アプタマーのネガティブ選択およびポジティブ選択
アプタマーは、結合剤に依拠する多数のタイプのアッセイを含む種々の生物学的アッセイにおいて使用することができる。例えば、アプタマーを、免疫ベースのアッセイにおいて抗体の代わりに使用することができる。本実施例は、アッセイ工程を通していかなる表面（基体、チューブ、フィルター、ビーズ、他の抗原など）にも結合せず、関心対象の抗原に特異的に結合するアプタマーを特定するアプタマースクリーニング法を提供する。アッセイは、最終的なアッセイの非標的抗原成分に結合するアプタマーを除去する、ネガティブ選択に依拠する。ネガティブ選択の後に、所望の抗原に結合するアプタマーを特定するポジティブ選択を行う。
予備的な実験を、各々1015個の配列を有する5種のDNAアプタマーライブラリーで行い、可変の長さ（60、65、70、75、80マー）を事前増幅して、鎖分離し、フォワード鎖（非ビオチン化）がアプタマーとして働くようにした。複数ラウンドのネガティブ選択およびポジティブ選択を行った。各ラウンドの前に、標準的な方法論を用い、回収されたアプタマー産物をPCR増幅して、鎖分離した。
アプタマーライブラリーおよび各ラウンドの選択後に回収されたアプタマーを増幅するために使用したプライマーを、表9に示す。アプタマーライブラリー配列において、20N〜40Nは、ライブラリー配列中のランダムヌクレオチドの数を指す。
（表９）アプタマーライブラリーおよびPCRプライマー
Figure 0006404822
選択は、以下のように行った。
ネガティブ選択
1．ビーズのネガティブ選択ミックスを調製する：1200個の非磁気ビーズを、標準的なブロッキング剤と20分間インキュベーションする。
2．50μlのアプタマーライブラリー（全部で5ライブラリー）を、4.5μlの各ビーズ混合物と共にPCRストリップチューブに添加する。2時間37℃で、550 rpmで撹拌しながらインキュベーションする。
3．フィルタープレート（1.2μm, Millipore）をPBS-BN緩衝液であらかじめ湿らせる。150μlのPBS-BNを添加する。
4．試料をPCRストリップチューブからフィルタープレートに移し、1時間室温で、550 rpmで撹拌しながらインキュベーションする。
5．真空マニホールドを用いて、フロースルーをフィルタープレートから収集（NBS）プレート中へ収集する。
6．望ましいように過剰な材料を除去するために、試料を濃縮して清浄にする。
ネガティブ選択プロセスを、6〜7回まで繰り返す。
ポジティブ選択
開始前に、当技術分野において公知の条件を用いて、関心対象のタンパク質バイオマーカー（SSX4、SSX2、PBP、KLK2、SPDEF）を望ましい非磁気マイクロビーズに結合させる。組み換え精製された出発材料には、以下が含まれた：Novus Biologicals (Littleton, CO, USA)、カタログ番号H00025803-P01のSPDEF組み換えタンパク質；Novus、カタログ番号H00003817-P02のKLK2組み換えタンパク質；Novus、カタログ番号H00006757-P01のSSX2組み換えタンパク質；Fitzgerald Industries International (Action, MA, USA)、カタログ番号30R-1382のPBP組み換えタンパク質；GenWay Biotech, Inc. (San Diego, CA, USA)、カタログ番号GWB-E219ACのSSX4組み換えタンパク質。
1．ビーズブロッキング：各々のビーズの望ましい数（8400×アプタマーライブラリーの数(5)×(1.2)の余剰係数）をstarting blockと共に20分間インキュベーションする。
2．50μlの各アプタマーライブラリー試料をPCRストリップチューブへ混合し、2.3μlの特定の抗原を有するビーズ試料を添加する。2時間37℃で、550 rpmで撹拌しながらインキュベーションする。
3．フィルタープレート（1.2μm, Millipore）をPBS-BN緩衝液であらかじめ湿らせる。150μlのPBS-BNを添加する。
4．試料をPCRストリップチューブからフィルタープレートに移し、1時間室温で、550 rpmで撹拌しながらインキュベーションする。
5．PBS-BNで3回洗浄し、50μlのPBSを添加し、試料をフィルターの上部から1.5 mlチューブに収集する。
ポジティブ選択を16回まで繰り返す。ある特定のラウンドのポジティブ選択は、以下のような、回収されたRNA（すなわち、残ったアプタマー候補）を処理する追加的な工程を有する。
ラウンド8のポジティブ選択を、以下のように改変した：
1．3回目の洗浄（PBS-BN）後に、25μlの試料をフィルターの上部から1.5 mlチューブ中に収集した。
2．フィルタープレートを、45℃で約10分間インキュベーションし、真空を用いて直ちに洗浄した。プレートを、PBS-BNでさらに3回洗浄した。
3．50μlのPBSをプレートに添加し、工程2を繰り返した。
4．最後の洗浄後に、25μlのPBSをウェルに添加した。試料を、十分に混合し、フィルターの上部から1.5 mlチューブ中に収集した。
ラウンド9のポジティブ選択を、以下のように改変した：
1．工程5）における最終的な洗浄後に、5μg/mlのストレプトアビジン-PEをアプタマー混合物に添加し、30分間室温で、550 rpmで撹拌しながらインキュベーションした。
2．フィルタープレート上の試料を、3回、PBS-BN（＋追加的な500 mM NaCl）で洗浄した。
3．正規のPBS-BNでの1回の追加的な洗浄を行った。
4．50μlのPBSを試料に添加し、その後、上記のように1.5 mlチューブ中に収集した。
5．試料を-20℃で保存した。
ラウンド14のポジティブ選択を、以下のように改変した：
このラウンドを開始する前に、関心対象の抗原（SSX4、SSX2、PBP、KLK2、SPDEF）を、当技術分野において公知である方法を用いて、カルボキシル化磁気ビーズに結合させた。
1．ビーズブロッキング：各々の非磁気ビーズの望ましい数（3000×アプタマーライブラリーの数(5)×1.2の余剰係数）を採り、starting block（3：1、1200ビーズ当たりのブロッキング）を添加し、4種の抗原の5個のミックスを作製して、磁気ビーズに結合させた異なる標的抗原を各々に補給し（示されている場合以外は抗原が非磁気ビーズに結合している、下記の表10を参照されたい）、20分インキュベーションする。
（表１０）ビーズブロッキング混合物
Figure 0006404822
2．50μlのアプタマーライブラリーをPCRストリップチューブに添加し、磁気ビーズ上に標的抗原を有するビーズ混合物を、あらかじめ選択された対応するアプタマーライブラリーを有するチューブに添加し、2時間37℃で、550 rpmで撹拌しながらインキュベーションする。
3．フィルタープレートをPBS-BN緩衝液であらかじめ湿らせ、150μlのPBS-BNを添加する。
4．試料をPCRストリップチューブからフィルタープレートに移し、1時間室温で、550 rpmで撹拌しながらインキュベーションする。
5．最後の（標準的な）洗浄後に、5μg/mlのストレプトアビジン-PEを添加し、30分間室温で、550 rpmで撹拌しながらインキュベーションする。
6．PBS-BN（＋追加的な500 mM NaCl）で3回、洗浄する。
7．正規のPBS-BNで、1回の追加的な洗浄を行う。
8．50μlのPBSを試料に添加し、その後、上記のように1.5 mlチューブに収集した。
9．磁気スタンドを用いて磁気ビーズを除去し、新鮮なPBS緩衝液で置換する。
10．その後のDNA抽出および鎖分離のために、試料を-20℃で保存した。
ポジティブ選択の後期のラウンドにおいて実行される任意の工程は、アプタマー結合のストリンジェンシーを増大させることを意図される（例えば、熱または塩濃度の増大）。
図19A〜図19Eは、ポジティブ選択中の、関心対象の抗原に対するアプタマーの選択を示す。3ラウンドのネガティブ選択が、事前に行われている。図19A〜図19Cは、SPDEFに対する結合について選択された5種のDNAアプタマーライブラリー（1M〜5Mと標識されている）を示す。ネガティブ選択後に、ライブラリーを、磁気ビーズに結合させたSPDEF抗原を補給した、マイクロビーズに結合させた4種の抗原の混合物（SSX2、SSX4、PBP、KLK2）とインキュベーションした。試料を、上記のポジティブ選択プロトコルに従って加工した。磁気ビーズを収集した後に、結合したDNAアプタマーを、ビーズから抽出して、再増幅した。図19A〜図19Cは、ポジティブ選択の1ラウンド後（図19A）、2ラウンド後（図19B）、および3ラウンド後（図19C）の、各々の出発ライブラリーから回収されたアプタマーを示す。
図19D〜図19Eは、特異的な抗原に対する第13ラウンドのポジティブ選択後の25アプタマーライブラリーのスクリーニングを示す（SSX2、SSX4、PBP、KLK2、およびSPDEF抗原の各々当たり5ライブラリー）。このラウンド後のアプタマーの選択を、上述のラウンド13の修飾当たりの交絡する抗原を含めることで改変した。関心対象のアプタマーに結合させた磁気ビーズに結合したDNAアプタマーを、ビーズから抽出して、再増幅した。回収されたライブラリーを、図19Dに示す。図19Eは、追加的なラウンドの選択およびストリンジェントの洗浄後のライブラリーを示す。
実施例10：鎖分離
上記の実施例における各ラウンドの選択後に、回収されたアプタマープールを、標準プロトコルのPCRを用いて増幅した。PCR産物を、本実施例に示されている方法論を用いて捕捉し、鎖分離した。
ネガティブ選択鎖分離
20μL/PCRのストレプトアビジン磁気ビーズ（Thermo Scientific, Rockford,IL, USA）を、磁石上に1分間置くことにより調製する。保存緩衝液を完全に除去する。PBS-Tで3回洗浄する。開始時と等容積のPBS-Tに再懸濁する。96ウェルプレート中のすべての関連するアプタマーのウェル（25/プレート）に、20μL／ウェルを分注する。
追加的な80μLのPBS-T／ウェルを添加する。
適切なウェル中の各それぞれのアプタマーについて、残りのPCR内容物を添加する。室温で15分間、穏やかに撹拌しながらインキュベーションする。プレートを磁石上に置く。上清を除去して廃棄する。150μLのPBSで3回洗浄する。
最終的な洗浄後に、磁石上に置き、PBSを除去する。50μLの0.1 M NaOHを添加し、5分間室温でインキュベーションする。インキュベーション後に、溶液中の鎖分離されたアプタマーを取り出して、新たな96ウェル中に置き、相補鎖をビーズ上に固定化させる。5μLの1 M HClの添加で、溶液を中和する。45μLの水で、容積を100μLにする。
1/10容積の3 M酢酸ナトリウムpH 5.2および3倍容積の95％エタノールを添加することにより、エタノール沈殿する。
1.25μLのグリコーゲン（Roche 20μg／μL）を添加し、室温で15分間スピンする。上清を廃棄し、沈殿物を乾燥させる。
次のラウンドの選択のために、適切な緩衝液に再懸濁する。
ポジティブ選択鎖分離
1．各試料を、1.7 mlエッペンドルフチューブ中に分注する。
2．標識されたチューブ中に5μLの1M HClをあらかじめ分注する。1チューブ／試料であるべきである。
3．試料容積が約38μLである場合、420μLの1×PBS中の0.05％ Tween（調製するためには、250μLのTweenを500mLのHyclone PBS中に添加し、物質が粘性であるため、tweenをゆっくりピペット操作してよく混合する）を添加する。
4．ストレプトアビジンビーズを調製する。試料当たり40μLが必要である（洗浄のために、ビーズをチューブ中にプールしておく）。25回の鎖分離を行う場合は、540μLのビーズ×2チューブ（余剰量を含む）を分注する。調製する前にビーズをよくボルテックスして、凝集塊が明らかでないようにするべきである。
5．ビーズを磁石上に置き、溶液が透明になるのを待つ。
6．ビーズを乱すことなく、上清を除去する。
7．1 mLの1×PBS中の0.05％ Tweenをビーズに添加し、磁石から外して混合する。混合した後、磁石上に再び置き、溶液が透明になるのを待つ。
8．ビーズを乱すことなく、上清を除去する。
9．工程7および8を繰り返す。事前に分注した同容積のtween-PBS溶液に、ビーズを再懸濁する。
10．磁石から外してビーズをよくボルテックスし、40μLを試料の各々に添加する。
11．試料にしっかりとふたをして、15分間室温で回転器上に置く。
12．結合していない試料を洗い流すために、試料を磁石上に戻して置く。
13．磁壁に向けて、1 mLの1×PBS中の0.05％ Tweenを各チューブに添加する。溶液が透明になるのを待つ。
14．ビーズを乱すことなく、上清を除去する。
15．工程12および13を繰り返す。残りの溶液がチューブ中に残っていないことを確かめる。
16．磁石から外して、50μLの0.1 M NaOHを各試料に添加する。
17．チューブをMix Mate上に5分間、350 RPMで室温に置く。
18．5分後に、チューブを磁石上に置く。
19．ビーズがきれいになり、磁石に貼り付いた後、上清を除去して、適切に標識された5μL HClチューブ（これらは、鎖分離の開始前に分注され、標識されているであろう）に添加する。これが、溶液を中和するはずである。溶液は、わずかに濁るはずである。
20．45μLの分子グレードのRNアーゼ／DNアーゼフリーの水を添加することにより、各チューブにおいて容積を100μLにする。試料を短時間、氷上に置く。
21．11μLの3M酢酸ナトリウムを、各チューブに添加する。これにより、溶液のいくらかは透明になる可能性がある。
22．350μLの95％エタノールを、各チューブに添加する。
23．1.25μLのグリコーゲンを各チューブに添加すると、かすかな白っぽいたなびくものが見られるはずである。
24．10回の反転により混合する。
25．エタノールチューブを最低で16分間、最高速度、室温で遠心分離する。
26．遠心分離が完了したら、沈殿物を乱さないように注意して、エタノールをチューブから除去する。最初にp1000を使用し、その後p200を使用する。
27．試料を約5分間、またはエタノール残留物がなくなるまで、風乾させる。風乾は長すぎないようにする。
28．試料を、55μLのPBS-BN中の25mM HEPESに再懸濁する。
29．約2分間置き、試料をボルテックスして、スピンダウンする。
30．5μlを、ポジティブ選択、ラウンド番号、日付、試料番号、および「増幅後」と標識されたチューブ中に分注する。-20℃で凍結する。
31．残りの50μLを、次のラウンドの選択に使用する。
実施例11：抗EpCAMアプタマーの発見および特徴決定
本実施例においては、上記の実施例9〜10における技術を用いて特定されたEpCAMに対するアプタマーを特徴決定する。上述のようなEpCAM結合アプタマーのプールについての選択後に、Ion Torrent標準プロトコル（Life Technologies, Carlsbad, CA）を用いてアプタマーライブラリーを配列決定した。リード候補を、（a）完全な期待される長さの産物でのすべての読み取り配列にわたる非常に高存在量のモチーフおよび（b）強い二次構造、を有するものとして選択した（図20B）。
アプタマーを、SSX4、SSX2、PBP、KLK2、およびSPDEF組み換えタンパク質との競合において、MicroPlexビーズに結合させたEPCAMタンパク質について選択した。アプタマーの一部を、最初のラウンドにおいて、Fcタグに付加させたEpCAMに対して選択し、ラウンド8後に、選択を、ヒスチジンタグを有するEPCAMに切り換えた。アプタマーの別の一部は、最初のラウンドにおいて、ヒスチジンタグに付加させたEpCAMに対して選択し、ラウンド8後に、選択を、Fcタグを有するEPCAMに切り換えた。タンパク質の精製および捕捉のためにFcタグおよびヒスチジンタグを用いる方法は、当業者に公知である。これらの手順から得られた数々の代表的な配列を、表11に示す。表11においては、配列を、5'から3'を左から右へ示し、各々の完全な配列は、示された5'リーダー配列、それに続く示された可変配列、それに続く示された3'テール配列からなる。各配列は、間に可変配列を伴う、リーダーおよびテールを有するライブラリー（表9を参照されたい）に由来する。表は、特定された配列が、5'末端または3'末端上にビオチン部分を含むか否かを示す。表11に開示されているヌクレオチド配列はまた、得られた修飾が、開示された配列に対して約50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、および99パーセントの相同性を有するアプタマーをもたらしかつEpCAM抗原またはその機能断片に対する結合機能を保持する程度まで改変され得ることが、理解される。
（表１１）EpCAMアプタマー候補配列
Figure 0006404822
Figure 0006404822
追加的なアプタマー候補を、最初のクローンスクリーニングで選択し、アプタマーおよび標的EpCAMタンパク質の滴定により、Fc-EpCamおよびHisタグEpcam標的の両方に対してさらに検証した。これらの手順から得られた数々の代表的な配列を、表12に示す。CAR027およびCAR028は、Fc-EpCam標的に対して最初に特定されたものであり、他方、CAR029およびCAR030は、HisタグEpCam標的に対して最初に特定されたものである。表12においては、配列を、5'から3'を左から右へ示し、各々の完全な配列は、示された5'リーダー配列、それに続く示された可変配列、それに続く示された3'テール配列からなる。各配列は、間に可変配列を伴う、リーダーおよびテールを有するライブラリー（表9を参照されたい）に由来する。表は、特定された配列が、5'末端または3'末端上にビオチン部分を含むか否かを示す。表13は、表12中の完全配列に基づいて修飾されたアプタマー候補を示す。修飾についての原理を、表に列挙する。配列は、期待される二次構造を保持する程度まで短縮されている。表12および表13に開示されているヌクレオチド配列は、得られた修飾が開示配列に対して約50、55、60、65、70，75、80、85、90、95、96、97、98、および99パーセントの相同性を有するアプタマーをもたらしかつEpCAM抗原またはその断片に対する結合機能を保持する程度まで改変され得ることが、理解される。
（表１２）追加的なEpCAMアプタマー候補配列
Figure 0006404822
（表１３）EpCAMアプタマーの最適化
Figure 0006404822
アプタマーの開発
RNAアプタマーとして、代替的なテール配列を伴うCAR003は、以下のRNA配列（SEQ ID NO: 230847）を有する。
Figure 0006404822
CAR003（CAR003.2_5'-B、CAR003.2_3'-B）を、さらに特徴決定した。EpCAMアプタマーCAR003を、ビオチン部分の付加により、3'末端上を望ましいように修飾する（CAR003.2_3'-B）。例えば、標識、捕捉、および／またはアンカリングのため、ビオチンを、ストレプトアビジン-ビオチンシステムを用いてアプタマーに結合するために使用することができる。図20Bは、-30.00 kcal/molの最小自由エネルギー（ΔG）を有するCAR003の最適二次構造を示す。図示において、アプタマーを、CAR003 DNA配列（SEQ ID NO: 230822〜230823）に対応するRNAアプタマー（SEQ ID NO: 230847）として示す。
合成および精製。選択されたCAR003アプタマーを、AKTA OligoPilot 100 Synthesizer（GE Healthcare Life Sciences Corp., Piscataway, NJ）を用い、3'ビオチンおよび最終的な脱トリチルを伴って再合成した。産物を、FPLCにより陰イオン交換クロマトグラフィーで精製した。FPLC後のいくつかの画分を、図20Cに示されているプール1〜3として示されるように、組み合わせた。図は、すべての産物、および、ゲル上で品質を確認した後にプールに割り当てられた画分でのFPLCクロマトグラムを含む。図20Dは、合成後のCAR003アプタマーの異なるFPLC画分を有するSYBR GOLD染色ゲルを示す。異なる画分を、高から低への順序で（プール1−プール3）未完成の鎖の量に基づいて、プールにおいて組み合わせた。プール1〜3は、図20Cに示されているものに対応する。
CAR003アプタマーの特徴決定。精製されたCAR003アプタマーを、以下の内部で開発されたアッセイを用いて、ポリヒスチジンタグを有する（「Hisタグ付加された」）組み換えEPCAMタンパク質への結合について試験した。抗Hisタグ結合ビーズを、EPCAM-Hisタグ付加タンパク質と混合した。試験されるべきアプタマーを、ストレプトアビジン-フィコエリスリン（SA-PE）で標識した。EpCAM-ビーズとSA-PE標識アプタマーとを、混合した。結合を、本明細書に記載されているようなビーズアッセイにおいて中央蛍光値として測定した。MFI値（図20E〜図20F）は、組み換えEpCAMに対するSA-PE標識アプタマーの結合の増大と共に増大する。図20E〜図20Fは、PBS-BN（PBS、1％ BSA、0.05％アジド、pH 7.4）を含む25 mM HEPESにおける（図20E）、または1 mM MgCl2を含む25 mM HEPESにおける（図20F）、EPCAMタンパク質へのCAR003の結合を示す。EPCAMアプタマーであるアプタマー4（上記を参照されたい）を、比較のために使用した。図に示されるように、CAR003のプール3は、BSAの存在下（図20E）よりもMgCl2の存在下（図20F）でより効率的に、その標的に結合する。
その性能をさらに理解するために、CAR003の結合を、種々の緩衝液においてBSAおよびMgCl2の両方の存在下で試験した。図20Gは、ウシ血清アルブミン（BSA）の添加を伴うおよび伴わない、示された塩におけるEpCAMへのCAR003の結合を示す。再び、EpCAMへのCAR003の結合は、BSAが存在しない際により効率的である。追加的に、150 mM NaClを試験したが、MgCl2を超えてCAR003の性能を改善するようには見られなかった。
アプタマーの性能に影響を及ぼし得る別の要因は、異なる塩組成での変性である。図20Hは、EPCAMタンパク質へのCAR003の結合に対する変性の効果を示す。チャートから見られるように、アプタマーの変性は、MgCl2由来のCAR003に対する効果と類似した、EpCAMへのCAR003の結合に対する正の効果を有する。しかしながら、MgCl2の存在下での変性は、EpCAMへのCAR003の結合を相乗的には改善し得ない。興味深いことに、CAR003は、試験された条件において対照のアプタマー4と比較してより安定なようであった。
ビーズアッセイ環境におけるEpCAMへのCAR003の親和性を、抗原の一定の投入にわたって滴定されたアプタマーで上記と同じアッセイにおいて評価した。図20Iは、EPCAM組み換えタンパク質（一定の投入5μg）に対するアプタマーの滴定を示す。試験された条件下で、5μgのアプタマー投入で開始する飽和レベルから示唆されるように、アプタマー4は、CAR003と比較してEPCAMタンパク質により高い親和性を有していた。
CAR003の特異性を評定するために、EPCAM組み換えタンパク質、ならびにウシ血清アルブミン（BSA）およびヒト血清アルブミン（HSA）を含む対照に対するウエスタンブロットを用いて試験した。図20Jは、EPCAM hisタグ付加タンパク質、BSA、およびHSA（各々5μg）に対するCAR003アプタマーでのウエスタンブロットを示す。ゲルを、0.5％のF127でブロッキングし、約50μg/mlのCAR003ビオチン化アプタマー、画分3をプローブとした。ブロットを、NeutrAvidin-HRP、それに続くSuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrateで可視化した。CAR003アプタマーをプローブとしたウェスタンブロットは、アルブミンを上回る、EPCAMタンパク質に対するアプタマーの明らかな優先傾向を示した。
血漿試料でのCAR003試験。5人の前立腺癌対象および5人の正常対象由来の血漿試料を、CAR003で試験し、微小胞を捕捉するためのビーズ結合タンパク質、および実施例8に記載されているような小胞を検出するためのSA-PE標識アプタマーを用いて微小胞を検出した。SA-PE標識アプタマー4検出物質を、対照として用いた。正常を上回る癌の倍率変化（fold change）を、表14に示す。倍率変化を、正規化を伴わず（「未処理」）、または陰性対照に対する正規化を伴って示す。小胞を、示されるようなSSX4、PBP、SPDEF、EPCAM、KLK2、およびSSX2に対する、ビーズ結合抗体で捕捉した。
（表１４）微小胞を検出するためのCAR003
Figure 0006404822
試験された条件下で、CAR003で検出された試料は、アプタマー4での検出と比較した際により低いMFI値を有したが、CAR003は、より良好なシグナル対ノイズ比を有し、かつ、SSX4、SPDEF、EPCAM、およびSSX2捕捉マーカーでの癌試料と正常試料との間のより良好な分離を示した。
対照アプタマー
アプタマーの特徴（サイズ、安定性、結合親和性、および特異性など）を、EpCAMまたは他の標的に特異的な対照アプタマーに対して比較することができる。例えば、アプタマーを、Kaur and Yung, 2012に記載されているような抗VEGFアプタマー：
Figure 0006404822
と比較する。
参照文献：
Figure 0006404822
実施例12：抗EpCAMアプタマーの最適化
本実施例は、上記に示されているアプタマーCAR016（SEQ ID NO: 230840）の最適化を実証する。CAR016は、上述のようないくつかのラウンドのEpCAMアプタマー選択において特定された最も優勢なアプタマーであった（実施例9を参照されたい）。上記に示されているようなその可変配列および共通モチーフを有する配列は、選択されたアプタマープールの50％より多くに相当していた。表15は、9ラウンドの選択後のIon Torrentプラットフォームを用いた2回の独立した配列決定試験（配列決定試験1および2）由来の、最も頻度が高いCAR016関連バリアントを示す。
（表１５）EpCAMアプタマースクリーニングの代表的な配列
Figure 0006404822
総合して、表15における配列は、以下の配列により表すことができ、配列中、[AT]は、アデニン（A）またはチミン（T）のいずれかが存在することを特定する。
Figure 0006404822
ELISAを介した試験により、CAR016は、標準的なELISAプレートにおいてEpCAM-Fcに、およびニッケルコーティングELISAプレートにおいてEPCAM-Hisタグ付加タンパク質に結合したことが、実証された。微小胞コーティングマイクロビーズでのマイクロビーズ結合アッセイにおいて、CAR016は、アプタマー4を含むすべての試験されたアプタマー候補の間で最高の平均蛍光値を有していた。従って、増強された性能について試験するために、様々なCAR016のバリアントを作製した。配列バリアントを表16に示し、各バリアントの背後の原理を表17に記載する。表16における「n/a」は、アプタマーのセクションが存在しないことを示す。表16における下線のヌクレオチドは、CAR016と比較した際に修飾されているヌクレオチドを示す。さらなる説明については、表17を参照されたい。ΔGの計算値により推定されるようなアプタマー安定性の効果を検討するために、ある特定の変異を作製する。CAR016の推定安定性は、ΔG＝-10.89 kcal/molである。より低いΔGは、より高い推定安定性を示す。特に、CAR016_M23〜CAR016_M27を参照されたい。
（表１６）EpCAMアプタマーCAR016変異配列
Figure 0006404822
Figure 0006404822
Figure 0006404822
（表１７）EpCAMアプタマーCAR016変異配列の原理
Figure 0006404822
表16および表17において観察されるように、5'-リーダーおよび3'-テールプライマー配列を含むアプタマーの長さに渡って、種々の修飾を行う。アプタマーバリアントを合成し、EpCAMへの結合を、CAR016について上述のようなELISAおよびマイクロビーズアッセイを用いて評価する」。結果により、EpCAMタンパク質およびEpCAM＋微小胞に特異的に結合するアプタマーの能力を増強または低下させるアプタマー配列の領域が明らかである。図21A〜図21Jは、CAR016ならびに表16および表17に示されているCAR016バリアントの予測される二次構造を示す。
実施例13：VCAP微小胞に対するアプタマー
本実施例においては、前立腺癌VCAP細胞株より流出した微小胞を認識するアプタマーを特定した。VCAP微小胞を、高結合表面を有する標準的なELISAプレート上にコーティングした。過剰な結合していない微小胞をウェルから洗浄した後に、ウェルをPluronic（登録商標）F-127（Sigma Aldrich）でブロッキングした。20nアプタマーライブラリー（表9を参照されたい）を、ウェル結合微小胞とインキュベーションした。結合していないアプタマーを除去するために、ウェルを洗浄した。残ったVCAP微小胞アプタマーを溶出し、精製し、増幅し、鎖分離し、かつ次のラウンドの前に清浄にした。上記の詳細な方法論を参照されたい。前の工程を、8ラウンド繰り返した。ラウンド8後に、選択されたアプタマープールを、IonTorrent配列決定に供した。
全体の読み取りの中で最上位の頻度を有するアプタマーを、表18に示す。表18においては、配列を、5'から3'を左から右へ示し、各々の完全な配列は、示された5'リーダー配列、それに続く示された可変配列、それに続く示された3'テール配列からなる。各配列は、間に可変配列を伴う、リーダーおよびテールを有するライブラリー（表9を参照されたい）に由来する。表は、特定された配列が、5'末端または3'末端上にビオチン部分を含むか否かを示す。表18に開示されているヌクレオチド配列もまた、得られた修飾が開示配列に対して約50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、および99パーセントの相同性を有するアプタマーをもたらしかつ小胞抗原またはその機能断片に対する結合機能を保持する程度まで改変され得ることが、理解される。
（表１８）VCAP微小胞アプタマー配列
Figure 0006404822
表18中の配列は、2回の独立した配列決定試験での配列決定プールにおいて最も頻度が高く表された。最高の頻度は、1）CAR023、18.3％；2）CAR024、12.7％；3）CAR025、9.8％；および4）CAR026、8.8％であった。CAR031は、5番目に頻度が高い配列であった。配列を、アプタマーおよび標的VCapエキソソームの滴定によりさらに評定した。
表18中のアプタマーをまた、5'ビオチン部分の代わりに標識で直接修飾する。例えば、ビオチンを、5'ジゴキシゲニン（NHSエステル）（「/5DigN/」と省略される）で置換してもよい。ジゴキシゲニン基は、蛍光標識を提供する。5'ジゴキシゲニンは、スペーサー、例えば、18原子のヘキサ-エチレングリコールスペーサーであり、Integrated DNA Technologies（IDT）から入手可能であるInt Spacer 18（「/Int18/」と省略される）で、ヌクレオチド配列から分離されてもよい。使用することができる、IDTから同様に入手可能な類似したスペーサーには、以下が含まれる：1）オリゴの内部または5'末端に組み込むことができるホスホラミダイトである、C3スペーサー。複数のC3スペーサーを、オリゴのいずれかの末端に付加して、蛍光体または他のペンダント基の付着のための長い親水性スペーサーアームを導入することができる；2）PC（光開裂性）スペーサーを、DNA塩基の間、またはオリゴと5'-修飾基との間に配置することができる。これは、300〜350 nmのスペクトル範囲におけるUV光への曝露で開裂することができる10原子のスペーサーアームを提供する。開裂は、5'-リン酸基を有するオリゴを放出する；3）ヘキサンジオールは、DNAポリメラーゼによる伸長を阻止することができる6個の炭素のグリコールスペーサーである。この3'修飾は、より長いオリゴの合成を支持することができる；4）スペーサー9は、オリゴの5'-末端もしくは3'-末端または内部に組み込むことができるトリエチレングリコールスペーサーである。複数の挿入を、長いスペーサーアームを作るために使用することができる；ならびに、5）1',2'-ジデオキシリボース（dSpacer）修飾を、オリゴヌクレオチド内に安定な脱塩基部位を導入するために使用する。
実施例14：アプタマー標的の特定
本実施例においては、ミクロスフェアに結合させたアプタマーを、上述のようなライブラリースクリーニング法により特定された2個のアプタマーの標的を決定することを手助けするために用いる。全般的なアプローチを、図14に示す。アプローチを、EpCAMを認識するライブラリースクリーニングにより特定されたアプタマーであるCAR029、およびVCAP微小胞の表面上の未知の標的を認識するライブラリースクリーニングにより特定されたアプタマーであるCAR024の標的を検証するために使用する。CAR029およびCAR024の両方については、上述を参照されたい。本アプローチにおいては、CAR029およびCAR024の配列を、ミクロスフェアへの連結の前にランダムに再配列させる。ミクロスフェアを、意図される標的分子に類似しているが同一ではない標的に結合する対照として、使用する。
本研究において使用した例示的なアプタマー対照を、表19に示す。表19においては、配列を、5'から3'を左から右へ示す。各配列は、表中のアプタマーIDにおいて示されるように、CAR029またはCAR024のランダムな再配列に由来する。表19に開示されているヌクレオチド配列もまた、得られた修飾が開示配列に対して約50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、および99パーセントの相同性を有するアプタマーをもたらしかつ望ましい機能を保持する程度まで改変され得ることが、理解される。
（表１９）陰性対照アプタマー配列
Figure 0006404822
使用したプロトコルは以下である。
1）候補アプタマー（ここでは、CAR029およびCAR024）および対照アプタマー（ここでは、CAR029-Neg1、CAR029-Neg2、CAR024-Neg1、CAR024-Neg2）を、捕捉を可能にする修飾（ここでは、アプタマーをビオチン化する）および架橋を可能にする修飾（ここでは、光架橋を可能にするために、Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL由来のSulfo-SBED Biotin Label Transfer Reagent and Kit、カタログ番号33073を用いる）を伴って合成する。
2）アプタマーの各々を、関心対象の標的を有する微小胞（ここでは、VCAP微小胞）と個々に混合する。
3）アプタマーを標的に結合させるために、インキュベーション後に、アプタマーと微小胞標的との架橋を引き起こすように、紫外線を混合物に適用する。
4）微小胞を溶解させ、それにより架橋されたアプタマー-標的複合体を溶液中に放出する。
5）架橋されたアプタマー-標的複合体を、ストレプトアビジンコーティング基体を用いて溶液から捕捉する。
6）各アプタマーについて架橋されたアプタマー-標的複合体を、SDS-PAGEゲル電気泳動上で個々に流す。捕捉されたタンパク質標的を、クマシーブルー染色で可視化する。
7）架橋工程および結合工程は無差別の可能性があるため、意図される標的を含むが、ランダムなタンパク質もまた含む複数のバンドが、ゲルの各々上に現れるであろう。意図される標的は、候補アプタマー（ここでは、CAR029およびCAR024）を有するゲル上には現れるが、関連する陰性対照アプタマー（ここでは、それぞれ、CAR029-Neg1、CAR029-Neg2；またはCAR024-Neg1、CAR024-Neg2）を有するゲル上には現れないバンド中に見出されるであろう。標的に対応するバンドを、ゲルから切り出す。
8）質量分析（MS）を用いて、切り出されたバンドからアプタマーの標的を特定する。
実施例15：抗PSMAアプタマー
本実施例においては、アプタマーライブラリーを、上記の実施例におけるような6ラウンドのポジティブ選択を用いて特定された、前立腺特異的膜抗原（PSMA／FOLH1／NAALADアーゼI）タンパク質に対するアプタマーについてスクリーニングする。上述のようなPSMA結合アプタマーのプールについての選択後に、アプタマーライブラリーを、Ion Torrent標準プロトコル（Life Technologies, Carlsbad, CA）を用いて配列決定した。リード候補を、以下のような特性について選択した：スクリーニングしたライブラリーにおける高頻度の出現、標的に対する親和性、標的に対する特異性、規定された分子構造、好みのコンフォメーションの存在、そのようなコンフォメーションの安定性、作業濃度で凝集の割合が全くないかまたは小さいこと、簡単なかつ再現性を有する合成および精製。
詳細な実験プロトコルを、下記の実施例17に示す。スクリーニングパラメータおよびプロトコルの概要には、以下が含まれた。
1．AS PCRによりフォワード鎖合成DNAライブラリーから生成された「6アプタマー」ssDNAライブラリーを、使用した。6アプタマーライブラリーには、表20に示されているリーダー配列およびテール配列を有する10n、20n、25n、30n、35n、および40nの可変配列が含まれた。
2．PSMA hisタグを、Dynabeads上に結合させた。
3．複数ラウンドのポジティブ選択を、PSMA結合ビーズの希釈されたアプタマーライブラリーとのF127／PEG4000における約2e12コピー／選択での混合により行った。
4．各ラウンド後に、溶出を含まず、再懸濁したビーズを増幅のためにPCR反応中に直接添加した。
5．PCR増幅後、PCRを次にλヌクレアーゼで2時間消化し、ssDNAをzymo ssDNA精製キットにより精製した。
6．全部で9ラウンドの選択を行った。35nおよび40nのライブラリーについては、ライブラリーが機能しなかったため、6ラウンドのみを行った。
7．ラウンド6およびラウンド9の選択回収物を、PCRクローニングにおいて使用し、ラウンド6およびラウンド9の各ライブラリーから30クローンを選んで、プラスミドを増幅および精製した。
8．ラウンド6については、180クローンを、最初のスクリーニングにおいて使用した。ラウンド9については、全部で120クローンを、最初のスクリーニングにおいて標的に対して使用した。
9．個々のssDNAクローンを小スケールで増幅し、最初のスクリーニングにおいて標的タンパク質（HisタグPSMAタンパク質）ならびに非標的タンパク質であるBSAおよびマウスIgに対して試験した。シグナル／ノイズ比を算出した。
10．上記のスクリーニングに従って、個々のクローンを選び、ssDNAを中スケールで増幅して、ELISAフォーマットにおいて標的に対してさらに滴定した。
11．最終的なクローンについてサンガー配列決定を行い、配列決定データを解析した。
最も再現性を有する結果は、30nアプタマーライブラリーにおいて観察された。これらの手順から得られた代表的な配列を、表20に示す。表20においては、配列を、5'から3'を左から右へ示し、各々の完全な配列は、示された5'リーダー配列、それに続く示された可変配列、それに続く示された3'テール配列からなる。各配列は、間に可変配列を伴う、リーダーおよびテールを有するライブラリーに由来する。表は、特定された配列が、5'末端または3'末端上にビオチン部分を含むか否かを示す。表20に開示されているヌクレオチド配列もまた、得られた修飾が開示配列に対して約50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、および99パーセントの相同性を有するアプタマーをもたらしかつPSMA抗原またはその機能断片に対する結合機能を保持する程度まで改変され得ることが、理解される。
（表２０）PSMAアプタマー候補配列
Figure 0006404822
CAR050およびCAR051が、クローニングにより特定された。これらの2種のアプタマーの結合親和性を、PSMA／FOLH1／NAALADアーゼI組み換えタンパク質に対してELISAにより試験した。図22を参照されたい。CAR052およびCAR053は、9ラウンドの選択後にIon Torrentシステムを用いた配列決定により特定された。CAR052は、全体の読み取り数の5.91％で、torrentにおいて最も頻度が高い配列であった。2番目に頻度が高い配列であるCAR053は、全体の読み取り数の3.34％を占めていた。
実施例16：アプタマーの競合的単離
本明細書に記載されているように、アプタマーを関心対象の標的に対して特定することができる。本実施例においては、関心対象の標的に対するアプタマーを特定するために、競合的結合スキームを用いる。
アプタマー特定法30を、図3において概略を述べる。関心対象の被分析物、例えば、タンパク質または微小胞などの生物学的実体を、基体に捕捉させる31。基体は、例えば、平面基体またはビーズであることができる。被分析物は、共有結合でまたは非共有結合で捕捉することができ、例えば、被分析物を、抗体、アプタマー、またはストレプトアビジン-ビオチン連結を用いて捕捉することができる。捕捉された被分析物を、オリゴヌクレオチドアプタマー候補のライブラリーと接触させる32。オリゴヌクレオチドは、被分析物、基体、捕捉剤（例えば、抗体（Ab）、アプタマーなど）、反応チューブまたはウェル、生物学的破片などを含む、混合物中の種々の成分に結合する33。被分析物に結合するオリゴヌクレオチドは、関心対象の標的に対するアプタマー候補を含む34。結合していないオリゴヌクレオチドを、洗浄を介して除去する35。この工程後に、反応混合物は、アプタマー候補が結合した捕捉被分析物を含む。特異的なエピトープを認識するリガンド、例えば抗体を、反応混合物と接触させる37。リガンドは、エピトープについての競合を介して、リガンドと同じエピトープに結合したアプタマー候補を解離する38。解離されたアプタマー候補を、収集および増幅する39。リガンドと同じエピトープに結合するものによりアプタマー候補をさらに富化するために、工程32〜39を、設定された回数のn回、例えば、1〜20回繰り返す。繰り返されたサイクル後に、残ったアプタマーを、配列決定、および本明細書に記載されているような他の特徴決定310により評価する。
対照スクリーニングを、上記の方法と並行して行う。対照スクリーニングを介して特定されたいかなるアプタマーも、廃棄する。対照被分析物は、非限定的に、被分析物とインキュベーションされる露出した基体、被分析物を含まない露出した基体、および関心対象の標的に結合しない抗体などの、対照リガンドで行った方法を含む。
実施例17：アプタマー選択プロトコル
本実施例は、タンパク質に結合する候補アプタマーを特定するために、タンパク質に対するアプタマーライブラリーをスクリーニングするプロトコルを提供する。プロトコルは、標的タンパク質を標的微小胞で置換することにより、微小胞に結合するアプタマー候補を特定するために使用することができる。微小胞に相当するためのプロトコル中の調整を、適切な場合に述べる。
実験設計：
1．精製されたタンパク質をDynabeads上に結合させる。
2．望ましいラウンド数についてポジティブ選択（SELEX）。
3．選択ラウンド後のハイスループット配列決定（例えば、Ion Torrentを用いた次世代型）。
4．望ましいラウンド後の選択されたクローンのクローニングおよび検証。
詳細なアプタマー親和性選択プロトコルは、以下である。
試薬：
1．Dynabeads（登録商標）M-270 Carboxylic Acid（「ビーズ」）（Life Tech, 14305D）
2．水、分子生物学試薬グレード（Sigma, W4502）
3．スルホ-NHS（Fisher Scientific, PI-24510）
4．EDC（Fisher Scientific, PI-77149）
5．MESカップリング緩衝液：0.05 M MES, pH 5.0（pHは標的タンパク質の等電点pIに依存し得る）
a．MES（2[N-モルホリノ]エタンスルホン酸）（Sigma, M2933）
b．5N NaOH（1N NaOHに希釈）（Fisher, SS256-500）
6．ビーズ結合洗浄緩衝液および保存緩衝液：0.01％ PBS-Tween 20
a．PBS, pH 7.5（Sigma, P3813）
b．TWEEN（登録商標）20（Sigma, 9416）
7．標的タンパク質
a．例えば、Hisタグ-Epcam、C-ter Epcam、Hisタグ-PSMA、タグなし-FYN、タグなし-AMACR、タグなし-DBF4B
8．ELISA洗浄緩衝液：0.05％ PBS-Triton
9．1％ PBS-Bにおいて希釈した一次抗体
10．1％ PBS-Bにおいて希釈した二次抗体
11．アプタマーライブラリー、10n、20n、25n、30n、35n、40nリバースライブラリー（λ消化および精製されたもの）。nがランダムに選択されたヌクレオチドを意味する、表21を参照されたい。
（表２１）アプタマーライブラリーおよびPCRプライマー
Figure 0006404822
12．4％高分解能E-Gel
13．ブロッキングおよびアプタマー希釈緩衝液（PBS（Hyclone）中の0.5％ F127 0.5％ PEG4000）
14．洗浄緩衝液（PBS＋1％ BSA）
15．Phusion PCR試薬（New England Biolabs, Inc (NEB), Ipswich, MA）
16．アプタマーPCR-F-5Phos／アプタマー-R-bio
17．非結合性白色96ウェルプレート（消耗品を参照されたい）
18．Nanodrop
19．λエキソヌクレアーゼキット（NEB, 5単位／μl）
20．サンガー配列決定試薬
21．M13フォワード（-20）プライマー：
Figure 0006404822
22．M13リバース（-27）プライマー：
Figure 0006404822
23．PEG4000、PEG8000
消耗品：
1．USA Scientificコポリマーポリプロピレン1.5 ml微量遠心分離機チューブ（USA Scientific, 1415-2500）
2．Vi-cellバイアル（Beckman Coulter, 723908）
3．96ウェル非結合性平底白色プレート（Corning（登録商標）Costar（登録商標）#3600）
4．96ウェル非結合性丸底白色プレート（Corning（登録商標）Costar（登録商標）#3605）
5．96ウェル媒体結合性平底透明プレート（Corning（登録商標）Costar（登録商標）#9017）
装置：
1．磁石：DynaMag（商標）-Spin Magnet（「磁石」）（Life Tech, 12320D）
2．Vi-Cell XR−細胞生存率解析装置
3．Veriti
4．Nanodrop
5．遠心分離機（Eppendorf, 5415）
6．プレート磁石：Magnetic Plate Separator（「プレート磁石」）（Luminex, CN-0269-01）
7．MixMate
8．BioTek Synergy 2プレートリーダー
手順：
工程1：標的タンパク質の結合
目的：占有されていない活性化部位をブロッキングするため、および選択中の非特異的なアプタマー結合を回避するために、磁気ビーズに標的タンパク質およびMA-PEGを同時に結合させること。
1．ビーズのストックを、ボルテックスにより2分間再懸濁する。
2．所望の容積のビーズをコポリマーチューブ中にピペットで移し、25 mM MES, pH 5（水で1：1に希釈したカップリング緩衝液）で100 ulにする。
3．チューブを磁石上に2分間置くことにより、移したビーズを沈殿させ、上清を除去する。
4．100 ulの25 mM MES（カップリング緩衝液）を添加し、800 rpmで10分間振盪する。
5．磁石上に1分間置き、上清を除去する。
6．全部で2〜10分間、MESでの洗浄を繰り返す。
7．使用直前に、スルホ-NHSを、50 mg/mlの終濃度を達成すように冷たい25 mM MESで希釈する（水のulでの容積を達成するためには、mg×20の掛け算をする）。
8．使用直前に、EDCを、バイアルあたり200 ulを添加することにより50 mg/mlの終濃度に冷たい25 mM MESで希釈する。
9．200 ulの50 mg/mlスルホ-NHSおよび200 ulの50 mg/ml EDCをビーズに添加し、RTで少なくとも30分間、または4℃で2時間、ボルテックス（800 rpm）により穏やかに混合する。
10．磁石上への1分間の配置により活性化ビーズを沈殿させ、上清を除去する。
11．ビーズを400 ulの25 mM MESカップリング緩衝液に再懸濁し、ボルテックス（800 rpm）により穏やかに混合する。
12．磁石上への1分間の配置によりビーズを沈殿させ、上清を除去する。
13．25 mM MESカップリング緩衝液での全部で2回の洗浄のために、工程11および工程12を繰り返す。
14．活性化されかつ洗浄された標的タンパク質を再懸濁し、ボルテックスにより穏やかに混合する。
15．少なくとも30分間、（回転により）混合しながら室温でインキュベーションする。
16．磁石上への1分間の配置により、カップリングされたビーズを沈殿させ、上清を除去する。
17．ビーズを4回、0.01％ PBS-Tween 20で洗浄する。
18．上清を沈殿させ、カップリングされかつ洗浄されたビーズを200 ulの保存緩衝液に再懸濁して、500Kビーズ／チューブのアリコートにおいて-80Cで保存する。
19．Vi-Cellカウンターを用いてビーズ懸濁液を計数する。
a．Vi-Cellバイアルにおいて14 ulのビーズを1386 ulの保存緩衝液に添加することにより、ビーズ：保存緩衝液の1：100希釈液を調製する。
b．希釈したビーズを、上下に数回ピペット操作することにより、十分に混合する。
c．700 ulの希釈したビーズを新たなVi-Cellバイアルに移す。
d．全細胞について二連のバイアルを読み取る。
e．全細胞数に工程19aにおける希釈係数（すなわち、100）を掛けることにより、ビーズ／ulの濃度を決定する。
f．濃度に工程18における再懸濁容積（すなわち、200 ul）を掛けることにより、結合後のビーズの全収量を決定する。
工程2a：ELISAによるビーズ結合の評価
1．200 ulの1％ PBS-Bを、Costarの平底非結合性プレートのウェルに添加する。
2．50,000個の結合させたビーズを添加し、プレートを密封し、1時間室温（RT）で、800 rpmで振盪しながらインキュベーションする。
3．プレート磁石上に30秒間、800 rpmで振盪しながら置く。上清を除去する。
4．プレートをプレート磁石から取り外す。
5．200 ulの0.05％ PBS-Tritonで3回、各々3分、800 rpmで振盪しながら洗浄する。
6．プレート磁石上に30秒間、800 rpmで振盪しながら置く。上清を除去する。
7．100 ulの1％ PBS-Bにおいて希釈した一次抗体（AB）を、適切なウェルに添加する。
8．プレートを十分に密封し、1時間37Cで、800 rpmで振盪しながらインキュベーションする（Jitterbug上。1時間のインキュベーション後、Jitterbugを元の速度に変更する）。
9．プレートをスピンして、凝縮体を収集する。
10．プレート磁石上に3分間置き、一次ABおよび緩衝液を除去する。
11．プレートをプレート磁石から取り外す。
12．200 ulの0.05％ PBS-Tritonで3回、各々3分、800 rpmで振盪しながらRTで洗浄する。
13．プレート磁石上に30秒間、800 rpmで振盪しながら置く。上清を除去する。
14．100 ulの1％ PBS-Bにおいて希釈した二次ABを、適切なウェルに添加する。
15．プレートを十分に密封し、1時間までの時間、RTで、800 rpmで振盪しながらインキュベーションする。注意：光から保護する。
16．プレート磁石上に3分間置き、二次ABおよび緩衝液を除去する。
17．プレートをプレート磁石から取り外す。
18．200 ulの0.05％ PBS-Tritonで3回、各々3分、800 rpmで振盪しながらRTで洗浄する。
19．プレート磁石上に30秒間、800 rpmで振盪しながら置く。上清を除去する。
20．100 ulの基質（TMB）を添加し、ピペットで混合し、密封し、30分までの時間、800 rpmで振盪しながらRTでインキュベーションする。注意：光から保護する。
21．100 ulの停止溶液（2N硫酸）を添加し、密封し、1分、800 rpmで振盪しながらRTでインキュベーションする。
22．プレートをプレート磁石上に3分間置き、その後、上清を新たな透明プレートである媒体結合性プレートに移し、マイクロプレートリーダーを用いて450-630 nmで読み取る。
工程3：ビーズベースのアプタマースクリーニングおよび選択
目的：親和性の成熟。
合成リバースアプタマーライブラリーを直接使用する（投入量は、必要な場合1013〜1015であろう）。
1．ビーズを、0.5％ F127／PEG4000 PBS（MgCl2なし）緩衝液において希釈して100,000ビーズ/50 ulにし（第1のラウンドについては100,000ビーズを使用し、その後よりストリンジェントについては望ましい量のビーズのようなより低い量を使用する）、800 rpmで1時間ボルテックスする。
2．100,000ビーズを有する50 ulを、非結合性平底白色プレート上の各ウェル中に分注する。
3．別々のコポリマーチューブ（USA Scientific）において、アプタマーライブラリーを、ウェルあたり50 ulの全容積において妥当な数のアプタマーコピーを達成するように、適切な2mM MgCl2を含む0.5％ F127／PEG4000 PBSにおいて希釈する（投入アプタマー量は、ビーズフォーマットについて1014までであり得る）。
4．50 ulの希釈したアプタマーライブラリーを、結合プレートの各々の50 ulビーズ＋緩衝液試料に添加し、RTで、800 rpmでボルテックスしながら30分間インキュベーションする。
5．ビーズを有するプレートを、プレート磁石上に2分間、800 rpmで振盪しながら置く（ビーズは、ウェルの中心に濃縮するであろう）。
6．緩衝液を完全に除去し；プレートをプレート磁石上に放置し、ビーズを乱すことなく角に液体を収集するようにプレートを傾ける。
7．プレートをプレート磁石から取り外し、ビーズを200 ulの洗浄緩衝液で洗浄し（最初の3回の洗浄機のためには、アプタマーインキュベーション緩衝液を使用し、その後、全般的な洗浄緩衝液は、PBS-Bであり、後のラウンドにおいて必要とされるように塩濃度を500mM NaClまで増大させてもよい）、700 rpmで1分間ボルテックスする。
8．プレートをプレート磁石上に2分間、700 rpmで振盪しながら置く。洗浄を10回繰り返し、最初の3回についてはブロッキング緩衝液で洗浄当たり1分とし、その後、残りについてはPBS-B（または塩を増大させたPBS-B緩衝液）を使用する。
9．最後の洗浄後に、プレートをプレート磁石上に3分間、700 rpmで振盪しながら置き、その後、緩衝液を完全に除去する。
10．ビーズを52 ulのDNアーゼフリーの水で再懸濁し、ピペット操作により十分に混合する。
11．再懸濁されたビーズを新たな1.5mlチューブに移す（第1のラウンドのためは、PCR反応においてすべてを使用する）。
12．PCR反応を調製する。各試料について4（第1のラウンドのためには5）反応を使用する。10ulの再懸濁されたビーズを1回のPCR反応において使用し、1試料について全部で4反応使用する（クローニングのために10 ul取っておく）。
13．アプタマー回収PCR増幅：すべてのライブラリーについて、PCRを、Phusionポリメラーゼで：PEG8000添加物を伴い、98'Cで30秒、98'C 10秒、60'C 30秒、および68'C 1分のサイクルで行うことができる。10n〜30nのアプタマーライブラリーについては、30PCRサイクルと同程度を使用する。35nおよび40nのライブラリーについては、25サイクルより下を使用する。
14．PCR増幅後に、10 ulのλエキソヌクレアーゼをPCR反応に直接添加し、ボルテックスして、37℃で2時間インキュベーションし、80'Cまでの10分間の加熱により終了させ、その後冷やして4'Cに戻す。消化の終了前に、2 ulを4％高分解能E-Gel上で泳動する。まだdsDNAのバンドが存在する場合は、消化を継続し、ssDNAのバンドのみが見える場合は、消化を終了する。
15．λ消化された産物のZymo ssDNA精製。
16．次のラウンド用に定量化して推定2e12コピーに調整するためのNanodrop（Zymo精製された場合のみ）。（Nanodropの読み取りが低い場合は、ssDNAの濃度を算出するためにqPCRが必要である。）
17．望ましいラウンド数の選択を繰り返す。
工程4：クローニングおよびssDNAの生成およびクローンプラスミドの増幅
目的：個々のアプタマーコロニーを分離して、精製されたプラスミドを取得すること。
1．5'修飾または3'修飾を有さないフォワードおよびリバースのアプタマーライブラリープライマーで、PhusionクローニングPCR反応を調製する。
2．回収アプタマー（上記のビーズ上）から、5ulの再懸濁されたビーズをPCR反応中に添加する。
3．PCRサイクルは、すべてのライブラリーについて、25サイクルより少なくすべきである。
4．5ulのE-gel緩衝液を直接PCR反応中に添加し、混合して、試料を4％ E-gelに2ウェル、20ul/ウェルでローディングする。黄色の色素がゲルの末端に近くなるまで泳動する。
5．画像装置上でゲルの画像を撮影する。
6．ゲル自体を壊さないように、E-gel openerでゲルを開く。ゲルを、画像機械の内側のUVボックスの上部に置く。
7．バンドの推定される縁に基づいてゲルを垂直にスライスし、UV光をつけて可能な限り速く、DNAバンドを素早く切り（365nm UVを用いる）、DNAバンドを有するゲルを1.5mlチューブに入れる。
8．ゲルサイズを推定し、（およそ100ul〜200ul）、Zymo Gel抽出キットを指示書に従って用いることにより、DNAをゲルから精製する。
9． DNAを、10ul DNアーゼ／RNアーゼフリーの水で最終的に溶出する。
10．Invitrogen由来のTOPO平滑末端クローニングキットに従って：2 ulのアプタマーPCR溶出産物、1 ulの塩溶液、および1 ulのベクター、および2 ulの水を混合する。ピペット操作により混合する。RTで15〜30分間インキュベーションする。
1．SOC培地およびTOP10化学コンピテント細胞を氷上で融解し；上記のTOPOライゲーション溶液を直接細胞に添加し、ピペット操作により混合する。氷上で30分間インキュベーションする。
2．チューブを42'Cの水浴に正確に30秒間入れ、その後直ちに、氷上で2、3分間冷却する。
3．250ulのSOC培地をチューブ中に添加し；チューブを200rpmで、37'Cで1時間水平に振盪する。
4．125ulの培養物を、100ug/mlアンピシリンを含むあらかじめ温めたLB寒天プレート上に移す。37'Cで一晩インキュベーションする。
5．十分なLB液体培地を作製し、100ug/ulアンピシリンストックを添加して、100ug/ml LB培地を作製する。培養チューブに、1ml／チューブで移す。
6．滅菌した20ulチップを用いて、個々のコロニーをそれぞれの培養チューブ中に選ぶ。300rpmで一晩、37'Cで振盪する。
7．Pure-Linkプラスミドミニプレプロトコルに従って、700ulの細菌培養物でプラスミド抽出。75ul TEへ最終的な溶出（プラスミド抽出は、Promega プラスミドミニプレバキュームキットまたはGenescript遠心分離プレートキットを使用することもできるが、任意の微量の化学物質を除去するためには10分間の最終的な最高速度のスピンを含むべきである）。
8．2ulを1％ Egelにおいて使用し、記録のために画像を撮影する。
9．Nanodropを用いてプラスミドプレップの濃度を推定する。すべてのプラスミド調製物を、算出シートに従って（およそ5e8 cp/ul）水において2.5ng/ulに調整する。
工程5：最初のスクリーニング試験のためのクローンssDNAのミニプレ
目的：限定された量の単一クローンssDNAを調製し、スクリーニング試験の準備をすること。
1．アプタマー生成（リバース鎖）のために、リン酸化されたフォワードのおよびビオチン化されたリバースのアプタマーライブラリープライマーで、PCR反応を設定する。40ul PCR反応容積において10ulの上記の2.5ng/ulプラスミド溶液を使用する。30サイクルのPCR。
2．PCR後に、10ulのλエキソヌクレアーゼをPCR反応に直接添加し、ボルテックスしてスピンダウンし、37'Cで2時間、続いて80'Cで10分間インキュベーションして、その後4'Cに冷却する。消化が完全であるかどうかを確認するために、2ulを4％ E-gel上の泳動に用いる。消化が完全であるとひとたび確認されたら、消化を停止し、精製に進む。
3．zymo ssDNA精製キットの指示書に従って、ssDNAを精製する（ハイスループットの目的には、プレートフォーマットにおけるZymo Oligo精製キットを用い、マニュアルにおける2000の代わりに大きい遠心分離機において10分間、すべての工程についてスピン速度すべてを5000に、および最終的な乾燥スピンについては最大に変更することができる）。両方の場合において、ssDNAを30ulのDNアーゼ／RNアーゼフリーの水で溶出する。
4．Nanodropを用いて、ssDNAの濃度を推定する。
工程6：クローンスクリーニング試験
目的：標的および対照タンパク質に対する個々のアプタマークローン（ssDNA）の親和性（基準に基づいて陽性または陰性）を試験すること。
1．最初のスクリーニング試験のワークシートに従って、試験の前日に、標的タンパク質および対照タンパク質を、望ましい濃度で、100ul／ウェルで、高結合性ELISAプレート上にRTで3〜5時間、コーティングする。
2．プレートを250ulの0.5％ F127／PEG4000（MgCl2を含まない）PBSで一晩、4'Cでブロッキングする。
3．Nanodropデータに従って、約10e11〜10e12／ウェルのssDNAレベルに達することができる容積を、すべての試料について選択する。
4．ssDNAを、0.5％ F127／PEG4000 PBS＋終濃度2mMのMgCl2において希釈する。
5．ブロッキング溶液をプレートから除去し；PBSで各洗浄について1分、2回洗浄する。ペーパータオル上で軽くたたいて、微量の液体を除去する。
6．100ulのssDNA希釈液（10e11〜10e13／ウェル。100ul）を添加し、RTで、800rpmで振盪しながら、4時間インキュベーションする。
7．プレートを、PBS＋1％ BSAで3回、1分／洗浄、400〜800rpmの振盪で洗浄する。各洗浄後に、液体を除去し、ペーパータオル上で軽くたたく。
8．ストレプトアビジン-ポリHRPを、1：1000でPBS＋1％ BSA緩衝液において希釈し、各ウェル中に100ulを添加する。RTで1時間、振盪しながらインキュベーションする。
9．プレートを3回、PBS-1％ BSAで洗浄し、1分／洗浄の各洗浄後に、ペーパータオル上で軽くたたいて、微量の液体を除去する。
10．Ultra ELISA基質をあらかじめ温めてRTにし、100ulの基質を各ウェル中に添加して、暗所で振盪しながら30分間インキュベーションする。
11．100ulの2N H2SO4を添加することにより反応を停止し、マイクロプレートリーダーによってOD450-630を読み取る。
12．規定された判定基準に従って、（例えば、この標準化されたプロトコルにおけるある特定のレベルより上のODまたは対照タンパク質より上のOD）、どのクローンが陽性または陰性であるかの判断を行う。
工程7：さらなる定量的評定のための候補クローン由来のアプタマーssDNAの中規模の生成
目的：標的に対する親和性のさらなる確認のために、アプタマー候補クローンからより多い量のssDNAを調製すること。
1．アプタマー生成（リバース鎖）のために、リン酸化されたフォワードのおよびビオチン化されたリバースのアプタマーライブラリープライマーで、PCR反応を設定する。40ul PCR反応容積において5ulの上記の2.5ng/ulプラスミド溶液を、試料当たり12反応使用する。PCR増幅を30サイクル行う。
2．PCR増幅後に、10ulのλエキソヌクレアーゼをPCR反応に直接添加し、ボルテックスしてスピンダウンし、37℃で一晩、2時間インキュベーションする。上述のように、2ulの反応物を用いて4％ Egel上で泳動し、消化を確認する。
3．zymo ssDNA精製キットの指示書に従って、ssDNAを精製する（1個のzymo精製カラムを通して4反応）。注意：この工程は、ssDNA精製キットを使用し、上記で使用されたプレートオリゴ精製キットは使用しない。
4．同じ試料由来の異なる溶出を組み合わせ、Nanodropを用いてssDNAの濃度を定量する。
5．精製されたアプタマーを-80℃で保存する。
工程8：個々のアプタマークローンの検証アッセイ
目的：選択されたクローンを定量的様式においてさらに評定すること。
1．さらなる評定試験のために、標的およびアプタマーの両方を、互いに対して滴定する。非特異的結合を評定するために、少なくとも1種の非標的タンパク質を（1種のコーティング濃度で）、アプタマーに対して滴定する。
2．ELISAプレートのウェルを、PBSにおける3種の異なる濃度の標的タンパク質（例えば、1ug、0.5ug、および0.25ug/ml、100ul/ウェルで）ならびに非標的タンパク質（一般的に0.5ug/mlおよび100ul/ウェル）で3〜5時間コーティングする。プレートを一晩、PBS中の0.5％ F127／0.5％ PEG4000（MgCl2を含まない）でブロッキングする。
3．アプタマーを、少なくとも4桁にわたって（例えば、回収に応じて10e13〜10e10／ウェルまたは10e12〜10e9／ウェル）、0.5％ F127／PEG4000を含むPBSにおいて希釈する。100ulのアプタマー希釈液を、それぞれのウェルに添加する。プレートをRTで、800rpmで4時間インキュベーションする。注意：アプタマー結合を評価するために精製されたタンパク質の代わりに微小胞を用いる場合は、800 rpm の代わりに300 rpmでインキュベーションする。
4．プレートを250ulのPBS-1％ BSAで洗浄し、各洗浄後に、ペーパータオル上で軽くたたいて、微量の液体を除去する。
5．ストレプトアビジン-ポリHRPを、1：1000でPBS-1％ BSAにおいて希釈し、100ulの溶液を各ウェルに添加し、RTで、800rpmで1時間インキュベーションする。注意：アプタマー結合を評価するために精製されたタンパク質の代わりに微小胞を用いる場合は、800 rpmの代わりに300 rpmでインキュベーションする。
6．プレートを3回、PBS-1％ BSAで洗浄し、ペーパータオル上で軽くたたいて、微量の液体を除去する。
7．100ulのUltraSubstrate（使用前に少なくとも2時間、あらかじめ温めてRTにする）を各ウェルに添加し、上部をホイルで覆う。300〜400 rpm で30分間、RTで振盪する。100ulの2N H2SO4を添加して、反応を停止する。
8．OD450-630を読み取る。
工程9：サンガー配列決定
目的：選択されたクローンから配列情報を取得すること。
1．配列決定プライマー：M13フォワード（-20）およびM13リバース（-27）。
2．サンガー配列決定プロトコルに従って、配列決定マスターミックスを作製し、8ul／ウェルに分注する。
3．選択されたクローン由来のミニプレプラスミドを、配列決定のために直接使用することになる（プラスミド濃度は、少なくとも10ng/ulであるべきである）。
4．2ulのプラスミドミニプレ試料を、それぞれのウェルに添加する。BDT標準反応としてのサイクル。
5．確立されたプロトコルに従って、試料をCleanseqで処理する。
6．サンガー配列決定のランを行う。
7．FinchTVソフトウェア上で、所望の配列決定ファイルを開く（最初にF、Fファイルが読み取り可能ではないか、または品質が不十分である場合は、Rファイルを使用する）。
8．検索バーにおいて、EcoRI（GAATTC）を入力し、検索をクリックする。
9．アプタマーPCR産物のベクター中へのクローニングが成功している場合、EcoRI部位は、アプタマープライマー配列決定の開始の前の6塩基である。配列ディスプレイのリバースをクリックして、EcoRI部位の最後の塩基（C）から、ベクター由来の次の6塩基はGCCCTTであるはずであり、その後の配列は、アプタマーフォワードパターン（ATCCAGA...）またはリバース鎖鋳型（ACTAA...）のいずれかにマッチするはずである。
10．アプタマーのクローニング方向はランダムであるため、従って、アプタマー配列の開始は、フォワード（ATCCAGA...GCAGCAとして開始）またはリバース（ACTAA...GTCCAで開始）である可能性がある。配列を確認した際に、アプタマーの方向を特定する（フォワード方向またはリバース）。
11．コールが正確であることを検証するために、配列決定グラム上の一塩基ずつを読み取る。
12．配列を、フォワードおよびリバースの両方の方向で記録する。
実施例18：アプタマーライブラリー選択プロトコル
本実施例は、上記の実施例において行われたSUL1 RNAライブラリー選択についてのプロトコルを提供する。プロトコルは、望ましいように、他のアプタマーライブラリーおよび試料投入に採り入れられ得る。
準備
作業空間を、作業前に80％ EtOHで清浄にする。
ビーズは、MagPlexビーズ（Luminex Corp., Austin, TX）である。望ましいように、他のビーズが代替になり得る。
準備する緩衝液／試薬：
・MilliQ水
・100mM MgCl2
・5×転写緩衝液（200mMトリス pH 7.9）
・1×PBS
・3mM MgCl2を含む1×PBS
・10×PBS
・選択緩衝液（0.1％ BSAおよび3mM MgCl2を含む1×PBS）
選択を開始する前に、ビーズ保存緩衝液を除去し、3mM MgCl2を含む1×PBSでビーズを1回洗浄する（4チューブすべてにおいて全部で200uL）。選択あたり200,000ビーズを使用する。
微小胞コーティング磁気ビーズへの2'F SUL1 RNAプールの結合
略語：TK−転写；NTC−鋳型なし対照。
工程：
1．第1ラウンド：1nmolの精製された2'F SUL1 RNAを、20μlの再懸濁されたビーズ（微小胞と結合させたもの）と混合する。10uLの10×PBS＋1％ BSA、3μl 100 mM MgCl2、および47uL H20。これにより、1×PBS、0.1％ BSA、3mM MgCl2の終濃度になる。
1.1 この工程におけるMgCl2の添加により、3mM MgCl2の濃度になる。これは、プロセス全体のための結合濃度である。
1.2 その後のラウンド：20μlの転写産物（内部に15 mM MgCl2）を、20μlの洗浄された微小胞コーティングビーズ、加えて9uLの1％ BSAを含む10×PBS、51uL H2Oと混合する。希釈された転写産物（TK）中のMgCl2が3mM MgCl2の終濃度を提供するため、追加のMgCl2は必要とされない。
2．30分間37℃でインキュベーションし、1000rpmで振盪し、10分毎にピペットで混合する。
3．ビーズを洗浄する：
3.1 1回の洗浄サイクルは以下を含む：
3.1.1 ビーズを磁石から取り外す。
3.1.2 ビーズを磁石から外して、100μlの1×PBS＋3mM MgCl2に再懸濁する。
3.1.3 試料を磁石から外して、30秒間インキュベーションする。
3.1.4 試料を磁石上に戻して置き、ビーズが側面に寄るまで待つ。
3.1.5 上清を除去して廃棄する。
3.1.6 磁石から外して、100μlの1×PBS＋3mM MgCl2＋0.1％ BSAに再懸濁する。
3.1.7 試料を磁石から外して、3分間インキュベーションする。
3.1.8 試料を磁石上に戻して置き、ビーズが側面に寄るまで待つ。
3.1.9 上清を除去して廃棄する。
3.2 第1ラウンド：ビーズ混合物を磁石上に置き、上清を除去する。100μlの1×PBS＋3mM MgCl2＋0.1％ BSAで1回洗浄し（ビーズをピペットで混合することにより）、緩衝液を廃棄する。
3.3 その後のラウンド：洗浄工程を、1ラウンドおきに、1回多い洗浄工程により3回の洗浄工程まで増大させる。
4．55μlのMilliQ水をビーズ試料に添加する。
5．ビーズ試料を5分間80℃でインキュベーションすることにより、RNAを溶出する。
5.1 50μlあるかどうかを確認し、ない場合は、凝縮された水を上部から離してスピンダウンするために、試料をスピンする。
5.2 上清を新たなバイアルに移す。鎖がビーズに再結合することを回避するために素早く作業する。
5.2.1 その後のRT-PCRに50μlの溶出液を使用し、残りを-20℃で保存する。
回収されたアプタマー候補のRT-PCR
実施の手引き
・RT-PCR試料およびTK-PCR試料の残りは、-20℃で保存する。
・RNAは、4℃で約1時間保存することができる。
・RT-PCR産物は、一晩4℃で保存することができる。
・最適なRNA品質のために、転写後直ちに次の選択サイクルに進む。
・RNAをボルテックスすることは回避する。
・氷上で混合する。
・0.5ml PCRチューブを使用する。
・すべてのRT-PCRは、鋳型の代わりに水を含む鋳型なし対照（NTC）を有する。
・DTTを、1回より多くは凍結融解しない。
6．第1ラウンドの前にマスターミックス（表21を参照されたい）を調製し、それを0.5 pmol RNAで確認し、48μlのアリコートを使用まで-20℃で保存する。
（表２１）RT-PCRマスターミックス
Figure 0006404822
7．陰性対照（NTC）としての50μl MilliQ水（これを最初にピペット操作する）または50μl選択溶出液を添加する。ピペットで混合する。
8．65℃で5分間、インキュベーションする。
9．4℃に冷却した後に、以下を添加する：
9.1 1μl Superscript II Reverse Transcriptase（Invitrogen、カタログ番号18064）（200 U／μl）
9.2 1μl GoTaqFlexi DNA polymerase（5単位／μl）Promegaカタログ番号M8305。
PCR-プログラム（SARTPCR）
a）10分、54℃
（この工程は、逆転写酵素のためだけであり、より多くのラウンドが必要とされる場合、工程Aは繰り返さない。）
b）1分、95℃
c）1分、60℃
d）1分、72℃
10．工程b〜dのサイクルを行う。
10.1 第1ラウンドはb〜dを4サイクル。5μLのPCR産物を4％アガロースゲル上で泳動する。
10.1.1 その後のラウンド：RNAの量は第1ラウンド後に減少し、必要とされるPCRサイクルの増大をもたらす。各々の時に必要とされるサイクルの回数を決定するために、前のラウンドの選択から、アガロースゲル由来のバンドの強度を確認する。その回数のサイクルを用いて、次のラウンドのRT-PCRを開始する。注意：常にアガロースゲル上の結果を確認する。
10.1.1.1 アガロースゲルの結果：産物のバンドが、標的の長さで見られるであろう。バンドの強度は、50bpラダーのバンドとほぼ同じであろう（同じでない場合は、少し強度が低い）。バンドが十分な強度ではない（かろうじて見える）場合は、適切な量より多くサイクルを行い、アガロースゲル上で再確認する。
転写
すべての混合を氷上で行う。転写マスターミックス（表22）を調製し、85.7μlのアリコートを使用まで-20℃で保存する。
11．使用前に、ストックの200 mMトリス pH 7.9のpHを検証する。経時的なpHの変化は、転写で問題を引き起こす可能性がある。
（表２２）SUL1ライブラリーのための転写（TK）マスターミックス
Figure 0006404822
12．10μlのRT-PCR産物を、マスターミックスに添加する。
13．1μlのRNasin（40単位／μl）を添加する。
13.1 Promega Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor カタログ番号N2515/N2511
14．4μlのT7 Y639F変異ポリメラーゼを添加する（25U／μl使用：反応当たり全部で100U）。
15．反応を30分間、37℃で行う。
16．転写産物を、次の選択ラウンドに直接使用する。次の工程が実行可能ではない場合は、転写産物を-20Cで凍結する。
その後のラウンド
ビーズのインキュベーション、RT-PCRおよび転写を、必要に応じてしばしば繰り返す。上述したように、すべてのラウンドにおいて試料について類似したバンド強度のRT-PCR産物を有するように努める。
結合アッセイ
癌で選択されたアプタマーの対照ビーズ（血漿超遠心分離由来の上清に結合させたもの、上記を参照されたい）への非特異的な結合を決定して評価するために、望ましいラウンドの選択後に結合アッセイを行い、同様に非癌対照試料についても行う。結合アッセイはまた、選択されたアプタマーの意図される標的微小胞に対する結合を評価するために行うこともできる。
チェレンコフプロトコル：32Pで放射性標識されたアプタマーライブラリーを用いて行う。
選択緩衝液の終濃度：1×PBS＋3mM MgCl2＋0.01％ BSA pH7.4
洗浄緩衝液：1×PBS＋3mM MgCl2 pH7.4
1．-80℃冷凍庫から微小胞試料を取り出して、融解する。
2．ビーズを磁石上に置き（試料実験当たり200,000個）、ビーズ保存緩衝液を除去する。
3．1×PBS、3mM MgCl2緩衝液で各々1分間、1×200μLで洗浄する。1チューブ中に200,000個になるようにビーズをプールする。
4．ビーズを70μLの選択緩衝液に再懸濁する。（試料当たり10μlの10×PBS、1％ BSA＋3μL 100mM MgCl2＋57μL H2O）。
5．30μLの放射性標識されたRNAアプタマーライブラリーを、それぞれの試料に添加する。
6．1000 rpmで振盪しながら、37℃で30分間インキュベーションする。
7．試料を磁石上に置く。
8．上清を除去して取っておく。
9．ビーズを、200μLの洗浄緩衝液1×PBS 3mM MgCl2 pH 7.4で、磁石から外して3分間インキュベーションし、洗浄する。
10．試料を磁石上に置き、洗浄溶液を除去して取っておく。
11．工程9、10を繰り返す。
12．100μLの水を試料に添加し、ピペットで混合する。
13．80℃で5分間、加熱する。
14．試料を磁石上に置き、上清を除去して取っておく。
15．ビーズを、100μLの水に再懸濁する。
16．シンチレーションカウンターを用いて、すべての画分の放射活性を測定する。
17．存在するバックグラウンド結合の量を解析する。
ネガティブ選択
望ましいように、ネガティブ選択工程を、アプタマーライブラリーを標的微小胞に結合させたビーズとインキュベーションする前に追加する（すなわち、上記の「微小胞コーティング磁気ビーズへの2'F SUL1 RNAプールの結合」の手順）。ネガティブ選択は、微小胞を試料から濾過または沈降させた後の上清または投入試料（例えば、血漿）に結合させたビーズ（「非微小胞コーティングビーズ」、「微小胞枯渇試料」、または類似して呼ばれる）を用いて行うことができる。工程は、以下である。
1）上述のような転写後の望ましいラウンド由来のアプタマーライブラリー産物で開始する。開始前にビーズを洗浄する：保存緩衝液を除去し、ビーズを200μLの洗浄緩衝液で洗浄し、その後、下記に述べるような緩衝液に置換する。
2）ネガティブ選択工程：20μlの新たに洗浄された非微小胞コーティングビーズを伴う転写産物（15 mM MgCl2）と、10μLの1％ BSAを含む10×PBS、70μL H2Oとを添加し、ピペットで混合する。希釈された転写産物（TK）中のMgCl2が3mM MgCl2の終濃度を提供するため、追加のMgCl2は必要とされない。
3）30分間37℃でインキュベーションし、1000rpmで振盪する。
4）上清を除去して、それを、洗浄された微小胞コーティングビーズであるポジティブ選択ビーズに（直接）添加する。
ポジティブ選択インキュベーションを継続する。工程2で開始する、上記の微小胞コーティング磁気ビーズへの2'F SUL1 RNAプールの結合を参照されたい。転写を通した追加的な工程は、上記で詳細に述べたようである。
実施例19：乳癌（BrCa）由来の微小胞に対するアプタマー
本実施例においては、アプタマーライブラリーを、乳癌患者の血液中に循環している微小胞と、健康な対照個体（すなわち、乳癌を有していない）の血液中に循環している微小胞とを識別するアプタマーを特定するためにスクリーニングする。
微小胞を、60人の乳癌患者（BrCa＋）のプールの血漿から単離した。微小胞をまた、60人の非癌試料（BrCa−）のプールからも単離した。微小胞は、超遠心分離（120,000×g）を用いて血漿から単離した。微小胞は、超遠心分離由来の沈殿物中に存在していた。超遠心分離由来の上清を、対照として使用するために取っておいた。両方の試料タイプ由来の微小胞を、MagPlexビーズ（Luminex Corp, Austin TX）に結合させた。任意で、単離された微小胞を、抗HSA／IgG／フィブリノゲンビーズと、これらの非常に高存在量の血液タンパク質を除去するためにインキュベーションした。しかしながら、結合工程を、非常に高存在量のタンパク質の除去が厳密には必要ではないような微小胞の結合に好都合であるように、最適化することができる。
使用されたアプタマーライブラリーは、2'F SUL1 RNAアプタマーライブラリーからなった。配列は、
Figure 0006404822
である。アプタマーライブラリーは、3個のセクションからなる：フォワードプライマー- 15ヌクレオチド、可変領域- 40ヌクレオチド；リバースプライマー- 25ヌクレオチド。すべてのピリミジン（CおよびU）は、2'フルオロ修飾されていた。
アプタマーライブラリーを、癌または対照の微小胞結合ビーズのいずれかとインキュベーションした。微小胞に結合するアプタマーについて13ラウンドのポジティブ選択を、両方のタイプの試料について並行して行った。ポジティブ選択工程の詳細のプロトコルについては、上記の実施例18を参照されたい。ネガティブ選択は、行わなかった。
上記のポジティブ選択から保持されたアプタマーを、Ion Torrent NGS（Life Technologies, Inc., Carlsbad, CA）からなる次世代配列決定技術を用いて配列決定した。MiSeqシステムがまた、使用されてもよい（Illumina, Inc., San Diego, CA）。配列を、癌試料において見出され、かつ対照試料において見出されない、およびその逆のアプタマーを特定するために比較する。そのようなアプタマーは、BrCa試料と非BrCa試料とを識別するために使用され得る候補を提供する。
これらの手順から得られた数々の代表的な配列を、表23に示す。表中の配列は、BrCa微小胞に対する選択由来のアプタマープールにおいて特定されたが、非癌試料に対して選択されたアプタマープールにおいては特定されなかった。表23においては、配列を、5'から3'を左から右へ示し、各々の完全な配列は、示された5'リーダー配列、それに続く示された可変配列、それに続く示された3'テール配列からなる。各配列は、間に可変配列を伴う、リーダーおよびテールを有するライブラリー（上述を参照されたい）に由来する。表23に開示されているヌクレオチド配列もまた、得られた修飾が開示配列に対して約50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、および99パーセントの相同性を有するアプタマーをもたらしかつ微小胞抗原またはその機能断片に対する結合機能を保持する程度まで改変され得ることが、理解される。
（表２３）BrCa微小胞アプタマー候補配列
Figure 0006404822
表23中の各配列を、さらなる研究のために2種のバリアント：5'ビオチン化および3'ビオチン化において合成する。これは、望ましいように5'末端または3'末端で捕捉することができるアプタマーバリアントを提供する。各ピリミジン（CおよびU）が2'フルオロ修飾されたアプタマーを、さらに合成する。
表23中の各RNA配列に対応するDNA配列を、配列表において提供し、そこでは、DNA配列がその対応するRNA配列のすぐ後に続いている。例えば、SEQ ID NO: 231019は、RNA配列SEQ ID NO: 231018に対応するDNA配列である、などである。アプタマーのDNA形態を、さらなる特徴決定のために同様に合成する。
上記のアプタマーを、ミクロスフェアに結合させたBrCa微小胞および非BrCa微小胞を認識するアプタマーについてのポジティブ選択を用いて特定した。
実施例20：乳癌（BrCa）由来の微小胞に対する追加的なアプタマー
本実施例においては、アプタマーライブラリーを、乳癌患者の血液中に循環している微小胞と、健康な対照個体（すなわち、乳癌を有していない）の血液中に循環している微小胞とを識別するアプタマーを特定するためにスクリーニングする。手順は、上記の実施例17〜19におけるものと同じ試料およびアプタマーライブラリーを使用する。ネガティブ選択を、第3ラウンドのポジティブ選択後に開始して、各ポジティブ選択の前に行う。
ネガティブ選択は、癌についての可溶性の／高存在量の／情報を与えない、かつ一般的なタンパク質、および非癌タンパク質に結合するアプタマーを除去するのに役立つ。ネガティブ選択は、以下のように、癌由来の微小胞に対して選択されたアプタマー候補についてネガティブ選択を行うことを含む：（i）癌由来の血漿の超遠心分離工程由来の上清（微小胞を含有しないはずである）に結合させたマイクロビーズを用いること；（ii）癌陰性の血漿の超遠心分離工程由来の上清（微小胞を含有しないはずである）に結合させたマイクロビーズを用いること；（iii）癌陰性の微小胞に結合させたマイクロビーズを用いること。ネガティブ選択はまた、以下のように、癌陰性微小胞に対して選択されたアプタマー候補について行うこともできる：（i）癌陽性の血漿の超遠心分離工程由来の上清（微小胞を含有しないはずである）に結合させたマイクロビーズを用いること；（ii）癌陰性の血漿の超遠心分離工程由来の上清（微小胞を含有しないはずである）に結合させたマイクロビーズを用いること；（iii）癌陽性の微小胞に結合させたマイクロビーズを用いること。ネガティブ選択のラウンドは、本明細書に記載されているようなポジティブ選択のラウンド間に行う。
微小胞を、超遠心分離（120,000×g）を用いて、60人の癌陽性患者のプールの血漿から、および60人の非癌試料のプールから単離する。微小胞は、超遠心分離由来の沈殿物中に見出される。超遠心分離由来の上清を、対照として使用するために取っておく。両方の試料タイプ由来の微小胞を、MagPlexビーズ（Luminex Corp, Austin TX）に結合させる。
使用されたアプタマーライブラリーは、2'F SUL1 RNAアプタマーライブラリーからなる。配列は、
Figure 0006404822
であり、配列中、N40は40個のランダムなヌクレオチドを意味する。アプタマーライブラリーは、3個のセクションからなる：フォワードプライマー- 15ヌクレオチド、可変領域- 40ヌクレオチド；リバースプライマー- 25ヌクレオチド。すべてのピリミジン（CおよびU）は、2'フルオロ修飾されていた。
アプタマーライブラリーを、癌または対照の微小胞結合ビーズのいずれかとインキュベーションする。微小胞に結合するアプタマーについて9ラウンドのポジティブ選択を、両方のタイプの試料について並行して行う。ネガティブ選択を、ラウンド4〜9においてポジティブ選択の前に、超遠心分離後の投入血漿上清に結合させたビーズに対して行う。ポジティブ選択工程およびネガティブ選択工程の詳細なプロトコルについては、上記の実施例を参照されたい。
上記のポジティブ選択から保持されているアプタマーを、Ion Torrent NGS（Life Technologies, Inc., Carlsbad, CA）からなる次世代配列決定技術を用いて配列決定する。MiSeqシステムなどの任意の適切なハイスループット配列決定プラットフォームを、この工程のために使用してもよい（Illumina, Inc., San Diego, CA）。配列を、癌試料において見出され、かつ対照試料において見出されない、およびその逆のアプタマーを特定するために比較する。そのようなアプタマーは、癌試料と非癌試料とを識別するために使用され得る候補を提供する。
配列決定データを、以下の手順に従って解析する。
工程1：配列を、微小胞を枯渇させた癌血漿に結合させたビーズに対するネガティブ選択、それに続く癌微小胞に結合させたビーズに対するポジティブ選択後にラウンド9において回収されたアプタマープール全体における頻度に従って、ランク付けする。
工程2：倍率変化を、工程1に述べられている試料と：（i）微小胞を枯渇させた癌血漿に対する追加的なネガティブ選択後の同じ試料；（ii）非癌微小胞に対する追加的なネガティブ選択後の同じ試料；（iii）微小胞を枯渇させた非癌血漿に対する追加的なネガティブ選択後の同じ試料との間で算出する。
工程3：乳癌由来の微小胞について選択されたアプタマープールにおいて高存在量であるかまたは欠損している配列を特定するために、配列を、工程2において算出された倍率変化に基づいてランク付けする。
工程4：可能性がある変異配列（例えば、PCRまたは他のエラーによる）を、圧密解析の結果に基づいて除去する。
工程5：すべての3種のバリアント（工程2におけるi、ii、およびiii）において、3より大きい倍率変化および最低頻度50を有する配列を特定する。
工程1〜5におけるものと同じ選択スキームを、非癌微小胞に結合させたビーズに対して選択されたアプタマーについて行う。
得られた配列を、さらなる研究のために2種のバリアント：5'ビオチン化および3'ビオチン化において合成する。これは、望ましいように5'末端または3'末端で捕捉することができるアプタマーバリアントを提供する。各ピリミジン（CおよびU）が2'フルオロ修飾されたアプタマーを、さらに合成する。アプタマーはまた、各RNA配列に対応するDNA配列として合成されてもよい。アプタマーライブラリーをまた、予測される二次配列、自由エネルギー、および本明細書に記載されているような他のパラメータに基づいて選別することもできる。特定された配列は、一般的に、対照と比較した際に癌陽性プールにおいて過剰に表されている。しかしながら、非癌プールにおいて過剰に表されている特定された配列もまた、観察されている。
これらの手順から得られた数々の代表的な配列を、表24に示す。表中の配列は、乳癌患者の血漿から得られた微小胞に対する選択由来のアプタマープールにおいて特定されたが、非癌血漿試料に対して選択されたアプタマープールにおいては特定されなかった。表24においては、配列を、5'から3'を左から右へ示し、各々の完全な配列は、示された5'リーダー配列、それに続く示された可変配列、それに続く示された3'テール配列からなる。各配列は、間に可変配列を伴う、リーダーおよびテールを有するライブラリー（上述を参照されたい）に由来する。表24に開示されているヌクレオチド配列もまた、得られた修飾が開示配列に対して約50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、および99パーセントの相同性を有するアプタマーをもたらしかつ微小胞抗原またはその機能断片に対する結合機能を保持する程度まで改変され得ることが、理解される。
（表２４）BrCa微小胞アプタマー候補配列
Figure 0006404822
図23A〜図23Cは、種々の投入試料に結合させたマイクロビーズに対する、表24に示されたアプタマーの結合を示す。アプタマーは、各プロットの上に示されている。表24を参照されたい。投入試料は、X軸上に左から右へ、以下のように示されている：1）癌エキソソーム：乳癌患者由来の血漿試料から単離された微小胞に結合させたマイクロビーズに対するアプタマー結合；2）癌非エキソソーム：超遠心分離による微小胞の除去後の乳癌患者由来の血漿試料に結合させたマイクロビーズに対するアプタマー結合；3）非癌エキソソーム：正常（すなわち、非乳癌）患者由来の血漿試料から単離された微小胞に結合させたマイクロビーズに対するアプタマー結合；4）非癌非エキソソーム：超遠心分離による微小胞の除去後の乳癌患者由来の血漿試料に結合させたマイクロビーズに対するアプタマー結合。図23A〜図23Cに示されるように、アプタマーは、各々、癌微小胞試料対上清対照試料および非癌微小胞を識別することができた。さらに、表24中のすべての配列が、癌由来の微小胞と比較した際に非癌由来の微小胞により豊富に結合すると観察されたBCE10およびBCE14を除いて、非癌由来の微小胞と比較した際に癌由来の微小胞により豊富に結合すると観察された。
本実施例において行われた比較に基づいて、以下を含む、異なる出発投入物に結合するアプタマーが得られる：1）非癌由来の微小胞を上回って癌由来の微小胞に優先的に結合するアプタマー；2）癌由来の微小胞を上回って非癌由来の微小胞に優先的に結合するアプタマー；3）非癌由来の微小胞および癌由来の微小胞の両方に結合するアプタマー（例えば、「万能」結合剤）；ならびに4）微小胞を枯渇させている血漿成分に結合するアプタマー。
本実施例におけるアプタマーライブラリーを、4ラウンドの追加的なネガティブ選択およびポジティブ選択にさらに供する。ポジティブ選択は、本実施例に記載されているように行う。ネガティブ選択のラウンドは、癌微小胞に結合させたビーズに対するポジティブ選択により得られたアプタマーについて、ネガティブ選択として非癌微小胞に結合させたビーズを用いて行う。同様に、ネガティブ選択のラウンドを、非癌微小胞に結合させたビーズに対するポジティブ選択により得られたアプタマーについて、ネガティブ選択として癌微小胞に結合させたビーズを用いて行う。
実施例21：疾患の診断
本実施例は、増殖性疾患を診断するための本発明のアプタマーの使用を例証する。
癌由来の微小胞に結合する、適当な量のアプタマーを、当技術分野において公知である化学的手段を介して合成する。アプタマーを、当技術分野において公知である結合法を用いて、蛍光部分などの、検出に適した診断物質に結合させる。
組成物を、微小胞の過剰発現と関連する増殖性疾患、例えば、前立腺癌、乳癌、または肺癌を患う患者の試験コホートより採取された血液試料から単離された微小胞に適用する。組成物を、増殖性疾患を患っていない陰性対照コホートより採取された血液試料から単離された微小胞に、同様に適用する。
試験コホート試料に対する適切な検出技術（例えば、マイクロビーズアッセイまたはフローサイトメトリー）の使用により、疾患が存在することが示され、他方、対照コホート試料に適用された同じ技術により、疾患が存在しないことが示される。
結果により、本発明のアプタマーが増殖性疾患を診断するのに有用であることが示される。
実施例22：治療用アプタマー
本実施例は、マウスにおいて増殖性疾患を治療するための本発明のアプタマーの使用を例証する。
癌由来の微小胞に結合する、適当な量のアプタマーを、当技術分野において公知である化学的手段を介して合成する。アプタマーを、当技術分野において公知である結合法を用いて、化学療法剤に結合させる。結合体を、水性組成物において製剤化する。
組成物を、微小胞の過剰発現と関連する増殖性疾患、例えば、前立腺癌、乳癌、または肺癌のモデルを患うマウスの試験コホートに、1つまたは複数の用量において、静脈内投与する。増殖性疾患を患っていない対照コホートに、対応する投薬レジメンに従って、同一組成物を静脈内投与する。
腫瘍試料の病理解析および／またはマウスの生存により、死亡率および／または罹患率が、対照コホートを上回って試験コホートにおいて改善されることが示される。
結果により、本発明のアプタマーが増殖性疾患を治療するのに有用であることが示される。
有用なアプタマーを、他の生物、例えばヒトにおいて癌を治療するために使用することができる。
実施例23：アプタマー-配列決定検出法
本実施例は、関心対象の表現型を示す微小胞を検出するためのアプタマープールの使用を例証する。方法は、関心対象の表現型を示す関心対象の標的に対して富化されているアプタマーのプールを使用する。本実施例における方法により、標的実体を優先的に認識するためのアプタマーのライブラリーの効率的な使用が可能になる。
例証の目的で、方法を、体液試料由来の微小胞標的を用いて、実施例において記載する。当業者は、所望の投入試料に対するアプタマーライブラリーを富化することにより、方法を、他のタイプの標的実体（例えば、細胞、タンパク質、種々の他の生物学的複合体）、試料（例えば、組織、細胞培養、生検、他の体液）、および他の表現型（他の癌、他の疾患など）に拡大できることを、理解するであろう。
全般的なワークフロー：
1）未知の医学的語源を有する患者の試料（血漿、血清、尿、または任意の他の生物学的試料）を取得し、関心対象の標的の利用可能性を確実にするために、それに応じて前処理する（下記を参照されたい）。関心対象の標的が微小胞集団である場合は、微小胞を単離し、任意で、マイクロビーズなどの固体支持体につなげてもよい。
2）試料を、関心対象の標的に対してある特定の特異性を保有するアプタマープールに曝露する。本明細書に記載されているように、関心対象の標的に対してある特定の特異性を保有するアプタマープールは、種々の選択スキームを用いて、例えば、上述のようなネガティブ選択のための非癌微小胞およびポジティブ選択のための癌微小胞を用いて、富化することができる。DNAアプタマーまたはRNAアプタマーを、望ましいように使用することができる。
3）アプタマーライブラリーを試料と接触させる。
4）標的に結合した任意のアプタマーを溶出する。
5）溶出されたアプタマーを配列決定する。次世代配列決定法を使用することができる。
6）配列決定由来のアプタマープロファイルを解析する。関心対象の標的に結合することが公知のアプタマーのプロファイルにより、投入試料内に標的が存在することが示される。プロファイルを、例えば、癌または非癌として、試料を特徴決定するために使用することができる。
プロトコルの変形：
アプタマー-配列決定アッセイの目的を果たす4種の基本プロトコルが、現在存在する。試料は、任意の生物学的試料であることができる。
プロトコル1：
微小胞を単離するための、沈殿の2回の洗浄を伴う、1〜5 mlの体液試料（例えば、血漿／血清／尿）の超遠心分離（120K×g、スクロースなし）。
単離された微小胞を含有する、回収された試料の全タンパク質濃度を測定する。
単離された微小胞を、磁気ビーズ（例えば、MagPlexビーズ（Luminex Corp. Austin TX））に結合させる。
結合させた微小胞を、関心対象のアプタマープールとインキュベーションする。
磁石を用いてビーズを保持することにより、結合していないアプタマーを洗浄する。
微小胞に結合したアプタマーを溶出する。
溶出されたアプタマーを増幅および精製する。
アプタマー配列決定（例えば、次世代法；Ion Torrent：融合PCR、エマルジョンPCR、配列決定）。
アプタマープロファイルを評価する。
プロトコル2：
この代替的なプロトコルは、微小胞単離工程、ビーズへの微小胞の結合、または分離した分配工程を含まない。これは、投入試料に対するアプタマーの非特異的結合を示す可能性がある。
体液試料から細胞／破片を除去し、試料を、MgCl2（2mM）を含有するPBSで希釈する。
上記で調製された試料を、アプタマーライブラリーとあらかじめ混合する。
アプタマー／試料混合物の超遠心分離（120K×g、スクロースなし）。沈殿した微小胞を洗浄する。
沈殿を回収して、微小胞に結合したアプタマーを溶出する。
溶出されたアプタマーを増幅および精製する。
アプタマー配列決定（例えば、次世代法；Ion Torrent：融合PCR、エマルジョンPCR、配列決定）。
アプタマープロファイルを評価する。
プロトコル3：
このプロトコルは、超遠心分離の代わりに濾過を使用し、より少ない時間および試料容積を必要とし得る。
体液試料から細胞／破片を除去し、それを、MgCl2（2mM）を含有するPBSで希釈する。
上記で調製された試料を、アプタマーライブラリーとあらかじめ混合する。
試料をフィルター（すなわち、150Kもしくは300K MWCOフィルター、または、結合していないもしくは望ましくないアプタマーを排除することができる任意の他のもの）中にローディングする。試料を遠心分離して濃縮する。濃縮された試料は、微小胞を含有するはずである。
濃縮物を洗浄する。バリアント1：濃縮物を上記で特定された緩衝液で元の容積に希釈し、遠心分離を繰り返す。バリアント2：濃縮物を上記で特定された緩衝液で元の容積に希釈し、濃縮物を新たなフィルター単位に移して、遠心分離する。2回繰り返す。
濃縮物を回収して、微小胞に結合したアプタマーを溶出する。
溶出されたアプタマーを増幅および精製する。
アプタマー配列決定（例えば、次世代法；Ion Torrent：融合PCR、エマルジョンPCR、配列決定）。
アプタマープロファイルを評価する。
プロトコル4：
微小胞を単離するための、沈殿の2回の洗浄を伴う、1〜5 mlの体液試料の超遠心分離（120K×g、スクロースなし）。
微小胞をアプタマープールとあらかじめ混合する。
試料を300K MWCOフィルター単位中にローディングし、遠心分離（2000×g）する。濃縮率は、約3倍である。
濃縮物を洗浄する。バリアント1：濃縮物を上記で特定された緩衝液で元の容積に希釈し、遠心分離する。2回繰り返す。バリアント2：濃縮物を上記で特定された緩衝液で元の容積に希釈し、濃縮物を新たなフィルター単位に移して、遠心分離する。2回繰り返す。
濃縮物を回収して、微小胞に結合したアプタマーを溶出する。
溶出されたアプタマーを増幅および精製する。
アプタマー配列決定（例えば、次世代法；Ion Torrent：融合PCR、エマルジョンPCR、配列決定）。
アプタマープロファイルを評価する。
実施例24：アプタマー配列決定を用いた癌由来の微小胞の検出
上記の実施例23における方法を、癌細胞に由来する体液試料において微小胞を検出するために使用する。微小胞は、癌細胞から流出したものであってもよい。アプタマーライブラリーは、非癌個体に対して癌患者由来の微小胞に優先的に結合する、上記の実施例18〜20に記載されているアプタマーのサブセットを含む。配列を、SEQ ID NO: 231032〜241535として本明細書で列挙する。方法を、癌を示す微小胞の有無を検出するために使用する。
試験試料は、癌を有するか、または癌を有する疑いがある患者から収集された血漿試料を含む。試験試料は、本発明の方法により特徴決定されるべき試料である。方法を、患者の循環において癌由来の微小胞の有無を判定するために行う。
方法をさらに、生検に先立って癌の証拠を検出するために使用する。試験試料は、生検を受ける予定の患者から収集された血漿試料を含む。試験試料は、本発明の方法により特徴決定されるべき試料である。方法を、生検に先立って患者の循環において癌由来の微小胞の有無を判定するために行う。癌由来の微小胞が検出されない場合には、生検を見送る決定がなされ得る。
実施例25：微小胞のためのアプタマー選択
古典的なアプタマー選択技術（すなわち、SELEX）は、典型的に、非標的分子（競合相手）での干渉が最小化されている「きれいな」条件において、特定の標的についてアプタマーを富化するために行われる。しかしながら、選択されたアプタマーについての種々の適用は、アプタマーが、多様な環境において、例えば、高存在量の潜在的干渉分子を伴う生物学的試料または組織培養培地において、その標的に結合するように働くことを必要としている。この場合には、選択プロセス中に存在しなかったそのような干渉分子が、理想的な条件において選択されたアプタマーによる標的に認識を干渉する可能性がある。本実施例は、標的に対して非常に特異的なアプタマーを選択するためにアプタマーライブラリーをスクリーニングし、かつまた、潜在的干渉分子を含む生物学的試料において行うことができるアプタマー選択プロセスを提供する。
本実施例において、標的は、正常（非癌対照）微小胞と比較した際に癌由来の微小胞に結合するメンバーについてアプタマーライブラリーをスクリーニングするように、微小胞を含む。当業者は、方法を、他のタイプの標的実体（例えば、細胞、タンパク質、種々の他の生物学的複合体）に拡大できることを、理解するであろう。方法は、種々の試料タイプ（例えば、組織、細胞培養、生検、他の体液）を使用することができ、かつ所望の投入試料に対してアプタマーライブラリーを富化することにより、種々の表現型（種々の癌、他の疾患など）を特徴決定するために使用され得る標的分子に方向づけることができる。さらに、癌試料および正常試料を、正常試料に優先的に結合するアプタマーについてスクリーニングするように切り換えることができる。
バリアント1：微小胞を枯渇させた血漿との競合における、微小胞ベースのアプタマー選択。ワークフロー：
→微小胞を、超遠心分離を用いて癌および正常の血漿試料から単離する。微小胞枯渇試料を構成する上清を、陰性対照試料として保存する。
→単離された微小胞を、磁気ビーズに捕捉／結合させる。
→上記由来の上清（すなわち、微小胞枯渇血漿）と混合された微小胞結合ビーズを用いて、アプタマースクリーニングおよび選択プロセスを開始する。上清にMgCl2を補給する。癌由来および正常（非癌由来）の微小胞についてのアプタマースクリーニングおよび選択を、並行して行うことができる。各ラウンドは、望ましいようにネガティブ選択およびポジティブ選択からなる。
最初のアプタマーライブラリーを、微小胞標的および血漿由来の競合相手（可溶性タンパク質）に同時に曝露するため、微小胞／ビーズから回収されたアプタマーは、微小胞膜上の標的に対してより特異的であり得る。そのようなアプタマーは、標的結合／検出の前に標的の大規模な精製を必要とすることなく、生物学的試料において有効に機能し得る。
バリアント2：正常試料から単離された微小胞との競合における、癌由来の微小胞（例えば、癌細胞から流出）についてのアプタマー選択。ワークフロー：
→微小胞を、超遠心分離を用いて癌および正常の血漿試料から単離する。
→単離された癌由来の微小胞を、磁気ビーズに捕捉／結合させる。
→MgCl2を補給した正常微小胞（非結合）と混合された癌微小胞結合ビーズを用いて、アプタマースクリーニングおよび選択プロセスを開始する。アプタマースクリーニングおよび選択を、磁気ビーズで保持されているアプタマーのみを保持することにより、癌由来の微小胞のみについて行う。
アプタマーライブラリーを、両方のタイプの微小胞（癌および正常）に同時に曝露することになるため、方法は、非癌微小胞の存在下で癌由来の微小胞に優先的に結合するアプタマーを選択する。
バリアント3：正常血漿（微小胞を枯渇させていない）との競合における、癌由来の微小胞（例えば、癌細胞から流出）についてのアプタマー選択。ワークフロー：
→微小胞を、超遠心分離を用いて癌血漿試料から単離する。
→単離された癌由来の微小胞を、磁気ビーズに捕捉／結合させる。
→MgCl2を補給した正常血漿（非結合）と混合された癌微小胞結合ビーズを用いて、アプタマースクリーニングおよび選択プロセスを開始する。アプタマースクリーニングおよび選択を、磁気ビーズで保持されているアプタマーのみを保持することにより、癌微小胞のみについて行う。
このアプローチは、上記のバリアント1および2の利点を組み合わせる。各ラウンドは、正常血漿との競合を含む。アプタマーは、干渉する血漿タンパク質および他の生物学的実体の存在下では、標的に対してより選択的であろう。
バリアント4：混合されたビーズ上での並行の癌／正常アプタマー選択。ワークフロー：
→癌由来の微小胞を、磁気ビーズに捕捉／結合させる。
→正常（非癌）微小胞を、非磁気ビーズに捕捉／結合させる。
→両方のビーズセットを混合し、開始アプタマーライブラリーでアプタマースクリーニングおよび選択プロセスを行う。
→アプタマーライブラリーとのインキュベーション後に、磁気ビーズと非磁気ビーズとを分離する。磁石を用いて磁気ビーズを捕捉し、その後、遠心分離して非磁気ビーズを分離する。
→分離された磁気ビーズおよび非磁気ビーズを、別々に洗浄する。
→両方のタイプのビーズから別々に、アプタマーを溶出および再増幅する。
→ラウンド2：両方のタイプのビーズから増幅されたアプタマープールを混合し、混合されたビーズに添加する。
→上記を繰り返す。
バリアント4の利点には、以下が含まれる：（i）癌微小胞および非癌微小胞の両方についてアプタマースクリーニングおよび選択プロセスを開始するために、同じアリコートのアプタマーライブラリーを使用すること；（ii）癌微小胞と非癌微小胞との間の競合を、各ラウンドにおいて1つの混合物中で直接使用すること；（iii）上清を、選択ストリンジェンシーを増大させるために追加的な競合相手として添加できること；（iv）正常のみまたは癌のみを特定するアプタマーをもたらすための競合における、癌特異的アプタマーおよび非癌特異的アプタマーについての並行富化（いずれか1つに結合する選択があるため）。
実施例26：カルボキシル基に対する万能ブロッキングDNAアプタマーの選択
当技術分野において公知であるブロッキング緩衝液は、一般的に、合成ペプチド、BSA、トリプシン処理されたタンパク質、またはランダムなDNAプール（合成もしくは天然、例えば、サケ精子DNA）の混合物を含む。これらの複合体混合物は、さらにそのブロッキング効果が、アッセイにおいて追加的な偽標的を提供し、それにより偽陽性を生じる可能性がある、分子を含有し得る。
本実施例において、カルボキシル化基体のための特異的遮断物として働くブロッキング試薬が開発された。ブロッキング試薬は、基体上のカルボキシル基以外の任意の他の標的に対して最小化された交差反応性を有するアプタマーを含む。
予備的な実験を、各々1015配列を有する5種のDNAアプタマーライブラリーで行い、可変の長さ（60、65、70、75、80マー）を事前増幅して、鎖分離し、フォワード鎖（非ビオチン化）がアプタマーとして働くようにした。複数ラウンドのネガティブ選択およびポジティブ選択を、上記の実施例9に記載されているように行った。
潜在的なブロッキングアプタマーを特定するために、異なるタンパク質標的での選択プロセスにおいて共通に観察された配列を特定した。上記の選択プロセスから回収された最も高存在量のものの1つとして特定された1つのアプタマー配列がまた、異なる標的タンパク質の各々についての最終的なアプタマープールにおいても特定された。このアプタマーが、アプタマーブロッキング候補として選択された：
Figure 0006404822
。
理論により束縛されることなく、グアニンに富む配列が、水素結合を介して基体ビーズ上のカルボキシル基に結合するということである。図16Aおよび図16Bを参照されたい。図16Aは、アプタマー1601の一部と、平面基体1603に付加されたカルボキシル基1602との間の水素結合を示している。図16Bは、アプタマー1601の一部と、ミクロスフェア基体1604に付加されたカルボキシル基1602との間の水素結合を示している。カルボキシル基1602はさらに、抗体1605に付加されている。グアニンは、2つの水素結合を形成することができる唯一のヌクレオチドである。
試験
アプタマーブロッキング候補のブロッキング特性を試験するために、以下の実験を行った。
アプタマーを取得するために、上記に示されている配列の大部分を含有していたポジティブ選択後の40マーのPBPプールを、PCRで再増幅し、鎖分離して、エタノール沈殿した。いくつかの関連した配列もまた増幅されたが、それらのより低い濃度で結果に影響を及ぼすとは考えられなかった。
所望のタンパク質バイオマーカー（SSX4、PBP、SPDEF、EPCAM、KLK2、SSX2）に対する抗体、陰性対照の抗IgG2B抗体、および陰性対照アプタマー（すなわち、Neg5およびNeg9と呼ばれる、タンパク質バイオマーカーのいずれにも非結合であるアプタマー）に結合させたマイクロビーズを、上記の候補ブロッキングアプタマーを含む溶液で20分間ブロッキングした。抗体結合マイクロビーズをアプタマーブロッキング候補とインキュベーションした後に、標準的なマイクロビーズブロッキング溶液を添加して、ビーズをさらに20分間インキュベーションした。ビーズをその後、PCRストリップチューブ中に分散させ、前立腺癌または良性前立腺障害を有する患者由来の血漿試料と混合した。混合物を、2時間37℃でインキュベーションした。試料をフィルタープレートに移し、抗体結合マイクロビーズにより捕捉された微小胞を認識するはずである、ビオチン化抗EpCAMアプタマーと混合した。ビーズを、抗EpCAMアプタマーと1時間室温でインキュベーションした。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン-PEを添加して、試料を30分間室温でインキュベーションした。プレートを洗浄し、マイクロビーズとの複合体におけるのPEの蛍光を、試料の100μl溶液で測定した。各試料を、三連のウェル中で試験し、結果を平均した。抗IgG2b抗体および2種の非結合アプタマーを用いた陰性対照もまた、行った。結果を、2種の非結合アプタマーであるNeg5およびNeg9について示し、それぞれ図24A〜図24Bに示す。図24A〜図24Bに示されている結果により、ビーズが標準的なブロッキング条件（StartingBlock Blocking Buffer, Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA）、1×候補ブロッキングアプタマー（〜34μg/ml）での標準的なブロッキング、および0.5×アプタマーブロッキングでの標準的なブロッキングであらかじめブロッキングされた際の、より低いバックグラウンドレベルが明らかになった。
ブロッキングアプタマーはグアニンに富んでいるため、実験を、単一のグアニンヌクレオチドのみを含む溶液、その後の標準的なstarting blockで繰り返した。単一のヌクレオチドのみを用いては、改善が観察されなかった。
実施例27：例証となるブロッキングアプタマー配列
以下の表25は、本発明の例証となるアプタマーを含む。アプタマーは、実施例26に記載されているアプタマーのプールの一部であり、特定されたブロッキングアプタマーの共通のプールの一部であった。表25に開示されているヌクレオチド配列は、得られた修飾が開示配列に対して約50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、および99パーセントの相同性を有するアプタマーをもたらしかつカルボキシル官能基への結合機能を保持する程度まで改変され得ることが、理解される。本明細書における任意の定義された数値単位の文脈において使用される際、「約」という用語は、その数値単位の10％上または下、およびその間のすべての単位の変動を意味する。
（表２５）例証となるアプタマー
Figure 0006404822
Figure 0006404822
Figure 0006404822
実施例28：ミクロスフェア結合微小胞
微小胞を、種々の方法を用いて基体に結合させることができる。本実施例においては、以下の3種の方法を、微小胞を基体に付加するために使用する：1）直接結合；2）脂質アンカリング；3）抗体結合；および4）アプタマー結合。図7A〜図7Dにおける概略図を参照されたい。図7Aは、カルボキシル化ミクロスフェアの小胞表面抗原に対する直接結合を示す。図7Bは、ビオチン官能化脂質アンカーを介した微小胞のミクロスフェアに対するアンカリングを示す。図7Cは、小胞表面抗原に対する抗体結合を示し、該抗体は、カルボキシル化ミクロスフェアに結合している。図7Dは、小胞表面抗原に対するアプタマー結合を示し、該アプタマーは、カルボキシル化ミクロスフェアに結合している。本実施例における方法により生成されたミクロスフェア付加微小胞を、上記の実施例に記載されているようにアプタマーライブラリーをスクリーニングするために、使用することができる。
直接結合：微小胞のミクロスフェアに対する直接結合を、VCAP前立腺癌細胞株から放出された微小胞を用いて試験した。プロトコル：VCAP微小胞を、抗体について確立されたプロトコルに従って、MagPlexビーズ（Luminex Corp, Austin TX）に結合させた（500万ビーズ、20μg微小胞）。詳細なプロトコルについては、下記の実施例29を参照されたい。単離された微小胞を、当技術分野において公知であるような標準的な二工程カルボジイミド化学を用いて、カルボキシル化ビーズに結合させた。MagPlexアッセイを、製造業者のプロトコルに従って、ウェルあたり1200ビーズで行った。可能性があるビーズにより駆動されるいかなるシグナルも排除するために、ビーズを、3種のブロッキング緩衝液で、およびブロッキングなしで試験した。微小胞を標識するために、ビーズを、5μg/mlのPE標識抗テトラスパニン検出抗体（抗CD9-PEおよび抗CD63-PE）と1時間、室温でインキュベーションした。結果を、図8A〜図8Bに示す。図から見られるように、ビーズ結合VCAP微小胞は、両方の検出抗体で特異的に検出された。さらに、特異的抗体に対する反応は、微小胞におけるCD9およびCD63表面タンパク質の天然の優勢度を反映していた（すなわち、CD9はCD63より優勢であり、これは、抗CD9検出抗体（図8A）対抗CD63検出抗体（図8B）を用いた際に、より大きなMFI値に反映されている）。
抗体結合：MagPlexビーズを、製造業者のプロトコルに従って、EpCAM、CD63、またはCD81に対する抗体と結合させた（Luminex Corp., Austin TX）。微小胞を、一般的な微小胞表面タンパク質であるCD9に対するフィコエリスリン（PE）標識抗体で検出した。図中のY軸は、検出された微小胞の中央蛍光強度（MFI）を示す。結果を、図9A〜図9Eに示す。図9Aおよび図9Cに示されているように、VCap細胞（図9A）または患者血漿試料（図9C）由来の小胞の量の増大は、MFIシグナルの増大を結果としてもたらした。ExoQuickで単離された小胞が、超遠心分離または超遠心分離で単離されたものよりも強いシグナルを生じたように、試料調製が、検出されるシグナルに影響を及ぼすようであった。図9Bを参照されたい。最終的に、長期のインキュベーション後の安定なシグナルにより示されるように、抗体捕捉小胞は、マイクロビーズに安定につながれるようであった。図9Dを参照されたい。
脂質アンカリング：VCAP微小胞を、結合標的として微小胞脂質膜を用いて、ミクロスフェアに結合させた。図10Aに示されるように、脂質官能基を有するヘテロ二官能性架橋剤を用いた。ヘテロ二官能性架橋剤を用いたミクロスフェアと微小胞との間の連結は、図10Bに示されるようである。ストレプトアビジンコーティングビーズを、ビオチン官能化脂質（「脂質アンカー」）とインキュベーションし、洗浄して、所望の微小胞とインキュベーションする。図10Bに示されるように、脂質アンカーのミクロスフェアとの付加は、ストレプトアビジン-ビオチンの親和性により行われ、微小胞の捕捉は、小胞脂質二重層膜中へのリン脂質類似体の取り込みにより促進される。プロトコルは、以下である。
1．600μlのストレプトアビジンコーティング磁気ビーズ（Pierce カタログ番号88817）を、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回洗浄する。
2．ビーズを、500μlのPBSのみ（対照として）または1μlの官能化脂質部分［1,2-ジヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(キャップビオチニル)］（Avanti Polar Lipids, Alabaster AL, カタログ番号870277X；水において1:1000希釈）を含む500μl PBSに再懸濁する。30分間37℃で、回転しながらインキュベーションする。
3．ビーズを、超純水（Invitrogen カタログ番号10977）で、その後PBS（HyClone カタログ番号SH30256）で2回洗浄する。
4．100μgのVCAP微小胞またはヒト血漿を、脂質アンカーを有するかまたは有さないビーズに添加する。PBSで容積を500μlに上げる。1時間37℃で、回転しながらインキュベーションする。一晩4℃で保存する。
5．以下の実験に必要とされるビーズのアリコートをピペットで取り、PBSで2回洗浄する。
6．捕捉された微小胞の存在を、微小胞特異的抗体であるPE標識抗ヒトCD9（BD Pharmingen カタログ番号555372）およびPE標識抗ヒトCD63（BD Pharmingen カタログ番号556020）、またはアイソタイプ対照のPEマウスIgG1κ（eBioscience カタログ番号12-4714-42）を用いたフローサイトメトリー（MoFlo（商標）XDP機器, Beckman Coulter, Inc., Indianapolis IN）で試験する。
7．試料を、1時間室温で、Eppendorf MixMate上で、暗所でインキュベーションした。ビーズをその後、PBS中で2回洗浄して再懸濁し、MoFlo XDPまたはLuminex 200上で解析した。
このプロトコルに従って、VCap微小胞を、磁気ストレプトアビジンビーズに結合したビオチン化脂質部分［1,2-ジヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(キャップビオチニル)］により捕捉した。これらの微小胞を、テトラスパニンであるCD9およびCD63に対するPE標識抗体で染色した際に、MoFloにより検出されたPEシグナルのMFIは、VCaP微小胞の投入量と共に漸増した。さらに、ビーズは、最高濃度のVCaP投入量の微小胞で飽和された。脂質アンカーの存在下でのビーズ結合微小胞の富化を実証する結果について、図10C〜図10Fを参照されたい。脂質アンカリング小胞に由来するシグナルは、図10Gおよび図10Hに示されるように、小胞の量に相関した。
ビオチン化脂質部分をまた、LumAvidinビーズに結合させて、VCaP微小胞を捕捉するために使用し、これはその後、伝統的なフローサイトメトリー（図10I）またはLuminex（図10J）のいずれかを用いることにより、解析することができた。テトラスパニンのシグナルは、脂質部分と結合し、かつ微小胞とインキュベーションされたビーズを含有する試料においてのみ検出され；微小胞を含有しない、またはビーズが脂質部分に結合していない対照試料は、抗CD9シグナルについて陰性であった。
レクチン結合：レクチンは、炭水化物結合タンパク質である。種々のレクチンを、微小胞の表面上の糖部分に結合するように使用することができる。例えば、コンカナバリンA（ConA）は、種々の糖、糖タンパク質、および糖脂質において見出されるある特定の構造、主に内部および非還元末端のα-D-マンノシル基およびα-D-グルコシル基に特異的に結合するレクチンである。ストレプトアビジンコーティングビーズを、ビオチン官能化ConAとインキュベーションし、洗浄して、所望の微小胞とインキュベーションする。
上記のいずれかの方法により生成されたミクロスフェア結合微小胞を、本明細書における実施例に記載されているようにアプタマーライブラリーをスクリーニングするために使用することができる。
試料調製の効果：試料調製を、基体につながれた微小胞の捕捉および／または検出のために最適化することができる。図10Kおよび図10Lに示されるように、超遠心分離を用いて血漿試料から単離された小胞をアンカリングした際には、わずかな脂質アンカリング小胞しか見出されなかった。類似した結果が、血漿由来の小胞がExoQuickを用いて単離された際に観察された（示されていない）。さらに、類似した結果がまた、ミクロスフェアに直接結合させた血漿試料由来の微小胞を用いた際にも観察された（示されていない）。理論により束縛されることなく、血漿試料中の非常に高存在量のタンパク質が、微小胞の脂質アンカリングまたは直接基体結合を干渉し得ることが、仮定された。この理論を試験するために、Vcap微小胞を、検出の前に試料に添加された30 mg/mlのヒト血清アルブミン（HSA）を伴うか（図10N）または伴わずに（図10M）、検出した。これらの図は、検出された小胞のシグナルが、HSAの存在下で減少したことを示す。
血液由来の微小胞の試料調製を改善するための種々の方法には、非常に高存在量のタンパク質（例えば、HSA／IgG／フィブリノゲン）の枯渇、血液ベースの脂質の除去、タンパク質および他の緩衝物質を除去するための150k、300K、および1000K MWCOフィルターでの血漿濃縮、ならびに／または小胞表面抗原に対する結合剤を用いた親和性単離（例えば、免疫沈降または親和性クロマトグラフィー）が含まれる。これらのアプローチには、その後、小胞単離（例えば、超遠心分離、限外濾過、Exoquick）が続く。
安定性：微小胞は、マイクロビーズに共有結合でカップリングされているため、ひとたび結合が行われ、ビーズが正しく洗浄されると、結合させた微小胞のビーズからの「滲出」は最小であるはずである。ビーズ結合微小胞の安定性を試験するために、実験を行った。種々の方法を用いて精製された微小胞を、上述のようにミクロスフェアに直接結合させた。微小胞結合ビーズ由来のシグナルを、2〜3日間の4℃での結合ビーズの保存後に、および再び、同じビーズを11〜12日間、-80℃で保存した後に測定した。微小胞を、PE結合抗CD9抗体またはPE結合抗CD63抗体で標識した。ビーズのロットの各々についてのMFI値を、測定した。図10O〜図10Pは、シグナルの最小の分解が、-80℃での12日の保存の前後に、抗CD9検出物質を用いて観察されたことを示す。異なる方法を用いて単離された小胞を、X軸に沿って条件により示されるように、試験した：1）ExoQuick（商標）キット（System Biosciences, Inc., Mountain View, CA）およびその後の限外濾過；2）超遠心分離；3）超遠心分離およびその後のExoquick；4）ExoQuickからExoMir（商標）キット（Bioo Scientific Corp., Austin TX）；5）限外濾過VCAP小胞プレップ番号1；6）限外濾過VCAP小胞プレップ番号2；ならびに7）限外濾過およびその後の超遠心分離。同一の結果が、抗CD63検出物質で観察された。
つながれた微小胞の画像化：電界放出走査型電子顕微鏡（FE-SEM）を、血漿から単離された微小胞をミクロスフェアの表面につなげるための代替的プロトコルの評定のために使用した。図11A〜図11Nは、FE-SEM画像を示す。図11Aは、官能化も結合もしないミクロスフェアを示す。図11Bは、超遠心分離を用いて単離された血漿微小胞の非磁気ビーズへの直接結合を示す。図11Cは、図11Bの示された領域の拡大を示す。矢印は、種々の微小胞を指し示す。図11Dおよび図11Eは、ビーズが磁気であること以外は、それぞれ図11Bおよび図11Cに対応する。図11F〜図11Hは、官能化磁気ビーズを示す。図11Fは、ビオチン化ConAで官能化されたアビジン結合ビーズを示す。図11Gは、ビオチン化脂質アンカーで官能化されたアビジン結合ビーズを示す。図11Hは、抗CD9抗体と直接結合させたビーズを示す。図11Iは、超遠心分離を用いて単離された血漿微小胞のConA官能化ビーズに対するビーズ捕捉を示す。図11Jは、図11Iの示された領域の拡大を示す。矢印は、種々の微小胞を指し示す。図11Kは、超遠心分離を用いて単離された血漿微小胞の脂質アンカー官能化ビーズに対するビーズ捕捉を示す。図11Lは、図11Kの示された領域の拡大を示す。矢印は、種々の微小胞を指し示す。図11Mは、超遠心分離を用いて単離された血漿微小胞の脂質アンカー官能化ビーズに対するビーズ捕捉を示す。図11Nは、図11Mの示された領域の拡大を示す。矢印は、種々の微小胞を指し示す。
概要：小胞をミクロスフェアにつなげるためのすべての3種のプラットフォーム（直接結合、抗体結合、および脂質アンカー）が、Vcap（ヒト前立腺細胞株）由来の微小胞を用いて実証された。最適化された試料条件（例えば、非常に高存在量のタンパク質の除去）で、ヒト血漿試料から単離された微小胞を用いて類似した結果が観察された。異なるサイズの小胞による立体干渉、凝集体の形成、可溶性タンパク質のブロッキング、または小胞断片の干渉を含むがこれらに限定されない、分子実体の干渉の可能性を考慮すると、複合体微小胞構造の直接的なビーズへの十分なカップリングを得ることは、驚くべきことである。本実施例における方法により生成されたミクロスフェア付加微小胞を、上記の実施例に記載されているようにアプタマーライブラリーをスクリーニングするために、使用することができる。
実施例29：タンパク質または微小胞のカルボキシル化ミクロスフェアに対する2工程カルボジイミドカップリングのためのプロトコル
下記のプロトコルを、タンパク質（例えば、抗体）または微小胞をカルボキシル化ミクロスフェア（MagPlex（登録商標）磁気ミクロスフェアまたはMicroPlex（登録商標）非磁気ミクロスフェア、Luminex Corporation, Austin, TX）に結合させるために使用する。
材料：
領域15：Luminex カタログ番号MC10015-01 ロット番号B28049 期限：2016/12/16
領域18：Luminex カタログ番号MC10018-01 ロット番号B29449 期限：2017/3/14
プロトコル：
ミクロスフェアを、本手順を通して、光への長期の曝露から保護する。
1．ミクロスフェアと共に提供された製品情報シートに記載されている指示に従って、ストックのカップリングされていないミクロスフェア懸濁液を再懸濁する。
2．5.0×106個のストックのミクロスフェアを、USA Scientific微量遠心分離チューブに移す。タンパク質／ビーズの比：20μg／5×106個。4μg／106個まで縮小することができる。
3．チューブを磁気分離器中に置き、60秒間分離が起きるようにする。下記の技術注記1を参照されたい。
4．チューブを磁気分離器にまだ位置づけた状態で、上清を除去する。ミクロスフェアを乱さないように気をつける。
5．チューブを磁気分離器から取り外し、ミクロスフェアを100μL dH2Oに、ボルテックスおよびおよそ20秒間の音波処理により再懸濁する。
6．チューブを磁気分離器中に置き、60秒間分離が起きるようにする。
7．チューブを磁気分離器にまだ位置づけた状態で、上清を除去する。ミクロスフェアを乱さないように気をつける。
8．チューブを磁気分離器から取り外し、洗浄されたミクロスフェアを80μLの100 mMリン酸二水素ナトリウム、pH 6.2に、ボルテックスおよびおよそ20秒間の音波処理により再懸濁する。
9．10μLの50 mg/mLスルホ-NHS（dH2Oにおいて希釈）をミクロスフェアに添加し、ボルテックスにより穏やかに混合する。
10．10μLの50 mg/mL EDC（dH2Oにおいて希釈）をミクロスフェアに添加し、ボルテックスにより穏やかに混合する。
11．20分間室温で、10分間隔でのボルテックスにより穏やかな混合しながら、インキュベーションする。
12．チューブを磁気分離器中に置き、60秒間分離が起きるようにする。
13．チューブを磁気分離器にまだ位置づけた状態で、上清を除去する。ミクロスフェアを乱さないように気をつける。
14．チューブを磁気分離器から取り外し、ミクロスフェアを250μLの50 mM MES、pH 5.0に、ボルテックスおよびおよそ20秒間の音波処理により再懸濁する。下記の技術注記2を参照されたい。
15．工程12および13を繰り返す。これは、合計で2回の50 mM MES、pH 5.0での洗浄である。
16．チューブを磁気分離器から取り外し、活性化されかつ洗浄されたミクロスフェアを100μLの50 mM MES、pH 5.0に、ボルテックスおよびおよそ20秒間の音波処理により再懸濁する。
17．20μgのタンパク質または等価の微小胞を、再懸濁されたミクロスフェアに添加する。
18．総容積を50 mM MES、pH 5.0で500μLにする。注意： 106個のビーズの結合の場合には、この容積を縮小することができる。
19．カップリング反応をボルテックスにより混合する。
20．室温で混合（MixMate上で800 rpm）しながら、2時間インキュベーションする。
21．チューブを磁気分離器中に置き、60秒間分離が起きるようにする。
22．チューブを磁気分離器にまだ位置づけた状態で、上清を除去する。ミクロスフェアを乱さないように気をつける。
23．チューブを磁気分離器から取り外し、カップリングされたミクロスフェアを500μLのPBS-Tに、ボルテックスおよびおよそ20秒間の音波処置により再懸濁する。下記の技術注記3を参照されたい。
24．室温で（回転により）混合しながら、30分間インキュベーションする。ミクロスフェアを同じ日に使用したため、この工程を行った。
25．チューブを磁気分離器中に置き、30〜60秒間分離が起きるようにする。
26．チューブを磁気分離器にまだ位置づけた状態で、上清を除去する。ミクロスフェアを乱さないように気をつける。
27．チューブを磁気分離器から取り外し、ミクロスフェアを1mLのPBS-TBNに、ボルテックスおよびおよそ20秒間の音波処理により再懸濁する。技術注記4を参照されたい。
28．工程25および26を繰り返す。これは、合計で2回の1mL PBS-TBNでの洗浄である。
29．チューブを磁気分離器から取り外し、カップリングされかつ洗浄されたミクロスフェアを250 ul PBS-TBNに再懸濁する（100万個のビーズについては150ul、PBS-TBN）。
30．ミクロスフェア懸濁液を、vicellにより計数する。
技術注記1：磁気分離器の一覧については、ビーズ製造業者の推奨を参照されたい。最適な分離時間は、使用される分離器のタイプで変動する可能性がある。
技術注記2：カップリングは、100 mM MES、pH 6.0において行うことができ、類似した結果を伴う。いくつかの場合に、より良好な溶解性およびより良好なカップリングが、より高いカップリングpHでまたは異なる緩衝液において達成され得る。標的がこれらの推奨の下で満足にカップリングしない場合は、代替のカップリング緩衝液としてPBS、pH 7.4を試されたい。
技術注記3：PBS-TBN（PBS、0.1％ BSA、0.02％ Tween-20、0.05％アジド、pH 7.4）またはPBS-BN（PBS、1％ BSA、0.05％アジド、pH 7.4）のいずれかが、ブロッキング／保存緩衝液として使用されてもよい。
技術注記4：PBS-TBNまたはPBS、0.05％ Tween-20のいずれかが、洗浄緩衝液として使用されてもよい。
実施例30：癌特異的アプタマーを特定するためのプラットフォームとしてのミクロスフェア結合微小胞
アプタマーライブラリーの分配のための戦略には、以下が含まれる：（i）固体支持体に固定された標的（例えば、アガロース、ポリメチルメタクリラート、または常磁性ビーズ）；（ii）ゲル移動度シフト；（iii）タンパク質と結合するがDNAと結合しないニトロセルロース膜；および（iv）キャピラリー電気泳動。癌特異的タンパク質に対するアプタマーを開発するために、これらのアプローチの各々は、典型的に、アプタマープールの「結合剤」および「非結合剤」集団への分配を可能にする様式で、固体支持体上に固定された、癌と関連している（少なくともいくらかの程度まで）ことが既知である組み換えタンパク質で始まる。これらのアプローチはさらに、以下を想定する：（i）タンパク質の化学的固定化はその構造およびコンフォメーションを改変する可能性があるが、組み換えタンパク質のフォールディングは、インサイチュの（例えば、組織または血液などの体液における）天然のタンパク質を表し得ること；ならびに（ii）所望の生物学的試料において他の成分との相互作用はないこと。従って、確認された癌を有する患者由来、および健康な個体由来の試料を用いて癌を検出するためのアプタマーを特定することおよび開発することは、課題のままである。本実施例は、アプタマー標的の事前の知識なしに癌を区別するアプタマーであって、標的がその天然の環境／コンフォメーションにおいて見出されるアプタマーの選択を可能にする、1つのそのようなアプローチを記載する。
患者試料から単離された、個々のタンパク質の代わりの無傷の微小胞を、ミクロスフェアに直接結合させる。カルボキシル化ビーズは、微小胞表面タンパク質の第1級アミノ基を介して微小胞を固定化するために有用である。あるいは、微小胞を、脂質アンカリングを介して固定化することができる。上記の実施例28を参照されたい。標識ミクロスフェアにより、結合およびアプタマーライブラリーの富化を単一アッセイにおいて直接確認すること可能になる。磁気ビーズは、取扱いのための追加的な利便性を提供することができる。微小胞は、非共有結合（例えば、抗体またはアプタマー結合、吸着）を介して微小胞に結合することができるが、そのような結合は、典型的に、効率的なアプタマースクリーニングを可能にするには不十分な安定性を有する。
アプタマー開発プロセスは、これらの工程に従って行われる。
1）微小胞を、癌および正常の患者血液試料（血漿または血清）から単離する。小胞単離の前に、試料から、非常に高存在量のタンパク質（例えば、IgG、ヒト血清アルブミン（HSA））を枯渇させる。
2）単離された微小胞を、当技術分野において公知であるような標準的な二工程カルボジイミド化学を用いて、カルボキシル化ビーズに結合させる。あるいは、微小胞を、脂質アンカリングを介して結合させる。
3）小胞結合ビーズを、癌および正常の試料について並行してアプタマーライブラリーとインキュベーションする。アプタマーライブラリーを、アッセイ成分（例えば、ビーズおよび血漿コーティングビーズ）とあらかじめインキュベーションして、そのような成分に結合する任意のアプタマーを除去する。
4）結合していないアプタマーを含有する上清を廃棄する。小胞結合ビーズを、0.1％ Tween 20を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて約10回洗浄する。
5）NaOHでの処理により微小胞に結合したアプタマーを解離させ、溶液を中和し、アプタマーを沈殿させ、かつ回収されたアプタマーを、qPCRを用いて増幅する。回収されたqPCR産物は、次のラウンドの選択のため（すなわち、工程3で始まるプロセスを繰り返すため）の出発ライブラリーとして使用される。
6）ひとたびアプタマーライブラリーの複雑性が、少なくとも106メンバーまで低減すると（例えば、1015から開始して）、アプタマーを、ハイスループット次世代配列決定技術（Illumina MiSeq（登録商標）System, Illumina, Inc., San Diego, CA）を用いて配列決定する。癌および正常に特異的に富化されたアプタマープールを並行して配列決定した後、癌プールおよび正常プールの両方において重複している配列を廃棄し、癌試料の大多数に特異的な配列を、アプタマー候補として考える。
実施例31：微小胞アプタマー選択法
本実施例は、癌患者および癌を有さない対照試料（例えば、「正常」）由来の微小胞を区別するために使用され得るアプタマーを選択する方法を示す。癌は、特定の系列の癌として選択され得る。追加的な層の複雑性を提供するために、対照は、種々の病理群（例えば、選択された癌以外の条件について陽性）に分割され得る。方法は、癌由来の微小胞に結合するが、対照微小胞には結合しないアプタマーメンバーについて、アプタマーライブラリーを富化する。
スキームにおいて、「ポジティブ選択」とは、癌由来の微小胞に対するアプタマーの富化を指し、他方、「ネガティブ選択」とは、対照微小胞に結合するアプタマーの枯渇を指す。一般的に、スキームは、ネガティブ選択があらゆるポジティブ選択の間に行われるように、ポジティブ選択とネガティブ選択とを交互に行う。選択を、上述のようにビーズ結合微小胞に対して行う。
コホートの250人の血漿試料を取得する。試料のおよそ3分の1は癌患者由来であり、残りは対照である。試料をプールして5〜6試料のプールにし、約16個の癌プールを結果としてもたらす。プールした試料由来の微小胞を、上述の方法を用いてマイクロビーズに結合させる。
ポジティブ選択を、各プールについて最初に行う。次に、ネガティブ選択を行う。7回のポジティブ選択／ネガティブ選択を、並行して行う。各並行選択において、選択の偏りを回避するために、プールをランダムな順序にする。グラフ描写については、図13Bを参照されたい。各ラウンド後に、残りのアプタマープールを、次世代配列決定技術を用いて配列決定する。配列決定により、ポジティブラウンドにおいて任意の富化を、および／またはネガティブラウンドにおいて枯渇を特定することができる。任意のコンセンサス配列（配列および／または構造）もまた、各ラウンド後に特定される。特定されたコンセンサス配列が、ある特定のラウンド後に、少数のプールにおいて失われるが他においては失われていない場合、それらのプールを、いずれかのエラーが導入されているかどうかを判定するために解析することができる。
実施例32：ミクロスフェア上に結合または免疫沈降された微小胞の免疫金標識
本明細書に記載されているように、微小胞の検出および特徴決定のための標準的な方法は、ウエスタンブロット、動的光散乱、フローサイトメトリー、および電子顕微鏡法を含む。上述のように、微小胞を、マイクロビーズに結合させた抗体により捕捉し、フローベースのマイクロビーズアッセイにおいて別の標識抗体で検出することができる。実施例28を参照されたい。本免疫アッセイにおいてビーズ上に捕捉された微小胞の存在を確認するために、電子顕微鏡法を使用することができる。本実施例は、ミクロスフェア上に結合または免疫沈降された微小胞を画像化するための、免疫金標識を伴う電子顕微鏡法を提供する。
全般的な考察：微小胞を、ヒト血漿から超遠心分離により単離し、非磁気カルボキシル化ミクロスフェア（MicroPlex（登録商標）Microspheres, Luminex Corporation, Austin TX）に結合させた。結合後、ビーズを、マウス抗CD9モノクローナル抗体で、その後抗マウス免疫金（10 nm粒子）で標識し、ポリ-リジンコーティングのカバーガラス上に載せ、乾燥し、脱水し、臨界点乾燥し、炭素コーティングし、（a）微小胞を可視化するためには二次電子（SE）モード、および（b）金ナノ粒子を可視化するためには後方散乱電子（BSE）モードで走査型電子顕微鏡を用いて画像化する。
含まれる工程は、以下を含む：（i）ビーズ上の微小胞を、膜タンパク質特異的抗体および対応する抗種の金結合体で標識する工程；（ii）走査型電子顕微鏡（SEM）のための正規の試料調製工程；（iii）炭素スパッターコーティング（金-パラジウムの代わり）；（iv）SEおよびBSEの画像化の組み合わせ。
微小胞のビーズへの結合は、例えば、微小胞表面抗原に対する抗体に結合させたビーズを用いて、微小胞のビーズへの免疫沈降で置換され得る。
プロトコル：
出発材料は、MicroPlexビーズに直接結合させた微小胞試料を含む。全般的な方法論については、実施例28を参照されたい。
1．4μlアリコートの出発材料（1.5 ml微量遠心分離チューブ中）を1分間、13,000 rpmで遠心分離し、ビーズを沈殿させる。沈殿物を乱すことなく、上清を除去する。
2．20μlのブロッキング緩衝液PBS-BSAT（ウシ血清アルブミンおよびTween（登録商標）-20を含むリン酸緩衝生理食塩水：（0.1M NaPO4 pH 7.2/ 150 mM NaCl/ 1％ BSA/ 0.01％ T20））を添加し、沈殿物を再懸濁する。30分間、室温でインキュベーションする。
3．1分間、13,000 rpmで遠心分離し、ビーズを沈殿させる。上清を除去する。
4．20μlの一次抗体溶液（PBS-BSATで10または100μg/ml、マウスモノクローナル抗CD9抗体（BD Biosciencesカタログ番号555370、ロット2097575））を添加し、沈殿を再懸濁する。30分間、室温でインキュベーションする。
5．50μl PBS-BSATで3回、5分間、室温で洗浄する（1分間、13,000 rpmでの遠心分離により沈殿させ、上清を除去する）。
6．20μlの二次抗体溶液（PBS-BSATで、1:100で0.3μg/ml、抗マウス金（ヤギ抗マウス金抗体、10 nm、MP Biomedicals カタログ番号67854））を添加し、沈殿物を再懸濁する。20分間、室温でインキュベーションする。
7．50μl PBS（1×、HyClone、pH 7.4）で3回、5分間、室温で洗浄する。
8．上清を除去した後に、10μlのPBSを添加し、沈殿物を再懸濁する。
9．標識されかつ再懸濁されたビーズの2μlを、ポリ-L-リジンであらかじめコーティングされたカバーガラスに採り、穏やかに塗抹してビーズを表面上に広げる。
10．カバーガラスを加湿チャンバー中で10分間、蓋をして室温でインキュベーションする。
11．3 mlの1×PBSを含む2％グルタルアルデヒドを用いた、個々のディスポーザルペトリ皿中での、蓋をして30分間、室温での一次固定。安全フード中で作業する。
12．カバーガラスを3回、1×PBSで洗浄する。一次固定溶液を処分し、指定の危険廃棄物容器中で洗浄する。
13．1×PBS中の0.5％四酸化オスミウムを用いた、蓋をして30分間、室温で安全フード中での二次固定。
14．カバーガラスを3回、nanopure水で洗浄する。二次固定溶液を処分し、指定の危険廃棄物容器中で洗浄する。
15．カバーガラスを、一連のエタノールにおいて脱水し、ステンレス鋼の網のバスケット中に、各々5分室温で置く：1）20％エタノール；2）50％エタノール；3）75％エタノール；4）100％エタノール；5）もう2回100％エタノールを繰り返す。
16．液体二酸化炭素における臨界点乾燥（CPD）。
17．カバーガラスをアルミニウムステージ上に接着剤で載せる。
18．炭素スパッターコーティング。
19．SE（焦点合わせ）およびBSE（金の検出）を用いて画像を取得する。
結果：
上記のプロトコルに従ったビーズ結合微小胞の画像化を、図12A〜図12Eに示す。
参照文献：S.L. Erlandsen, P. T. Macechko and C. Frethem. High resolution backscatter electron (bse) imaging of immunogold with in-lens and below-the-lens field emission scanning electron microscopes. Scanning Microscopy 13:43-54 (1999)。
実施例33：微小胞に対するアプタマーの競合的単離
実施例31の方法を、関心対象の微小胞抗原に結合するアプタマーを特定するために行う。抗テトラスパニン抗体をマイクロビーズにつなぎ、前立腺癌患者からの血漿試料由来のcMVとインキュベーションする。捕捉されたcMVは、実施例31の方法における被分析物として働く。アプタマー候補を、表26中の抗体を用いて、微小胞から解離させる。
（表２６）抗体
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方法を、表26中の抗体の代わりになるアプタマーを開発するために使用する。アプタマーを、関心対象の微小胞の捕捉および／検出のために使用する。方法を、EGFR、TOMM22、NDRG1、VDAC2、KLK6、MMP7、EDIL3 (del-1) 、CCR5、BDNF、Hsp10、GOLPH2、Hsp40/DNAJB1、KLK4、LGALS3BP、p130 /RBL2、SCARB2、スタニオカルシン2 /STC2、TGN46 /TGOLN2、ANXA2、TMPRSS1、KLK14、SPEN/ RBM15、ME1、PhIP、ALDOA、MMP25、NCL、EDNRB/EDN3、MTA1、CDH1、KLK15、CHRDL2、CXCR3に対するアプタマーを開発するために使用する。方法を、CD81、EDN-3、チトクロームC、CD10、CD151、セプラーゼ/FAP、HGF、PAP、CD41、IGFBP-2、TWEAK、MMP 2、H3F3A、DDX1、99-14-3-3ζ/β、IDH2、CD49d、KLK12、DCTN2-50、ヒストンH4、EDIL3 (del-1) 、CD9、COX2、hnRNP M1-M4、CDH2、SPEN/ RBM15、81-プロヒビチン、SYT9に対するアプタマーを開発するために使用する。これらのアプタマーを、抗Eカドヘリン（CDH1）抗体または関心対象の微小胞を検出する捕捉／検出物質ペアのためのアプタマーと共に使用する。前立腺癌試料を非前立腺癌試料から識別する微小胞が、特定される。
本発明の好ましい態様が、本明細書において示されかつ記載されてきたが、そのような態様は例としてのみ提供されていることが、当業者に明らかであろう。本発明から逸脱することなく、多数の変形、変化、および置換が、今や当業者の心に浮かぶであろう。本明細書に記載されている本発明の態様についての種々の代替物が、本発明を実施する上で使用されてもよいことが、理解されるべきである。添付の特許請求の範囲が本発明の範囲を規定すること、ならびに、添付の特許請求の範囲内の方法および構造ならびにそれらの等価物がそれによりカバーされることが、意図される。

Claims (18)

  1. (a)複数種のオリゴヌクレオチドを提供する工程であって、該オリゴヌクレオチドは微小胞タンパク質に結合するように事前に選択され、該複数種のオリゴヌクレオチドは、異なる結合配列を有する少なくとも5種のメンバーを含む、工程；
    (b)癌を有する、または癌を有することが疑われる対象由来の微小胞を含む生物学的試験試料を提供する工程；
    (c)生物学的試験試料を、複数種のオリゴヌクレオチドと接触させる工程；
    (d)工程(c)で生物学的試験試料中の微小胞と複合体を形成した複数種のオリゴヌクレオチドのメンバーそれぞれの存在またはレベルを検出するために、複数種のオリゴヌクレオチドのメンバーの配列決定を実施する工程；および
    (e)工程(d)で検出された存在またはレベルを参照レベルと比較する工程であって、それによって癌を特徴決定する、工程
    を含む、癌を特徴決定する方法。
  2. 複数種のオリゴヌクレオチドが、少なくとも一段階のポジティブ選択および/またはネガティブ選択を通して事前に選択されており、ポジティブ選択が、試験試料と実質的に類似した癌を有する試料に対するオリゴヌクレオチドの選択を含み、かつネガティブ選択が、試験試料に比べて実質的に異なる癌を有するか、もしくは癌を有さない試料に対するオリゴヌクレオチドの選択を含む、請求項1記載の方法。
  3. 工程(d)の配列決定が、ハイスループット配列決定を含む、請求項1または2記載の方法。
  4. 対象が、癌の素因を有する、請求項1〜2のいずれか一項記載の方法。
  5. 生物学的試験試料が、組織試料、細胞培養物、または生物学的流体を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
  6. 生物学的流体が体液を含み、任意で該体液が、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（CSF）、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液もしくは尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、涙液、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤胞腔液、または臍帯血を含む、請求項5記載の方法。
  7. 生物学的試験試料を、微小胞の単離前に複数種のオリゴヌクレオチドと接触させる、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
  8. 生物学的試験試料が、単離された微小胞を含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
  9. 複数種のオリゴヌクレオチドの少なくとも1種のメンバーが、表3または表4のバイオマーカーに結合する、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
  10. 複数種のオリゴヌクレオチドのすべてのメンバーが標的ポリペプチドまたはその断片に結合し、任意で該ポリペプチドまたはその断片が可溶性であるか膜結合性であり、かつ任意で該ポリペプチドまたはその断片が、表3または表4のバイオマーカーを含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
  11. 複数種のオリゴヌクレオチドの少なくとも1種のメンバーが、微小胞表面抗原に結合する、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
  12. 複数種のオリゴヌクレオチドのすべてのメンバーが、標的微小胞表面抗原に結合する、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
  13. 癌が、急性リンパ芽球性白血病；急性骨髄性白血病；副腎皮質癌；AIDS関連癌；AIDS関連リンパ腫；肛門癌；虫垂癌；星状細胞腫；非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍；基底細胞癌；膀胱癌；脳幹神経膠腫；脳腫瘍（脳幹神経膠腫、中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、星状細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、上衣腫、髄芽腫、髄上皮種、中間型松果体実質腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、および松果体芽腫を含む）；乳癌；気管支腫瘍；バーキットリンパ腫；原発不明癌；カルチノイド腫瘍；原発不明癌腫；中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍；中枢神経系胚芽腫；子宮頸癌；小児癌；脊索腫；慢性リンパ球性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖性疾患；結腸癌；結腸直腸癌；頭蓋咽頭腫；皮膚T細胞リンパ腫；内分泌膵島細胞腫瘍；子宮内膜癌；上衣芽腫；上衣腫；食道癌；鼻腔神経芽細胞腫；ユーイング肉腫；頭蓋外胚細胞腫瘍；性腺外胚細胞腫瘍；肝臓外胆管癌；胆嚢癌；胃癌；消化管カルチノイド腫瘍；消化管間質細胞腫瘍；消化管間質腫瘍（GIST）；妊娠性絨毛性腫瘍；神経膠腫；毛様細胞性白血病；頭頸部癌；心臓癌；ホジキンリンパ腫；下咽頭癌；眼内黒色腫；膵島腫瘍；カポジ肉腫；腎臓癌；ランゲルハンス細胞組織球症；喉頭癌；口唇癌；肝臓癌；肺癌；悪性線維性組織球腫；骨癌；髄芽腫；髄上皮種；黒色腫；メルケル細胞癌；メルケル細胞皮膚癌；中皮腫；原発不明転移性扁平上皮性頸部癌；口腔癌；多発性内分泌腫瘍症候群；多発性骨髄腫；多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍；菌状息肉腫；骨髄異形成症候群；骨髄増殖性腫瘍；鼻腔癌；鼻咽頭癌；神経芽細胞腫；非ホジキンリンパ腫；非黒色腫皮膚癌；非小細胞肺癌；口腔癌；口腔癌；口腔咽頭癌；骨肉腫；その他の脳および脊髄の腫瘍；卵巣癌；卵巣上皮癌；卵巣胚細胞腫瘍；卵巣低悪性度腫瘍；膵臓癌；乳頭腫症；副鼻腔癌；副甲状腺癌；骨盤癌；陰茎癌；咽頭癌；中間型松果体実質腫瘍；松果体芽腫；下垂体腫瘍；形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫；胸膜肺芽腫；原発性中枢神経系（CNS）リンパ腫；原発性肝細胞肝癌；前立腺癌；直腸癌；腎臓癌；腎細胞（腎臓）癌；腎細胞癌；気道癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；唾液腺癌；セザリー症候群；小細胞肺癌；小腸癌；軟部組織肉腫；扁平上皮癌；頸部扁平上皮癌；胃癌；テント上原始神経外胚葉性腫瘍；T細胞リンパ腫；精巣癌；咽喉癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺癌；移行上皮癌；腎盂尿管移行上皮癌；絨毛性腫瘍；尿管癌；尿道癌；子宮癌；子宮肉腫；膣癌；外陰癌；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；またはウィルムス腫瘍を含む、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
  14. 複数種のオリゴヌクレオチドが、異なる結合配列を有する少なくとも10種のメンバーを含む、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
  15. 複数種のオリゴヌクレオチドが、異なる結合配列を有する少なくとも20種のメンバーを含む、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
  16. 複数種のオリゴヌクレオチドが、異なる結合配列を有する少なくとも50種のメンバーを含む、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
  17. 微小胞が、クロマトグラフィー法、ろ過法、限外ろ過法、遠心分離法、超遠心分離法、フローサイトメトリー法、アフィニティー捕捉法、および／またはマイクロ流体工学を使用して単離される、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法。
  18. 参照と比較した、微小胞との複合体を形成した複数種のオリゴヌクレオチドのいくつかまたは全ての存在またはレベルの変化が、試料が癌性であることまたは癌性の素因を有することを示す、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
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