CN115806993B - 特异识别人绒毛促性腺激素的核酸适配体hcg-2 - Google Patents
特异识别人绒毛促性腺激素的核酸适配体hcg-2 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物医药领域，具体涉及特异识别人绒毛促性腺激素的核酸适配体HCG‑2。具体地，所述核酸适配体的序列如SEQ ID NO.1或2所示。如本发明所提供的SEQ ID NO.2所示的HCG‑2S是SEQ ID NO.1所示核酸适配体的截短体，是特异性结合hcg的核心结构，在HCG‑2S的任意一端增加一个或多个核苷酸还可以起到特异性结合hcg的功能。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及特异识别人绒毛促性腺激素的核酸适配体HCG-2。
背景技术
人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hcg)是一种由胎盘绒毛膜囊泡的滋养层细胞分泌的糖蛋白激素，由α亚基和β亚基两条不同的亚基和244种氨基酸组成，分子量约为36.7kda。在结构上，α亚基与很多激素如促甲状腺激素、卵泡刺激素等相似，而β亚基是hcg特有的，故临床上hcg检测主要是利用β亚基的特异性。胎盘可产生hcg，滋养层细胞瘤、含滋养层组织的生殖细胞瘤以及一些非滋养层细胞瘤也可产生hcg。妊娠妇女血清中主要含有完整分子的hcg，其浓度会在怀孕早期呈指数型增长，并与时间有关，这对维持妊娠起着重要作用。
若hcg数值的变化不规律，特定时间过高或者过低，说明妊娠异常。检测结果的异常偏高提示绒毛膜癌、葡萄胎或多胎妊娠可能，检测结果偏低则提示先兆/早期流产、异位妊娠、妊娠中毒或胎儿宫内死亡。结合甲胎蛋白检测和准确的孕龄、孕妇体重等其他参数，检测hcg+β有助于在孕中期评价21三体综合征的风险，21三体孕妇的血清甲胎蛋白浓度降低，而母体血清hcg+β浓度可达到正常中位值的两倍。监测人绒毛膜促性腺激素水平可以预测妊高征的发生，对妊娠期高血压疾病的病程诊断有着重要的指导意义。hcg也是一种重要的血清和尿液肿瘤标志物，与妊娠无关的hcg浓度升高还可见于生殖细胞、卵巢、膀胱、胰腺、胃、肺和肝脏肿瘤病人。目前常用的检测方法有：胶乳集抑制试验和血凝抑制试验、放射免疫试验(RIA)、吸附试验(ELISA)、单克隆抗体胶体金试验。
指数富集的配基系统进化技术，简称SELEX(Systematic volution of Ligandsby EXponential Enrichment)技术，是近十几年兴起并迅速得到发展的高通量生物文库筛选技术。应用大容量的随机寡核苷酸文库(ssDNA文库和RNA文库)，结合PCR体外扩增技术，以指数级富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过反复的体外筛选、扩增，最终获得的核酸适配体(aptamer)基于空间结构与靶分子呈高特异性和高亲和力的结合。
核酸适配体具有精确识别、无免疫原性、易体外合成与修饰等优点，又称为“人工替代抗体”，在基础医学、临床诊断与新药研发等方面具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明通过SELEX技术以人绒毛膜促性腺激素作为靶标，筛选获得了一组特异识别人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hcg)的核酸适配体HCG-2及其在识别人绒毛膜促性腺激素中的应用。所述核酸适配体是DNA序列，不仅可以直接用于诊断，还可以作为分子探针构建生物检测传感器等。经鉴定该核酸适配体及其截短序列均能够特异识别人绒毛膜促性腺激素，而不结合其它无关蛋白(BSA蛋白)，对照核酸序列与人绒毛膜促性腺激素均无结合。
具体技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种核酸适配体，所述核酸适配体的序列选自以下任意一种：
(1)如SEQ ID NO.1或2所示；
(2)与(1)所示序列具有至少85％的同源性；
(3)与(1)(2)中任一项部分互补或完全互补。
优选地，所述核酸适配体还可以是相对于SEQ ID NO.1或2所示序列增加或删减1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核苷酸得到的特异性结合hcg的核酸分子。
优选地，所述至少85％的同源性包括至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源性的核酸分子。
如本发明所述，术语“核酸适配体”是指一种能和靶分子特异性结合的单链寡核苷酸，本发明提供的核酸适配体与hcg之间的结合反应是非随机的。本发明中，所述靶分子是hcg。术语“hcg”、“HCG”、“hCG”、“human chorionic gonadotropin”、“人绒毛膜促性腺激素”表示相同含义，可互换使用。
如本发明所提供的SEQ ID NO.2所示的HCG-2S是SEQ ID NO.1所示核酸适配体的截短体，是特异性结合hcg的核心结构，在HCG-2S的任意一端增加一个或多个核苷酸还可以起到特异性结合hcg的功能。
另一方面，本方面提供了可检测标记物标记的核酸适配体。
优选地，所述标记可以是通过化学键连接或物理吸附。
优选地，所述可检测标记物包括放射性标记物、化学发光标记物、荧光标记物、亲和素，生物素，地高辛，或酶。
优选地，所述放射性标记物包括例如3H、14C、32P、33P、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho和153Sm。
优选地，所述化学发光标记物包括鲁米诺及其衍生物、光泽精(Lucigenin)、过氧草酸酯(Peroxyoxalate)等。
优选地，所述荧光标记物包括但不限于FAM(羧基荧光素，Carboxy fluorescein)、FITC(异硫氰酸荧光素，Fluorescein isothiocyanate)、TET(四氯-6-羧基荧光素，Tetrachloro fluorescein)、HEX(六氯-6-甲基荧光素，Hexachloro fluorescein)、JOE(2,7-二甲基-4,5-二氯-6-羧基荧光素)、罗丹明类(Rhodamine染料如R110、TAMRA、Texas Red等)、ROX、AlexaFluor染料(如Alexa 350、Alexa 405)、ATTO染料(如ATTO 390、ATTO 425、ATTO 465)、DyLight染料、cyanine染料(如Cy2、Cy3、Cy5.5、Cy7、Cy7.5)、FluoProbes染料、SulfoCy染料、Seta染料、IRIS染料、SeTau染料、SRfluor染料、Square染料。
优选地，所述酶包括辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP)、荧光素酶、水母发光蛋白。
优选地，所述可检测标记物可以发出可检测信号。优选地，所述可检测信号包括光学信号或电学信号。所述光学信号包括荧光信号、光吸收信号、红外吸收信号、拉曼散射信号或化学发光信号。
如本发明具体实施例所使用的可检测标记物是生物素，其标记核酸适配体的方法是本领域常规的。
优选地，所述核酸适配体、可检测标记物标记的核酸适配体在日常储存中可固定于合适的固相载体上，以便于更方便、可视化的检测、鉴定hcg；或者所述核酸适配体、可检测标记物标记的核酸适配体也可以存储与合适的液体中以保持其稳定性，例如水、缓冲液。
优选地，所述固相载体的实例有：基板、树脂、平板(例如多孔平板)、滤器、药筒、柱、多孔材料。基板可以是用于DNA芯片、蛋白质芯片等中的那些；例如，镍-PTFE(聚四氟乙烯)基板、玻璃基板、磷灰石基板、硅基板、氧化铝基板等，以及通过使用聚合物等包覆这些基板而制备的基板。树脂的实例有：琼脂糖颗粒、二氧化硅颗粒、丙烯酰胺与N，N’-亚甲基双丙烯酰胺的共聚物、聚苯乙烯交联的二乙烯基苯颗粒、使用表氯醇交联的葡聚糖颗粒、纤维素纤维、芳基葡聚糖与N，N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联聚合物、单分散系的合成聚合物、单分散系的亲水性聚合物、琼脂糖(Sepharose)、Toyopearl等，还包括通过将各种官能团结合至这些树脂而制备的树脂。
另一方面，本发明提供了一种靶向hcg探针的制备方法，所述方法包括合成本发明所提供的核酸适配体，并用可检测标记物标记。
优选地，所述合成包括生物合成(如PCR扩增)或化学合成。
另一方面，本发明提供给了一种检测hcg的方法，所述方法包括将待测物与本发明所述核酸适配体或可检测标记物标记的核酸适配体接触。
优选地，所述待测物包括采集自人体的样品。
优选地，所述待测物中疑似含有hcg。
优选地，所述样品包括外周血、组织、血液、血清、血浆、尿液、唾液、精液、乳汁、脑脊髓液、泪液、痰、粘液、淋巴、胞液、腹水、胸膜积液、羊水、膀胱冲洗液和支气管肺泡灌洗液。
优选地，所述样品包括尿液和血液。
优选地，所述方法是非诊断目的的。
优选地，所述接触保持至少5、10、15、20、30、40分钟或更长时间。
优选地，所述方法还包括使用报告集团使检测结果可视化的步骤。
优选地，所述核酸适配体或其衍生物是经过变性处理的。
更优选地，所述变性处理的具体步骤是：将核酸适配体溶解在缓冲液中，100℃变性后冷却；
优选地，所述缓冲液的成分是50mM HEPES,100mM NaCl，2mM MgCl2，5mM KCl，1mMCaCl2。
另一方面，本发明还提供了本发明核酸适配体、可检测标记物标记的核酸适配体在特异性结合hcg中的应用。
优选地，所述特异性结合是在体外发生的、非诊断目的的。
优选地，所述检测包括定量检测或定性检测，所述定性检测的结果包括待测物中“存在”或“不存在”hcg。
因此，通过使用本发明的核酸适配体作为探针，通过与酶免疫测定(EIA)(例如，直接竞争性ELISA、间接竞争性ELISA、夹心式ELISA)、放射免疫测定(RIA)、荧光免疫测定(FIA)，Western印迹法(例如在Western印迹法中用以代替二抗)、免疫组织化学染色法、细胞分选法等方法相同的方式可以进行检测和定量。这些方法可用于例如，测定生物体或生物样品中的hcg的量，以及用于诊断与hcg相关的疾病。
另一方面，本发明还提供了本发明核酸适配体、可检测标记物标记的核酸适配体在制备诊断hcg相关症状的产品中的应用。
优选地，所述hcg相关症状包括受孕、绒毛膜癌、葡萄胎、多胎妊娠、先兆/早期流产、异位妊娠、妊娠中毒、胎儿宫内死亡、21三体综合征、妊娠期高血压疾病、生殖细胞肿瘤、卵巢肿瘤、膀胱肿瘤、胰腺肿瘤、胃肿瘤、肺肿瘤和肝脏肿瘤。
附图说明
图1是HCG-2特异结合人绒毛促性腺激素hCG的EMSA实验结果图。
图2是酶联法检测的结果统计图。
图3是梯度浓度核酸适配体进行酶联法检测的结果统计图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1、EMSA实验验证核酸适配体的特异性
1、实验材料
(1)人绒毛膜促性腺激素：华阳正龙货号：201215
(2)牛血清白蛋白(BSA)：北京中生奥邦生物公司货号：01.10001D
(3)生物素标记的核酸适配体：生工合成，具体序列如表1所示
(4)HRP酶：Solarbio货号898800
表1、核酸适配体的序列
2、实验方法
2.1分别将一定浓度的Bio-HCG-2适配体和无关对照序列Bio-AAAA溶解于合适体积的缓冲液中(50mM HEPES,100mM NaCl，2mM MgCl2，5mM KCl，1mM CaCl2)，于100℃变性5min后立即置于冰上充分冷却；
2.2将经过变性处理后的Bio-HCG-2与人绒毛促性腺激素hCG蛋白(或者无关蛋白BSA)在37℃共孵育40min；
2.3适配体与人绒毛促性腺激素hCG的共同孵育体系加入10×DNA上样缓冲液，6％天然PAGE胶电泳分离；
2.4卸胶后转模，紫外交联2min后封闭液封闭30min；
2.5将膜放入按照1:1000稀释好的HRP酶中，室温孵育40min，将膜取出并洗膜2次，每次10min；
2.6加TMB底物显色并留图。
3、实验结果
如图1所示，EMSA实验证明核酸适配体HCG-2特异结合人绒毛促性腺激素hCG，而不结合其它无关蛋白(BSA蛋白)。
实施例2、酶联法验证核酸适配体的特异性
1、实验材料
同实施例1。
2、实验方法
2.1将一定量的人绒毛促性腺激素hCG融于pH 9.7的碳酸盐缓冲液中，按照100μl/孔加入到酶联条中，4℃包被过夜；
2.2弃包被液，每孔加入100μl含2％ BSA封闭液，室温封闭60min；
2.3分别将一定浓度的Bio-HCG-2/Bio-HCG-2S适配体和无关对照序列Bio-AAAA溶解于合适体积的缓冲液中(50mM HEPES,100mM NaCl，2mM MgCl2，5mM KCl，1mM CaCl2)，于100℃变性5min后立即置于冰上充分冷却；
2.4将经过变性处理后的生物素标记的HCG核酸适配体和无关对照序列Bio-AAAA加入酶联条中，使核酸适配体与包被的人绒毛促性腺激素hCG蛋白共同孵育37℃30min；
2.5弃去孔内液体，每孔用200μl的洗涤液洗涤，重复洗涤3次，最后一次洗涤后要把孔内液体完全甩干；
2.6每孔加入100μl按照1:100稀释好的HRP酶，室温孵育40min，弃去孔内液体，洗板5次，方法同上；
2.7每孔加入100μl TMB显色底物，37℃避光显色，当有明显颜色变化时，加10μl终止液，酶联仪读数。
3、实验结果
酶联仪读数结果统计如图2所示，ELISA实验证明核酸适配体HCG-2及其截短序列HCG-2S均可特异结合人绒毛促性腺激素hCG。
实施例3、浓度梯度结合实验
1、实验材料
同实施例1。
2、实验方法
2.1将一定量的人绒毛促性腺激素hCG融于pH 9.7的碳酸盐缓冲液中，按照100μl/孔加入到酶联条中，4℃包被过夜；
2.2弃包被液，每孔加入100μl含2％ BSA封闭液，室温封闭60min；
2.3分别将0μg、0.5μg、1μg、2μg、3μg的Bio-HCG-2/Bio-HCG-2S适配体和无关对照序列Bio-AAAA溶解于合适体积的缓冲液中(50mM HEPES,100mM NaCl，2mM MgCl2，5mM KCl，1mM CaCl2)，于100℃变性5min后立即置于冰上充分冷却；
2.4将经过变性处理后的生物素标记的Bio-HCG-2/Bio-HCG-2S和无关对照序列Bio-AAAA加入酶联条中，使核酸适配体与包被的人绒毛促性腺激素hCG蛋白共同孵育37℃30min；
2.5弃去孔内液体，每孔用200μl的洗涤液洗涤，重复洗涤3次，最后一次洗涤后要把孔内液体完全甩干；
2.6每孔加入100μl按照1:100稀释好的HRP酶，室温孵育40min，弃去孔内液体，洗板5次，方法同上；
2.7每孔加入100μl TMB显色底物，37℃避光显色，当有明显颜色变化时，加10μl终止液，酶联仪读数。
3、实验结果
酶联仪读数结果统计如图3所示，ELISA实验证明核酸适配体HCG-2及其截短序列HCG-2S与人绒毛促性腺激素的结合有浓度梯度，而对照序列AAAA则没有。
Claims (15)
1.一种核酸适配体，所述核酸适配体的序列如SEQ ID NO.1或2所示。
2.可检测标记物标记的核酸适配体，所述核酸适配体的序列如SEQ ID NO.1或2所示，所述可检测标记物为放射性标记物、化学发光标记物、荧光标记物、亲和素、生物素、地高辛或酶。
3.如权利要求2所述核酸适配体，所述放射性标记物为3H、14C、32P、33P、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho和153Sm。
4.如权利要求2所述核酸适配体，所述化学发光标记物为鲁米诺及其衍生物、光泽精或过氧草酸酯。
5.如权利要求2所述核酸适配体，所述荧光标记物为FAM、FITC、TET、HEX、JOE、罗丹明类染料、ROX染料、AlexaFluor染料、ATTO染料、DyLight染料、cyanine染料、FluoProbes染料、SulfoCy染料、Seta染料、IRIS染料、SeTau染料、SRfluor染料或Square染料。
6.如权利要求2所述核酸适配体，所述酶为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素酶。
7.一种靶向hcg探针的制备方法，所述方法包括合成权利要求1所述的核酸适配体，并用可检测标记物标记。
8.如权利要求7所述制备方法，所述合成为生物合成或化学合成。
9.权利要求1所述核酸适配体，或，权利要求2所述可检测标记物标记的核酸适配体在制备特异性结合hcg、检测hcg的产品中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，所述检测通过以下任意方法实现：酶免疫测定、放射免疫测定、荧光免疫测定、Western印迹法、免疫组织化学染色法或细胞分选法。
11.如权利要求9所述的应用，所述检测所针对的待测物为采集自人体的样品。
12.如权利要求11所述的应用，所述样品为组织、血液、血清、血浆、尿液、唾液、精液、乳汁、脑脊髓液、泪液、痰、淋巴、胞液、腹水、胸膜积液、羊水、膀胱冲洗液和支气管肺泡灌洗液。
13.如权利要求11所述应用，所述样品为尿液和血液。
14.权利要求1所述核酸适配体，或，权利要求2所述可检测标记物标记的核酸适配体在制备诊断hcg相关症状的产品中的应用。
15.如权利要求14所述应用，所述hcg相关症状为受孕、绒毛膜癌、葡萄胎、多胎妊娠、先兆/早期流产、异位妊娠、妊娠中毒、胎儿宫内死亡、21三体综合征、妊娠期高血压疾病、生殖细胞肿瘤、卵巢肿瘤、膀胱肿瘤、胰腺肿瘤、胃肿瘤、肺肿瘤和肝脏肿瘤。
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