CN113884685B - 牛结核病血清学诊断标志物及其临床应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了牛结核病血清学诊断标志物及其临床应用。本发明通过转录组测序分析、小鼠动物实验和临床试验获得了能够鉴别牛结核病阴、阳性的血清标志物:KLK12、MMP‑1和MMP‑9。本发明提供的牛结核病血清学诊断标志物与结核菌素皮试的诊断结果可达到100%一致,并且能够鉴别诊断潜伏感染牛和活动性结核病牛,不受其他分枝杆菌感染的影响,具有较强的特异性和较高的灵敏度。本申请的诊断标志物为牛结核病的诊断提供了新的靶点,可用于制备牛结核病的血清学诊断试剂盒,无需采集抗凝血和特异性抗原刺激,简化操作要求,提高诊断效率,有助于结核病牛的批量、快速检测和淘汰,为牛结核病的防控和净化提供了技术支撑。
Description
技术领域
本发明属于兽医领域中的牛结核病防治领域,具体地,本申请提供了牛结核病血清学诊断标志物KLK12、MMP-1、MMP-9及其在制备牛结核病诊断试剂盒中的应用
背景技术
结核病由结核分枝杆菌复合群引起的慢性传染性疾病,结核分枝杆菌和牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis,简称M.bovis)为主要致病菌,由牛分枝杆菌引起的牛结核病是一种重要的人畜共患病,也是危害畜牧业发展的重大传染病,而且严重威胁公共卫生和食品安全。研究显示牛分枝杆菌除感染牛外,还能感染不同种属的温血动物,包括灵长类、有袋、有蹄、食肉类、啮齿类和鳍脚类动物在内的50多种哺乳动物,还包括鸟类、北美洲乌鸦、石鸽等20多种禽类动物。此外,牛型分枝杆菌与人型结核分枝杆菌在基因水平上达到了99.95%的相似,人类食用未经巴氏消毒的奶制品或者与患病动物直接接触都有被感染的风险,有10%以上的结核病人(不同的国家和地区有不同的比例)是由牛分枝杆菌感染引起的。因此,对牛结核病的防控直接关系着畜牧业发展和人类健康。
副结核病(Paratuberculosis)又称为副结核性肠炎,是由副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis,MAP)引起的反刍动物的慢性消化道疾病,该病以顽固性腹泻、渐进性消瘦、肠黏膜增厚并形成皱襞为特征。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须通报的动物疫病,我国将其列为B类疫病。副结核病在世界范围内广泛流行,近年来我国发病率也呈上升趋势,给养殖业和乳制品行业造成了严重的经济损失。除此之外,副结核分枝杆菌的感染还可干扰结核病的诊断,造成结核病假阳性,影响结核病防控、清除以及进出境动物检疫。
结核菌素皮试(也称为芒图试验、PPD试验)是最早被用来检测牛结核病的方法,也是目前世界上应用最广泛的、世界动物卫生组织(OIE)推荐的牛结核病标准检测方法。但是,结核菌素皮试以牛结核菌素(PPD-B)作为刺激原,在生产过程需要培养大量牛分枝杆菌,对生产条件要求严苛,并且牛结核菌素与禽结核菌素(PPD-A)、环境分枝杆菌和卡介苗(BCG)存在共同抗原,在临床应用中容易导致假阳性结果的出现,也无法鉴别诊断潜伏感染牛和活动性结核病牛。血清学检测方法具有方便、快捷、高通量等优势,然而目前建立的牛结核病血清学诊断方法都未能达到所需的灵敏度和特异性,所以尚未被国际组织推荐使用。因此,筛选牛结核病的血清学诊断标志物,建立高敏感性、高特异性的牛结核病血清学检测方法,有助于结核病牛的批量快速检测和淘汰,为牛结核病的防控和净化提供技术支撑。
发明内容
为解决上述问题,本发明首先利用牛基因表达谱芯片研究了不同感染状态牛的巨噬细胞转录组变化,通过筛选找到了结核感染状态不同造成的差异基因,包括KLK12、SPARC、COL1A1、COL1A2、MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、TIMP3等与细胞外基质重塑相关的蛋白网络,利用ELISA检测不同感染状态的牛血清筛选诊断标志物,从而提供一种牛结核病血清学诊断标志物,以筛选牛分枝杆菌感染牛,特别是鉴别诊断潜伏感染牛和活动性结核病牛。
一方面,本发明提供了牛结核病诊断相关标志物,其特征在于,所述牛结核病诊断相关标志物选自KLK12、MMP-1、MMP-9中的一种或多种。
另一方面,本发明提供了检测牛结核病诊断相关标志物的试剂在制备牛结核病诊断试剂盒中的应用,其特征在于,所述牛结核病诊断相关标志物选自KLK12、MMP-1、MMP-9中的一种或多种。
另一方面,本发明提供了检测牛结核病诊断相关标志物的试剂在制备牛结核病潜伏感染和开放性感染诊断试剂盒中的应用,其特征在于,所述牛结核病诊断相关标志物选自KLK12、MMP-9中的一种或两种。
进一步地,所述牛结核病诊断相关标志物为血清标志物。
进一步地,所述试剂盒为ELISA试剂盒。
进一步地,所述牛结核病诊断相关标志物为KLK12。
进一步地,所述诊断试剂盒应用时,血清中KLK12浓度<125ng/ml或者MMP-1浓度<6ng/ml时判定为结核病阳性;血清中KLK12浓度≥125ng/ml或者MMP-1浓度≥6ng/ml时判定为结核病阴性。
进一步地,所述诊断试剂盒应用时,结核病阳性牛血清中KLK12浓度≥41ng/ml,且血清中KLK12浓度<125ng/ml时判为活动性结核病牛,即结核病阳性开放性感染牛;血清中KLK12浓度<41ng/ml时判为非活动性结核病牛,即结核病阳性潜伏感染牛。
进一步地,所述诊断试剂盒应用时,结核病阳性牛血清中MMP-9浓度≥7ng/ml,且血清中MMP-9浓度<10ng/ml时判为活动性结核病牛,,即结核病阳性开放性感染牛;血清中MMP-9浓度<7ng/ml时判为非活动性结核病牛,即结核病阳性潜伏感染牛。
除上述ELISA试剂盒外,其他可以检测血清中蛋白水平的检测试剂如免疫印迹也可以使用。
由于样本量的不同可能会影响检测阈值的准确性,但发明人仔细筛查并统计后发现,结核病阳性牛血清中KLK12和MMP-1的平均浓度仅仅不到结核病阴性牛的25%,显著低于阴性牛。本发明在实施例中发现,副结核病阳性牛血清中KLK12、MMP-1以及MMP-9浓度与阴性对照组相比无显著差异,不会干扰结核病的诊断。同时,经过仔细筛查和统计后,发明人还发现结核病阴性牛血清中的KLK12浓度是活动性结核病牛和潜伏感染牛的3倍以上,显著高于结核病阳性牛。
有益效果:
本发明首次发现并证实KLK12、MMP-1和MMP-9能够作为牛结核病的诊断标志物,并发现其能够区分活动性结核病牛和潜伏感染牛,具有较强的特异性和较高的灵敏度。
本发明为血清学检测方法,无需采集抗凝血,无需特异性抗原刺激,简化操作要求,提高诊断效率,方便临床一线的推广应用。并且本发明可以区分鼻拭子PCR阳性和阴性牛,有助于排菌牛的及时检测和淘汰,利于我国牛结核病的防控、净化。
附图说明
图1为各组牛血清中KLK12、MMP-1、MMP-9浓度比较图。
图2为各组副结核病阳性牛与阴性牛血清中KLK12浓度比较图。
图3为结核病阳性牛与阴性牛血清中诊断标志物浓度显示图。
图4为鼻拭子PCR阳性牛与PCR阴性牛血清中诊断标志物浓度显示图。。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明,而不用于限制本发明的范围。
实施例1主要检测方法
结核菌素皮试试验
根据《牛结核病诊断标准》(GB/T 18645-2002)进行结核菌素皮试试验。在牛颈部上1/3处剃毛,皮内注射提纯牛型结核菌素(PPD-B,250IU/头份)0.1mL。分别于注射前和注射后72h由同一操作人员用游标卡尺测量注射部位皮肤厚度,计算皮厚差。当皮厚差大于或等于4mm时,该牛为结核病阳性;当皮厚差小于2mm时,则判定为结核病阴性;当皮厚差介于2~4mm之间时,判定为可疑,需在第一次检测结束后的60天再进行皮试试验,若第二次检测皮厚差大于或等于2mm,则判定为结核病阳性。
鼻拭子分泌物的PCR检测
在无菌管中放入2ml无菌PBS,用植绒拭子伸入牛鼻腔内部,转动5-8圈,立即放于无菌管中,将拭子头浸入PBS中,折断拭子头,旋紧盖子,低温保存。12000r/min离心5min,弃去上清,沉淀用CTAB法提取基因组DNA。以提取的基因组DNA为模板,用Rv3877/8F和Rv3877/8R扩增结核分枝杆菌群RD1基因的特异性目的序列(999bp),反应体系(20μL):DDW 7μL,2×PCR Mix 10μL,Rv3877/8F(10μM)0.5μL,Rv3877/8R(10μM)0.5μL,基因组DNA模板2μL。PCR扩增的反应条件为:98℃变性10s,60℃退火30s,72℃延伸1min,30个循环;72℃再延伸5min。引物序列:Rv3877/8F 5’-CGA CGG GTC TGA CGG CCA AAC TCA TC-3’(SEQ ID NO.1);Rv3877/8R 5’-CTT GCT CGG TGG CCG GTT TTT CAG C-3’(SEQ ID NO.2)。
利用上述结核菌素皮试试验方法进行检测,筛选结核病阳性牛和结核病阴性牛,利用上述鼻拭子分泌物的PCR检测方法将结核病牛分为PCR阳性牛和PCR阴性牛。
实施例2分子标志物的筛选
样品采集及制备
无菌采集牛的静脉血5ml,不加抗凝剂,37℃静置1h后4℃过夜,当血清自然析出后3000r/min离心10min,分离血清并移入1.5ml离心管中,储藏于-80℃备用。
牛副结核病检测
利用实施例1的方法随机筛选出结核病阴性牛(NC),“样品采集及制备”的方法制备这批牛的血清样品,然后利用牛副结核抗体ELISA试剂盒检测血清中的抗体水平,筛选出结核病阴性、副结核病阳性牛(paraTB)。
ELISA验证分子标志物
利用实施例1的方法随机筛选结核病牛PCR阳性(bTBPCR-P)17头,结核病牛PCR阴性(bTBPCR-N)83头和结核病阴性牛(NC)5头;利用“牛副结核病检测”的方法筛选结核病阴性、副结核病阳性牛(paraTB)20头;按照“样品采集及制备”的方法制备每头牛的血清样品。
利用ELISA试剂盒检测血清中的KLK12、MMP-1和MMP-9,结果显示bTBPCR-P组和bTBPCR-N组血清中KLK12、MMP-1、MMP-9浓度显著低于NC组,并且bTBPCR-N组血清中KLK12、MMP-1、MMP-9浓度显著低于bTBPCR-P组,三个分子标志物单独或联合使用均具有检测牛结核病的能力。但paraTB组血清中的KLK12、MMP-1、MMP-9浓度与NC组相比却无显著性差异,三个分子标志物在牛结核病诊断中都具有较强的特异性。由于牛血清中KLK12的浓度远高于MMP-1和MMP-9,因此KLK12作为牛结核病的诊断标志物更有优势,可更好地用于bTBPCR-P和bTBPCR-N牛的鉴别诊断。
以上结果表明,血清KLK12、MMP-1和MMP-9有区分结核病牛和阴性牛的能力,且能够区分活动性结核病牛和非活动性结核病牛。因此KLK12、MMP-1和MMP-9可用于牛结核病的诊断,且能够用于活动性牛结核病和牛分枝杆菌潜伏感染的鉴别诊断,三个分子标志物(尤其是KLK12)均具有较强的特异性和较高的灵敏度。
实施例3检测牛结核病方法cutoff值的确定
本研究通过结核菌素皮试试验和鼻拭子分泌物的PCR检测方法,筛选结核病牛PCR阳性(bTBPCR-P)17头,结核病牛PCR阴性(bTBPCR-N)83头和结核病阴性牛(NC)5头,无菌采集上述总计105头牛的静脉血,利用ELISA试剂盒检测血清中的KLK12、MMP-1和MMP-9浓度,根据工作特征曲线分析KLK12、MMP-1和MMP-9区分结核病阳性牛和阴性牛的cutoff值,分析KLK12用于区分活动性和非活动性结核病牛的cutoff值。
结果表明,在区分结核病阳性牛和阴性牛时,KLK12和MMP-1的AUC为1,且选择特异性和检测敏感性可同时达100%;MMP-9的AUC为0.924,特异性为100%时,其检测敏感性为89.09%和90.91%。在鉴别潜伏感染牛和活动性结核病牛时,KLK12和MMP-9的AUC为1,当特异性为100%时,其检测敏感性均可达100%。因此,三者均可作为牛结核病的血清学诊断标志物,其中KLK12和MMP-1更具有作为鉴别结核病阳性/阴性的潜力,KLK12和MMP-9则更具有作为鉴别潜伏感染/活动性结核病的潜力。
表1cutoff值的确立
实施例4临床应用
以实施例3确定的cutoff值作为判定标准(KLK12<125ng/mL或MMP-1<6ng/mL时判定为结核病阳性牛),本发明的KLK12、MMP-1牛结核病检测方法与传统的结核菌素皮试试验的检测符合率可达100%,检测的灵敏度可以达到98%,特异性达到100%。这些试验数据表明KLK12、MMP-1牛结核病检测方法具有较高的灵敏度和特异性,可以用于鉴别结核病阳性牛和结核病阴性牛。
以实施例3确定的cutoff值作为判定标准(KLK12<41ng/mL或MMP-9<7ng/mL时判定为结核潜伏感染牛),本发明的KLK12、MMP-9的牛结核病检测方法与鼻拭子PCR结果的检测符合率可达94.44%,检测的灵敏度可以达到97%,特异性达到100%。这些试验数据表明KLK12、MMP-9牛结核病检测方法具有较高的灵敏度和特异性,可以用于鉴别潜伏感染牛和活动性结核病牛。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明技术原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 牛结核病血清学诊断标志物及其临床应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial
<400> 1
cgacgggtct gacggccaaa ctcatc 26
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<400> 2
cttgctcggt ggccggtttt tcagc 25
Claims (3)
1.检测血清中牛结核病诊断相关标志物的试剂在制备牛结核病潜伏感染和开放性感染诊断试剂盒中的应用,其特征在于,所述牛结核病诊断相关标志物为KLK12和MMP-9;牛结核病诊断相关标志物为血清标志物;所述试剂盒的检测样本为血清。
2.根据权利要求1所述的应用,其中所述试剂盒为ELISA试剂盒。
3.根据权利要求1或2所述的应用,其中所述诊断试剂盒应用时,结核病阳性牛血清中KLK12浓度≥41ng/ml,且血清中KLK12浓度<125ng/ml时判为活动性结核病牛,即结核病阳性开放性感染牛;血清中KLK12浓度<41ng/ml时判为非活动性结核病牛,即结核病阳性潜伏感染牛;或者,结核病阳性牛血清中MMP-9浓度≥7ng/ml,且血清中MMP-9浓度<10ng/ml时判为活动性结核病牛,即结核病阳性开放性感染牛;血清中MMP-9浓度<7ng/ml时判为非活动性结核病牛,即结核病阳性潜伏感染牛。
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