CN110914687A - 血浆微量样品中肿瘤源性细胞外囊泡的纳米等离激元定量 - Google Patents
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Abstract
本文描述了快速、超灵敏且廉价的纳米等离激元增强散射(nPES)测定，其直接定量了来自少至1μL的血浆的肿瘤源性EV。该测定使用了金纳米球和纳米棒与EV‑特异性以及肿瘤源性EV‑特异性的结合，以产生局部等离激元效应，其增强了肿瘤源性EV的检测灵敏性和特异性。这种nPES方法还是一种评估胰腺癌阶段和治疗响应的非侵入性方法，其可以很容易地改进以用于临床使用，并且很容易适用于对具有疾病特异性EV蛋白质的其他病症进行诊断和监测。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年12月30日提交的美国临时专利申请号62/440,494的优先权，其公开内容通过引用整体并入本文中。
关于联邦政府资助的研究或开发的声明
本发明是在国立卫生研究院授予的RO1 AI113725和RO1 AI122932的政府支持下完成的。政府拥有本发明的一定权利。
背景技术
细胞外囊泡(EV)，包括外泌体和其他膜囊泡，由大部分细胞大量分泌到细胞外空间，它们最终可以从细胞外空间在循环中积聚。EV活跃地参与肿瘤起始、进展和转移，反映其亲代细胞和组织起源的穿梭信号分子(蛋白质和核酸)。
因此，循环肿瘤源性EV具有以非侵入性方式检测癌症的巨大潜力，然而，由于缺乏1)用于进行EV分析的简单的方法和2)区分肿瘤源性EV与正常EV的分子靶标，将肿瘤EV转化为癌症检测测定一直具有挑战性。常规检测技术需要耗时且劳动密集的分离和纯化程序(例如，超速离心、免疫磁性富集、多级过滤或基于微流控的分离)，然后进行EV定量和/或携带分子内容物(例如，mRNA、miRNA和蛋白质)的EV的分析。这些技术对于临床和研究用途是不实际的，因为它们需要相对大的样品体积并且复杂、低通量、昂贵以及具有较长的周转时间。样品要求对于基于动物的研究是一种特别的障碍，因为可以从人类疾病的常见小鼠模型获得的血液体积非常有限并且排除了纵向研究。用于标准EV分析的富集EV的膜蛋白(例如，CD9、CD63和CD81)存在于源自大多数细胞类型的EV，但是目前很少有人提出EV蛋白质与不同类型的癌症相关。
发明内容
本技术的实施方式公开了用于检测癌症特异性蛋白质的方法。该方法包括使含有EV的样品与缀合有针对EV分子的第一抗体的表面接触，以将所述EV与含有EV的样品分离；从表面上除去含有EV的样品；将该表面与缀合有针对癌症特异性蛋白质的第二抗体的第一组纳米颗粒一起孵育；以及，通过检测第二抗体与EV之间的结合来检测所述癌症特异性蛋白质是否存在于该含有EV的样品中。接触步骤还包括将表面与针对EV分子的第一抗体缀合。在某些实施方式中，EV蛋白质选自由以下组成的组：CD63、CD81、CD9、CD24、CD26、CD10、肿瘤易感基因101(TSG101)、热休克70kDa蛋白4(HSP70)、Rab-5b、程序性细胞死亡6-互动蛋白(AIP1/Alix)、水通道蛋白2(AQP2)、血管内皮生长因子受体1(FLT1)、含有岩藻糖残基的N-聚糖、磷酸胆碱、磷脂酰丝氨酸以及鞘磷脂。
孵育步骤还包括将表面与缀合有针对EV分子的第三抗体的第二组纳米颗粒一起孵育，其中，EV蛋白质选自由以下组成的组：CD63、CD81、CD9、CD24、CD26、CD10、TSG101、HSP70、Rab-5b、AIP1/Alix、AQP2、FLT1、含有岩藻糖残基的N-聚糖、磷酸胆碱、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂；以及，纳米颗粒包括多个纳米球、多个纳米棒或其组合。检测步骤还包括检测针对癌症特异性蛋白质的第二抗体与EV之间的结合；以及检测针对EV分子的第三抗体与EV之间的结合。此外，检测步骤还包括形成EV复合物，该EV复合物包括EV、经由第二抗体结合至EV的第一纳米颗粒以及经由第三抗体结合至EV的第二纳米颗粒，其中，第一纳米颗粒可以与第二纳米颗粒相互作用，以在第一纳米颗粒与第二纳米颗粒之间达到一定距离时产生纳米等离激元；以及检测所述纳米等离激元。
此外，本技术的实施方式涉及了一种用于检测胰腺癌特异性蛋白质——肝配蛋白A型受体2(EphA2)的方法，包括使含有细胞外囊泡(EV)的样品与缀合有针对EV分子的第一抗体的表面接触，以将所述EV与含有EV的样品分离；从表面上除去含有EV的样品；将该表面与缀合有针对EphA2的第二抗体的第一组纳米颗粒一起孵育，以获得胰腺癌源性EV；以及，通过检测第二抗体与胰腺癌源性EV之间的结合来检测EphA2是否存在于含有EV的样品中。
接触步骤还包括将表面与针对EV分子的第一抗体缀合，其中，EV分子选自有以下组成的组：CD63、CD81、CD9、CD24、CD26、CD10、TSG101、HSP70、Rab-5b、AIP1/Alix、AQP2、FLT1、含有岩藻糖残基的N-聚糖、磷酸胆碱、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂。此外，孵育步骤包括将表面与缀合有针对EV分子的第三抗体的第二组纳米颗粒一起孵育，其中，EV分子选自由以下组成的组：CD63、CD81、CD9、CD24、CD26、CD10、TSG101、HSP70、Rab-5b、AIP1/Alix、AQP2、FLT1、含有岩藻糖残基的N-聚糖、磷酸胆碱、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂；纳米颗粒包括多个纳米球、多个纳米棒或其组合。检测步骤还包括检测针对EphA2的第二抗体与胰腺癌源性EV之间的结合；以及检测针对EV分子的第三抗体与胰腺癌源性EV之间的结合。另外，检测步骤还包括形成EV复合物，EV复合物包括EV、经由针对EphA2的第二抗体结合至EV的第一纳米颗粒以及经由第三抗体结合至EV的第二纳米颗粒，其中，第一纳米颗粒可与第二纳米颗粒相互作用，以在第一纳米颗粒与第二纳米颗粒之间达到一定距离时产生纳米等离激元；以及检测所述纳米等离激元。
另外，本技术的实施方式涉及一种用于诊断受试者的胰腺癌的方法，包括使含有细胞外囊泡(EV)的样品与缀合有针对EV蛋白质的第一抗体的表面接触以将所述EV与含有EV的样品分离；从表面上除去含有EV的样品；将该表面与缀合有针对EphA2的第二抗体的第一组纳米颗粒一起孵育以获得胰腺癌源性EV；以及，通过检测第二抗体与胰腺癌源性EV之间的结合来检测EphA2是否存在于含有EV的样品中。接触步骤还包括将表面与针对EV蛋白质的第一抗体缀合，其中，EV蛋白质选自由以下组成的组：CD63、CD81、CD9、TSG101、HSP70、Rab-5b、AIP1/Alix、AQP2和FLT1。孵育步骤还包括将表面与缀合有针对EV蛋白质的第三抗体的第二组纳米颗粒一起孵育，其中，EV蛋白质选自由以下组成的组：CD63、CD81、CD9、TSG101、HSP70、Rab-5b、AIP1/Alix、AQP2和FLT1；以及，纳米颗粒包括多个纳米球、多个纳米棒或其组合。检测步骤还包括检测针对EphA2的第二抗体与胰腺癌源性EV之间的结合；以及，检测针对EV蛋白质的第三抗体与胰腺癌源性EV之间的结合。另外，检测步骤还包括形成EV复合物，EV复合物包括EV、经由针对EphA2的第二抗体结合至EV的第一纳米颗粒以及经由第三抗体结合至EV的第二纳米颗粒，其中，第一纳米颗粒可以与第二纳米颗粒相互作用，以在第一纳米颗粒与第二纳米颗粒之间达到一定距离时产生纳米等离激元；以及检测所述纳米等离激元。
附图说明
图1.用于EV检测的纳米等离激元增强散射(nPES)平台的设计。(a)用于EV的特异性检测的nPES测定的示意性视图。(b-d)Au纳米球颗粒(AuS)-抗-CD63(绿点)、Au纳米棒颗粒(AuR)-抗-CD9(红点)和AuS-EV-AuR复合物(可检测为亮黄色点)的暗场显微镜(DFM)图像。比例尺：2μm(100nm放大图像)。(e)散射光谱，以及(f)AuS-抗-CD63 48、AuR-抗-CD9(红色)和AuS-EV-AuR(黄色)复合物的强度。散射光谱和相关强度由配备有单色仪(CASCADE512B，Roper Scientific)的光谱仪CCD从10个随机选择的颗粒记录。数据代表平均值±SEM；n＝10个重复/样品。
图2.使用外泌体加标的人血浆样品的nPES测定性能的表征。(a)暗场显微镜(DFM)图像和(b)阴性(无EV等离激元、没有捕获Ab和AuS-EV单标记物)对照中金纳米颗粒(GNP)信号与nPES测定(AuS-EV-AuR复合物)样品的面积比。(c)在加标有指定EV浓度的血浆样品中检测到的AuS-EV-AuR复合物的DFM图像。(d)AuS-EV加标血浆样品的相关性。通过NIH IMAGEJ图像分析软件在255的像素强度阈值下分析了所有暗场图像。数据表示平均值±SEM；n＝3/组。
图3.通过建立nPES-EphA2-EV检测系统识别PC相关的EV作为潜在的生物标志物。(a)针对来自不同的PC细胞系(BxPC3、MIAPaCa-2和PANC-1)和正常胰腺(HPNE)细胞系的EV的EphA2表达的Western印迹分析。HPNE和PANC-1培养物中分别随时间变化的(b)EphA2-EV和(c)总EV信号；n＝3个一式三份样品/时间点。(d)NC(n＝10)、胰腺炎(n＝10)和PC(n＝10)患者的血浆中EphA2-EV和总-EV(分别为CD81-EphA2-CD9和CD81-CD63-CD9 nPES测定)以及EphA2-EV和CD9-EV(CD9-EV和CD81-EV ELISA)的定量。将所有数据归一化为对应的NC样品数据。在没有或有PANC-1人PC细胞(2×106细胞/小鼠)皮下注射后的裸鼠血浆样品中指定时间点的(e)DFM图像和(f)EphA2-EV面积比；n＝3个重复/样品。数据代表平均值±SEM；相对于对照小鼠，**p<0.01且****p<0.0001，并且通过双向ANOVA，以及，然后进行了Sidak多重比较测试，相对于PC基线，
且
图4.EphA2-EV检测和临床表现。827(a)正常对照(NC；n＝48)、慢性胰腺炎(Pt；n＝48)和PC(n＝49：8个I期，29个II期以及12个III期)患者血浆样品中EphA2-EV水平的比较。EphA2-EV和CA19-9的(b，d，f，h)ROC曲线和(c，e，g，i)AUC、灵敏性和特异性用于PC诊断。PC患者新辅助治疗前后的EphA2-EV水平，显示为对治疗的(j)良好/偏好响应(n＝13)或(k)不良响应(n＝10)以及(l)这些组治疗前后的相对差异。数据代表平均值±SEM；n＝3个重复/样品，通过双侧t检验(j)或配对t检验(l)，*p<0.05。进行这些分析的研究人员不会对样品特征不知情。
具体实施方式
将肿瘤EV转化为癌症蛋白质标志物的问题在于通过开发系统和方法的现有技术以快速、超灵敏且廉价的方式从较小体积的样品中定量和检测肿瘤源性EV。
参照附图，在下文描述中的一种或多种示例性实施方式中描述了本文公开的技术，其中相同的数字表示相同或相似的要素。整个本说明书对“一种实施方式(oneembodiment)”、“实施方式(an embodiment)”或类似语言的引用是指结合该实施方式描述的特定特征、结构或特性包括在本文公开的本技术的至少一种实施方式中。因此，在整个说明书中出现的短语“在一种实施方式中(in one embodiment)”、“在实施方式中(in anembodiment)”和类似语言可以但不是必须全部指同一实施方式。
本文公开的技术的所描述的特征、结构或特性可以在一种或多种实施方式中以任何合适的方式组合。在以下描述中，列举了许多具体细节以提供对本文公开的技术的实施方式的透彻理解。然而，相关领域的技术人员将认识到，可以在没有一个或多个具体细节的情况下或者利用其他方法、组件、材料等来实践本文公开的技术。在其他情况下，未详细示出或描述公知的结构、材料或操作以避免模糊本文公开的技术的各方面。
对于术语“例如”和“诸如”及其语法等同物，除非另有明确说明，否则应理解短语“和但没有限制”。如本文所用，术语“约”是指由于实验误差而引起±10％的任何测量变化。下面公开的任何测量的数值结果应理解为由术语“约”修饰，无论该术语是否明确使用且除非另有明确说明。
最近，已经开发了通过捕获EV膜上的候选的肿瘤调节标志物来分离肿瘤源性EV的方法，但是EV作为肿瘤生物标志物的临床效用仍然非常有限，因为大多数提出的方法实际分析之前需要耗时的EV分离步骤。在临床环境中有用的测定通常具有共同的几个特征。大多数是快速、高度灵敏和特异性、需要最少的处理以及通常易于自动化。
为了解决上述问题并符合临床有用性，在某些实施方式中，开发了并且在本文中描述了快速的基于纳米颗粒的EV测定法，其中，存在于含有EV的较小体积的生物样品中的EV被传感器芯片表面上的EV特异性抗体捕获，并且然后与两种抗体-缀合的纳米颗粒探针杂交。两种纳米颗粒探针对EV的双重结合产生了局部等离激元以增加散射强度并使其波长偏移，引起EV检测的灵敏性和特异性的显著增加。在一些实施方式中，含有EV的样品可以是含有EV的未处理的血浆样品。在其他实施方式中，含有EV的样品可以是含有EV的尿液样品。在某些实施方式中，传感器芯片的表面是玻璃。在其他实施方式中，传感器芯片的表面包括二氧化硅。仍然在其他实施方式中，传感器芯片的表面包括功能性多糖，诸如壳聚糖、纤维素或其他合适的功能性多糖。在某些实施方式中，EV特异性抗体用于检测EV特异性标志物。EV特异性标志物选自由以下组成的组：CD63、CD81、CD9、肿瘤易感基因101(TSG101)、热休克70kDa蛋白4(HSP70)、Rab-5b、程序性细胞死亡6-互动蛋白(AIP1/Alix)、水通道蛋白2(AQP2)和血管内皮生长因子受体1(FLT1)。在某些实施方式中，EV特异性标志物包括EV表面上的其他膜分子，诸如除其他以外的附接至EV的膜蛋白质CD24、CD26和CD10，和含有岩藻糖残基的N-聚糖，以及附接至EV的磷脂，诸如磷酸胆碱、磷脂酰丝氨酸、鞘磷脂等。
对来自正常和肿瘤源性胰腺细胞系的EV的比较和定量蛋白质组学分析，识别了在胰腺癌(PC)细胞的EV上选择性富集的候选生物标志物，包括肝配蛋白A型受体2(EphA2)，其在几种肿瘤上富集并且在癌症进展、转移和预后中起关键作用。本领域普通技术人员已知的其他方法可以用于针对其他类型的肿瘤识别其他潜在的EV癌症蛋白生物标志物。据报道，EphA2过表达增加了胰腺癌细胞系的体外侵入性和失巢凋亡抗性，而体外EphA2敲除具有相反的效果，并且EphA2 siRNA治疗降低了小鼠PC肿瘤生长和转移同时增加与肿瘤相关的细胞凋亡。在纳米等离激元增强散射(nPES)方法中将EphA2特异性纳米颗粒另外地替换为两种EV特异性纳米颗粒之一，产生了基于血液的EphA2-EV nPES测定，该测定在与正常健康对照(NC)受试者、胰腺炎患者和患有I-III期癌症的PC患者组群一起进行的试验研究中对PC患者表现出强大的诊断灵敏性和特异性。其他识别的EV癌症蛋白质生物标志物可以用于形成EV癌症生物标志物特异性纳米颗粒，以代替一种EV特异性纳米颗粒，用于诊断与EV癌症生物标志物相关的肿瘤。治疗前后EphA2-EV血液水平的变化还与治疗响应相对应，表明EphA2-EV血液水平可以用于非侵入性地监测治疗响应。nPES平台可以用作快速、低成本、高通量、灵敏且特异的方法，用于检测和定量来自各种样品类型的微量样品体积中的EV。对于诊断测定开发，该方法可以容易地定制以检测特定疾病源性EV群，如我们在PC患者中进行的概念验证研究所示。
实施例
实施例1-用于EV检测的无纯化nPES平台的原理和设计
金纳米颗粒(GNP)根据其尺寸和形状在特征波长处散射光。例如，50nm金纳米球(AuS)散射绿光，以及25×60nm金纳米棒(AuR)散射红光；然而，当AuS与AuR颗粒之间的距离<200nm时，它们的散射被耦合，形成等离激元，其将散射光的光谱转变为黄色，同时散射强度也显著增加(图1a-f)。我们应用了该原理以设计一种简单、无纯化的纳米等离激元增强散射(nPES)测定平台，以直接检测不同标本类型(包括培养基和血浆)的微量样品中的EV。对于原理验证演示，我们使用了在大多数EV膜上富集的抗CD81、CD63和CD9的抗体，以捕获和检测样品中存在的所有EV。我们首先将抗CD81抗体与传感器芯片的116二氧化硅表面缀合，以便当该芯片的孔加载有来自任何细胞类型的含有EV的样品时，捕获并富集表达该共同EV标志物的所有EV。通过向这些样品孔中添加抗CD63-AuS和抗CD9-AuR GNP检测了结合的EV，使得这两种GNP物质与芯片表面上固定的EV的双重结合形成了AuS-EV-AuR复合物(图1a)。AuS和AuR信号通过暗场显微镜(DFM)可以很容易地检测到(图1b和图1c)，但是在添加两种GNP后形成的AuS-EV-AuR复合物产生了纳米等离激元，纳米等离激元显著地偏移了散射光的光谱(图1d和图le)并且增加了信号强度(图1f)，尽管由于CD63/CD9表达的显著变化，这种光谱偏移并不总是明显的。进行了扫描电子显微镜(SEM)以分析该传感器芯片上的AuS-EV-AuR、AuS-EV和AuR-EV结合以及形态，检测到相对均匀的EV分布，具有易于检测的单和双GNP结合事件。
实施例2-评估用于EV检测的nPES平台
为了表征该nPES平台的EV检测性能，将显示出与纯EV制剂一致的囊泡形态和尺寸分布的EV样品添加到无EV血浆中以产生已知浓度的EV血浆标准品，使用nPES面积比(nPES信号的面积比孔面积)来评估样品EV浓度。使用显示出非常低nPES面积比(<0.02％)的无EV血浆进行了阴性对照分析，并且当150ng/μL的EV血浆标准品在没有抗CD81捕获抗体修饰的传感器芯片上分析时，发现了类似的结果(图2a和图2b)。仅用AuS-抗CD63探针进行的实验显示出0.04％的nPES面积比(图2a和图2b)。然而，当将抗CD81缀合的传感器芯片与该浓度标准品和两种抗体缀合的GNP一起孵育时，观察到了显著不同的结果。用AuS-抗CD63和AuR-抗CD9进行的测定显示出了>0.35％的面积比，这是因为nPES信号增强(图2a和图2b)。在阴性对照样品和AuS-EV测定中重复出现的低非特异性信号，其仅显示AuS-EV-AuR测定的信号的～10％，强烈表明nPES面积比应该准确地反映AuS-EV-AuR复合物丰度，并从而反映血浆EV浓度。
为了证实这一假设，我们分析了来自该nPES测定的EV值与通过常规ELISA测定的那些值的灵敏性和线性。我们发现nPES信号随EV浓度增加(图2c)，并且在计算的EV浓度和已知的EV浓度之间存在具有强相关性(r2＝0.99)的宽线性范围(～10-1-104ng/μL)。该nPES测定揭示了0.07ng/μL空白限和0.23ng/μL检测限，而ELISA(用于EV的标准定量方法)未能检测到低于10ng/μL的EV浓度(图2d)。
值得注意的是，在所有浓度下由AuS-EV-AuR标记物产生的面积比显著大于由单一GNP标记物(AuS-EV)产生的面积比(p<0.05)，并且这种差异随着EV浓度逐渐增加(对于AuSEV的斜率为0.010，以及对于AuS-EV-AuR的斜率为0.069)，揭示了双GNP识别的信号放大等离激元耦合效应(图2d)。由于其极高的灵敏性nPES平台需要非常少的血浆，并且低于该测定的线性范围(估计50μg/μL)的未处理血浆样品可以稀释>40倍并且仍然产生该范围内的信号。我们发现了1μL血浆对于这些稀释是足够的，进行以及更大的输入体积，并且使用5μL稀释的血浆得到了足够的材料用于>5个重复孔，其在具有低和高nPES信号的样品中显示出了良好的测定内和测定间再现性。对于单个重复孔，可比较的ELISA需要预纯化程序和最少50μL未稀释的血浆。这些ELISA成本还是高于nPES测定($1.65/孔比$1.20/孔)，这是由于ELISA需要先前的EV纯化和使用更大的孔、更大的样品量以及对额外的酶联检测抗体和试剂的需要(表1)。基于这些结果，这些nPES测定提供了超过通常用于测量EV浓度的ELISA方法的多个优点(表1)。
表1.nPES和ELISA方法的比较。
实施例3-对与胰腺癌相关的EV表面标志物的识别
胰腺癌是一种致命疾病，特征是侵袭性局部侵入、早期转移和高度的治疗抗性。尽管其预后不佳，但目前还没有有效的非侵入性生物标志物用于PC诊断。血液碳水化合物抗原19-9(CA19-9)水平是唯一临床上接受的PC标志物，但它的用途有限，因为它仅被批准用于监测PC进展或对治疗的响应。大多数PC患者被诊断出患有晚期疾病，这通常排除了完全切除以大大降低有利治疗结果的可能性。因此，非常需要能够有效用于早期PC诊断并且区分PC和慢性胰腺炎的非侵入性生物标志物，以降低癌症发病率和死亡率。PC源性EV代表这种生物标志物的可能来源，因为PC细胞差异地表达多种因子，其中一些应该存在于由PC肿瘤分泌的稳定循环的EV中，因此增强它们在PC早期阶段的循环中的检测。然而，这种肿瘤源性EV可能对来源于多种组织的复杂EV群的贡献相对较小，并且因此难以用常规方法检测，这需要EV纯化和随后的分析以确定该群中候选诊断标志物的相对丰度。理论上，nPES测定可以快速适用于灵敏地定量直接来自于患者血液样品的肿瘤源性EV，通过将两种EV特异性GNP中的一种替换为特异于在肿瘤细胞分泌的EV上选择性富集的膜蛋白的一种。然而，常规的和nPES方法都受到相同的限制，即，缺乏已知的肿瘤特异性EV标志物。
因此，我们尝试了识别EV膜标志物以测试改进的nPES测定检测和定量肿瘤源性EV的能力。我们选择了PC作为模型系统，并且使用基于LC-MS/MS的蛋白质组学和生物信息学方法来识别源自人胰腺癌(PANC-1和MIA PaCa-2)和胰腺导管腺癌(BxPC-3)细胞系的EV上的跨膜蛋白质。该方法识别了128种膜蛋白质，其中仅有26种在3种PC细胞系中的至少2种的EV上表达了。在这26种膜蛋白质中，只有EphA2在Oncomine数据库(www.oncomine.org)人PC组织样品中表现出比慢性胰腺炎或正常胰腺组织样品显著更高的表达。由于报道的其与癌症进展、转移和预后密切相关，EphA2也特别令人感兴趣。相应地，我们发现了EphA2由来自PC细胞系的EV显著表达，而不是由未转移的人胰腺细胞系的EV表达(HPNE；图3a)。基于这些结果，我们选择EphA2作为候选标志物用于检测PC源性EV(EphA2-EV)。
选择了CD81和CD9作为EV捕获和识别靶标用于我们的测定，这是因为尽管CD63、CD9和CD81都是熟知的EV标志物蛋白质并且CD63通常用于许多ELISA中的EV捕获，但只有CD81和CD9是在本研究中分析的所有胰腺细胞系的EV上表达的。因此，我们建立了一个改进的nPES检测系统，该系统包括一种捕获抗体(抗CD81)和两种抗体缀合的GNP探针(抗EphA2-AuS和抗CD9-AuR)，其中，PC源性EV通过识别CD9/EphA2双阳性EV来量化。为了评估CD81-EphA2-CD9系统对PC源性EV的特异性，在进行性组织培养时间点分析了来自正常(HPNE)或PC肿瘤(PANC-1)组织的细胞系的上清液。在所有时间点EphA2-EV信号在HPNE细胞培养上清液中比在PANC-1细胞培养上清液中显著更低，并且在培养期间没有显著增加，不同于来自HPNE和PANC-1细胞的PANC-1EphA2-EV信号和总EV信号在培养期间呈线性增加(图3b和图3c)。还测试了来自正常健康对照(NC)和胰腺炎以及PC患者的血浆样品以测定EphA2-EV(CD81-EphA2-CD9)和一般EV(CD81-CD63-CD9)检测和定量系统的PC特异性。EphA2-EV信号在PC患者血浆样品中显著高于胰腺炎患者或NC受试者(p<0.001)，其具有相似的EphA2-EV信号(图3d)，而这些组中的一般EV信号没有显著差异，EV-CD9 ELISA值也没有显著差异。当我们采用定制的EphA2 EV ELISA时，尽管该测定需要EV预分离并且检测到更小的差异，在这些样品之间也观察到了EphA2 EV增加(图3d)。基于NanoSight、ELISA和nPES测定数据的计算确定了EphA2-EV分别占NC和胰腺炎样品中总血浆EV的约0.15％和0.26％，以及PC患者样品中血浆EV的5.93％。为了解决nPES CD81-EphA2-CD9系统在PC肿瘤发展过程中检测EphA2-EV的能力，用PANC-1PC细胞注射允许肿瘤生长的无胸腺裸鼠，并在注射后每10天分析了EphA2-EV血液水平。EphA2-EV血浆水平在对照小鼠中保持稳定(对于任何时间点的差异P>0.5)，但在注射有PC肿瘤细胞的小鼠中随时间而增加，注射后20天与基线和对照小鼠显著不同(图3f)，并且与肿瘤尺寸高度相关(R2>0.60)。
实施例4-对EphA2-EV用于早期PC检测和监测治疗响应进行评估
为了研究nPES EphA2-EV是否检测早期PC病例，我们分析了来自更大组群的血浆样品中的EphA2-EV信号，该组群包括患有早期疾病的PC患者(PC I期和II期)，他们仍然可能从治愈性手术切除中获益。这些组中没有一个因年龄或性别而显著不同，而非诊断性PC生物标志物CA19-9的血浆水平在PC与NC和胰腺患者之间存在差异，但是当这些患者分离为早期(I+II期)和晚期(III期)肿瘤阶段时没有差异。与之前的结果相似，PC中血浆EphA2-EV水平显著254高于胰腺炎和NC病例。此外，早期PC患者(I期和II期)的EphA2-EV水平也显著高于胰腺炎(p<0.001)和NC病例(图4a，p<0.001)的EphA2-EV水平。这些结果表明循环的EphA2-EV与PC(包括早期PC)之间强烈相关，这表明EphA2-EV作为早期PC检测标志物的潜在用途。对血浆CA19-9水平也进行了类似的比较，临床上已批准其作为监测患者疾病进展和治疗响应的手段，但不用于PC诊断或分期。相比于胰腺炎和NC血浆样品，PC中的CA19-9水平显著增加，但不是早期PC样品，尽管所有这些组之间存在广泛的重叠，这将降低该测定用于PC诊断的区分能力。受试者工作特征(ROC)曲线表明，血浆EphA2-EV水平是区分PC病例(包括早期PC病例)与胰腺炎和NC病例的优秀分类器(classifier)(图4b-i；AUC 0.93-0.96)，性能显著优于CA19-9(p<0.001)。相比于NC(94％)或胰腺炎(89％)病例，血浆EphA2-EV对PC的灵敏性显著优于CA19-9(分别为81％和61％)。值得注意的是，相比于NC(91％)或胰腺炎(86％)，EphA2-EV对早期(I-II期)PC的区分灵敏性仅略有下降，进一步证明了EphA2-EV作为有希望的PC早期检测标志物的潜力。
PC病例通常以高治疗抗性比率为特征，并且迫切需要改善的监测治疗响应的手段以允许快速改进个性化治疗方案以改善患者预后。因此，我们研究了血浆EphA2-EV水平是否反映了PC肿瘤对新辅助治疗的响应。在新辅助化疗和/或放化疗之前和之后收集了来自23名PC患者的血浆样品，并根据患者对新辅助治疗的响应进行了分类。治疗后的EphA2-EV水平在具有良好/偏好治疗响应(治疗后活肿瘤细胞<50％)的患者中显著下降，但在具有不良响应(治疗后活肿瘤细胞>50％)的患者中则不然(图4j-l)，而在这些样品中CA19-9水平没有因治疗响应而显著不同。因此，EphA2-EV水平的变化与治疗响应强烈相关，并且性能优于CA19-9水平，CA19-9水平有时用于PC治疗响应的临床评估。因此，EphA2-EV水平可以是监测PC患者对治疗的响应的有用的独立指标。
讨论
常规蛋白质生物标志物通常经受非特异性因子(诸如血液水解酶)的可变调节，这可能显著影响它们在循环中的水平。生物标志物检测还可能受到来自血液中丰富的蛋白质和肽的非特异性竞争的损害，特别是在生物标志物水平较低的疾病的早期阶段。基于EV的测定可能受这些混杂影响的影响较小，因为膜结合或膜封闭的EV生物标志物可能至少部分地免受水解的影响，并且与不受囊泡膜物理性约束的靶蛋白相比，更容易与丰富的非特异性蛋白质分离。当低生物标志物水平可能更易于退化(degradation)或掩蔽相互作用时，这些优点对于检测早期疾病状态可能特别重要。
EV越来越多地被认为是新的诊断性生物标志物的潜在有价值的来源，但是目前的EV分析技术需要复杂且冗长的分离程序，并且它们的体积要求限制了它们在人类疾病常见小鼠模型中的用途并且排除了纵向研究。灵敏的检测和定量与特定疾病状态相关的EV不需要单独的预纯化步骤，这对于研究和临床应用而言都非常需要。例如，最近的报道描述了一种表面等离激元共振传感器方法，该方法可以基于分离自患者血液样品中的外泌体microRNA来区分健康和胰腺癌患者；然而，该方法在样品分析之前需要EV和RNA两者分离，并且因此不适合高通量的临床分析。
我们的nPES平台集成了EV捕获和检测，利用等离激元耦合效应来实现检测灵敏性和特异性的双重提升，从而在小样品体积中允许快速、超灵敏的生物标志物定量。值得注意的是，我们使用1μL血浆样品实现了稳健的测定重现性。这种使用小样品体积的能力在临床或研究环境中可能特别有价值，在临床或研究环境中样品受到体积限制并且通常需要多次分析。例如，该测定所需的微量样品体积允许进行多样品小鼠时程研究，由于常规EV分析方法需要较大体积，这在以前是不可行的。这应该极大地有利于使用小鼠模型来监测与肿瘤或疾病进展以及对应的治疗响应相关的EV变化的研究。
我们描述的EV nPES平台应该可以推广到与特异性EV标志物相关的任何疾病状态。我们选择了PC作为本研究中的原理验证模型，使用蛋白质组学和生物信息学来识别候选PC特异性EV膜生物标志物，以用作定制nPES测定中的疾病特异性探针。我们发现了EphA2在PC细胞的EV上高度富集，但在正常胰腺细胞的EV上基本不存在，并且因此选择EphA2作为PC选择性EV生物标志物用于我们的测定。然而，EphA2过度表达不限于PC肿瘤，因为它在结直肠癌和非小细胞肺癌的早期阶段也存在过表达，这表明其作为靶标用于早期癌症检测的潜力，并且在肿瘤进展期间积聚，与下游肿瘤相关信号传导通路相互作用，以促进恶性细胞生长和侵袭。本研究的结果说明EphA2-EV对PC的早期诊断能力，并且未来的研究应该解决其检测其他形式癌症的潜力。如有必要，可以通过用细胞特异性AuR探针替换EV特异性抗CD9-AuR探针来解决EphA2-EV或其他疾病相关的EV的细胞来源。类似地，可以通过替换抗CD9-AuR探针或通过使用另外一组探针的平行测定来评估与特定突变或表型相关的EV标志物。
对PC患者进行了研究，因为该疾病的特征是侵袭性局部侵入、早期转移和高治疗抗性比率，并且目前没有批准的FDA非侵入性测定用于PC诊断，以及仅有一种相对非特异性生物标志物CA19-9，用于评估患者对治疗的响应。由于其非特异性症状、侵袭性和缺乏有效的用于早期检测的策略，80％-85％的PC患者被诊断为晚期疾病，排除了手术切除——唯一可行的治疗方法。因此，我们评估了我们的nPES EphA2-EV测定区分患有早期疾病(I/II期)的PC患者的能力，这些来自NC和胰腺炎病例的患者仍然可能从治愈性手术切除中获益。治疗前的EphA2-EV血液水平准确地区分了来自NC(AUC＝0.96)和胰腺炎患者(AUC＝0.93)的I/II期PC患者，其表现优于使用循环CA19-9水平的类似比较，后者有时用作PC诊断中初始的未经FDA批准的筛查方法。因此，我们建议nPES EphA2-EV血液测定可能具有作为PC筛查检验的重要价值，因为对早期PC诊断的快速、准确、非侵入且廉价的血液检验可以提高早期检测率以改善患者预后，尽管我们承认这将需要更多的影像学研究和/或活组织检查以排除假阳性结果。
较低的新辅助治疗响应率是PC患者预后不良的主要因素。循环的CA19-9水平有时用于监测治疗响应，但需要更灵敏且特异性的非侵入性标志物来引导更有效的个性化治疗方案的设计。我们的研究结果建议将nPES EphA2-EV血液测定用于监测PC患者的治疗响应，因为EphA2-EV血液水平在表现为良好/偏好治疗响应的患者中显著降低，而非不良治疗响应的患者。
本文所述的nPES方法为快速、无纯化和超灵敏测量小样品体积中循环的EV提供了有吸引力的手段。我们的概念验证研究的结果证明了有希望的转化意义，并为未来的研究提供了重要途径。非侵入性nPES EphA2-EV分析可以改善早期PC检测和治疗监测，但需要更多的前瞻性研究来验证这些结果。nPES平台还应该易于定制，以通过用疾病的细胞类型特异性EV标志物替换一种或两种探针来诊断和监测其他癌症和感染。此外，虽然该测定的图像捕获和分析方面已经自动化，并且可以直接转化为临床环境，但是为了增加测定能力和自动化而进行的微小改变应该允许高通量检测以改善临床转化。
材料和方法
实验设计.本项转化研究旨在建立和表征快速、无纯化的三探针EV定量测定，该测定可以通过添加胰腺癌特异性EV探针进行修改，以允许根据较小量的血液样品对早期和晚期胰腺癌进行高灵敏性和高特异性诊断。癌症源性EV作为潜在的诊断标志物是非常感兴趣的，但是已经识别的癌症特异性EV标志物很少，并且大多数当前的EV测定是劳动密集型的和低通量的，这使得它们对于临床使用是不实际的。因此，我们尝试了开发三探针EV捕获和检测系统，其中，识别EV膜蛋白质的捕获抗体(抗CD81)被用于富集传感器孔内的EV，而抗体缀合的金纳米棒和纳米球被用作EV探针来识别另外两种EV膜蛋白质。设计该方法使得EV上的不同金纳米颗粒物质的结合将形成等离激元以在暗场照射下偏移波长并增加散射光的强度，以提高EV检测的灵敏性和特异性。接下来我们使用了比较蛋白质组学来识别具有已知癌症相关性的膜蛋白质，该膜蛋白质选择性地富集在人胰腺癌或导管腺癌细胞系的EV上作为PC特异性EV探针的候选者。为了证明这种方法的可行性，在我们的三探针测定中包括了抗该标志物的探针，然后检验其在以下中对PC EV的灵敏性和特异性：细胞培养物上清液；10例PC、10例胰腺炎和10例对照患者的小组群的治疗前血液样品；或注射有人PC细胞系的小鼠的纵向血液样品。接下来，我们在59例PC、48例胰腺炎和48例对照患者的更大、独立组群中检查了测定的性能，该测定区分早期PC疾病阶段与胰腺炎和对照患者的能力，以及该测定相对于另一种常见PC标志物CA 19-9的表现，CA 19-9未经FDA批准用于PC诊断或癌症分期。最后，我们使用收集自23名PC患者新辅助治疗前后的血液样品分析了测定值是否反映了PC肿瘤对新辅助治疗的响应，并且根据患者对治疗的响应进行分类，将结果与CA19-9表达进行比较以评估测定非劣效性。
细胞培养.人PC细胞系PANC-1、MIA PaCa-2、BxPC-3和人胰腺细胞系HPNE获得自American Type Culture Collection(美国模式培养物集存库)(Manassas，VA)。PANC-1和BxPC-3细胞在RPMI-1640培养基(Hyclone，GE Healthcare Life Sciences)中培养，MIAPaCa-2细胞在DMEM/高葡萄糖培养基(Hyclone，GE Healthcare Life Sciences)中培养以及HPNE细胞在含有10％FBS的最低基本培养基(MEM，Hyclone，GE Healthcare LifeSciences)中培养。所有培养物补充有10％胎牛血清(FBS，Life technology，ThermoScientific Inc.)、青霉素(1U)和链霉素(1μg/mL)，并在37℃在潮湿的5％CO2培养箱中孵育。所有细胞系在相同条件下一式三份培养，并且然后收获以收集独立的EV样品。
临床样品.来自较小试验组群(n＝10/组)和较大验证组群(n＝48-49/组)的PC、胰腺炎和NC受试者血浆样品，由休斯顿卫理公会医院(Houston Methodist Hospital)病理学和基因组医学部门在经机构审查委员会(Institutional Review Board)批准(IRB0213-0011)后在诊断时进行采集。基于来自试验组群的数据，卡方幂分析(PASS V08.0.3，Kaysville，UT)表明每组至少需要47个临床标本来检测30％的效果大小，α为0.05和幂90％。用于治疗评估的PC样品、人口统计学信息、治疗史以及对治疗的响应获得自在MDAnderson癌症中心接受治疗的23名PC患者。在新辅助化疗和/或放化疗之前和之后1-2个月从这些PC患者收集了血浆样品。所有患者都给出了参与研究的书面知情同意书(IRB PA11-0670和IRB PA14-0646)。治疗响应由MD Anderson的病理学家作为常规诊断评估的一部分进行了评估，使用基于Evans等人提出的标准评分系统来评估残留肿瘤的程度。研究人员在样品分析期间对临床样品的群体特征不知情。
制备EV浓度标准品.将血浆样品以110,000g离心过夜，收集上清液作为无EV血浆，并通过Western印迹分析进行了分析，发现EV标志物蛋白质CD63和Tsg101在无EV血浆上清液中显著耗尽，但在匹配的血浆沉淀中高度富集。将分离自合并的人血清(SystemBiosciences Inc.)的已知质量的标准EV样品溶解于无EV血浆中至终浓度1μg/μL，并在使用时通过用无EV血浆进行2倍稀释而进一步稀释至所需浓度(30000、15000、7500、3750、1870、938、469、234pg/μL)。
从培养基分离EV.细胞在具有10％FBS的培养基中生长至少48h，用PBS(pH 7.0)洗涤三次，并且然后在无血清培养基中培养48h。然后收集培养物上清液并以400g离心15min以沉淀细胞，以8,000g离心40min以除去细胞碎片，用10kDa离心过滤装置(MerckMillipore Ltd.)浓缩，并且然后以110,000g离心90min分钟。仔细收集沉淀物，重悬于PBS(pH 7.0)中，并且然后以110,000g离心90min。收集得到的EV沉淀物，溶于200μL PBS(pH7.0)中，并在4℃储存。
用于ELISA的血浆EV分离.使用ExoQuick试剂盒(SBI Inc.)分离血浆中的总EV。简言之，将10μL的ExoQuick试剂加入至50μL血浆中。轻轻摇动后，将混合物在冰浴中孵育1h，然后以20,000g离心30min，并将得到的EV沉淀物溶于100μL的PBS(pH 7.0)中同时进行超声破碎。
ELISA测定.首先将96孔板与抗人CD81抗体(PBS中0.2μg/mL；R&D Systems，克隆#454720)一起在4℃孵育12h。在用PBS仔细洗涤后，将板在25℃与分离自细胞培养基或血浆的EV(100μL/孔)一起孵育4h，吸出并在室温下与pH 7.0PBS中的5％BSA(100pL/孔)孵育4h，用PBS中的0.01％Tween-20(PBST，pH 7.0)洗涤三次，并在37℃与100μL/孔的抗人CD9或EphA2抗体(5％BSA/PBS中0.2μg/mL；R&D Systems，克隆#209306和#371805)孵育1h。然后用PBST将孔洗涤5次，在37℃用5％BSA/PBST中的1:5,000稀释的HRP-缀合的第二抗体(CellSignaling Technology)(100μL/孔)孵育0.5h，用PBST洗涤5次，在37℃用100μL/孔的TMB试剂(eBioscience Inc.)孵育10-15min，并且然后补充有50μL/孔的终止溶液(2M H2SO4)并分析450nm处的吸光度。使用Origin 8.0软件(OriginLab)相对于log10 EV标准浓度(单位为pg/μL)绘制了吸光度，计算了标准曲线。
LC-MS/MS蛋白质组学分析.将EV样品与M-PER哺乳动物蛋白质提取试剂(ThermoScientific Co.)一起在冰浴中孵育30min以纯化EV溶液，并用二辛可宁酸(BCA)(微BCA试剂盒，Thermo Scientific)测定测量了提取的蛋白质浓度。用100mM NH4HCO3将蛋白质提取物稀释至1μg/μL，补充有10mM二硫苏糖醇，在37℃孵育1h，补充有30mM碘乙酰胺，在室温于黑暗中孵育30min，然后补充有1μg胰蛋白酶并孵育，并在37℃孵育过夜。加入0.1％三氟乙酸抑制蛋白质水解，并且用H2O/乙腈(95:5)将肽溶液481稀释至0.25μg/μL，以21,000g离心20min，并且将上清液直接进行LC-MS/MS分析。
使用配备有CI 8Pepmap 100富集柱(Thermo Scientific；5μm粒径，
孔径，300μm i.d.x 5mm)和C18 Pepmap 100分析柱(Thermo Scientific；3μm粒径，
孔径，75μm i.d.×150mm)的最终3000纳米-LC(Thermo Scientific Co.)，分别使用20μL/min和300nL/min的流速用于加载和分析柱将肽分离。通过Velos Pro双压线性离子阱质谱仪(Thermo Scientific)分析洗脱的肽级分。一次MS扫描后进行了8次MS/MS扫描。所有MS/MS光谱用于Mascot 2.3.0(www.matrixscience.com)检索，使用0.5Da的测量公差。
金纳米颗粒(GNP)的抗体修饰.使用不同抗体对金纳米球(AuS)和纳米棒(AuR)进行的修饰遵循类似的程序。简而言之，将40μL的羧基官能化的金纳米颗粒(GNP；9×10-10M，Ocean NanoTech)与20μL MES缓冲液(pH 4.7，Ocean NanoTech)混合，然后与20μL的EDC/磺基-NHS溶液(Sigma-Aldrich；MES缓冲液中的2mg/mL 1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)和1mg/mL N-羟基磺基琥珀酰亚胺(磺基-NHS))混合，在室温孵育10min，并且依次补充有80μL偶联缓冲液(Ocean NanoTech)和20μL抗体溶液(0.5mg/mL；R&DSystems，克隆#371805(抗EphA2)、#209306(抗CD9)和#460305(抗CD63)然后在室温下振荡2h以完成偶联过程。然后用2μL的猝灭缓冲液(Ocean NanoTech)终止该反应，并以6,000rpm离心10min。用400μL洗涤缓冲液(Ocean NanoTech)洗涤沉淀的GNP三次，并且然后重悬于40μL洗涤缓冲液中，并在4℃储存。
构建用于EV定量的nPES平台.将氨基官能化载玻片(NH2-玻璃，Nanocs Inc.)在甲醇中超声清洗5min，用去离子水彻底冲洗，在N2流下干燥，并且然后用50孔聚二甲基硅氧烷膜(CW-50R-1.0-CultureWell Gasket，Grace Bio-Labs Inc.)覆盖NH2官能化玻璃。载玻片填充有10μL/孔的5mM EDC/PBS中的12.5μg/mL抗人CD81抗体(R&D系统，克隆#454720)，并在室温下于潮湿室中孵育2h，吸出并填充有10μL/孔的5％BSA/PBS(pH7.0)并在室温下孵育4h，然后PBS(pH 7.0)洗涤并抽吸三次，然后将这些孔加载有分析样品。样品孔填充有5μL/孔的血浆样品(用pH 7.0PBS稀释40倍)或细胞培养物EV样品，在室温下于潮湿室中孵育4h，用PBST洗涤三次，用PBS洗涤三次，并且然后填充有7uL/孔的AuS和AuR PBST探针溶液(每个颗粒4×10-11M)并在室温下孵育1h，之后除去PDMS覆盖物，载玻片用PBST洗涤三次并且用PBS洗涤三次，然后装上盖玻片并用暗场显微镜(DFM)成像。
DFM成像和散射光谱测量.在配备有100物镜(NA，0.8)和暗场聚光器(0.8<NA<0.95)的倒置显微镜(Olympus 1X71，Olympus Co.)上获得了DFM图像。来自100W卤素灯的散射光由Olympus DP70数码相机记录以产生暗场彩色图像，并通过配备有单色仪(CASCADE512B，Roper Scientific.)的光谱仪CCD记录以获得孔中所选择的AuS、AuR和AuS-AuR颗粒的散射光谱(在10s内集成)。
NIH IMAGE J图像分析软件用于分析DFM图像。使用255的像素强度阈值定量了DFMAuS-EV-AuS信号以排除在较低阈值处检测到的AuS-EV信号，因为发现这个截止值在孵育有AuS和AuR探针两者的20个EV孔中，检测到<0.4％的AuS-EV斑点和0％的AuR-EV斑点，其中假阳性AuS-EV信号占≤0.2％的总AuS-EV-AuR信号。
使用NIH Image J软件处理了DFM图像，其中颜色阈值设置为色调0、饱和度0和亮度255。亮度等于255的图像区域是软件选择的，并且这些区域的面积与整个图像的面积的比率是通过软件计算的，以给出表示特异性nPES EV信号的面积比。使用nPES面积比与log10 EV浓度的线性回归来产生标准浓度曲线用于推导实验EV浓度。
小鼠PC模型.根据机构动物护理和使用委员会(IACUC)指南将购自Charles RiverLaboratories(Wilmington，MA)的六至八周龄雄性裸鼠(Crl：NU-Foxnlnu)饲养于HoustonMethodist Research Institute(HMRI)动物设施中。所有动物程序均遵循HMRI政策和IACUC批准的方案。三只小鼠在左侧腹部皮下注射悬浮于100μL的PBS中的2×106个PANC-1细胞以建立皮下胰腺肿瘤63并与未接受肿瘤细胞注射的三只健康对照小鼠进行比较。在注射后0、10、20、30和40天收集了用于分析EphA2-EV血浆水平和肿瘤尺寸数据的小鼠眼眶后血液样品。使用卡尺测定了肿瘤长度和宽度，并使用修改的椭圆体积公式(1/2长度×宽度2)估计了肿瘤体积。在nPES分析期间，研究人员对动物样品的群体特征不知情。
Western印迹.使用标准方法用10μg EV蛋白质裂解物和预制的Mini-PROTEAN TGX凝胶以及聚偏二氟乙烯膜(Bio-Rad)进行了Western印迹分析。
方法重复性的测量.使用两个随机选择的样品对测定再现性进行了评估，该样品在具有20个重复的三次测定中进行了分析，其在三个单独的日子中进行以产生每个样品60个值。将得到的值用于计算测定内和测定间平均值以及变异系数(％CV)。
SEM图像分析.使用纯化自50μL的人血浆的EV和ExoQuick试剂盒以减少SEM伪影，生成了结合至EV的GNP的SEM图像。如上所述，将纯化的EV固定在传感器芯片上并与抗CD63-AuS和抗CD9-AuR杂交。然后将传感器芯片用PBS(pH 7.0)洗涤，在温和的N2流下干燥，然后用直流溅射涂覆方法处理以施涂3nm的铱层并用NOVA NanoSEM 230显微镜(FEI)在5kV加速电压于高真空(3×10-6Torr)中使用5mm的工作距离成像。分析了三个随机选择的80-120μm2的SEM场，以计算每次测定的每μm2的总的EV数量和GNP结合的EV数量。
患者血浆样品中的EV浓度.使用NanoSight LM10仪器和纳米颗粒跟踪分析软件(Malvern Instruments)测量了合并的患者血浆样品(10例PC、10例Pt和10例NC样品)中的总EV浓度。通过使用ExoQuick试剂盒的分离自合并的血浆样品的EV的BCA测定对总EV蛋白质/μL血浆的估计值进行了测定。将nPES测定标准曲线方程(nPES信号强度＝0.069×Log10[EphA2 EV浓度]-0.093)和来自每个患者组中的10个样品的平均EphA2nPES信号强度数据用于计算各组的血浆EphA2-EV蛋白质含量的估计值(EphA2 EV浓度＝10(nPES强度+0.093)/0.069)。将每个患者组中的总-EV的EphA2-EV百分比计算为EphA2-EV与总-EV蛋白质含量的比率。将每个测定孔的总-EV计算为稀释血浆样品的输入体积(5μL的40倍稀释的血浆)，以及将每孔的EphA2-EV作为EphA2-EV/总-EV的分数。
统计学分析.GraphPad Prism版本5.0(GraphPad软件)和MedCalc统计软件版本13.0(MedCalc Software bvba)用于所有的计算。MedCalc用于创建患者nPES EphA2-EV水平的热图。使用学生t检验，具有Bonferroni's的后检验的单向ANOVA或具有Dunn's后检验的Kruskal-Wallis单向ANOVA进行了统计学分析，如通过样品分布和方差确定的。具有的p值<0.05的差异被认为具有统计学意义。ROC曲线用于确定灵敏性和特异性，最佳切割点定义为根据以下标准最接近左上轴的点：min[(1-灵敏性)2+(1-特异性)2]。使用GraphPadPrism(GraphPad)和Origin软件(OriginLab)制备了图。所有数据点均来自三个或更多个生物重复或技术重复，如各实验所示的。
Claims (22)
1.一种检测在细胞外囊泡(EV)上富集的癌症特异性蛋白质的方法，包括：
使含有EV的样品与缀合有针对EV分子的第一抗体的表面接触，以将所述EV与所述含有EV的样品分离；
从所述表面上除去所述含有EV的样品；
将所述表面与缀合有针对所述癌症特异性蛋白质的第二抗体的第一组纳米颗粒一起孵育；以及
通过检测所述第二抗体与所述EV之间的结合来检测所述癌症特异性蛋白质是否存在于所述含有EV的样品中。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述接触步骤还包括将所述表面与针对EV分子的所述第一抗体缀合，其中，所述EV分子选自由以下组成的组：CD63、CD81、CD9、CD24、CD26、CD10、肿瘤易感基因101(TSG101)、热休克70kDa蛋白质4(HSP70)、Rab-5b、程序性细胞死亡6-互动蛋白(AIP1/Alix)、水通道蛋白2(AQP2)、血管内皮生长因子受体1(FLT1)、含有岩藻糖残基的N-聚糖、磷酸胆碱、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述孵育步骤还包括将所述表面与缀合有针对EV分子的第三抗体的第二组纳米颗粒一起孵育，其中：
所述EV分子选自由以下组成的组：CD63、CD81、CD9、CD24、CD26、CD10、TSG101、HSP70、Rab-5b、AIP1/Alix、AQP2、FLT1、含有岩藻糖残基的N-聚糖、磷酸胆碱、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂；以及
所述纳米颗粒包括多个纳米球、多个纳米棒或其组合。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述检测步骤还包括检测针对所述癌症特异性蛋白质的所述第二抗体与所述EV之间的结合；以及检测针对EV分子的所述第三抗体与所述EV之间的结合。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述检测步骤还包括：
形成EV复合物，所述EV复合物包括EV、经由所述第二抗体结合至所述EV的第一纳米颗粒以及经由第三抗体结合至所述EV的第二纳米颗粒，其中，所述第一纳米颗粒与所述第二纳米颗粒相互作用，以在所述第一纳米颗粒与所述第二纳米颗粒之间达到一定距离时产生纳米等离激元；以及
检测所述纳米等离激元。
6.根据权利要求3所述的方法，其中，所述纳米颗粒包括金。
7.根据权利要求3所述的方法，其中，所述第一抗体不同于所述第三抗体。
8.根据权利要求3所述的方法，其中，所述第一抗体与所述第三抗体相同。
9.根据权利要求1所述的方法，还包括识别在EV上富集的所述癌症特异性蛋白质。
10.一种检测胰腺癌特异性蛋白质，肝配蛋白A型受体2(EphA2)，的方法，包括：
使含有EV的样品与缀合有针对EV分子的第一抗体的表面接触，以将所述EV与所述含有EV的样品分离；
从所述表面上除去所述含有EV的样品；
将所述表面与缀合有针对EphA2的第二抗体的第一组纳米颗粒一起孵育，以获得胰腺癌源性EV；以及
通过检测所述第二抗体与所述胰腺癌源性EV之间的结合来检测EphA2是否存在于所述含有EV的样品中。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述接触步骤还包括将所述表面与针对EV分子的所述第一抗体缀合，其中，所述EV分子选自由以下组成的组：CD63、CD81、CD9、CD24、CD26、CD10、TSG101、HSP70、Rab-5b、AIP1/Alix、AQP2、FLT1、含有岩藻糖残基的N-聚糖、磷酸胆碱、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂。
12.根据权利要求10所述的方法，其中，所述孵育步骤还包括将所述表面与缀合有针对EV分子的第三抗体的第二组纳米颗粒一起孵育，其中：
所述EV分子选自由以下组成的组：CD63、CD81、CD9、CD24、CD26、CD10、TSG101、HSP70、Rab-5b、AIP1/Alix、AQP2、FLT1、含有岩藻糖残基的N-聚糖、磷酸胆碱、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂；以及
所述纳米颗粒包括多个纳米球、多个纳米棒或其组合。
13.根据权利要求10所述的方法，其中，所述检测步骤还包括检测针对EphA2的所述第二抗体与所述胰腺癌源性EV之间的结合；以及，检测针对EV分子的所述第三抗体与所述胰腺癌源性EV之间的结合。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述检测步骤还包括：
形成EV复合物，所述EV复合物包括EV、经由针对EphA2的所述第二抗体结合至所述EV的第一纳米颗粒以及经由第三抗体结合至所述EV的第二纳米颗粒，其中，所述第一纳米颗粒与所述第二纳米颗粒相互作用，以在所述第一纳米颗粒与所述第二纳米颗粒之间达到一定距离时产生纳米等离激元；以及
检测所述纳米等离激元。
15.根据权利要求12所述的方法，其中，所述纳米颗粒包括金。
16.根据权利要求12所述的方法，其中，所述第一抗体不同于所述第三抗体。
17.根据权利要求12所述的方法，其中，所述第一抗体与所述第三抗体相同。
18.一种诊断受试者的胰腺癌的方法，包括：
使含有EV的样品与缀合有针对EV分子的第一抗体的表面接触，以将所述EV与所述含有EV的样品分离；
从所述表面上除去所述含有EV的样品；
将所述表面与缀合有针对EphA2的第二抗体的第一组纳米颗粒一起孵育以获得胰腺癌源性EV；以及
通过检测针对EphA2的所述第二抗体与所述胰腺癌源性EV之间的结合来检测所述受试者中是否存在胰腺癌。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述孵育步骤还包括将所述表面与缀合有针对EV分子的第三抗体的第二组纳米颗粒一起孵育，其中：
所述EV分子选自由以下组成的组：CD63、CD81、CD9、CD24、CD26、CD10、TSG101、HSP70、Rab-5b、AIP1/Alix、AQP2、FLT1、含有岩藻糖残基的N-聚糖、磷酸胆碱、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂；以及
所述纳米颗粒包括多个纳米球、多个纳米棒或其组合。
20.根据权利要求18所述的方法，其中，所述检测步骤还包括检测针对EphA2的所述第二抗体与所述胰腺癌源性EV之间的结合；以及检测针对EV蛋白质的所述第三抗体与所述胰腺癌源性EV之间的结合。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述检测步骤还包括：
形成EV复合物，所述EV复合物包括EV、经由针对EphA2的所述第二抗体结合至所述EV的第一纳米颗粒以及经由第三抗体结合至所述EV的第二纳米颗粒，其中，所述第一纳米颗粒与所述第二纳米颗粒相互作用，以在所述第一纳米颗粒与所述第二纳米颗粒之间达到的一定距离时产生纳米等离激元；以及
检测所述纳米等离激元。
22.根据权利要求19所述的方法，其中，所述纳米颗粒包括金。
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| EP3577463A1 (en) | 2019-12-11 |
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