JP2005517409A - デオキシリボザイム - Google Patents
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Abstract
【課題】新規な信号発生アロステリックDNA酵素の選択方法を提供する。
【解決手段】新規な信号発生アロステリックDNA酵素の選択方法を提供する。特に、蛍光信号発生アロステリックDNA酵素を記載する。選択系は、発蛍光団で修飾したヌクレオチドと消光物質で修飾したオリゴヌクレオチドによりフランキングされたリボヌクレオチドの開裂に基く。シス作用性およびトランス作用性の双方のアロステリックDNA酵素、並びにアプタマー/DNA酵素共役体を確認した。
【解決手段】新規な信号発生アロステリックDNA酵素の選択方法を提供する。特に、蛍光信号発生アロステリックDNA酵素を記載する。選択系は、発蛍光団で修飾したヌクレオチドと消光物質で修飾したオリゴヌクレオチドによりフランキングされたリボヌクレオチドの開裂に基く。シス作用性およびトランス作用性の双方のアロステリックDNA酵素、並びにアプタマー/DNA酵素共役体を確認した。
Description
発明の分野
本発明は、所望の特徴を有する核酸酵素の検出方法および単離方法に関する。また、記載された方法に従って単離された酵素、およびその酵素の使用に基くアッセイに関する。特に、基質特異性および/または反応特異性を持つ蛍光信号発生レポーターの生成に関する。
本発明は、所望の特徴を有する核酸酵素の検出方法および単離方法に関する。また、記載された方法に従って単離された酵素、およびその酵素の使用に基くアッセイに関する。特に、基質特異性および/または反応特異性を持つ蛍光信号発生レポーターの生成に関する。
発明の背景
本出願を通して、様々な引用文献が挿入により引用されて、本発明が関連する最新技術をより完全に説明する。これらの引用文献の開示はここで引用により本願の開示に組み入れられ、そして便宜上、該引用文献は本願明細書に付属する引用文献のリストに列挙する。
本出願を通して、様々な引用文献が挿入により引用されて、本発明が関連する最新技術をより完全に説明する。これらの引用文献の開示はここで引用により本願の開示に組み入れられ、そして便宜上、該引用文献は本願明細書に付属する引用文献のリストに列挙する。
過去10年にわたり、生体認識要素としてのDNAの使用に基く選択的バイオセンサーの開発に顕著な前進があった。大多数のDNAをベースとするセンサーは相補的DNAを検出するために設計されるが、多くの最近の報告は、1本鎖DNAが同様に非DNA標的(所謂、アプタマー)に選択的に結合することや1、2、または化学反応の触媒作用を行うこと3、4を可能にする複雑な3次構造を形成できることを示している。現在まで、多くの種類の化学転位を容易にする100個以上のDNA配列が報告されている5。非常に限定された化学官能性を有するにも関わらず、驚くべき効率で触媒作用を行うデオキシリボザイム(deoxyribozyme)が、数々の研究で報告されている6。例えば、10−23として知られている小さなDNA酵素は、〜10分-1の非常に印象的なkcatで部位特異的RNA開裂を行う7。RNAに対するDNA中の2’−ヒドロキシ基の欠如が触媒性能に損失を与えないことは明らかである。さらに、DNAの触媒能力は、金属イオン8および小分子コファクター9の使用により並びに触媒作用に有用な化学官能基での修飾10により増大できる。さらに、リボザイム(ribozyme)と比較したとき、デオキシリボザイムは生成が容易であり、また化学分解および酵素分解に対してより抵抗性であり、そして従って、適切に作製され、そして触媒的に有効なDNA酵素は、頑強なバイオセンサーの構成のために非常に望ましい要素である。
アロステリックなリボザイムおよびデオキシリボザイムは、診断分野、バイオセンシング分野および医薬スクリーニング分野での広範囲にわたる用途について、とても大きな可能性を有する。高速な触媒速度および大きな代謝回転数を持つデオキシリボザイムの使用は、迅速な酵素作用が必須である実用のための有効なアロステリックDNA酵素の作製を可能にする。検出関連用途のための触媒性DNAプローブを作製するために、酵素作用を蛍光信号発生能力と組み合わせることのできるDNA酵素の使用が非常に望ましく、それにより時間の掛かる分離工程の必要無しに即時の容易かつ高速な検出が行える。
Ellington, A. D.; Szostak, J. W. Nature 1990, 346, 818-822. Tuerk, C.; Gold, L. Science 1990, 249, 505-510. Famulok, M.; Mayer, G.; Blind, M. Acc. Chem. Res. 2001, 33, 591-599. Wilson, D. S.; Szostak, J. W. Annu. Rev. Biochem. 1999; 68, 611-647. Breaker, R. R. Nat. Biotechnol. 1997, 15, 427-431. Breaker, R. R. Science 2000, 290, 2095-2096. Sen D.; Geyer, C. R. Curr. Opin. Chem. Biol. 1998, 2, 680-687. Li, Y.; Breaker, R. R. Curr. Opin. Struct. Biol. 1999, 9, 315-323. Jaschke, A. Curr. Opin. Struct. Biol. 2001, 11, 321-326. Emilsson, G. M.; Breaker, R. R. Cell Mol. Life Sci. 2002, 59, 596-607. Breaker, R. R.; Joyce, G. F. Chem. Biol. 1994, 1, 223-229. Cuenoud, B.; Szostak, J. W. Nature 1995; 375, 611-614. Li, Y.; Sen, D. Nat. Struct. Biol. 1996, 3, 743-747. Carmi, N.; Schultz, L. A.; Breaker, R. R. Chem. Biol. 1996, 3, 1039-1046. Burmeister, J.; von Kiedrowski, G.; Ellington, A. D. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1997, 36, 1321-1324. Travascio, P.; Li, Y.; Sen, D. Chem. Biol. 1998, 5, 505-517. Li, Y.; Breaker, R. R. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999, 96, 2746-2751. Li, Y.; Liu, Y.; Breaker, R. R. Biochemistry 2000, 39, 3106-3114. Sheppard, T. L.; Ordoukhanian, P.; Joyce, G. F. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, 97, 7802-7807. Levy, M.; Ellington, A. D. Bioorg. Med. Chem. 2001, 9 2581-2587. Santoro, S. W.; Joyce, G. F. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1997, 94, 4262-6. Li, J.; Zheng, W.; Kwon, A. H.; Lu, Y. Nucleic Acids Res. 2000, 28, 481-448. Feldman, A. R.; Sen, D. J. Mol. Biol. 2001, 313, 283-294. Wang, W.; Billen, L. P.; Li, Y. Chem. Biol. 2002, 9, 507-517. Santoro, S. W.; Joyce, G. F. Biochemistry 1998, 37, 13330-13342. Roth, A.; Breaker, R. R. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1998; 95, 6027-6031. Santoro, S. W.; Joyce, G. F.; Sakthivel, K.; Gramatikova, S.; Barbas, C. F. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 2433-2439. Perrin, D. M.; Garestier, T.; Helene, C. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 1556-1563. Lermer, L.; Roupioz, Y.; Ting, R.; Perrin, D. M. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124 9960-9961.
Ellington, A. D.; Szostak, J. W. Nature 1990, 346, 818-822. Tuerk, C.; Gold, L. Science 1990, 249, 505-510. Famulok, M.; Mayer, G.; Blind, M. Acc. Chem. Res. 2001, 33, 591-599. Wilson, D. S.; Szostak, J. W. Annu. Rev. Biochem. 1999; 68, 611-647. Breaker, R. R. Nat. Biotechnol. 1997, 15, 427-431. Breaker, R. R. Science 2000, 290, 2095-2096. Sen D.; Geyer, C. R. Curr. Opin. Chem. Biol. 1998, 2, 680-687. Li, Y.; Breaker, R. R. Curr. Opin. Struct. Biol. 1999, 9, 315-323. Jaschke, A. Curr. Opin. Struct. Biol. 2001, 11, 321-326. Emilsson, G. M.; Breaker, R. R. Cell Mol. Life Sci. 2002, 59, 596-607. Breaker, R. R.; Joyce, G. F. Chem. Biol. 1994, 1, 223-229. Cuenoud, B.; Szostak, J. W. Nature 1995; 375, 611-614. Li, Y.; Sen, D. Nat. Struct. Biol. 1996, 3, 743-747. Carmi, N.; Schultz, L. A.; Breaker, R. R. Chem. Biol. 1996, 3, 1039-1046. Burmeister, J.; von Kiedrowski, G.; Ellington, A. D. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1997, 36, 1321-1324. Travascio, P.; Li, Y.; Sen, D. Chem. Biol. 1998, 5, 505-517. Li, Y.; Breaker, R. R. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999, 96, 2746-2751. Li, Y.; Liu, Y.; Breaker, R. R. Biochemistry 2000, 39, 3106-3114. Sheppard, T. L.; Ordoukhanian, P.; Joyce, G. F. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, 97, 7802-7807. Levy, M.; Ellington, A. D. Bioorg. Med. Chem. 2001, 9 2581-2587. Santoro, S. W.; Joyce, G. F. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1997, 94, 4262-6. Li, J.; Zheng, W.; Kwon, A. H.; Lu, Y. Nucleic Acids Res. 2000, 28, 481-448. Feldman, A. R.; Sen, D. J. Mol. Biol. 2001, 313, 283-294. Wang, W.; Billen, L. P.; Li, Y. Chem. Biol. 2002, 9, 507-517. Santoro, S. W.; Joyce, G. F. Biochemistry 1998, 37, 13330-13342. Roth, A.; Breaker, R. R. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1998; 95, 6027-6031. Santoro, S. W.; Joyce, G. F.; Sakthivel, K.; Gramatikova, S.; Barbas, C. F. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 2433-2439. Perrin, D. M.; Garestier, T.; Helene, C. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 1556-1563. Lermer, L.; Roupioz, Y.; Ting, R.; Perrin, D. M. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124 9960-9961.
発明の要約
本発明は、低いバックグラウンド蛍光を維持しながらRNA開裂により非常に大きな蛍光信号を生成でき、かつ非常に大きな触媒速度定数を示すデノボ(de novo)蛍光生成RNA開裂DNA酵素系を提供する。DNA酵素の検出方法および単離方法が提供される。本発明のRNA開裂DNA酵素は、化学触媒作用を即時の蛍光信号発生能力と独特に結び付ける。この系の2つの特別な例、自己触媒作用可能なシス作用性酵素、および特定のキメラ基質に作用するトランス作用性酵素が提供される。アプタマー標的結合により調節さ
れるアロステリックDNA酵素の開発もまた示される。好ましい態様において、既知のATPアプタマーがシス作用性酵素に共役する。
本発明は、低いバックグラウンド蛍光を維持しながらRNA開裂により非常に大きな蛍光信号を生成でき、かつ非常に大きな触媒速度定数を示すデノボ(de novo)蛍光生成RNA開裂DNA酵素系を提供する。DNA酵素の検出方法および単離方法が提供される。本発明のRNA開裂DNA酵素は、化学触媒作用を即時の蛍光信号発生能力と独特に結び付ける。この系の2つの特別な例、自己触媒作用可能なシス作用性酵素、および特定のキメラ基質に作用するトランス作用性酵素が提供される。アプタマー標的結合により調節さ
れるアロステリックDNA酵素の開発もまた示される。好ましい態様において、既知のATPアプタマーがシス作用性酵素に共役する。
本発明の1つの観点において、信号発生DNA酵素構造物が提供される。該構造物は、a)リボヌクレオチド部位で開裂できる酵素性DNA配列(enzymatic DNA sequence)、およびb)発蛍光団で修飾したオリゴヌクレオチドと消光物質で修飾したオリゴヌクレオチドであって、互いに十分に接近しており、それにより触媒作用の不在下で、該発蛍光団からの蛍光が該消光物質により消光されるオリゴヌクレオチドによりフランキングされたリボヌクレオチド結合を有するDNA鎖を含む。
好ましい態様において、前記酵素性DNA配列は、配列番号7または配列番号8に記載の配列を有するシス作用性酵素である。
他の好ましい態様において、前記酵素性DNA配列は、配列番号9記載の配列を有するトランス作用性DNA酵素である。
本発明のさらなる観点において、信号発生DNA酵素構造物は、前記酵素性DNA配列に共役したアプタマー配列を含む。
好ましい態様において、前記信号発生DNA酵素/アプタマー構造物は、配列番号10の配列を含む。
本発明の他の観点において、RNA開裂触媒性DNA分子の選択方法が提供される。該方法は以下の工程を含む:
a.一方側で発蛍光団で標識したヌクレオチドと他方側で消光物質で修飾したヌクレオチドによりフランキングされたリボヌクレオチドを有し、かつランダム配列挿入部位を有する1本鎖DNAを合成する工程;
b.ランダムDNA配列を該挿入部位中に挿入して、候補DNA分子を用意する工程;
c.該候補DNA分子をコファクターの存在下で定温放置する工程;および
d.蛍光信号の存在または不在を検出する工程であって、該信号は開裂が該リボヌクレオチドで起こり、それにより該消光物質が該発蛍光団から分離したときに生成する工程。
a.一方側で発蛍光団で標識したヌクレオチドと他方側で消光物質で修飾したヌクレオチドによりフランキングされたリボヌクレオチドを有し、かつランダム配列挿入部位を有する1本鎖DNAを合成する工程;
b.ランダムDNA配列を該挿入部位中に挿入して、候補DNA分子を用意する工程;
c.該候補DNA分子をコファクターの存在下で定温放置する工程;および
d.蛍光信号の存在または不在を検出する工程であって、該信号は開裂が該リボヌクレオチドで起こり、それにより該消光物質が該発蛍光団から分離したときに生成する工程。
本発明はまた、酵素性DNA配列の他の選択方法を提供する。該方法は:
ランダム配列を含むオリゴヌクレオチドのライブラリを用意する工程と;
該オリゴヌクレオチドを、発蛍光団で修飾したヌクレオチドと消光物質で修飾したオリゴヌクレオチドによりフランキングされたリボヌクレオチド結合を含むアクセプター配列に結合する工程と;
該リボヌクレオチド結合の開裂により、蛍光信号が生成されるか否かを決定する工程と;該リボヌクレオチドで開裂した配列を増幅する工程
を含む。
ランダム配列を含むオリゴヌクレオチドのライブラリを用意する工程と;
該オリゴヌクレオチドを、発蛍光団で修飾したヌクレオチドと消光物質で修飾したオリゴヌクレオチドによりフランキングされたリボヌクレオチド結合を含むアクセプター配列に結合する工程と;
該リボヌクレオチド結合の開裂により、蛍光信号が生成されるか否かを決定する工程と;該リボヌクレオチドで開裂した配列を増幅する工程
を含む。
本発明のさらなる観点において、DNAのランダム集合から自己触媒性DNAを選択する方法が提供され、該方法は:
i.第1所定配列と、ランダム配列と、第2所定配列とを含む1本鎖DNA分子の集合を用意する工程と;
ii.該1本鎖DNA分子を、発蛍光団で修飾したオリゴヌクレオチドと消光物質で修飾したオリゴヌクレオチドにより結合接点でフランキングされた少なくとも1つのリボヌクレオチド結合を含むアクセプターDNA配列に結合する工程と;
iii.結合した1本鎖オリゴヌクレオチドを単離する工程と;
iv.該結合したオリゴヌクレオチドをコファクターの存在下で定温放置する工程と;
v.RNA開裂活性をPAGEにより測定する工程と;
vi.リボヌクレオチドで開裂されたDNA分子を単離する工程
を含む。
i.第1所定配列と、ランダム配列と、第2所定配列とを含む1本鎖DNA分子の集合を用意する工程と;
ii.該1本鎖DNA分子を、発蛍光団で修飾したオリゴヌクレオチドと消光物質で修飾したオリゴヌクレオチドにより結合接点でフランキングされた少なくとも1つのリボヌクレオチド結合を含むアクセプターDNA配列に結合する工程と;
iii.結合した1本鎖オリゴヌクレオチドを単離する工程と;
iv.該結合したオリゴヌクレオチドをコファクターの存在下で定温放置する工程と;
v.RNA開裂活性をPAGEにより測定する工程と;
vi.リボヌクレオチドで開裂されたDNA分子を単離する工程
を含む。
好ましい態様において、上記方法により選択されたDNAにさらなる選択ラウンドを受けさせる。これは、
vii.結合接点を包含する前記結合したDNAの領域に相補的な第1プライマーと、前記第2所定領域に相補的な第2プライマーを使用する第1PCR増幅;
viii.該結合接点でリボヌクレオチドを有する2本鎖DNA生成物を与えるための、リボ末端第3プライマーを使用する第2PCR増幅;
ix.該リボヌクレオチドでの該2本鎖DNA生成物の開裂;
x.工程1記載の1本鎖DNA分子の単離;および
xi.十分な程度の選択が達成されるまでの工程ii)ないしx)の反復
の工程を含む。
vii.結合接点を包含する前記結合したDNAの領域に相補的な第1プライマーと、前記第2所定領域に相補的な第2プライマーを使用する第1PCR増幅;
viii.該結合接点でリボヌクレオチドを有する2本鎖DNA生成物を与えるための、リボ末端第3プライマーを使用する第2PCR増幅;
ix.該リボヌクレオチドでの該2本鎖DNA生成物の開裂;
x.工程1記載の1本鎖DNA分子の単離;および
xi.十分な程度の選択が達成されるまでの工程ii)ないしx)の反復
の工程を含む。
本発明はまた、所望の標的に特異的なアプタマー配列の選択方法を提供する。該方法は、ランダム配列を信号発生自己触媒性DNA酵素に共役させることと、該共役した配列を所望の標的の存在下で定温放置することと、該溶液の蛍光強度を決定することを含む。好ましい態様において、重要な生物学的標的の検出アッセイが提供される。
本発明はまた、酵素性DNA配列の選択キットを提供する。1つの好ましい態様において、該キットは、発蛍光団で修飾したヌクレオチドと消光物質で修飾したオリゴヌクレオチドによりフランキングされたリボヌクレオチド結合を持つDNAクレームと、ランダムオリゴヌクレオチドの挿入に適合した配列を含むDNA構造物を含む。他の態様において、キットは、ランダムまたは既知の配列の挿入に適合したライブラリーDNAと、発蛍光団で修飾したヌクレオチドと消光物質で修飾したオリゴヌクレオチドによりフランキングされたリボヌクレオチドを含むアクセプターDNAと、RNA開裂配列のPCR増幅のためのプライマーを含む。
さらなる他の観点において、要求ファクターの検出方法が提供される。該方法は、信号発生DNA構造物を用意することと、試料を導入することと、信号が生成されるか否かを決定することを含む。好ましい態様において、金属イオンまたは小分子の検出方法が提供される。
図面の簡単な説明
本発明の好ましい態様は図面を参照して下記され、ここで:
図1は、リボヌクレオチド結合でのDNA鎖の開裂により生成する信号の模式図であり、図2は、信号発生配列の選択を図示し、
図3Aは、RNA開裂DNA酵素の選択方法の模式図であり、
図3Bは、図3Aに図示した方法に従いDNA酵素を選択するために使用する例示的な配列を図示し、
図3Cは、様々な選択条件下での酵素活性をグラフにより図示し、
図4Aは、シス作用性DNA酵素の配列を図示し、
図4Bは、図4Aに図示した酵素の信号発生特性を図示し、
図5は、信号発生活性についての3’側切除の効果を図示し、
図6Aは、シス作用性DNA酵素、DEC22−18Aの2次構造を図示し、
図6Bは、トランス作用性DNA酵素、DET22−18の提案される2次構造を図示し、
図6Cは、DET22−18の速度論的分析のグラフ図であり、
図7Aは、酵素が過剰であるときの、DET22−18の即時信号発生能力を示し、
図7Bは、基質が過剰であるときの、DET22−18の即時信号発生能力を示し、
図8Aは、アプタマー配列が信号発生DNA酵素に結合したアロステリックDNAS酵素を図示し、
図8Bは、アプタマー標的の導入に基く活性アッセイをグラフにより図示し、そして
図8Cは、信号発生構造物の標的特異性を示す。
本発明の好ましい態様は図面を参照して下記され、ここで:
図1は、リボヌクレオチド結合でのDNA鎖の開裂により生成する信号の模式図であり、図2は、信号発生配列の選択を図示し、
図3Aは、RNA開裂DNA酵素の選択方法の模式図であり、
図3Bは、図3Aに図示した方法に従いDNA酵素を選択するために使用する例示的な配列を図示し、
図3Cは、様々な選択条件下での酵素活性をグラフにより図示し、
図4Aは、シス作用性DNA酵素の配列を図示し、
図4Bは、図4Aに図示した酵素の信号発生特性を図示し、
図5は、信号発生活性についての3’側切除の効果を図示し、
図6Aは、シス作用性DNA酵素、DEC22−18Aの2次構造を図示し、
図6Bは、トランス作用性DNA酵素、DET22−18の提案される2次構造を図示し、
図6Cは、DET22−18の速度論的分析のグラフ図であり、
図7Aは、酵素が過剰であるときの、DET22−18の即時信号発生能力を示し、
図7Bは、基質が過剰であるときの、DET22−18の即時信号発生能力を示し、
図8Aは、アプタマー配列が信号発生DNA酵素に結合したアロステリックDNAS酵素を図示し、
図8Bは、アプタマー標的の導入に基く活性アッセイをグラフにより図示し、そして
図8Cは、信号発生構造物の標的特異性を示す。
詳細な説明
本発明は、基質を規定した開裂部位で開裂する酵素に関する。特に、酵素レポーターとして機能できるDNA含有分子およびその単離方法が提供される。
本発明は、基質を規定した開裂部位で開裂する酵素に関する。特に、酵素レポーターとして機能できるDNA含有分子およびその単離方法が提供される。
本明細書を通して、用語:酵素性DNA分子、触媒性DNA、DNA酵素、DNAザイムおよびデオキシリボザイムは交換可能に使用される。酵素的に活性な部分もまた該用語に包含される。本発明の酵素性DNA分子は、変異、欠失および/または付加により変性され得、そしてそれらはヌクレオチド類似物を含み得る。本発明の酵素性DNA分子はオリゴヌクレオチド基質を開裂する。シス作用性およびトランス作用性の双方の酵素が包含される。
触媒性DNA分子はホスホジエステル結合を開裂し、そしてそれ故、医薬的/医療的用途および毎日の生活の双方において多くの用途を有する。
本発明は、RNAを開裂できる触媒性DNA分子の検出のための、迅速な蛍光に基く系を提供する。リボヌクレオチドを含む信号発生オリゴヌクレオチドが合成される。発蛍光団で修飾したヌクレオチドは該リボヌクレオチドの一方側(例えば、上流側)に位置し、そして消光物質で修飾したヌクレオチドは他方側(例えば、下流側)に位置する。反対の配向(即ち、該発蛍光団で修飾したヌクレオチドが該リボヌクレオチドの下流に位置し、そして該消光物質で修飾したヌクレオチドが上流に位置する)も機能性であることは明白である。該消光物質で修飾したヌクレオチドは、低い蛍光バックグラウンドを与えるために、該発蛍光団で修飾したヌクレオチドに十分近くなければならない。該信号発生オリゴヌクレオチドはランダム配列に結合されれる。該ランダム配列が該信号発生オリゴペプチドを該リボヌクレオチドで開裂できるDNA酵素を含む場合、該発蛍光団および該消光物質は分離されることとなり、そして該蛍光信号の顕著な増加が検出できる。
本発明は、蛍光信号の生成に基くDNA酵素の選択および単離を可能にする。本発明の1つの観点において、RNA開裂に基く信号発生DNA酵素リポーター系が提供される。一般的な概念を図1に図示する。埋め込まれたRNA結合14を有するDNA鎖12を含むリポーター10を用意する。発蛍光団16は鎖12に該RNA結合の一方側で結合し、そして消光物質18は該鎖に該RNA結合の他方側で結合する。該発蛍光団と該消光物質は互いに十分近く、該消光物質が該発蛍光団からの蛍光を効率良く消光する。これはまた偽陽性を最小限にする。該RNA結合が開裂したとき、該発蛍光団と該消光物質は分離し、そして蛍光信号が生成する。この系は、RNAを開裂する何れの成分の存在をも検出するために使用できる。この系はまた、RNA開裂酵素により要求されるコファクターの存在を検出するために使用できる。
本発明は、蛍光信号の生成に基くDNA酵素の選択および単離を可能にする。本発明の1つの観点において、RNA開裂に基く信号発生DNA酵素リポーター系が提供される。一般的な概念を図1に図示する。埋め込まれたRNA結合14を有するDNA鎖12を含むリポーター10を用意する。発蛍光団16は鎖12に該RNA結合の一方側で結合し、そして消光物質18は該鎖に該RNA結合の他方側で結合する。該発蛍光団と該消光物質は互いに十分近く、該消光物質が該発蛍光団からの蛍光を効率良く消光する。これはまた偽陽性を最小限にする。該RNA結合が開裂したとき、該発蛍光団と該消光物質は分離し、そして蛍光信号が生成する。この系は、RNAを開裂する何れの成分の存在をも検出するために使用できる。この系はまた、RNA開裂酵素により要求されるコファクターの存在を検出するために使用できる。
最適な信号発生DNAリポーターは、良好な信号対ノイズ比を有する。あらゆる酵素活性の不在下では低いバックグラウンドであり、そして開裂が生じると、強い信号が生成する。これらの特性についての前記発蛍光団と前記消光物質との間の距離の効果は、図2に示したものと同様な構造物を使用して評価でき、そして実施例2でさらに議論する。該発蛍光団と消光物質が異なる距離で隔て離れた一連の構造物を用意する。RNAは塩基で断片化できることは良く知られており、またNaOHはRNAを破壊するがDNAを破壊し
ないことが知られている。それ故、NaOHが該構造物に添加でき、そして蛍光の倍数変化を決定できる。この方法において、特定部位での開裂に基く信号発生レポーターが生成できる。一般に、該発蛍光団と消光物質は、開裂の不在下では低いバックグランドを与え、そして良好な信号対ノイズ比を与えるために十分に近くなければならない。
ないことが知られている。それ故、NaOHが該構造物に添加でき、そして蛍光の倍数変化を決定できる。この方法において、特定部位での開裂に基く信号発生レポーターが生成できる。一般に、該発蛍光団と消光物質は、開裂の不在下では低いバックグランドを与え、そして良好な信号対ノイズ比を与えるために十分に近くなければならない。
他の観点において、本発明は、蛍光信号を発生しRNAを開裂する自己触媒作用性DNA分子の選択方法および単離方法を提供する。基本的に、発蛍光団で修飾したオリゴヌクレオチドと消光物質で修飾したオリゴヌクレオチドによりフランキングされたリボヌクレオチドを含むDNA構造物を用意する。該構造物はまた、ランダムヌクレオチド配列の挿入部位を含む。挿入した配列がRNA開裂活性を有する場合、該リボヌクレオチド結合は開裂し、そして該発蛍光団は該消光物質から分離し、そして蛍光信号が生成する。
幾つかの選択ラウンドが、触媒作用性配列を濃縮するために好ましくなされる。好ましい態様において、図3Aに示しまた実施例5で議論するものに類似した選択計画が、RNA開裂DNA酵素を濃縮および選択するために使用される。
本発明の選択計画は、所定の5’側配列と所定の3’側配列によりフランキングされたランダム配列を含む1本鎖DNA分子の集合を生成することを含む。これらのDNA分子は“ライブラリー”DNAと呼ばれる。本願明細書で“アクセプター”オリゴヌクレオチドと呼ぶオリゴヌクレオチドは、発蛍光団で修飾したヌクレオチドと、消光物質で修飾したヌクレオチドと、該発蛍光団と該消光物質との間に位置するリボヌクレオチド結合を含む。“テンプレートDNA”と命名する他のオリゴヌクレオチドも用意する。テンプレートDNAは、該アクセプターオリゴヌクレオチドの配列に少なくとも部分的に相補的である第1配列と、該ライブラリーDNAの所定の5’側配列に少なくとも部分的に相補的である第2配列とを含む。該配列の相補性により、該テンプレートDNAは該アクセプターオリゴヌクレオチドおよび該ライブラリーDNAと2重構造を形成し、そしてそれらを接近させる。リガーゼを導入すると、該ライブラリーDNAは該アクセプターオリゴヌクレオチドに結合して結合分子を形成する。該2重構造は解離し、そして該結合分子はテンプレートDNAからPAGEにより分離できる。
本発明の特別な特徴は、蛍光信号発生に基き酵素の選択および単離を可能にすることである。本発明の選択計画が図3に示す特定の配列に限定されないことは明白である。一般的な計画は、異なる特徴を有する様々なDNA酵素を選択するために使用できる。
小分子、ペプチド、金属イオン、代謝産物、糖、核酸等のようなコファクターの存在を必要とする酵素性DNA分子は、前記結合分子をそのファクターの存在下で定温放置することにより選択される。該結合分子がそのファクターに応答性のDNA酵素を含む場合、開裂が該リボヌクレオチド結合で生じる。これは、前記発蛍光団と消光物質が分離されることとなるので、蛍光信号の発生を生じる。この一例は、金属イオンを導入する場合、図3の工程IIIに示される。
前記自己触媒作用性分子はその後、一連のポリメラーゼ連鎖反応を通して濃縮できる。該自己触媒作用性DNAは、前記ライブラリーDNAの所定の3’側配列を有するので、その配列に相補的なプライマーが使用できる。このプライマーをP1と命名する。第2プライマー、P2は、前記アクセプターオリゴヌクレオチドに相補的な配列と、前記集合DNAの保存された5’側配列を含む。これらのプライマーでのPCRは、リボヌクレオチドを除き前記結合DNAの配列を有するDNA分子を生成する。リボヌクレオチドはその後、リボ末端化した第3プライマー、P3を使用して導入する。増幅後、該DNAをNaOHのようなRNA開裂成分で処理する。開裂したDNAにPAGE精製およびDNAリン酸化を受けさせる。該5’側リン酸化DNAは、さらなる選択ラウンドを開始するため
に使用する。この戦略を使用して、非常に選択的なレポーターでさえその場で再生できる。
に使用する。この戦略を使用して、非常に選択的なレポーターでさえその場で再生できる。
前記方法は一般的に適用可能で、そして図3に示す特定のヌクレオチド配列に限定されないことは、当業者に明白である。
前記DNA酵素は始めに選択し、そして数々の選択ラウンドを通過することにより濃縮できる。加えて、自己開裂反応に許される時間は、図3Cに示しまた実施例5でさらに議論するように、最も有効なDNA酵素を選択するために徐々に減少できる。好ましい態様において、該技術は、数回の選択ラウンド後、単一種のDNA酵素を含むクローンを生じる。
RNA開裂DNA酵素を上記の方法論を使用して単離し、そしてDEC22−18と命名した。該命名は、DNA酵素(DNA enzyme)、シス作用性(cis-acting)、22選択ラウンド(22 rounds of selection)、クローン18(clone 18)に基く。DEC22−18は、109個のヌクレオチドからなる大きなDNA分子である。この酵素の配列を図4Aおよび配列番号7に示す。この分子の触媒作用活性は、図4Bに図示しまた実施例7でさらに記載するように確認した。
本発明の1つの観点において、触媒作用活性に必要とされる最小の配列が、一連のヌクレオチド切除をし、そして切除した分子の酵素活性を測定することにより決定された。本発明の例示的な態様において、DEC22−18に一連の3’側切除を受けさせた。該切除実験は、図5に図示しまた実施例8でより完全に記載する。最後の26個のヌクレオチドの切除は、より高度に有効な酵素であるDEC18−22Aと命名する酵素を生じた。一度、主要なオリゴヌクレオチド構造が既知となると、2次構造は様々なアルゴリズムを使用して予測できる。DEC22−18Aの2次構造を、M−フォールドプログラム(hhtp://bioinfo.math.rpi.edu/~mfold/dna)を使用して予測し、そして図6Aに示す。
DEC22−18Aはシス作用性酵素である。DEC22−18Aの2次構造に基いて、トランス作用性DNA酵素系を設計することが可能である。トランス作用性DNA酵素、DET22−18もまた提供される。DET22−18の構造およびその信号発生特性の説明を図6および7に図示し、また実施例9および10でより完全に記載する。
本発明のRNA開裂DNA酵素はまた、信号発生アロステリックデオキシリボザイムを設計するために使用できる。アプタマー配列は、ステム−ループ2次構造を有するDNA酵素に共役する。例示的な信号発生アロステリックデオキシリボザイムを表8に図示し、また実施例11でさらに議論する。好ましい態様において、弱いステムを該アプタマー配列を該酵素配列に共役させるために使用する。該アプタマー標的の不在下では、該ステムは弱く、そして触媒作用活性も弱い。該標的の存在下では、ステムの形成が促進され、そして2次構造の形成により付随して触媒作用活性が増加する。該DNA酵素成分は、発蛍光団と消光物質によりフランキングされたリボヌクレオチドを含むために、上記したように変性される。アプタマー標的の不在下では、該ステム形成は弱く、そして該リボヌクレオチドでの開裂は殆どまたは全くない。それ故、標的の不在下では、該発蛍光団と消光物質は近く接近したままであり、そして蛍光は消光される。アプタマー標的の存在下では、該DNA酵素はその2次構造を呈し、そして開裂が該リボヌクレオチドで生じて、蛍光信号が生成することとなる。それ故、信号を発生するアロステリックDNA酵素または“アプタザイム(aptazyme)”は、標的分子の存在を検出するために使用できる。
本発明の信号発生DNA酵素が様々な技術を使用して様々なアプタマー配列に共役できることは明白である。開裂が蛍光信号により検出できる容易性に基いて、本発明の信号発
生酵素は、アプタマー配列を確認するために使用できる。ランダム配列をデオキシリボザイムドメインに共役させ、そして様々な標的に結合するその能力について試験できる。
生酵素は、アプタマー配列を確認するために使用できる。ランダム配列をデオキシリボザイムドメインに共役させ、そして様々な標的に結合するその能力について試験できる。
好ましい態様において、アプタマー配列に共役したDE22−18Aを含む信号発生アロステリックDNA酵素が提供される。好ましい態様において、ATP結合アプタマーに共役したDE22−18Aを含む信号発生アロステリックDNA酵素が提供される。この共役DNA分子の2次構造を図8Aに示し、また配列を配列番号10に記載する。この分子の標的報告能力を図8Bおよび8Cにし、また実施例11でさらに議論する。ATPアプタマー/DEC22−18アプタザイムがATPの存在を検出し、そして信号が標的特異的に生成されることは明白である。他のアプタマー配列を組み入れた信号発生アロステリックDNA酵素は、本発明内に包含される。
本発明の信号発生DNA酵素は様々な方法で有用である。本発明の信号発生DNA酵素系は、特定の分析物を検出する溶液をベースとしたアッセイに良く適している。そのようなアッセイは使用が容易であり、また、分離工程を有する必要または蛍光発色剤を添加する必要がないので、該検出は極めて迅速である。本発明はまた、選択が所定の位置にある発蛍光団と消光物質でなされるので、後の標識化反応により触媒作用性DNAの活性を変化させる危険が排除される利点を有する。
本発明のDNA分子はまた、水晶、ガラス、シリカ、様々な金属および何れかのポリマーを含む様々な表面上に固定化できる。該DNAは、光ファイバー、平面導波管または顕微鏡スライド上に固定化できる。該DNAは単層または多層として適用できるか、またはポリマー溶液中に捕捉できる。
本説明を通して、前記発蛍光団としてフルオレセインおよび前記消光物質としてDABCYLの使用を記載してきた。同様に有効であるかまたは増大した光安定性を有し、またより良好な散乱阻止を有する他のプローブ系が使用できることは明白である。例えば、Eu(III)およびTb(III)をベースとする長寿命プローブ、Ru(II)プローブおよびテキサスレッドのような長波長プローブも使用できる。加えて、FRET受容体およびFRET供与体は、測定可能な蛍光信号を生成するために使用できる。本発明の系はまた、波長をシフトする蛍光レポーターの構成に良く適している。
本発明はまた、酵素性DNA配列の選択キットを提供する。1つの好ましい態様において、該キットは、発蛍光団で修飾したヌクレオチドと消光物質で修飾したオリゴヌクレオチドによりフランキングされたリボヌクレオチド結合を持つDNAクレームと、ランダムオリゴヌクレオチドの挿入に適応した配列を含むDNA構成物を含む。他の態様において、キットは、ランダムまたは既知の配列の挿入に適応したライブラリーDNAと、発蛍光団で修飾したヌクレオチドと消光物質で修飾したオリゴヌクレオチドによりフランキングされたリボヌクレオチドを含むアクセプターDNAと、RNA開裂配列のPCR増幅のためのプライマーを含む。
本発明は、信号発生アロステリックDNA酵素、およびその検出方法、選択方法および増幅方法を提供する。独特に同時に起こる化学触媒作用/即時信号発生能力を有するシス作用性RNA開裂DNA酵素、DEC22−18、および関連するトランス作用性DNA酵素、DET22−18の双方が提供される。DEC22−18は、該酵素および基質が同じ分子内に存在する独特な構造的特徴を有し、適した2価金属イオンで大きな蛍光信号を生成できる自己触媒作用性系を導く。そのような系の利点は、触媒作用成分および信号発生成分の双方が単一分子中に存在するので、光ファイバーのもののような適した表面上への該DNAザイムの固定化に基いて、“無試薬”センサーを開発できることである。この場合において、信号を生成するために、適した標的の存在のみが必要とされる。大きな
kobs値、およびこの系からの蛍光強度の非常に顕著な増加を達成する能力があれば、標的分子の迅速かつ敏感な検出は、そのようなリポーターで達成できる。
kobs値、およびこの系からの蛍光強度の非常に顕著な増加を達成する能力があれば、標的分子の迅速かつ敏感な検出は、そのようなリポーターで達成できる。
トランス作用性DNAザイム、DET22−18は、現在まで報告されている最速のDNA酵素の1つである〜7分-1のkcatを持つ真の酵素である。58−ntのDNA酵素は、キメラRNA/DNA基質を、近接した間隔にある発蛍光団−消光物質対により囲まれた孤立RNA結合で開裂する。この独特な構造は、化学開裂と蛍光信号発生が同時に起こることを可能にする。FとQとの間の非常に短い距離は、開始基質における最大蛍光消光を起こし(シスおよびトランスの双方の反応について)、そして化学触媒作用による非常に大きな蛍光増大を生じる。同時に、同じ基質内でのFおよびQの共有結合による一体化は、発蛍光団および消光物質の互いから離れる望ましくない広範囲の移動を抑止して、化学触媒作用を起源としない偽信号発生の可能性を最小にする。本発明の信号発生DNA酵素は、高速な化学作用の能力、同時に起こる触媒作用−信号発生能力、優れた蛍光信号特性(低いバックグラウンド蛍光、大きな信号増大、および偽信号発生の最小の可能性)、および単純なステム−ループ構造を有する。これは、それらを、例外的な即時検出感度および正確性を持つ有用なアロステリックデオキシリボザイムバイオセンサーを作製するために理想的なDNA酵素とする。異なる発蛍光団および消光物質を伴う多数の同様なDNA酵素が、DEC22−18およびDET22−18の生成に使用したのと同様な戦略で非常に容易に生成できる。そのようなDNA酵素は、重要な生物学的標的の検出のための様々な形態の多重アッセイを組み立てることに有用である。
上記の開示は本発明の一般的な説明である。より完全な理解は以下の特定の実施例の参照により得ることができる。これらの実施例は説明の目的のみのために記載されており、そして本発明の範囲を限定することを意図しない。形態の変化および等価物の置換は、状況が都合が良いことを示唆するか都合を良くするときに考慮される。特別な用語が本明細書において使用されているけれども、そのような用語は記述上の観念を意図し、そして限定目的を意図しない。
実施例
例は説明の目的のために記載され、そして本発明の範囲を限定することを意図しない。
例は説明の目的のために記載され、そして本発明の範囲を限定することを意図しない。
本開示で言及されるが明記されていない合成化学、タンパク質およびペプチド化学および分子生物学の方法は、化学文献において報告され、また当業者に良く知られている。
実施例1.オリゴヌクレオチド
標準オリゴヌクレオチドを、シアノエチルホスファアミダイト化学(ケック・バイオテクノロジー・リソース・ラボラトリー、イェール・ユニヴァーシティー;セントラル・ファシリティ、マクマスター・ユニヴァーシティー)を使用する自動化DNA合成により生成した。ランダム配列DNAライブラリーを4つの標準ホスファアミダイトの等モル混合物を使用して合成した。DNAオリゴヌクレオチドを10%予備変性(8M尿素)ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)により精製し、そしてその濃度を分光光度計により決定し、そしてバイオポリマー・カリキュレーター・プログラム( HYPERLINK http://paris.chem.yale.edu http://paris.chem.yale.eduで入手可能)を使用して計算した。
標準オリゴヌクレオチドを、シアノエチルホスファアミダイト化学(ケック・バイオテクノロジー・リソース・ラボラトリー、イェール・ユニヴァーシティー;セントラル・ファシリティ、マクマスター・ユニヴァーシティー)を使用する自動化DNA合成により生成した。ランダム配列DNAライブラリーを4つの標準ホスファアミダイトの等モル混合物を使用して合成した。DNAオリゴヌクレオチドを10%予備変性(8M尿素)ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)により精製し、そしてその濃度を分光光度計により決定し、そしてバイオポリマー・カリキュレーター・プログラム( HYPERLINK http://paris.chem.yale.edu http://paris.chem.yale.eduで入手可能)を使用して計算した。
フルオレセインおよび4−(4−ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(DABCYL)標識を、自動化DNA合成の間に、フルオレセイン−dTアミダイトおよびDABCYL−dTアミダイト(グレン・リサーチ社、スターリング、バージニア)を使用して組み入れた。アデニンリボヌクレオチド結合をまた、固相合成の間に、A−TOM−CEホスファアミダイト(グレン・リサーチ社製)を使用して組み入れた。フルオレセインおよ
びDABCYLで修飾したオリゴヌクレオチドを、168・ダイオード・アレイ検出器を持つベックマン−カルター・HPLC・システム・ゴールドで行う逆相液体クロマトグラフィ(HPLC)により精製した。使用したHPLCカラムは、4.6mm×250mmの寸法および5μmのビーズ径を持つアジレント・ゾーバックス・ODS・C18カラムだった。溶離を0.1Mトリエチルアンモニウムアセテート(TEAA、pH6.5)である緩衝液Aおよび純粋なアセトニトリルである緩衝液Bでの2緩衝液系を使用して達成した。最良の分離結果は非線形溶離勾配(5分間0%B、95分にわたり10%Bから30%B)を使用し0.5mL/分の流速で達成された。主ピークは260nmおよび491nmの双方で非常に強い吸収を有することが見出された。
びDABCYLで修飾したオリゴヌクレオチドを、168・ダイオード・アレイ検出器を持つベックマン−カルター・HPLC・システム・ゴールドで行う逆相液体クロマトグラフィ(HPLC)により精製した。使用したHPLCカラムは、4.6mm×250mmの寸法および5μmのビーズ径を持つアジレント・ゾーバックス・ODS・C18カラムだった。溶離を0.1Mトリエチルアンモニウムアセテート(TEAA、pH6.5)である緩衝液Aおよび純粋なアセトニトリルである緩衝液Bでの2緩衝液系を使用して達成した。最良の分離結果は非線形溶離勾配(5分間0%B、95分にわたり10%Bから30%B)を使用し0.5mL/分の流速で達成された。主ピークは260nmおよび491nmの双方で非常に強い吸収を有することが見出された。
RNA結合の2’−ヒドロキシ基についてのTOM保護基を、THF中で150mLの1Mテトラブチルアンモニウムフルオライド(TBAF)と共に60℃で振盪しながらの6時間の定温放置、続く250mLの100mMトリス(pH8.3)の添加、およびさらなる振盪しながらの30分間、37℃での定温放置により除去した。該DNAをエタノール沈殿を使用して回収し、0.01%SDSを含有する水中に溶解し、そしてテトラブチルアンモニウム塩を、スピンカラム(ナノセップ・3K・オメガ、ポール・コーポレイション、アン・アンバー、ミシガン)を使用する遠心分離により除去した。
ヌクレオチド5’−トリホスフェート、[g−32P]ATPおよび[a−32P]dGTPはアマーシャム・ファルマシア社より購入した。TaqDNAポリメラーゼ、T4DNAリガーゼおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼ(PNK)はMBI・ファールメンタス社より購入した。全ての他の化学試薬はシグマ社より購入した。
実施例2.最適な蛍光消光のためのオリゴヌクレオチドの設計
何れかの与えられた条件下でもその不活性状態では低いバックグラウンド蛍光を有するが、DNA鎖中に埋め込まれそして共有結合した発蛍光団および消光物質の対によりフランキングされた1つのRNA結合の開裂により大きな蛍光信号を生成できるRNA開裂に基く信号発生DNA酵素レポーターを生成した。この配置は、該発蛍光団と該消光物質との間の短い距離のために、非常に有効な蛍光消光を生じるだけでなく、該RNA結合が開裂するまで該消光物質が該発蛍光団から分離できないので、偽陽性を最小にする。該発蛍光団と該消光物質との間の最適な距離を決定するために、図2Aに示すような変化を持つ一連のDNAオリゴヌクレオチド(F:フルオレセイン−dT;Q:DABCYL−dT;Ar:アデニンリボヌクレオチド)を合成した。これらのDNA分子の開裂に依存した信号発生挙動を0.25MのNaOHでの処理により評価し、そしてデータを図2Bに示すが、ここでF0およびFは、0.25MのNaOHの添加直後(RNA開裂はまだ起こっていない)および20時間の定温放置後(完全なRNA開裂19)に測定した関連するDNAの蛍光強度を表す。この例において、F1QDNAは最も顕著な蛍光変化(〜70倍の強度の増加を持つ)を有し、続いてF2QDNA(〜30倍)であった。F3DNAは約4倍の蛍光増大を生じた。距離に伴う蛍光増大の減少は、より効果的でない消光により距離が増大するにつれてF0の高い値が高くなる結果から生じた。全てのFxQDNA系(x=1〜3)は、FDNAと同様な最終強度値に到達した。
何れかの与えられた条件下でもその不活性状態では低いバックグラウンド蛍光を有するが、DNA鎖中に埋め込まれそして共有結合した発蛍光団および消光物質の対によりフランキングされた1つのRNA結合の開裂により大きな蛍光信号を生成できるRNA開裂に基く信号発生DNA酵素レポーターを生成した。この配置は、該発蛍光団と該消光物質との間の短い距離のために、非常に有効な蛍光消光を生じるだけでなく、該RNA結合が開裂するまで該消光物質が該発蛍光団から分離できないので、偽陽性を最小にする。該発蛍光団と該消光物質との間の最適な距離を決定するために、図2Aに示すような変化を持つ一連のDNAオリゴヌクレオチド(F:フルオレセイン−dT;Q:DABCYL−dT;Ar:アデニンリボヌクレオチド)を合成した。これらのDNA分子の開裂に依存した信号発生挙動を0.25MのNaOHでの処理により評価し、そしてデータを図2Bに示すが、ここでF0およびFは、0.25MのNaOHの添加直後(RNA開裂はまだ起こっていない)および20時間の定温放置後(完全なRNA開裂19)に測定した関連するDNAの蛍光強度を表す。この例において、F1QDNAは最も顕著な蛍光変化(〜70倍の強度の増加を持つ)を有し、続いてF2QDNA(〜30倍)であった。F3DNAは約4倍の蛍光増大を生じた。距離に伴う蛍光増大の減少は、より効果的でない消光により距離が増大するにつれてF0の高い値が高くなる結果から生じた。全てのFxQDNA系(x=1〜3)は、FDNAと同様な最終強度値に到達した。
実施例3.蛍光測定
全ての測定は、400μl溶液でキャリー・エクリプス・フルオレセンス・スペクトロフォトメーター(バリアン社製)でなした。励起は490で設定し、そして発光は520nmで設定した。
全ての測定は、400μl溶液でキャリー・エクリプス・フルオレセンス・スペクトロフォトメーター(バリアン社製)でなした。励起は490で設定し、そして発光は520nmで設定した。
実施例4.速度論的分析
典型的な反応は以下の工程を伴った:(1)水中で30秒間90℃でのDNAの熱変性、(2)室温で反応緩衝液中、指定した時間のRNA開裂のための定温放置、(3)該反応を停止するための30mMまでのEDTAの添加、(4)変性10%PAGEによる開裂生成物の分離、および(5)ホスフォイメージャーおよびイメージクアントソフトウェアを使用する定量。RNA開裂反応溶液の一定分量を、全て完了10%以下の異なる反応時点で収集し、そして該反応についての速度定数を、未反応のままであるDNA画分の自然対数を反応時間に対してプロットすることにより決定した。該データへの最小二乗合わせにより生成した直線の負の勾配を速度定数とした。
典型的な反応は以下の工程を伴った:(1)水中で30秒間90℃でのDNAの熱変性、(2)室温で反応緩衝液中、指定した時間のRNA開裂のための定温放置、(3)該反応を停止するための30mMまでのEDTAの添加、(4)変性10%PAGEによる開裂生成物の分離、および(5)ホスフォイメージャーおよびイメージクアントソフトウェアを使用する定量。RNA開裂反応溶液の一定分量を、全て完了10%以下の異なる反応時点で収集し、そして該反応についての速度定数を、未反応のままであるDNA画分の自然対数を反応時間に対してプロットすることにより決定した。該データへの最小二乗合わせにより生成した直線の負の勾配を速度定数とした。
実施例5.DNA酵素の単離のための選択計画
F1QDNAが最大の蛍光強度増加を有したので、発蛍光団を含有するヌクレオチドと消光物質で変性されたヌクレオチドにより直ちにフランキングされたRNA結合を、DNA酵素の生成に使用するための開始ランダム配列集合に組み入れた。信号を発生する自己触媒作用性DNA分子を単離するための選択計画を図3に示す。一般的な計画を図3Aに示し、そして好ましい態様の特定の配列を図3Bに示す。工程Iにおいて、43個のランダム配列ヌクレオチドを含有する1本鎖で86−ntのDNAの集合を生成した。これをライブラリーL1と命名する。図3Bに示す配列において、N43は、43個のヌクレオチドのランダム配列を示す。300pmolの5’側をリン酸化しゲル精製した86−ntのランダム配列DNAL1を、等モル比で、テンプレートT1およびアクセプターA1(全ての配列を図3Bに示す)と混合し、90℃まで30秒間加熱し、室温まで冷却し、そして修飾したDNAドメインを導入するDNA結合のために、10×リガーゼ緩衝液およびT4DNAリガーゼと組み合わせた(工程I、図3A)。結合混合物(50mL)は、50mMのトリス−HCl(23℃でpH7.8)、40mMのNaCl、10mMのMgCl2、1mg/mLのBSA、0.5mMのATP、および0.1U(ヴァイス)mL-1のT4DNAリガーゼを含有した。該溶液を23℃で1時間定温放置し、そして結合した109−ntのDNAを10%変性PAGEにより精製した(工程II)。
F1QDNAが最大の蛍光強度増加を有したので、発蛍光団を含有するヌクレオチドと消光物質で変性されたヌクレオチドにより直ちにフランキングされたRNA結合を、DNA酵素の生成に使用するための開始ランダム配列集合に組み入れた。信号を発生する自己触媒作用性DNA分子を単離するための選択計画を図3に示す。一般的な計画を図3Aに示し、そして好ましい態様の特定の配列を図3Bに示す。工程Iにおいて、43個のランダム配列ヌクレオチドを含有する1本鎖で86−ntのDNAの集合を生成した。これをライブラリーL1と命名する。図3Bに示す配列において、N43は、43個のヌクレオチドのランダム配列を示す。300pmolの5’側をリン酸化しゲル精製した86−ntのランダム配列DNAL1を、等モル比で、テンプレートT1およびアクセプターA1(全ての配列を図3Bに示す)と混合し、90℃まで30秒間加熱し、室温まで冷却し、そして修飾したDNAドメインを導入するDNA結合のために、10×リガーゼ緩衝液およびT4DNAリガーゼと組み合わせた(工程I、図3A)。結合混合物(50mL)は、50mMのトリス−HCl(23℃でpH7.8)、40mMのNaCl、10mMのMgCl2、1mg/mLのBSA、0.5mMのATP、および0.1U(ヴァイス)mL-1のT4DNAリガーゼを含有した。該溶液を23℃で1時間定温放置し、そして結合した109−ntのDNAを10%変性PAGEにより精製した(工程II)。
上記のように構成した109−ntのDNA集団を初期集合(世代0またはG0と記載)として使用し、90℃まで30秒間加熱し、室温まで冷却し、そしてその後、2’選択緩衝液(100mMのHEPES、23℃でpH6.8、800mMのNaCl、200mMのKCl、15mMのMgCl2、10mMのMnCl2、2.5mMのCdCl2、2mMのCoCl2、0.5mMのNiCl2)と、0.05mMの最終DNA濃度まで組み合わせた(工程III)。該混合物を自己開裂のために23℃で5時間定温放置した。
該開裂反応を30mMの最終濃度までのEDTA(pH8.0)の添加により停止した。開裂したDNAを10%変性PAGEにより単離した。DNA回収の収率を増加させるためおよび94−ntの開裂生成物の状態を追跡するために、109−ntの構造物のアルカリ消化により作製した強放射線活性で94−ntのDNAマーカー0.25pmolを、“キャリアDNA”として使用した。該単離した開裂生成物を、5×100mL反応体積においてプライマーP1およびP2(図3B)を使用するPCRにより増幅した(工程IV)。該PCR反応をSYBRグリーン(モレキュラー・プローブ社製)を使用して即時観察した。2%の増幅したDNA生成物を、10×100mLの反応体積においてプライマーP1およびリボ末端プライマーP3を使用する新たなPCR反応のためのDNAテンプレートとして使用した(工程V)。反応混合物はまたDNA標識のための30mCiの[a−32P]dGTPを含んだ。
前記第2のPCRにおけるDNA生成物をエタノール沈殿により回収し、0.25MのNaOH90mLに再懸濁し、そして90℃で10分間定温放置して1つの埋め込んだR
NA結合を開裂した(工程VI)。該開裂溶液を、3MのNaOAc(23℃でpH5.2)10mLを添加することにより変性し、そして〜86−ntの1本鎖DNA断片を、10%変性PAGEにより単離した。該回収したDNA分子を、10単位のPNKと共に37℃で1時間、DNAリン酸化のために、50mMのトリス−HCl(23℃でpH7.8)、40mMのNaCl、10mMのMgCl2、1mg/mLのBSAおよび0.5mMのATPを含有する100mLの反応混合物中で定温放置した。該反応を30mMの最終濃度までのEDTAの添加により停止した。51−リン酸化DNAを、最初の選択ラウンドについて記載したのと同じ手順を使用する第2の選択ラウンドに使用した。
NA結合を開裂した(工程VI)。該開裂溶液を、3MのNaOAc(23℃でpH5.2)10mLを添加することにより変性し、そして〜86−ntの1本鎖DNA断片を、10%変性PAGEにより単離した。該回収したDNA分子を、10単位のPNKと共に37℃で1時間、DNAリン酸化のために、50mMのトリス−HCl(23℃でpH7.8)、40mMのNaCl、10mMのMgCl2、1mg/mLのBSAおよび0.5mMのATPを含有する100mLの反応混合物中で定温放置した。該反応を30mMの最終濃度までのEDTAの添加により停止した。51−リン酸化DNAを、最初の選択ラウンドについて記載したのと同じ手順を使用する第2の選択ラウンドに使用した。
この例において、Mg2+並びにMn2+、Co2+、Ni2+およびCd2+を含む幾つかの2価遷移金属イオンが前記選択緩衝液中に含まれていた。2価金属イオンの総濃度は15mMとなるように選択し、個々の濃度は以下のように設定した:7.5mMのMg2+、5mMのMn2+、1.25mMのCd2+、1mMのCo2+、0.25mMのNi2+。他の組み合わせおよび濃度も有効であり得ることは明白である。
反復した選択ラウンドは高効率のデオキシリボザイムの選択を導く。選択の進行を図3Cに要約する。開裂活性が無いか低い開裂活性が、世代G0〜G8において単離したDNA配列に観察された。しかしながら、顕著な開裂がG9およびG10において見られた。G11では、DNA構造物の30%以上が5時間の定温放置後に開裂した。非常に有効なDNA酵素を得るため、反応時間をその後暫時減少した。自己開裂反応を、G12において10分間またG13において1分間のみ進行させ、そして該反応時間をさらにG14およびG15において30秒まで、G16およびG17において5秒まで、そして最後にはG18〜G21において1秒まで減少させた。G22におけるDNA分子は、1分間反応させ、そして開裂されたDNAはクローン化した。
実施例6.選択したデオキシリボザイムのクローン化および配列決定
22番目の選択ラウンドからのDNA配列をPCRにより増幅し、そしてTAクローン化法によりベクター中へクローン化した。個々の触媒を含有するプラスミドを、キアゲン・ミニプレップ・キットを使用して生成した。DNA配列決定を、製造者により推奨された手順に従いLCQ2000キャピラリーDNAシークエンサー(ベックマン−カルター社製)で行った。
22番目の選択ラウンドからのDNA配列をPCRにより増幅し、そしてTAクローン化法によりベクター中へクローン化した。個々の触媒を含有するプラスミドを、キアゲン・ミニプレップ・キットを使用して生成した。DNA配列決定を、製造者により推奨された手順に従いLCQ2000キャピラリーDNAシークエンサー(ベックマン−カルター社製)で行った。
実施例7.自己触媒作用性DNA分子の単離および活性
単一種のデオキシリボザイムを、20個以上のクローンを配列決定した後に、G22集合中に見出した。この自己触媒作用性DNA分子、名称DEC22−18の配列を図4Aに与える。その触媒作用活性の確認および金属イオン要求の分析を図4Bに示す。該DNA酵素を、23番目と24番目とを結合するホスホジエステル結合で32Pで標識した。未開裂で109−ntのDEC22−18は従って弱蛍光性(Q成分が未だ存在しているから)であり、そして高放射線活性であった。図4Bに示すように、自己開裂により、DEC22−18は2つの開裂生成物を生じさせ、5’側開裂断片(15−nt;P1)は強蛍光性であるが放射線活性でなく、そして3’側断片(94−nt;P2)は放射線活性のみであった。該2つの開裂生成物はNaOHでの該デオキシリボザイムの部分消化により得、そして対照(第1列)として使用した。該デオキシリボザイムを水(第2列)、1価金属イオン(第3列)、Cd2+(第5列)またはMg2+(第8列)で処理したとき、開裂生成物は生成せず、該DNA酵素をCo2+(第4列)、Ni2+(第6列)またはMn2+(第7列)で処理したとき、それは合致する信号発生特性を持つ2つの予期されたDNA断片に自己開裂した。各場合において、未開裂のDEC22−18のものに対するP1の蛍光強度の比率は、これらの種の放射線活性の比率より大きく、結合した触媒作用−信号
発生機構と合致した蛍光増大を意味する。該データは、DEC22−18が2価金属コファクターとしてCo(II)、Ni(II)またはMn(II)を使用できるメタロDNA酵素であることを示す。さらなる実験は、Co(II)がDEC22−18のための好ましい金属コファクターであることを示唆した。
単一種のデオキシリボザイムを、20個以上のクローンを配列決定した後に、G22集合中に見出した。この自己触媒作用性DNA分子、名称DEC22−18の配列を図4Aに与える。その触媒作用活性の確認および金属イオン要求の分析を図4Bに示す。該DNA酵素を、23番目と24番目とを結合するホスホジエステル結合で32Pで標識した。未開裂で109−ntのDEC22−18は従って弱蛍光性(Q成分が未だ存在しているから)であり、そして高放射線活性であった。図4Bに示すように、自己開裂により、DEC22−18は2つの開裂生成物を生じさせ、5’側開裂断片(15−nt;P1)は強蛍光性であるが放射線活性でなく、そして3’側断片(94−nt;P2)は放射線活性のみであった。該2つの開裂生成物はNaOHでの該デオキシリボザイムの部分消化により得、そして対照(第1列)として使用した。該デオキシリボザイムを水(第2列)、1価金属イオン(第3列)、Cd2+(第5列)またはMg2+(第8列)で処理したとき、開裂生成物は生成せず、該DNA酵素をCo2+(第4列)、Ni2+(第6列)またはMn2+(第7列)で処理したとき、それは合致する信号発生特性を持つ2つの予期されたDNA断片に自己開裂した。各場合において、未開裂のDEC22−18のものに対するP1の蛍光強度の比率は、これらの種の放射線活性の比率より大きく、結合した触媒作用−信号
発生機構と合致した蛍光増大を意味する。該データは、DEC22−18が2価金属コファクターとしてCo(II)、Ni(II)またはMn(II)を使用できるメタロDNA酵素であることを示す。さらなる実験は、Co(II)がDEC22−18のための好ましい金属コファクターであることを示唆した。
実施例8.最適配列の決定
活性についての最適な配列を、ヌクレオチド切除実験を使用して決定した。切除戦略を図5に示す。DEC22−18は、選択緩衝液(50mMのHEPES、23℃でpH6.8、400mMのNaCl、100mMのKCl、7.5mMのMgCl2、5mMのMnCl2、1mMのCoCl2、0.25mMのNiCl2、1.25mMのCdCl2)条件下で、1.0分-1のkobsを示す。DEC22−18は109個のヌクレオチドからなる大きなDNA分子である。DNA酵素配列が最小化できるか否かを決定するために、3’−末端からの様々な切除して一連のDNA分子を合成した。これらの切除した変異体を触媒作用活性について調査し、そして結果を図5に要約する(相対的活性は野生種DEC22−18のものを100として示す)。1つの態様において、該結果は、DEC22−18の最後の29個のヌクレオチドを、触媒作用活性を顕著に低減することなく除去できることを示す。他の態様において、幾つかの切除変異体は、野生種分子より有効である。好ましい態様において、最後の26個のヌクレオチドの切除は、DEC22−18Aと記載する83−ntの酵素を生じ、それは該選択緩衝液条件下で2.1分-1のkobsを持つ顕著に改良された触媒作用活性を有する。DEC22−18Aはさらに、50mMのHEPES(23℃でpH6.8)、5mMのMgCl2、10mMのCoCl2を含有し、1価金属イオンを伴わない溶液中に存在するとき、より有効な触媒である。この場合、自己開裂反応は、慣用の手動停止方法を使用して速度定数の正確な測定を可能にするには速過ぎた(データは示さない)。kobs値は、DEC22−18Aの約50%が3秒で開裂した観察に基いて、10分-1であると見積もることができる。
活性についての最適な配列を、ヌクレオチド切除実験を使用して決定した。切除戦略を図5に示す。DEC22−18は、選択緩衝液(50mMのHEPES、23℃でpH6.8、400mMのNaCl、100mMのKCl、7.5mMのMgCl2、5mMのMnCl2、1mMのCoCl2、0.25mMのNiCl2、1.25mMのCdCl2)条件下で、1.0分-1のkobsを示す。DEC22−18は109個のヌクレオチドからなる大きなDNA分子である。DNA酵素配列が最小化できるか否かを決定するために、3’−末端からの様々な切除して一連のDNA分子を合成した。これらの切除した変異体を触媒作用活性について調査し、そして結果を図5に要約する(相対的活性は野生種DEC22−18のものを100として示す)。1つの態様において、該結果は、DEC22−18の最後の29個のヌクレオチドを、触媒作用活性を顕著に低減することなく除去できることを示す。他の態様において、幾つかの切除変異体は、野生種分子より有効である。好ましい態様において、最後の26個のヌクレオチドの切除は、DEC22−18Aと記載する83−ntの酵素を生じ、それは該選択緩衝液条件下で2.1分-1のkobsを持つ顕著に改良された触媒作用活性を有する。DEC22−18Aはさらに、50mMのHEPES(23℃でpH6.8)、5mMのMgCl2、10mMのCoCl2を含有し、1価金属イオンを伴わない溶液中に存在するとき、より有効な触媒である。この場合、自己開裂反応は、慣用の手動停止方法を使用して速度定数の正確な測定を可能にするには速過ぎた(データは示さない)。kobs値は、DEC22−18Aの約50%が3秒で開裂した観察に基いて、10分-1であると見積もることができる。
実施例9.トランス作用性DNA酵素の設計
トランス作用性DNA酵素を与える。M−フォールドプログラム(http://bioinfo.math.rpi.edu/~mfold/dna)により予測したDEC22−18Aについての2次構造を図6Aに示す。この構造を、DEC22−18A中に存在するステム−1およびそのループを8つの塩基対からなるステムと交換することにより、トランス作用性DNA酵素系、DET22−18を首尾良く設計するために使用した。この構造を図6Bに示す。DET22−18は、メカエリス−メンテン速度論に従って基質S1を開裂する真のDNA酵素かつ多重代謝回転DNA酵素である。図6Cは、DET22−18を5nMで使用し、一方、S1の濃度が100〜2000nMの間で変化する速度論的実験からのデータを示す。7.2±0.7分-1のkcatおよび0.94±0.19mMのKMをグラフィットソフトウェアを使用して得た。これらのデータは、58−ntのDET22−18が非常に有効なDNA酵素であることを示す。
トランス作用性DNA酵素を与える。M−フォールドプログラム(http://bioinfo.math.rpi.edu/~mfold/dna)により予測したDEC22−18Aについての2次構造を図6Aに示す。この構造を、DEC22−18A中に存在するステム−1およびそのループを8つの塩基対からなるステムと交換することにより、トランス作用性DNA酵素系、DET22−18を首尾良く設計するために使用した。この構造を図6Bに示す。DET22−18は、メカエリス−メンテン速度論に従って基質S1を開裂する真のDNA酵素かつ多重代謝回転DNA酵素である。図6Cは、DET22−18を5nMで使用し、一方、S1の濃度が100〜2000nMの間で変化する速度論的実験からのデータを示す。7.2±0.7分-1のkcatおよび0.94±0.19mMのKMをグラフィットソフトウェアを使用して得た。これらのデータは、58−ntのDET22−18が非常に有効なDNA酵素であることを示す。
実施例10.DET22−18の信号発生特性
DET22−18/S1基質系の信号発生挙動を蛍光分光計を介して即時測定し、そして結果を図7に示す。最適なCo(II)濃度未満(10mMよりむしろ1mM)を、蛍光強度変化が慣用の分光法を使用して観察できるように開裂反応を鈍化するため、並びにこの金属イオンにより引き起こされる何れかの蛍光消光を最小化するために使用した。信号発生反応を2つの異なる酵素:基質比の下で調査した:(1)S1に対し10倍過剰のDET22−18(E)(図7A)および(2)DET22−18に対し10倍過剰のS1(図7B)。双方の場合において、該系は、S1を金属イオン単独とDET22−18
を伴わずに定温放置したとき、一定の蛍光強度を有した(反応の最初の10分)。該DNA酵素を導入したとき、双方の溶液の蛍光強度は鋭く増加した。図7A(E:S=10:1)において、蛍光増大(F/F0;F0は初期強度を表し、そしてFは何れかの与えられた時間での強度を表す)は、1分以内に、7.4倍の増大が観察されるような急激な速度で増加した(挿入したグラフ参照)。図7Bにおいて、蛍光増大は、DNA酵素の濃度が基質のものの10倍低いので、予期したような低減した比率で増加した。1分の定温放置においいて3.3倍の増大があり(挿入したグラフ参照)、2.1/分の初期代謝回転率を表した(反応が完了したとき、16倍の増大が観察された観察に基く)。これらのデータは、信号発生DNA酵素が、広範囲の基質濃度下での信号発生のために使用できることを示す。
DET22−18/S1基質系の信号発生挙動を蛍光分光計を介して即時測定し、そして結果を図7に示す。最適なCo(II)濃度未満(10mMよりむしろ1mM)を、蛍光強度変化が慣用の分光法を使用して観察できるように開裂反応を鈍化するため、並びにこの金属イオンにより引き起こされる何れかの蛍光消光を最小化するために使用した。信号発生反応を2つの異なる酵素:基質比の下で調査した:(1)S1に対し10倍過剰のDET22−18(E)(図7A)および(2)DET22−18に対し10倍過剰のS1(図7B)。双方の場合において、該系は、S1を金属イオン単独とDET22−18
を伴わずに定温放置したとき、一定の蛍光強度を有した(反応の最初の10分)。該DNA酵素を導入したとき、双方の溶液の蛍光強度は鋭く増加した。図7A(E:S=10:1)において、蛍光増大(F/F0;F0は初期強度を表し、そしてFは何れかの与えられた時間での強度を表す)は、1分以内に、7.4倍の増大が観察されるような急激な速度で増加した(挿入したグラフ参照)。図7Bにおいて、蛍光増大は、DNA酵素の濃度が基質のものの10倍低いので、予期したような低減した比率で増加した。1分の定温放置においいて3.3倍の増大があり(挿入したグラフ参照)、2.1/分の初期代謝回転率を表した(反応が完了したとき、16倍の増大が観察された観察に基く)。これらのデータは、信号発生DNA酵素が、広範囲の基質濃度下での信号発生のために使用できることを示す。
実施例11.信号発生アロステリックDNA酵素の生成
DEC22−18Aの構造におけるステム−ループ特徴は、アロステリックデオキシリボザイムの設計のために理想的である。DEC22−18AがアロステリックDNA酵素へと容易に設計できるか否かを決定するために、ATPアプタマーを該DNA酵素に弱めたステム−1を通して共役させた。この構造を図8Aに示す。ATPの不在下では、弱いステム−1は強く対合せず、そして結果としてこの構造物の触媒作用活性は相当に弱い。しかしながら、ATPが導入されると、該アプタマードメインはATPと安定な複合体を形成して、ステム−1の形成を促進し、そしてそれにより、開裂活性が顕著に増加する。
DEC22−18Aの構造におけるステム−ループ特徴は、アロステリックデオキシリボザイムの設計のために理想的である。DEC22−18AがアロステリックDNA酵素へと容易に設計できるか否かを決定するために、ATPアプタマーを該DNA酵素に弱めたステム−1を通して共役させた。この構造を図8Aに示す。ATPの不在下では、弱いステム−1は強く対合せず、そして結果としてこの構造物の触媒作用活性は相当に弱い。しかしながら、ATPが導入されると、該アプタマードメインはATPと安定な複合体を形成して、ステム−1の形成を促進し、そしてそれにより、開裂活性が顕著に増加する。
共役したDNA分子または“アプタザイム”を、始めに以下の反応条件下で信号発生特性について評価した:50mMのHEPES(23℃でpH6.8)、14mMのMgCl2、1mMのCoCl2、23℃。結果を図8Aに示す。蛍光強度は、ATPが存在しないとき(最初の5分の定温放置)、〜0.04蛍光単位/分(f.u./分)の比率で増加した。ATPの導入により(定温放置6分目でのデータ記録の前)、信号比率は〜0.16f.u./分、即ち、触媒速度の4倍の増大まで増加した。該系はATPの添加後3分のうちに、その最大信号発生能力の80%に到達した。RNA開裂依存性蛍光信号発生の性質を、32P−標識したDNA構造物を使用する開裂生成物のPAGE分析により確認した。ATPによるRNA開裂の同様の4倍の活性化をPAGE実験において観察した。
図8Bに示すデータは、アプタマー−デオキシリボザイム構造物のRNA開裂活性がATPの不在下で高いことを示唆する。これは、酵素性ドメイン単独が有効な触媒作用を与えるために十分安定かつ活性な構造を形成できることを示唆する。“自己折畳み”のこの能力がより高い温度および低減したCo2+濃度で弱まるか否かを決定するために、高温および低減したCo2+濃度で一連の実験を行った。図8Cは、37℃および0.25mMのCo2+で1mMのATP(三角)または1mMのGTP(四角)の存在下で行った1組の実験からの結果を図示する。各反応混合物をATPまたはGTPの不在下で最初に10分間定温放置し、そしてATPまたはGTPを反応の11分目でのデータ記録の前に導入した。ATPの不在下およびGTPを伴うか伴わない場合、反応は、9.5×10-4f.u./分の同じ信号発生比率(初期比率)で進行した。ATPの存在下では、信号発生比率は1.8×10-2f.u./分まで増加し、ATPによる約20倍の活性化を表す。図8Cでのデータはまた標的報告がATP特異的であり、GTPは顕著な信号増大を全く生じないことをも示す。より応答性のアロステリック活性とより小さな触媒速度の減少とを伴う信号発生DNA酵素は、部分的にランダム化したDEC22−18配列を使用するインビトロ選択を通して入手できる。
当業者は、本明細書において開示された特定の態様の変法および等価法は、通常の実験のみを使用して達成できることを容易に認識するであろう。そのような変法および等価法は本願の請求の範囲に包含されることが意図される。
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Claims (11)
- 信号発生DNA構造物であって、
i.酵素性DNA配列;および
ii.発蛍光団で修飾したオリゴヌクレオチドと、消光物質で修飾したオリゴヌクレオチドであって、それらは互いに十分に接近しており、それにより触媒作用の不在下で、該発蛍光団からの蛍光が該消光物質により消光されるオリゴヌクレオチドによりフランキングされたリボヌクレオチド結合を有するDNA鎖
を含む、信号発生DNA構造物。 - 前記酵素性DNA配列は、配列番号7または配列番号8に記載の配列を有するシス作用性酵素である、請求項1記載の信号発生酵素構造物。
- 前記酵素性DNA配列は、配列番号9に記載の配列を有するトランス作用性DNA酵素である、請求項1記載の信号発生DNA構造物。
- さらに、前記酵素性DNA配列に共役したアプタマー配列を含む、請求項1記載の信号発生DNA構造物。
- 配列番号10記載の配列を含む、請求項4記載の信号発生DNA構造物。
- 酵素性DNA配列の選択方法であって、該方法は、ランダム配列を、発蛍光団で修飾したオリゴヌクレオチドと消光物質で修飾したオリゴヌクレオチドによりフランキングされたリボヌクレオチド結合を有するDNA鎖中に挿入すること、および蛍光信号が生成されるか否かを決定することを含み、ここで該発蛍光団で修飾したオリゴヌクレオチドと該消光物質で修飾したオリゴヌクレオチドは互いに十分に接近しており、それにより触媒作用の不在下で、該発蛍光団からの蛍光が該消光物質により消光される、方法。
- 酵素性DNA配列の検出方法であって、該方法は、
i.スクリーニングするオリゴヌクレオチドのライブラリーを用意する工程と;
ii.該オリゴヌクレオチドを、発蛍光団で修飾したオリゴヌクレオチドと消光物質で修飾したオリゴヌクレオチドによりフランキングされたリボヌクレオチド結合を含むアクセプター配列に結合する工程と;
iii.該リボヌクレオチド結合での開裂により、蛍光信号が生成されるか否かを決定する工程
を含む、方法。 - DNA酵素の選択方法であって、該方法は、
i.スクリーニングするオリゴヌクレオチドのライブラリを用意することと;
ii.該オリゴヌクレオチドを、発蛍光団で修飾したオリゴヌクレオチドと消光物質で修飾したオリゴヌクレオチドによりフランキングされたリボヌクレオチド結合を含むアクセプター配列に結合することと;
iii.該リボヌクレオチド結合での開裂により、蛍光信号が生成されるか否かを決定することと;
iv.蛍光信号を生成する配列を増幅すること
を含む、方法。 - アプタマー配列の選択方法であって、該方法は、
i.オリゴヌクレオチド配列のライブラリを請求項1記載の信号発生DNA構造物に共役させて、共役分子を用意することと;
ii.該共役分子を所望の標的の存在下で培養することと;
iii.蛍光信号が生成されるか否かを決定することと;
iv.信号を生成する配列を増幅すること
を含む、方法。 - 酵素性DNA配列の選択キットであって、該キットは、
a)試験ヌクレオチド配列の挿入部位と;
b)発蛍光団で修飾したオリゴヌクレオチドと消光物質で修飾したオリゴヌクレオチドであって、それらは互いに十分に接近しており、それにより触媒作用の不在下で、該発蛍光団からの蛍光が該消光物質により消光され、かつ試験触媒作用性ヌクレオチド配列の存在下で蛍光信号が生成されるオリゴヌクレオチドよりフランキングされたリボヌクレオチド結合
を含む、キット。 - コファクターの検出方法であって、該方法は、
i.請求項1または4に記載の信号発生DNA構造物を用意する工程と;
ii.試料を導入する工程と;
iii.信号が生成されるか否かを決定する工程
を含み、ここで要求コファクターの存在下で、開裂が前記リボヌクレオチド結合で生じ、そして蛍光信号が生成される、方法。
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