KR20040036676A

KR20040036676A - 시그날링 압타머의 시험관내 선별 방법

Info

Publication number: KR20040036676A
Application number: KR10-2003-7005848A
Authority: KR
Inventors: 엘링톤앤드류디; 라젠드란마뉴라; 챠베리술레이디팍쿠마
Original assignee: 리서치 디벨럽먼트 파운데이션
Priority date: 2000-10-27
Filing date: 2001-10-26
Publication date: 2004-04-30
Also published as: US20020127581A1; WO2002034935A3; US6706481B2; CA2427109A1; EP1409720A4; WO2002034935A2; EP1409720A2; WO2002034935A8

Abstract

본 발명은 DNA가 특정한 비대칭 몰 비의 뉴클레오티드의 무작위 삽입물을 갖는 DNA 풀을 합성하는 단계; 이러한 DNA 풀을 증폭시키는 단계; 형광-표지된 뉴클레오티드를 사용하여, 상기와 같이 증폭시킨 DNA로부터 RNA 풀을 전사하는 단계; 상기 형광-표지된 RNA 풀을 친화성 칼럼에 적용하여, 고친화성 형광성 RNA 분자를 상기 형광-표지된 RNA 풀로부터 제거하는 단계; 상기 고친화성 형광성 RNA 분자로부터 cDNA 풀을 수득하는 단계; 형광성 RNA 분자에 대해 상기 증폭 및 선별 단계를 반복하는 단계; 및 상기 형광성 RNA 분자를 클로닝하여 시그날링 압타머를 생성시키는 단계를 포함하는, 시그날링 압타머를 시험관 내에서 선별하는 방법을 제공해준다. DNA 분자를 포함하는 시그날링 압타머를 또한 선별한다. 또한, 리간드 결합시 통상적인 변화를, 시그날링 압타머의 형광 세기 변화로 변환시키는 시그날링 압타머가 제공된다.

Description

시그날링 압타머의 시험관내 선별 방법{In vitro selection of signaling aptamers}

광범위한 표적과 결합하는 핵산 결합 종[압타머(aptamer)]는 무작위 서열 집단으로부터 용이하게 선별된다^3-6. 선별된 압타머는 아미노산⁷과 같이 간단한 분자를 인식할 수 있거나 또는 적혈구 세포막⁸과 같이 복잡한 분자를 인식할 수 있다. 화학적으로 변형된 염기를 압타머 내로 혼입하게 되면, 이들의 안정성이 상당히 개선되므로, 혈청 또는 뇨 샘플을 이용한 균질성 검정에 이들 압타머를 사용하는 것이 적합해질 것이다.

분자상 인식을 광학 시그날로 직접적으로 변환시킬 수 있는 무시약 바이오센서(reagentless biosensor)는 광범위한 분석물에 대한 센서 어레이의 개발을 증대시킬 수 있다. 다능성 핵산 결합 종, 즉 압타머는 용이하게 선별되긴 하지만, 바이오센서 적용에 맞도록 적응시키는 것은 어려울 수 있다. 선별된 핵산 결합 종(압타머)이 바이오센서로서 작용하도록 적응시키는 것은 수 많은 진단 적용 분야 개발을 추가로 증대시킬 수 있다^1,2.

압타머 바이오센서에 대한 초기 단계 수준의 몇 가지 예가 이미 개발된 바 있다. 레이저 유도된 형광과 접목된 모세관 전기영동(CE-LIF) 및 형광-표지된 압타머가 용액 중의 트롬빈과 IgE를 민감하게 검측하는데 사용되어 왔다. 유리 지지체 상에 고정화된 표지된 항-트롬빈 압타머는, 소멸파(evanescent-wave)-유도된 형광 이방성(anisotropy)이 변화된 후, 용액 중의 트롬빈을 검측할 수 있다¹⁰. 표지된 항-CD4 압타머는 사람 CD4를 발현하는 마우스 T 세포를 염색하는데 사용한다¹¹. 표지된 항-사람 호중구 엘라스타제(HNE) 압타머는 비드 상의 사람 호중구 엘라스타제를 검측하기 위한 항-항-사람 호중구 엘라스타제 항체로서 유효하다¹².

그러나, 이들 분석 방법은 본질적으로, 항체를 이용하여 이미 개발된 방법을 모방하고 있으며, 일반적으로는, 세척이나 기타 분리 기술을 수행한 후에 결합에 대해 간접적으로 판독해 내는 방식에 의존하고 있다. 이와는 대조적으로, 분석물의 존재를 직접적으로 시그날링할 수 있는 분자가 바이오센서로서 상당히 유용한 것으로 입증되고 있다¹³. 예를 들면, 이의 결합 부위 가장자리에 형광성 염료를 표지시킨 이. 콜라이(E. coli) 포스페이트 결합성 단백질의 돌연변이체는 무기 포스페이트 결합시 현저한 형광성 증가를 나타내었다¹⁵. 유사하게 표지된 말토즈 결합성 단백질은 용액 중의 말토즈를 정량적으로 검측하는 반면¹⁶, 표지된 글루코즈 결합성 단백질은 글루코즈를 검측한다¹⁷. 수용체와 공여체 형광단 둘 모두를 cAMP-의존성 단백질 키나제에 접합시켜, 형광 공명 에너지 전이(FRET)가 cAMP에 의해 조정되는 센서를 생성시켰다¹⁸.

작은 분자와 결합하는 압타머는 이들의 동족(cognate) 리간드와의 상호작용시 입체구조 상의 변화를 겪는 것으로 밝혀졌다^19,20. 입체구조 상의 변화를 겪는 것으로 공지된 영역에서 압타머 내로 도입된 리포터(reporter) 형광단은 결합 사건 후에 형광 세기의 변화를 초래할 수 있다. 그러나, 이러한 형광단의 도입으로 인해, 결합 에너지가 상당히 손실될 수 있는데, 이는 입체구조상 평형 상태의 교란 또는 입체 장애 때문인 것으로 예상된다.

작용성 핵산이 제한된 화학을 나타내는 4개의 단량체 만을 함유하고, 뉴클레오티드가 상호-의존적인 왓슨-크릭(Watson-Crick) 쌍에 근거하여 핵산 구조가 대부분 예측되고 있다고 가정해 보면, 소정의 뉴클레오티드가 실질적으로 고갈된 무작위 서열 풀(pool)로부터 결합 종 및 촉매를 선별할 수 있다는 것은 놀라운 일이다. 그러나, 로저스(Rogers)와 조이스(Joyce)²²는, 바르텔(Bartel) I형 리가제를 연속적으로 발전시킴으로써, 시티딘이 결여된 리보자임을 선별할 수 있다는 사실을 밝혀내었다. 뉴클레오티드 중의 하나가 고갈된 풀(pool)로부터 압타머와 리보자임을 선별할 수 있지만, 상실된 화학 및 구조에 대한 기능상의 대가는 분명히 치뤄야 한다. C-결여된 리보자임은 시티딘을 함유하는 필적하는 리보자임 보다 대략 100 내지 10,000배 정도 더 느리다.

따라서, 리간드-결합과 형광성 시그날링 간의 명백한 부조화를 감소시키는 것이 유리하다. 처음부터, 소수의 동일한 형광성 뉴클레오티드 잔기 만을 함유하는 시그날링 압타머를 생성시키는 선별 방법이 이러한 수단을 제공해준다. 이들 선별된 시그날링 압타머는, 이들의 압타머의 광범위한 분자상 인식 특성과 시그날 변환을 접목시켜 준다.

선행 기술은 시그날링 압타머에 대한 시험관내 선별 방법이 결여되어 있다는 점에서 결함이 있다. 본 발명은 이러한 당해 분야의 오랜 숙원과 요망을 충족시켜 준다.

발명의 요약

본 발명은 DNA가 특정한 비대칭 몰 비의 뉴클레오티드의 무작위 삽입물을 갖는 DNA 풀(pool)을 합성하는 단계; 이러한 DNA 풀을 증폭시키는 단계; 이와 같이 증폭시킨 DNA로부터 RNA 풀을 전사하는 단계(여기서, 이러한 RNA 전사에 사용된 뉴클레오티드는 형광-표지시킨다); 상기 형광-표지된 RNA 풀을 친화성 칼럼에 적용하여, 고친화성 형광성 RNA 분자를 상기 형광-표지된 RNA 풀로부터 제거하는 단계; 상기 고친화성 형광성 RNA 분자로부터 cDNA 풀을 수득하는 단계; 형광성 RNA 분자에 대한 상기 증폭 및 선별 단계를 반복하는 단계; 및 상기 형광성 RNA 분자를 클로닝하는 단계(이로써 생성되는 클론은 시그날링 압타머를 포함한다)를 포함하는, 시그날링 압타머를 시험관 내에서 선별하는 방법을 제공해준다.

본 발명은 또한, DNA가 뉴클레오티드의 무작위 삽입물을 갖고 이러한 뉴클레오티드가 특정한 비대칭 몰 비를 포함하는 DNA 풀을 합성하는 단계; 이러한 DNA 풀을 증폭시키는 단계(여기서, 이러한 DNA 증폭에 사용된 뉴클레오티드는 하나 이상의 리포터 분자로 표지시킨다); 이와 같이 증폭시킨 DNA로부터 상기 표지된 단일 가닥 DNA를 분리하는 단계; 상기 표지된 단일 가닥 DNA 풀을 친화성 칼럼에 적용하여, 고친화성 표지된 DNA 분자를 상기 표지된 DNA 풀로부터 제거하는 단계; 상기 고친화성 표지된 DNA 풀이 상기 친화성 칼럼 상에 보유되도록 단계 (a) 내지 (d)를 반복하는 단계; 및 상기와 같이 보유시킨 표지된 DNA 분자를 클로닝하는 단계(이로써 생성된 클론은 시그날링 압타머를 포함한다)를 포함하는, 시그날링 압타머를 시험관 내에서 선별하는 방법을 제공해준다.

본 발명의 또 다른 양태에서는, 리간드 결합시 입체구조 상의 변화를, 해당 시그날링 압타머의 RNA 서열 내로 혼입된 형광-표지된 뉴클레오티드의 형광 세기 변화로 변환시키는 시그날링 압타머가 제공된다. 부가적으로, 상기 형광-표지된 뉴클레오티드를 DNA 시그날링 압타머 내로 혼입시킬 수 있다.

본 발명의 바람직한 양태에서는, 플루오레세인화 RNA 항-아데노신 시그날링 압타머가 제공된다.

본 발명은 일반적으로 생화학 및 핵산 화학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로 언급하면, 본 발명은 1개 내지 3개의 형광-표지된 동일한 뉴클레오티드를 함유하는 RNA 핵산 결합 종(species)을 시험관 내에서 선별하는 방법에 관한 것이다.

상기 언급된 본 발명의 특징, 이점 및 목적 뿐만 아니라 명백해질 기타 내용들이 획득되고 보다 상세히 이해될 수 있기 때문에, 상기에 간단하게 요약된 본 발명의 보다 특정한 기재 내용이 첨부된 도면에 예시되는 이의 특정한 양태를 참조할 수 있다. 이들 도면은 본 명세서의 일부이다. 그러나, 첨부된 도면은 본 발명의 바람직한 양태를 예시하기 위한 것이므로, 이로써 본 발명의 범위가 제한되지 않는다는 것을 인지해야 한다.

도 1A는 선별에 사용된 RNA 풀의 서열을 도시한 것이다. 이러한 풀의 51-뉴클레오티드 무작위 서열 영역은 비대칭적이다(33.1% A, C 및 G, 6% U). 우리딘 잔기는 F-12-U로 완전히 대체시킨다.

도 1B는 사산파르(Sassanfar)와 스조스탁(Szostak)²³에 의해 선별된 최소한의 항-아데노신 압타머를 도시한 것이다.

도 1C는 클로닝된 압타머로부터의 51개 뉴클레오티드 무작위 영역의 서열을 도시한 것이다. 동일한 클론의 수가 괄호 안에 제시되어 있다. 밑줄친 잔기는 계열 1 및 계열 2의 서열에 의해 공유된 6개-뉴클레오티드 모티프를 지시한다.

도 1D는 시그날링 압타머에 대한 스크린을 도시한 것이다. 200mM ATP의 존재 하에서의 압타머(100nM)의 시그날링 능력이 제시되어 있다.

도 2A는 시그날링 압타머 raf17, raf17-U61C 및 raf17s의 예상된 2차 구조를 도시한 것이다. 불변 영역에서의 잔기가 진하게 제시되어 있다. F-12-U 잔기가강조된다.

도 2B는 시그날링 압타머에 대한 반응 곡선을 도시한 것이다. 방정식 Y=AX/(X+K_d)를 사용하여, 다중 데이터 세트를 곡선에 맞춘다. 곡선 아래의 표는 산정된 곡선-맞춤 파라미터와, 포화시 상대적인 형광 단위(RFU)의 변화를 제시한 것이다.

도 3A는 raf17-U61C(21nM)의 시그날링 특이성을 도시한 것이다. 압타머 raf17-U61C를 대상으로 하여, 200μM 리간드의 존재 하에서의 시그날링에 대해 검정한다. 상이한 리간드에 대한 RFU의 변화는, ATP를 이용한 RFU의 변화에 대해 표준화되어 제시된다.

도 3B는 ATP-40-1에 대해 보고된 결합 특이성²⁰을 raf17-U61C의 양성 시그날링 특이성과 비교한 결과를 도시한 것이다.

도 4는 기타 뉴클레오티드의 존재 하에서의 시그날링 압타머에 대한 반응 곡선(도 4A) 및 1% 혈청의 존재 하에서의 시그날링 압타머에 대한 반응 곡선(도 4B)을 도시한 것이다.도 4A: ATP, GTP, CTP 및 UTP의 등몰 용액을 각종 농도로 시그날링 압타머 raf17와 혼합한다.도 4B: 시그날링 압타머 raf17를 각종 양의 ATP와 혼합한다. 표현 방식과 값은도 2에서와 같다.

도 5는 시그날링 압타머 raCB7b(도 5A) 및 raRG7b(도 5B)에 대한 반응 곡선을 도시한 것이다. 이중 데이터 세트를 상기 곡선에 맞춘다. 곡선 아래의 표는 산정된 곡선-맞춤 파라미터를 제시한 것이다.

도 6은 선별된 시그날링 압타머 raf17s, 및 고안된 시그날링 압타머 RNA-13-AC²¹에 대한 반응 곡선을 도시한 것이다.

본 발명의 한 양태는, DNA가 특정한 비대칭 몰 비를 포함하는 뉴클레오티드의 무작위 삽입물을 갖는 DNA 풀을 합성하는 단계; 이러한 DNA 풀을 증폭시키는 단계; 이와 같이 증폭시킨 DNA로부터 RNA 풀을 전사하는 단계(여기서, 이러한 RNA 전사에 사용된 뉴클레오티드는 형광-표지시킨다); 상기 형광-표지된 RNA 풀을 친화성 칼럼에 적용하여, 고친화성 형광성 RNA 분자를 상기 형광-표지된 RNA 풀로부터 제거하는 단계; 상기 고친화성 형광성 RNA 분자로부터 cDNA 풀을 수득하는 단계; 상기 고친화성 형광성 RNA 분자에 대한 상기 증폭 및 선별 단계를 반복하는 단계; 및 이와 같이 선별된 형광성 RNA 분자를 클로닝하는 단계(이로써 생성된 클론은 시그날링 압타머를 포함한다)를 포함하는, 시그날링 압타머를 시험관 내에서 선별하는 방법이다.

상기 양태의 한 국면에서는, RNA 증폭에 사용된 뉴클레오티드를 화학적으로 변형시킬 수 있다. 바람직하게는, 상기 DNA가 3:3:2:0.38 A:C:G:T의 몰 비로 비대칭적인 51개 뉴클레오티드의 무작위 삽입물을 갖는다. 형광-표지는 형광성 염료일 수 있고, 이는 특정한 뉴클레오티드에 부착되며 이와 같이 형광-표지된 뉴클레오티드가 전사 동안 RNA 내로 혼입된다. 형광성 염료의 대표적인 예가 플루오레세인,캐스케이드 블루(Cascade Blue) 및 로다민 그린(Rhodamine Green)이다. 바람직하게는, 상기 형광성 RNA는 형광-표지를 보유하고 있는 뉴클레오티드를 약 1 내지 3개 함유하며, 이러한 형광성 RNA가 시그날링 압타머이다. 본 발명의 바람직한 양태에서는, 1 내지 3개의 플루오레세인화 우리딘을 함유하는 선별된 시그날링 압타머가 제공된다.

본 발명의 또 다른 양태는, DNA가 비대칭 몰 비를 포함하는 뉴클레오티드의 무작위 삽입물을 갖는 DNA 풀을 합성하는 단계; 이러한 DNA 풀을 증폭시키는 단계(여기서, 이러한 DNA 증폭에 사용된 뉴클레오티드는 하나 이상의 리포터 분자로 표지시킨다); 이와 같이 증폭시킨 DNA로부터 상기 표지된 단일 가닥 DNA를 분리하는 단계; 상기 표지된 단일 가닥 DNA 풀을 친화성 칼럼에 적용하여, 고친화성 표지된 DNA 분자를 상기 표지된 DNA 풀로부터 제거하는 단계; 상기 고친화성 표지된 DNA 풀이 상기 친화성 칼럼 상에 보유되도록 단계 (a) 내지 (d)를 반복하는 단계; 및 상기와 같이 보유된 표지된 DNA 분자를 클로닝하는 단계(이로써 생성된 클론은 시그날링 압타머를 포함한다)를 포함하는, DNA 시그날링 압타머를 시험관 내에서 선별하는 방법이다.

상기 양태의 한 국면에서는, DNA 증폭에 사용된 뉴클레오티드를 화학적으로 변형시킬 수 있다. 바람직하게는, 상기 DNA가 3:3:2:0.38 A:C:G:T의 몰 비로 비대칭적인 51개 뉴클레오티드의 무작위 삽입물을 갖는다. 형광-표지는 형광성 염료일 수 있고, 이는 특정한 뉴클레오티드 또는 프라이머에 부착되며 이와 같이 형광-표지된 뉴클레오티드가 증폭 동안 DNA 내로 혼입된다. 형광성 염료의 대표적인 예가플루오레세인, 캐스케이드 블루 및 로다민 그린이다. 바람직하게는, 상기 형광성 DNA는 형광-표지를 보유하고 있는 뉴클레오티드를 약 1 내지 3개 함유하며, 이러한 형광성 DNA가 시그날링 압타머이다.

본 발명의 또 다른 양태는, RNA 또는 DNA 핵산 결합 종(압타머)를 포함하는 선별된 시그날링 압타머인데, 이러한 압타머는 약 1 내지 3개의 형광-표지된 동일한 뉴클레오티드를 함유한다. 상기 선별된 시그날링 압타머는 리간드 결합시 입체구조상의 변화를, 해당 시그날링 압타머 내로 혼입된 형광성 염료의 형광 세기 변화로 변환시킨다. 본 발명의 바람직한 양태에서는, 상기 시그날링 압타머가 플루오레세인화 항-아데노신 RNA 압타머이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "압타머" 또는 "선별된 핵산 결합 종"은 변형되지 않거나 화학적으로 변형된 RNA 또는 DNA를 포함할 것이다. 당해 선별 방법은 친화 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있고, 증폭 방법은 역전사(RT) 또는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 수행될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "시그날링 압타머"에는, 압타머와 리간드와의 상호작용으로부터 비롯된 입체구조 상의 변화시, 리포터 분자가 차별 시그날(differential signal), 바람직하게는 형광 세기 변화를 가져다 주는 방식으로 특정한 뉴클레오티드에 부착된 리포터 분자, 바람직하게는 형광성 염료를 수반하는 압타머가 포함될 것이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "리간드"는 상기 시그날링 압타머와 결합하는 모든 분자를 포함할 것이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "부착된"이란 시그날링 압타머를 포함하는 RNA의 전사 동안 형광-표지된 뉴클레오티드의 혼입을 의미하지만, 이에 제한되지는 않는다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "PCR"은 미국 특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호(Mullis) 뿐만 아니라 현재 당업계에 공지된 기타 개량 특허의 주제가 되는 폴리머라제 연쇄 반응을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "염기"는 데옥시리보핵산과 리보핵산 둘 다를 지칭한다. 다음 약어가 사용된다: "A"는 아데닌 뿐만 아니라 이의 데옥시리보즈 유도체를 지칭하고; "T"는 티민을 지칭하며; "U"는 우리딘을 지칭하고; "G"는 구아닌 뿐만 아니라 이의 데옥시리보즈 유도체를 지칭하며; "C"는 시토신 뿐만 아니라 이의 데옥시리보즈 유도체를 지칭한다. 당업자는 본 발명의 방법을 최적화하기 위해 이들 염기를 변형시키거나 유도체화할 수 있다는 것을 용이하게 인식할 것이다.

다음 표 1에는 본 발명의 선별된 시그날링 압타머에 대한 상세한 정보가 제공되어 있다:

본 발명은 약 1 내지 3개의 형광-표지된 동일한 뉴클레오티드를 함유하는 시그날링 압타머를 시험관 내에서 선별하는 방법에 관한 것이다. 부가적으로, 본 발명은 리간드 결합시 입체구조 상의 변화를, 이 안에 혼입된 형광성 뉴클레오티드의 형광 세기 변화로 변환시키는 시그날링 압타머에 관한 것이다.

압타머는 리간드-유도된 입체구조 상의 변화를 겪는다. 압타머를 시그날링 압타머로 전환시키기 위해, 리포터 분자를 상기 압타머 내로 도입한다. 이러한 리포터 분자는 입체구조 상의 변화에 따른 결과로서 이들의 국소 화학적 환경 상의 변화를 감지하고, 그 결과, 입체구조 상의 변화를 시그날링함으로써 리간드-결합 사건을 시그날링할 수 있다.

시그날링 압타머를 발생시키기 위해, 형광성 또는 기타 리포터(들)를 본래의 무작위 서열 풀 내로 도입한다. 예를 들면, 형광성 리포터를 보유하고 있는 뉴클레오티드를, DNA 또는 RNA 폴리머라제를 사용하여 상기 풀 내로 도입할 수 있다. 유사하게, 형광성 리포터를 보유하고 있거나 또는 리포터(들)를 함유하는 뉴클레오티드를 보유하고 있는 프라이머를 DNA 풀 내로 도입할 수 있다. 이들이 표적 분자와 결합하는 능력에 근거하여, 상기 풀로부터 압타머를 선별한다. 이와 같이 선별된 압타머는 당연히, 형광성 리포터의 존재를 수용할 것이다. 압타머는 리간드-유도된 입체구조 상의 변화를 겪기 때문에, 현존하는 형광성 리포터 또한 이들의 국소 화학적 환경 상의 변화를 겪으며, 이에 따라 이러한 입체구조 상의 변화를 시그날링할 수 있다.

선별 후에, 형광성 또는 기타 리포터를 상기 압타머 내로 도입하면, 압타머의 결합 능력 또는 기타 기능 상의 능력이 붕괴될 수 있다. 그러나, 형광성 리포터를 선별 이전에 도입하면, 이러한 형광성 리포터가 압타머의 결합 능력 또는 기타 기능 상의 능력을 사후에 붕괴시킬 수 없는 압타머를 선별할 수 있도록 해주는데, 이는 결합 능력 또는 기타 기능 상의 능력이 붕괴된 압타머는 시험관내 선별 과정 동안에 소실되기 때문이며; 형광성 리포터를 기능적으로 수용할 수 있는 압타머 만이 당해 집단 내에 잔존하게 된다.

다음의 실시예는 본 발명의 각종 실시 양태를 예시하기 위해 제공된 것이지, 이로써 본 발명이 어떠한 방식으로든 제한되지 않는다.

실시예 1

재료

시그날링 압타머의 특이성을 시험하기 위해 사용된 ATP의 유도체 및 아가로즈 친화성 수지는 공급처[Sigma(St. Louis, MO)]로부터 구입하였다. 플루오레세인-12-UTP는 공급처[Roche Diagnostics(Indianapolis, IN)]로부터 구입하였다. 기타 형광성 UTP 접합체, 캐스케이드 블루-7-UTP, 텍사스 레드-5-UTP 및 로다민 그린-5-UTP는 공급처[Molecular Probes(Eugene, OR)]로부터 구입하였다.

실시예 2

형광성 측정

모든 형광성 측정을 공급처[SLM-AMINCO(Spectronic Instruments, Rochester, NY)]로부터의 시리즈 2 발광 분광계 상에서 수행한다. 실험용 샘플을 상응하는 염료에 대한 여기 최대치(플루오레세인 λ_ex=494nm, 로다민 그린 505nm, 캐스케이드 블루 400nm)에서 여기시키고, 상응하는 방출 최대치(플루오레세인 λ_ex=521nm, 로다민 그린 533nm, 캐스케이드 블루 420nm)에서 형광 세기를 측정하였다. 압타머 용액 1ml를 형광계 전지(Starna Cells, Inc., Atascadero, CA) 내로 피펫팅하고, 각종 농도의 리간드 용액을 소 용량으로 가한다.

실시예 3

형광 반응 곡선

형광성 압타머(50nM)를 결합 완충액에서 열적으로 평형시킨다. 평균적으로, 8회 판독치를 취하여 상기 압타머의 초기 형광 세기를 정립한다. 결합 완충액 중의 각종 농도의 ATP 용액을 2㎕씩 증량시키면서 가한다. ATP 부가시의 형광 변화를 플롯팅하는데; 데이터 표시 방식을 표준화하기 위해서는, 소정의 ATP 농도에서의 형광 변화(F_x-F_o)를 포화 ATP 농도에서의 형광 변화(F₁₀₀-F₀)로 나눈다. 이러한 데이터를 프로그램 칼레이도그래프(Kaleidograph; Synergy, Reading, PA)를 사용하여 다음 방정식에 맞춘다: Y = AX/(X + B)[여기에서, Y는 소정의 ATP 농도에서의 상대적인 형광 증가, (F_x-F_o)/(F₁₀₀-F₀)이고; X는 ATP의 농도이며; A는 포화 ATP 농도에서의 형광 증가, (F₁₀₀-F₀)이며; B는 겉보기 해리 상수 값(Y=0.5A에서의 ATP의 농도)이다].

실시예 4

형광성 RNA 풀의 제조

큰 시그날과 적은 배경수준을 산출하는 시그날링 압타머를 생성시키기 위해서는, 단지 소수의 형광성 잔기 만이 각 결합 종에 존재해야 한다. 다수의 형광성 잔기가 존재하는 경우, 이들 중의 다수가 국소화된 입체구조 상의 변화에 의해 영향을 받지 않으므로, 시그날링 압타머을 동정하는 것을 보다 더 어렵게 만드는 고유 형광성 배경수준을 표시하게 되고, 이로써 전반적인 시그날링 수위가 감소된다.

따라서, 51개 잔기의 무작위 서열 영역이 비대칭적이어서, U 잔기가 부족한 수준으로 표시되는(33.1% A, C 및 G, 6% U) RNA 분자의 풀(N51)이 생성된다(도 1A). 이로써 생성된 RNA 집단은 이항 분포(binomial distribution)로써 기재되는데, 여기서 상기 집단의 대부분은 분자당 단지 3개 내지 4개 만의 우리딘을 함유하고 있다[Y = [51! / ((X!)(51-X)!)] (0.06)^x(0.94)^(51-x)(여기서, Y는 상기 집단의 비율이고, X는 분자당 우리딘의 수이다)]. C-결여된 리보자임에 대한 최근의 선별 방법²²은, 4개 염기 중의 하나가 결여된 풀로부터 작용성 핵산 분자를 효과적으로 선별할 수 있으므로, U가 부족한 수준으로 존재하는 풀로부터 항-아데노신 압타머를 선별할 수 있다는 사실을 입증해준다.

구체적으로 언급하면, 51개 뉴클레오티드의 무작위 삽입물을 갖는 102량체 DNA 풀(N51; 5' TAATACGACTCACTATAGGGAAGGCACGAC---N₅₁---AGACCCAACCAGCCAGAGACC (서열 번호 1))(도 1A)를 합성하였다. 각각의 N은 3:3:2:0.38 A:C:G:T 포스포르아미다이트 몰 비의 A, C, G 및 T의 혼합물을 나타낸다. 단일 가닥 DNA 풀을 표준프로토콜에 따라서 탈보호, 정제 및 PCR-증폭시킨다³³. 이로써 생성된 DNA 풀의 10% 만이 증폭 가능하다. UTP를 1mM F-12-UTP로 대체시키면서 T7 Ampliscribe 시험관내 전사용 키트(Epicentre, Madison, WI)를 사용하여, 이중 가닥 DNA 풀로부터 형광성 RNA 풀을 전사시킨다. DNAse 분해로 dsDNA 주형을 제거한 후, 형광-표지된 RNA를 10% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 정제하고, 0.3M NaCl 용액 중에서 37℃ 하에 밤새 용출시킨 다음, 에탄올 침전시킨다. 상기 풀을 15㎕ H₂O에 재현탁시킨 다음, 흡광(extinction) 계수 0.025ml cm^-1㎍^-1를 사용하여 A₂₆₀을 측정함으로써 정량화한다. 이는 비-형광성 핵산에 대한 표준 흡광 계수이고³⁴, 이를 채택한 이유는 플루오레세인의 흡광 계수가 뉴클레오티드의 것과 유사한 260 근처(21,000 M^-1cm^-1)이기 때문이다. 따라서, 소수의 플루오레세인 표지를 부가하는 것은 해당 핵산 풀의 전반적인 흡광 계수를 크게 교란시키지 말아야 한다.

실시예 5

형광-표지된 RNA 압타머의 시험관내 선별

형광-표지된 항-아데노신 압타머의 선별 과정은, 항-아데노신 압타머에 대한 본래의 선별 과정²³과 본질적으로 동일한 방식으로 수행한다. 초기의 RNA 풀은 대략 2 x 10¹⁴서열을 함유하고 있다. 65℃에서 3분 동안 결합 완충액(300mM NaCl,20mM 트리스-Cl, pH 7.4, 5mM MgCl₂)에서 열 변성시키고 실온으로 평형시킨 후, 상기 풀을 0.5ml 아가로즈 칼럼 내로 통과시켜, 칼럼 매트릭스에 결합된 종을 제거한다. 연속해서, 상기 풀(선별 과정 동안 4 내지 30㎍ 범위이다)을 ATP-아가로즈 친화성 칼럼에 적용한 다음(ATP는 디아미노헥실 링커에 의해 이의 C8을 통하여, 시아노겐 브로마이드-활성화 아가로즈에 연결된다), 10분 동안 평형시킨다. 상기 칼럼 중의 ATP 농도는 2.3mM이고, 친화성 칼럼의 용적은 선별 과정 동안 0.2ml 내지 1ml의 범위이다. 결합 완충액 15 내지 104 칼럼 용적을 이용하여 상기 칼럼을 전개시킴으로써, 저친화성 결합 종을 제거한다. 5mM ATP를 함유하는 0.4 내지 3ml 결합 완충액 중에서 상기 칼럼으로부터 고친화성 종을 용출시킨다. 에탄올 침전을 통하여 농축시킨 후, 이로써 생성된, 형광성 RNA 분자가 풍부한 풀을 cDNA 풀로 역전사시키고, PCR로 증폭시킨 다음, 다음 라운드를 위한 형광성 RNA를 시험관내 전사에 의해 생성시킨다. 마지막 3 라운드에서는, 상기 풀을 먼저, 음성 선별로서 0.5ml GTP 아가로즈 칼럼 상으로 통과시킨다. 선별과 증폭 단계를 11 라운드 수행한 후, 형광성 RNA 풀의 1/3을 8 칼럼 용적의 용출 수행에 이어 ATP 아가로즈 칼럼 상에 보유시키는데; 초기 라운드에서는, 상기 풀의 1% 미만이 특이적으로 보유 및 용출되었다. 더우기, 전사 과정 동안 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 사용함으로써 전사를 통하여 형광성 RNA를 생성시키는 것이 가능하다.

TOPO TA 클로닝 키트(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여, 라운드 11로부터의 압타머를 클로닝하고, SequiTherm EXCEL II 키트(Epicentre, Madison, WI)를사용하여, 24 압타머의 서열을 결정한다. 평균적으로, 선별된 서열당 2.25개 우리딘이 존재하는데, 이는 상기 변형된 염기의 혼입에 대한 선별이 거의 또는 전혀 이루어지지 않았다는 것을 지시해준다. 2가지 아웃라이어(outlier)를 사용하여 서열 유사성에 기초하여 압타머를 5가지 계열로 용이하게 나눈다(도 1C). 계열 1 및 2는 6개-잔기 서열 모티프, 즉 CAGAAG(서열 번호 16)를 공유하는 것으로 여겨진다. 도 1B는 사산파르(Sassanfar)와 스조스탁(Szostak)²³에 의해 선별된 최소한의 항-아데노신 압타머를 도시한 것이다.

raf17은 뉴클레오티드 중의 하나가 현저히 고갈된 풀로부터 선별된 압타머의 첫 번째 예이다. 상기 풀로부터의 기타 압타머(계열 4, 도 1C)는 우리딘 잔기를 전혀 함유하고 있지 않다. 작용성 핵산이 C가 아니라 U가 고갈된 풀로부터 선별될 수 있었다는 사실은 특히 고무적인 일인데, 이는 C-결여된 풀 내에 잔존하는 우리딘은 2종의 푸린 모두와 쌍을 형성할 수 있는 반면, U-부족한 풀 내에 잔존하는 시티딘은 주로 구아노신과 쌍을 형성해야 하며, 아데노신과는 쌍을 형성하지 말아야 하기 때문이다. 이들 결과는, 핵산 복제인자와 촉매를 원시적으로 진화시키는 데에, 전체 유전 정보^24,25가 요구되지 않는다는 것을 추가로 입증해준다.

실시예 6

시그날링 기능을 알아보기 위한 압타머의 스크리닝

플루오레세인화 RNA의 최종 풀은 약간의 시그날링 능력을 나타낸다. 상기풀의 600nM을 2mM ATP의 존재 하에 평형시킨 경우, 상대 형광도가 7% 증가하는 것으로 나타났다. 상이한 계열의 대표적인 서열을 대상으로 하여, 200μM ATP의 존재 하에서의 시그날링에 대해 검정하였다(도 1D). 계열 1로부터의 압타머 만이 상당히 양성인 시그날링 능력을 나타내었으며(형광성 증가), raf17이 가장 우수한 시그날링 압타머이다. 계열 5로부터의 압타머와, 아웃라이어 raf128은 몇몇 음성 시그날링 능력을 나타내었다(형광성 감소).

실시예 7

시그날링 잔기 지도화

압타머 raf17과 raf15는 둘 다 아데노신의 존재를 시그날링하는데, 후자는 전자 보다 1개 더 많은 우리딘 잔기를 함유하고 있다. 이러한 비교는, raf15 및 기타 계열 1 구성원 중에서의 3'-가장 많은 우리딘 잔기가 배경수준 형광의 원인이 되긴 하지만 시그날링에는 불필요하다는 것을 제시해준다. 이는 raf17(상대 형광도 22% 증가)이 raf15(상대 형광도 15% 증가) 보다 약간 더 높은 시그날링 능력을 나타낸다는 사실로써 뒷받침된다.

raf17 중의 2개의 잔존하는 플루오레세인화 우리딘(도 2A) 중의 어느 것이 시그날링에 필요한 것인지를 결정하기 위해, 위치 52에서의 우리딘을 시티딘으로 대체시키거나(raf17-U52C) 또는 위치 61에서의 우리딘을 시티딘(raf17-U61C)로 대체시킨 raf17의 돌연변이체를 작제하였다. 상기 U52C 대체물은 ATP-의존적인 형광 변화를 전혀 나타내지 않는 반면, U61C 대체물은 시그날 뿐만 아니라 모 분자인raf17 보다 약간 더 큰 ATP-의존적인 형광 변화를 나타낸다(도 2B). 이는 시그날링과 무관한 형광단을 제거함에 따라, 시그날링이 개선된다는 가설과 일치한다. raf17은 RFU의 최대 변화율 56%를 나타내고, ATP에 대한 겉보기 K_d는 223μM ±20μM이다. raf17-U61C는 RFU의 최대 변화율 75%를 나타내고, ATP에 대한 겉보기 K_d는 165μM ±10μM이다(도 2B). 전반적으로, 상이한 압타머와 돌연변이체를 이용한 결과는, 위치 52에서의 플루오레세인화 우리딘이 시그날링을 위해 계열 1 압타머에 요구되는 유일한 잔기라는 사실을 입증해준다. 더우기, 시그날링은 분명히, 동족 리간드의 부재 하에서 플루오레세인을 소광(quenching)시킴으로써 비롯된 것이다. 압타머를 리보뉴클레아제로 분해시키는 경우에는, 최대 형광 세기가, 포화 농도의 ATP의 존재 하에서 본래의 압타머의 형광 세기와 등가이다.

기타 어떤 잔기가 시그날링에 중요한지에 관한 가설을 진전시키기 위해, 압타머 raf17-U61C의 예상된 2차 구조(도 2A)를 검사하였다. 불변 영역으로부터 멀리 떨어진 외견상 멀티-암(multi-arm) 연결부에 단일 우리딘이 존재한다. 대부분의 불변 영역이 제거되고, 멀티-암 연결부를 지지해주는 예상되는 긴 줄기 만이 남아있는, 압타머의 절두된(truncated) 변형물(raf17s)를 작제하였다. raf17는 시그날링 활성을 지지해준다(도 2B). 사실상, 상기 시그날링 활성은 개선되어, RFU의 최대 변화율은 81%이며, 겉보기 K_d는 175μM ±5μM인데, 이는 모 압타머 raf17-U61C의 것과 본질적으로 동일하다. 멀티-암 연결부 부분이 제거된, raf17s의 추가의 절두물은 시그날링하지 못하였다(데이터는 제시되지 않음).

U-부족한 항-아데노신 시그날링 압타머는 ATP에 대한 겉보기 K_d가, 사산파르와 스조스탁²³에 의해 선별되고 버키(Burke)와 골드(Gold)²⁶및 버그스탈러(Burgstaller)와 파물로크(Famulok)²⁷에 의해 독립적으로 선별된 표준적인 항-아데노신 압타머 ATP-40-1의 것 보다 대략 200배 정도 더 높다. 그러나, 이와 같이 선별된 시그날링 압타머는 상응하는 특이성 상실을 나타내는 것으로 여겨지지 않는다. 이들 결과는, 압타머 특이성이 수소 결합의 형성 또는 상실이나 개개의 리간드와의 염 브릿지 형성 또는 상실에 기인하는 것이 아니라, 주로 결합성 포켓의 구조에 내재된 입체적 제한 요인에 기인된다는 사실에 부합된다.

실시예 8

시그날링의 특이성

압타머 raf17-U61C의 특이성을 평가하기 위해, 각종 아데노신 유도체와 기타 뉴클레오티드의 존재 하에서 형광성 시그날의 상대적인 변화를 모니터한다. 이들 데이터가 도 3A에 도시되어 있으며, 이는 ATP의 존재 하에서의 형광성 변화에 표준화된다. 상기 압타머는 뉴클레오염기 또는 당(ATP, ADP, AMP, 아데노신, NAD)을 교란시키지 않는 어떠한 아데노신 유도체의 존재 하에서도 시그날링한다. 그러나, 상기 뉴클레오염기 또는 당이 아데노신과 상이한 대부분의 유도체는 시그날링을 전혀 나타내지 않거나 또는 약간의 형광단 소광을 나타낸다. 예외는 N6-메틸 아데노신과 2' dATP인데, 이는 여전히 약간의 양성 시그날링 능력을 나타낸다. 흥미롭게도, 2' 데옥시아데노신은 시그날링하지 못한다. 상기 압타머는 2' dATP와 2' 데옥시아데노신 간을 식별할 수 있는데, 이는 5' 포스페이트의 존재가 일반적으로, 인식과 시그날링을 향상시키는 것으로 여겨지기 때문이며; ATP와 ADP는 AMP와 아데노신 보다 더 잘 시그날링한다.

사산파르와 스조스탁²³에 의해 선별된 항-아데노신 압타머(ATP-40-1)와 시그날링 압타머 둘 다는 주로, 아데노신 뉴클레오티드의 염기 부분과 당 부분을 인식한다. 그러나, 양성 시그날링 기준에 근거해 보면, raf17b 시그날링 압타머의 특이성은 등량의 4개 잔기 모두를 함유하는 풀로부터 선별된 항-아데노신 압타머의 특이성과 동등하거나 이 보다 더 우수하다(도 3B). 'U 풍부한' ATP-40-1은 또한, 아데닌, 2'-O-메틸아데노신 및 7-데아자아데노신을 교차 인식하는 반면, 'U 부족한' raf17-U61C는 그러하지 못하다. 반대로, raf17-U61C는 또한, N6-메틸 아데노신을 인식하는 반면, ATP-40-1은 그러하지 못하다.

선별된 시그날링 압타머가 복합 혼합물의 존재 하에서 리간드를 정량화하기에 충분히 특이적 인지를 결정하는 것이 필요하다. ATP 농도가 GTP, CTP 및 UTP의 배경수준에 대해 다양하거나(도 4A) 또는 1% 송아지 혈청에 대해 다양하기 때문에(도 4B), raf17의 형광 세기 변화를 결정하였다.

두 경우 모두에 있어서, 시그날링 압타머는 ATP의 존재 여부와 이의 농도를 추적하였다. 그러나, 이들 두 가지 환경 하에서의 시그날링 압타머의 겉보기 K_d는 다소 상이하다: 기타 뉴클레오티드의 존재 하에서의 겉보기 K_d는 127μM ±3μM인반면, 혈청 중에서의 겉보기 K_d는 212μM ±7μM이다. 상이한 환경은 리간드 연결되지 않고 소광된 형태의 시그날링 압타머를 상이한 정도로 안정화 또는 탈안정화시키는 것으로 여겨진다. 실제적으로, 복합 혼합물 중에서 분석물을 정량화하는 것은 수 많은 기타 분석 기술에 대한 경우에서와 같이, 표준 곡선의 사용을 요구할 수 있다.

실시예 9

선별된 시그날링 압타머는 리간드 인식을 형광 세기 변화와 총칭적으로 접목시킬 수 있다

raf17-U61C가 시그날링하는 기전은 공지되어 있지 않지만, U52가 화학적 환경 하에서 리간드-의존적 변화를 겪는 것으로 예상된다. 그럴 경우, 2가지 가능성, 즉 리간드-의존적 입체구조 상의 변화가 F-12-U에 의존적일 가능성, 또는 리간드-의존적 입체구조 상의 변화가 F-12-U와 독립적일 가능성이 있다.

이들 가능성을 면밀히 조사하기 위해, 기타 UTP 동족체를 사용하여 상기 압타머를 전사시킨다: 캐스케이드 블루-7-UTP, 로다민 그린-5-UTP 및 텍사스 레드-5-UTP. 광학 특성 상의 명백한 차이점과는 별도로, 이들 동족체는 또한, 형광단과 뉴클레오시드 사이의 알킬 아미노 스페이서 길이가 상이하다(이러한 스페이서 내의 원자 수는 동족체의 명칭을 지시해주는데; 캐스케이드 블루-7-UTP는 해당 염료와 뉴클레오티드 사이에 7개의 원자가 있다는 것을 지시해준다).

raf17-U61C를 텍사스 레드(raTR7b)로 전사시키면, 시그날링하지 못하는 표지된 압타머가 생성된다. 그러나, 현저하게, F-12-UTP 대신 캐스케이드 블루(raCB7b) 및 로다민 그린(raRG7b)을 사용하여 전사시키면, 시그날링 압타머가 생성되었다(도 5A 및 5B). raCB7b에 대한 RFU의 최대 증가율은 160%이고, 겉보기 K_d는 188μM ±15μM이다. raRG7b에 대해 산정된 RFU의 최대 증가율은 220%이고, ATP에 대한 겉보기 K_d는 571μM ±39μM이다. 어떠한 압타머도 500μM 이하의 GTP의 존재 하에서는 시그날링하지 않는다.

선별된 시그날링 압타머 내의 몇 개의 우리딘은 기능 면에서 중요하다. 다소 상이한 우리딘-염료 접합체가 raf17b에 의한 시그날링을 지지할 수 있다는 사실은, 결합 및 입체구조 상의 변화가 잔존하는 단일 우리딘 잔기와 상당히 접목된다는 것을 제시해준다. 이는, 플루오레세인이 선별 과정 동안 화학적 잔기를 ATP-결합시키기 위한 어떠한 뉴클레오염기, 당 또는 포스포디에스테르 만큼이나 많은 기회를 갖고 있다고 가정하면, 다소 놀라운 일이다. 보다 긴 스페이서 암을 갖는 변형된 뉴클레오티드(F-12-UTP 및 캐스케이드 블루-7-UTP)는 다소 짧은 스페이서 암을 갖는 뉴클레오티드(로다민 그린-5-UTP 및 텍사스 레드-5-UTP) 보다 결합을 덜 교란시켰다. 이러한 명백한 길이 상관관계는, 우리딘 잔기 그 자체가 결합과 시그날링에 있어서 중심적인 중요한 역할을 한다는 것을 지시해준다.

실시예 10

선별되고 스크리닝된 시그날링 압타머의 민감도 및 반응도

고안된 시그날링 압타머는 3차원적인 분자 구조에 관한 풍부한 지식을 필요로 하고, 정성을 들여서 합성한 다음, 사용하기에 앞서 검정해야만 하는 반면, 선별되고 스크리닝된 시그날링 압타머는 구조 또는 서열에 대한 어떠한 사전 지식도 요구하지 않으며, 이를 센서 소자로서 즉시 적용할 수 있다. 더우기, 선별된 시그날링 압타머는 고안된 시그날링 압타머 보다 민감도가 더 우수하다. 잔기 A13을 아크리딘 표지물로 대체시킨 ATP-40-1 유도체의 겉보기 K_d는 340μM ±70μM인 반면, raf17s의 기본 K_d는 175μM ±5μM이다. 선별된 시그날링 압타머는 또한, 반응도가 상당히 탁월하다(도 6). 아크리딘-접합된 ATP-40-1은 상대적인 형광에 있어서 최대의 아데노신-의존적 증가율 28±2%²¹을 나타내는 반면, 선별되고 스크리닝된 시그날링 압타머는 상대적인 형광에 있어서 7배 정도로 더 큰 증가율을 나타낸다. 상이한 형광단을 시그날링 압타머 선별(플루오레세인)에서 보다는 시그날링 압타머 고안(아크리딘)에 활용하였다는 사실은 이러한 비교 결과의 유효성을 제한하지 못하는데, 이는 A13을 플루오레세인으로 대체시킨 압타머가 시그날링 능력을 전혀 나타내지 못하였기 때문이다²¹.

실시예 11

형광-표지된 DNA 시그날링 압타머의 시험관내 선별

형광-표지된 DNA 시그날링 압타머에 대해 제공된 바와 같이, DNA 최종 생성물을 밝혀내기 위해 약간 변형시킨 방법을 사용하여, 상응하는 형광-표지된 DNA 시그날링 압타머를 시험관 내에서 용이하게 선별할 수 있다는 것은 명백하다. 이들 DNA 압타머는 변형되지 않거나 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 혼입할 수 있다. 비대칭 몰 비의 뉴클레오티드의 무작위 삽입물을 사용한 DNA 풀을 합성한 다음, 이를 증폭시킨다. 이러한 DNA의 증폭은 하나 이상의 리포터 분자를 함유하는 프라이머, 또는 하나 이상의 리포터 분자를 함유하는 뉴클레오티드를 통하여 달성할 수 있다. 이와 같이 증폭시킨 DNA로부터 단일 가닥 DNA를 분리시키고, DNA 압타머의 특이적 결합 종을 선별한 다음, 증폭시킨다.

실시예 12

진단 시약으로서의 시그날링 압타머

압타머를 시험관 내에서 선별하는 것이, 각종 표적에 대한 수용체를 생성시키기 위한 극도로 용이하면서도 강건한 방법이라는 것이 입증되었다. 압타머는 현재, 기존에 항체를 대상으로 입증된 바와 동일한 방식으로 보면, 훨씬 더 만능(universal) 수용체로서 여겨질 수 있다. 그러나, 항체와는 달리, 압타머는 용액 중에서 동족 리간드와의 상호작용을 즉시 보고하는, 용이하게 합성된 진단 시약으로 전환된다^1,2,28.

압타머 내로 도입된 형광성 리포터는 세기, 이방성, 수명 또는 스펙트럼 특성 상의 변화를 초래할 수 있다. 특히, 동일한 시그날링 압타머가 다중의 상이한 형광성 염료를 수용할 수 있다는 사실은, 상이한 파장에서의 분석을 요구하는 장치 또는 계획에 시그날링 압타머를 적용하는데 있어서 좋은 조짐이다. 다중 형광제 또는 형광제의 특성을 조정하는 분자를 상기 동일한 압타머 내로 도입할 수 있고, 이에 따른 세기, 이방성, 수명 또는 스펙트럼 특성 상의 변화를 겪을 수 있으며; 또한, 형광성 공명 에너지 전이(FRET) 상의 변화도 가능하다.

이들 특징에 근거해 보면, 시그날링 압타머를 선별하기 위한 고-처리량 방법을 추가로 개발하는 것은 상당수의 비-핵산 분석물을 검측할 수 있는 센서 어레이의 개발을 증대시킬 수 있다. 구체적으로 언급하면, 예를 들어, 기술의 유용한 조합은, 비드 상에서 시그날링 압타머를 화학적으로 합성하는 것과, 이들 비드를 광 섬유 케이블^29,30상으로 직접 도입하거나 에칭 마이크로웰(etched microwell)^31,32내로 직접 도입하는 것과 관련이 있을 수 있다.

다음 참조 문헌이 본 발명에서 인용된다:

본 명세서에서 언급된 모든 특허 또는 공개공보는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련인의 수준을 지시해준다. 추가로, 이들 특허 및 공개공보는, 각각의 개별적인 공개공보가 구체적이고도 개별적으로 참조문헌으로 삽입된다고 지시되는 경우와 동일한 정도로 본원에 참조문헌으로 삽입된 것이다.

당업자는 본 발명이 당해 목적을 수행하고 언급된 용도 및 이점 뿐만 아니라 본원에 내재된 목적, 용도 및 이점을 획득하도록 잘 적응시킨 것이라는 것을 용이하게 인지할 것이다. 본 발명의 실시예는 본원에 기재된 방법, 과정, 처치, 분자 및 특정 화합물과 함께, 대표적인 바람직한 양태이며, 예시적이고, 이로써 본 발명의 범위가 제한되지 않는다. 청구의 범위로써 규정되는 바와 같이 본 발명의 요지 내에 포괄되는 본 발명의 변화 및 기타 용도가 당업자에게는 명백할 것이다.

Claims

(a) DNA가 비대칭 몰 비를 포함하는 뉴클레오티드의 무작위 삽입물을 갖는 DNA 풀(pool)을 합성하는 단계;

(b) 상기 DNA 풀을 증폭시키는 단계;

(c) 이와 같이 증폭시킨 DNA로부터 RNA 풀을 전사하는 단계(여기서, 이러한 RNA 전사에 사용된 뉴클레오티드는 하나 이상의 리포터 분자로 표지시킨다);

(d) 상기 표지된 RNA 풀을 친화성 칼럼에 적용하여, 고친화성 표지된 RNA 분자를 상기 표지된 RNA 풀로부터 제거하는 단계;

(e) 상기 고친화성 표지된 RNA 분자로부터 cDNA 풀을 수득하는 단계;

(f) 상기 친화성 칼럼 상에 고친화성 표지된 RNA 풀이 보유되도록 상기 단계 (a) 내지 (e)를 반복하는 단계; 및

(g) 상기와 같이 보유된 표지된 RNA 분자를 클로닝하는 단계(이로써 생성된 클론은 시그날링 압타머를 포함한다)를 포함하는, 시그날링 압타머를 시험관 내에서 선별하는 방법.
제1항에 있어서, RNA 전사에 사용된 뉴클레오티드가 화학적으로 변형된 뉴클레오티드인 방법.
제1항에 있어서, DNA가 51개 뉴클레오티드의 무작위 삽입물을 갖는 방법.
제2항에 있어서, DNA가 서열 번호 1에 제시된 서열을 갖는 방법.
제1항에 있어서, 비대칭 몰 비가 3:3:2:0.38 A:C:G:T 포스포르아미다이트인 방법.
제1항에 있어서, 고친화성 표지된 RNA 풀의 약 1/3이 친화성 칼럼 상에 보유될 때까지 단계 (a) 내지 (e)를 반복하는 방법.
제1항에 있어서, 친화성 칼럼이 ATP-아가로즈 친화성 칼럼인 방법.
제1항에 있어서, 리포터 분자가 하나 이상의 형광제 또는 이러한 형광제의 특성을 조정하는 분자를 포함하는 방법.
제8항에 있어서, 형광제가 형광성 염료이고, 이로써 형광성 염료-뉴클레오티드 접합체가 형성되는 방법.
제9항에 있어서, 형광성 염료가 플루오레세인, 캐스케이드 블루, 텍사스 레드 및 로다민 그린으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
제10항에 있어서, 형광성 염료-뉴클레오티드 접합체가 형광성 염료-우리딘 5'-트리포스페이트 접합체인 방법.
제11항에 있어서, 형광성 우리딘 5'-트리포스페이트 접합체가 플루오레세인-12-UTP, 캐스케이드 블루-7-UTP, 텍사스 레드-5-UTP 및 로다민 그린-5-UTP로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
제1항에 있어서, 시그날링 압타머가 raf15, raf17, raf17-U61C, raf17-U52C, raf17s, raf134, raf110, raf111, raf18, raf133, raf117, raf114, raf120, raf126, raf128, racb7b 및 rarg7b로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
제1항의 방법에 의해 선별된 시그날링 압타머.
제14항에 있어서, 하나 이상의 리포터 분자(들)를 함유하는 RNA 핵산 결합 종(압타머)을 포함하는 시그날링 압타머.
제15항에 있어서, 리포터 분자가 하나 이상의 형광제 또는 이러한 형광제의 특성을 조정하는 분자를 포함하는 시그날링 압타머.
제16항에 있어서, 형광제가 형광성 염료이고, 이로써 형광성 염료-뉴클레오티드 접합체가 시그날링 압타머 내에 형성되는 시그날링 압타머.
제17항에 있어서, 형광성 염료-뉴클레오티드 접합체가 형광성 염료-우리딘 5'-트리포스페이트 접합체인 시그날링 압타머.
제14항에 있어서, raf15, raf17, raf17-U61C, raf17-U52C, raf17s, raf134, raf110, racb7b 및 rarg7b로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 시그날링 압타머.
제14항에 있어서, 리간드가 아데노신 5'-트리포스페이트인 시그날링 압타머.
제14항에 있어서, 리간드 결합시 입체구조 상의 변화를, 시그날링 압타머 내로 혼입된 리포터 분자의 분광학적 특성 변화로 변환시키는 시그날링 압타머.
제21항에 있어서, 분광학적 특성이 형광 세기, 이방성, 수명, 파장 및 형광 공명 에너지 전이로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 시그날링 압타머.
(a) DNA가 비대칭 몰 비를 포함하는 뉴클레오티드의 무작위 삽입물을 갖는 DNA 풀을 합성하는 단계;

(b) 상기 DNA 풀을 증폭시키는 단계(여기서, 이러한 DNA 증폭에 사용된 뉴클레오티드는 하나 이상의 리포터 분자로 표지시킨다);

(c) 이와 같이 증폭시킨 DNA로부터 상기 표지된 단일 가닥 DNA를 분리시키는 단계;

(d) 상기 표지된 단일 가닥 DNA 풀을 친화성 칼럼에 적용하여, 고친화성 표지된 DNA 분자를 상기 표지된 DNA 풀로부터 제거하는 단계;

(e) 상기 친화성 칼럼 상에 고친화성 표지된 DNA 풀이 보유되도록 상기 단계 (a) 내지 (d)를 반복하는 단계; 및

(f) 상기와 같이 보유된 표지된 DNA 분자를 클로닝하는 단계(이로써 생성된 클론은 시그날링 압타머를 포함한다)를 포함하는, 시그날링 압타머를 시험관 내에서 선별하는 방법.
제23항에 있어서, DNA 증폭에 사용된 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드인 방법.
제23항에 있어서, DNA가 51개 뉴클레오티드의 무작위 삽입물을 갖는 방법.
제25항에 있어서, DNA가 서열 번호 1에 제시된 서열을 갖는 방법.
제23항에 있어서, 비대칭 몰 비가 3:3:2:0.38 A:C:G:T 포스포르아미다이트인 방법.
제23항에 있어서, 친화성 칼럼이 ATP-아가로즈 친화성 칼럼인 방법.
제23항에 있어서, 리포터 분자가 하나 이상의 형광제 또는 이러한 형광제의 특성을 조정하는 분자를 포함하는 방법.
제29항에 있어서, 형광제가 형광성 염료이고, 이로써 형광성 염료-뉴클레오티드 접합체가 형성되는 방법.
제30항에 있어서, 형광성 염료가 플루오레세인, 캐스케이드 블루, 텍사스 레드 및 로다민 그린으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
제23항의 방법에 의해 선별된 시그날링 압타머.
제32항에 있어서, 하나 이상의 리포터 분자(들)를 함유하는 DNA 핵산 결합 종(압타머)을 포함하는 시그날링 압타머.
제33항에 있어서, 리포터 분자가 하나 이상의 형광제 또는 이러한 형광제의 특성을 조정하는 분자를 포함하는 시그날링 압타머.
제34항에 있어서, 형광제가 형광성 염료이고, 이로써 형광성 염료-뉴클레오티드 접합체가 시그날링 압타머 내에 형성되는 시그날링 압타머.
제32항에 있어서, 리간드가 아데노신 5'-트리포스페이트인 시그날링 압타머.
제32항에 있어서, 리간드 결합시 입체구조 상의 변화를, 시그날링 압타머 내로 혼입된 리포터 분자의 분광학적 특성 변화로 변환시키는 시그날링 압타머.
제37항에 있어서, 분광학적 특성이 형광 세기, 이방성, 수명, 파장 및 형광 공명 에너지 전이로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 시그날링 압타머.