CN109946456B - 牛结核病诊断标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了牛结核病诊断标志物及其应用，本发明利用非靶向蛋白质组学技术筛选、靶向蛋白质组学技术验证获得了能够区分牛结核病阴、阳性的标志物，其为IL‑8、CRP。本发明提供的牛结核病诊断标志物能够鉴别待检牛是否为牛结核病阴、阳性及阳性结核病牛是否处于排菌期，所述诊断标志物可用于制备检测牛结核病的试剂盒或试剂，为牛结核病的诊断提供了新的检测靶点，有助于结核病牛的及时检测和淘汰，也为牛结核病的综合防控提供了保障。

Description

牛结核病诊断标志物及其应用
技术领域
本发明涉及牛结核病诊断标志物及其在制备牛结核病诊断试剂盒中的应用。
背景技术
牛结核病(Bovine Tuberculosis)主要由结核分枝杆菌复合群(Mycobacteriumtuberculosis comples，MTBC)成员——牛分枝杆菌(M.bovis)感染引起的一种人兽共患慢性传染病。与结核分枝杆菌相比，牛分枝杆菌具有更广的宿主范围，其最容易感染牛，同时可以感染其他家畜、灵长目动物、猫、犬以及野生反刍动物等，还能通过吸入含菌气溶胶或食用未经巴氏消毒的牛奶传染给人，在人与动物、人与人之间传播。结核病牛将病原菌以气溶胶形式排泄到体外，含有牛分枝杆菌的气溶胶附着在草场、水槽等地方，健康动物吸入6～10个病菌即可引起感染，此外，一头结核乳腺炎奶牛产奶时会释放大量的牛分枝杆菌，足以污染100头健康牛生产的总奶量。研究显示人类免疫缺陷病毒(Human ImmunodeficiencyVirus，HIV)患者更容易共感染牛分枝杆菌，并且发展为活动性结核病，更容易将牛分枝杆菌传染给与其密切接触的人，结核病已经成为了杀死HIV患者的最重要的凶手。因此，牛结核病不仅危害养殖业的健康发展，更引起严重的公共卫生安全问题，威胁人民的健康和生命安全，该病的有效防控直接关系着人类健康。
结核菌素皮试试验(Tuberculin Skin Test，TST)是最早被用来诊断牛结核病方法，也是目前世界上应用最广泛、世界动物卫生组织(Office International DesEpizooties，OIE)推荐的检测牛结核病的标准方法。γ-干扰素释放试验(Interferongamma release assay,IGRA)可以作为结核菌素皮试试验的替代检测方法，被OIE推荐用于牛结核病检测。
目前，皮试试验和IFN-γ释放试验主要以牛结核菌素(PPD-B)作为刺激原，其生产过程需要牛分枝杆菌强毒株，存在散毒危险，与禽结核菌素(PPD-A)、环境分枝杆菌、BCG存在共同抗原，存在部分假结核阳性牛的结果，因其是多种蛋白、脂类和糖的混合物，定性定量困难，难以保持批次间的稳定性。CFP-10、ESAT-6等重组牛分枝杆菌特异性蛋白具有成份明确、易于质控、制备简单且无生物安全隐患的优势，研究显示以CFP-10和ESAT-6作为皮试试验或IFN-γ释放试验刺激原，能有特异性检测牛结核病，但其敏感性还有待进一步提高。尽管许多疾病可依靠检测血液中的抗原或抗体而得到有效的诊断，但结核病的血清学诊断仍是一个难点。目前世界上用于结核病血清学检测的抗原主要有PPD、MPB70、Ag85复合物、MPB83蛋白及多肽等。Redchuk等用MPT63和MPB83建立的间接ELISA检测方法可鉴别诊断牛分枝杆菌感染和环境分枝杆菌感染。血清学检测方法非常方便，但由于目前建立的牛结核病血清学诊断方法都未能达到有效的灵敏度和特异性，所以未被国际结核病研究组织推荐使用。目前已建立的皮试试验、IFN-γ释放试验和血清学检测方法均无法区分排菌期和非排菌期结核病牛。巢氏PCR检测方法能够用于检测鼻腔分泌物、肺泡灌洗液、奶中的牛分枝杆菌病原，研究显示23％～80％的结核病阳性牛的鼻拭子中可以检测到牛分枝杆菌病原，但是该方法对检测环境、技术和人员的要求比较高，难以在基层推广应用。因此，筛选结核病牛特别是排菌期牛的生物标志物，并建立相关的诊断方法，有助于结核病牛的及时检测和淘汰，利于我国牛结核病的综合防控。
发明内容
本发明的目的在于提供一种牛结核病诊断标志物，以鉴别结核病牛特别是排菌期的结核病牛。
为实现上述目的，本发明首先利用蛋白质组学高通量筛选技术对结核病PCR阳性、结核病PCR阴性、结核病阴性牛共60头牛的血浆样本进行了非靶向蛋白质组学技术筛选，发现了223个血浆蛋白在结核病牛和健康牛之间表达水平的差异，以及107个血浆蛋白在排菌期结核病牛和非排菌期结核病牛之间表达水平的差异。通过靶向蛋白质组学技术验证，确定8个血浆蛋白有作为诊断标志物的潜力，分别是单核细胞分化抗原CD14、C反应蛋白(CRP)、补体6(C6)、IL-8、转铁蛋白(TF)、EGF类纤维蛋白样细胞外基质蛋白(EFEMP2)、α-1-酸性糖蛋白(agp)、白介素受体拮抗蛋白(IL1RN)，利用ELISA最终筛选得到2个牛结核病诊断相关的标志物，其为IL-8和/或CRP。
本发明提供了IL-8和/或CRP在制备牛结核病诊断试剂盒中的应用。
本发明提供了IL-8在制备牛结核病诊断试剂盒中的应用，所述的应用为诊断牛结核病阴或阳性。
本发明的一个实施例中发现，PPD-B刺激后血浆中IL-8浓度≥42ng/ml时判定为结核病阳性；PPD-B刺激后血浆中IL-8浓度＜42ng/ml时判定为结核病阴性。由于样本量的不同可能会影响检测阈值的准确性，但发明人仔细筛查并统计后发现，结核病牛PPD-B刺激后血浆中IL-8平均浓度是结核病阴性牛的5倍以上，显著高于阴性牛。本发明还发现经其他公知的刺激原刺激后，血浆中IL-8浓度的情况在结核病阴性、阳性牛的浓度数值差异显著，且与PPD-B刺激后的类似。
优选地，结核病牛血浆中IL-8平均浓度是结核病阴性牛的6倍以上，显著高于阴性牛。
本发明提供了CRP在制备牛结核病诊断试剂盒中的应用，所述的应用为诊断排菌期结核病牛。
本发明在实施例中发现，结核病阳性牛PPD-B刺激后血浆中CRP浓度≥790ng/ml时判为排菌期牛，当PPD-B刺激后血浆中CRP浓度＜790ng/ml时判为非排菌期牛。当血浆中IL-8浓度≥42ng/ml，且血浆中CRP浓度＜790ng/ml时判为结核病阳性非排菌期牛。本发明还发现经其他公知的刺激原刺激后，血浆中CRP浓度的情况在结核病阳性排菌期牛和非排菌期牛中的浓度数值差异显著，且与PPD-B刺激后的类似。
同时，经过仔细筛查和统计后，发明人还发现排菌期结核病牛PPD-B刺激后的CRP浓度是非排菌期结核病牛和阴性牛的3倍以上，显著高于非排菌期结核病牛和阴性牛。
优选地，排菌期结核病牛刺激原刺激后的CRP浓度是非排菌期结核病牛和阴性牛的4倍以上，显著高于非排菌期结核病牛和阴性牛。
本发明提供了IL-8和CRP在制备排菌期结核病牛和非排菌期结核病牛诊断试剂盒中的应用。
本发明提供了CRP在制备排菌期结核病牛和非排菌期结核病牛诊断试剂盒中的应用。
本发明上述的应用中，所述试剂盒为ELISA试剂盒。
进一步地，所述ELISA试剂盒还含有刺激原，所述刺激原为牛型结核菌素、禽型结核菌素、CFP-10、ESAT-6或PBS。
本发明提供了一种排菌期结核病牛和非排菌期结核病牛的诊断试剂盒，该试剂盒含有检测IL-8和/或CRP表达量的检测试剂。
本发明的有益效果在于：本发明通过非靶向蛋白质组学技术筛选与牛结核病感染相关的分子标志物，并利用靶向蛋白质组学技术和ELISA方法对分子标志物进行验证，从中获得了最具潜力的牛结核病分子标志物即细胞因子IL-8和CRP，且IL-8和CRP的表达量显著高于IFN-γ、IP-10、IL-17A，并与IFN-γ的表达水平具有良好的相关性，具有作为牛结核病分子标志物的优势。本发明首次发现并证实IL-8和CRP能够作为牛结核病的诊断标志物，并发现其能够区分排菌期结核病牛和非排菌期结核病牛。
本发明构建了牛结核病IL-8、CRP夹心ELISA试剂盒，采用该试剂盒检测牛分枝杆菌特异性抗原(PPD-B/CE刺激)刺激后血浆中IL-8、CRP的表达量，结核病阳性牛IL-8显著高于健康牛(血浆中IL-8浓度是结核病阴性牛的5倍以上)，而排菌期牛的CRP显著高于非排菌期牛和健康牛(血浆中的CRP浓度是非排菌期结核病牛和阴性牛的3倍以上)。该检测方法能够提高牛结核病的诊断效率，且可以区分PCR阳性和阴性牛，有助于排菌牛的及时检测和淘汰，利于我国牛结核病的防控、净化。
附图说明
图1为SDS-PAGE检测血清及血浆样品高丰度蛋白去除效果图。泳道M：蛋白分子量标准；泳道1：bTBPCR-P P1去丰峰度蛋白后；泳道2：bTBPCR-P P1去高丰度蛋白前；泳道3：bTBPCR-P P2去高丰度蛋白后；泳道4：bTBPCR-P P2去高丰度蛋白前；泳道5：bTBPCR-N P1去高丰度蛋白后；泳道6：bTBPCR-N P1去高丰度蛋白前；泳道7：bTBPCR-N P2去高丰度蛋白后；泳道8：bTBPCR-N P2去高丰度蛋白前；泳道9：NC P1去高丰度蛋白后；泳道10：NC P1去高丰度蛋白前；泳道11：NC P2去高丰度蛋白后；泳道12：NC P2去高丰度蛋白前。
图2为PPD-B刺激后血浆中TF表达水平显示图。
图3为PPD-B刺激后血浆中agp表达水平显示图。
图4为PPD-B刺激后血浆中IL-8表达水平显示图。
图5为PPD-B刺激后血浆中IP-10表达水平显示图。
图6为PPD-B刺激后血浆中IL-17表达水平显示图。
图7为PPD-B刺激后血浆中IL-8、IFN-γ、IP-10和IL-17浓度比较图。
图8为PPD-B刺激后血浆中CRP表达水平显示图。
图9为CFP-10-ESAT-6刺激后IL-8表达水平显示图。
图10为CFP-10-ESAT-6刺激后IP-10表达水平显示图。
图11为CFP-10-ESAT-6刺激后IL-17表达水平显示图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。牛型结核菌素(PPD-B)和提纯禽型结核菌素(PPD-A)购自哈药六厂。重组蛋白ESAT-6-CFP-10、CFP-10、ESAT-6由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所结核病和宠物疫病诊断实验室制备，已在文献Xin T,Jia H,Ding J,Li P,Yang H,Hou S,Yuan W,Guo X,Wang H,Liang Q,Li M,Wang B,Zhu H.2013.Assessment of a protein cocktail-based skin test for bovine tuberculosis in a double-blind field test incattle.Clin Vaccine Immunol 20:482-90.中公开。
实施例1本发明中涉及的临床样本的检测及采集
1、结核菌素皮试试验：
根据《牛结核病诊断标准》(GB/T 18645-2002)进行结核菌素皮试试验。在牛颈部上1/3处剃毛，皮内注射提纯牛型结核菌素(PPD-B，250IU/头份，)0.1mL。分别于注射前和注射后72h由同一操作人员用游标卡尺测量注射部位皮肤厚度，计算皮厚差。当皮厚差大于或等于4mm时，该牛为结核病阳性；当皮厚差小于2mm时，则判定为结核病阴性；当皮厚差介于2～4mm之间时，判定为可疑，需在第一次检测结束后的60天再进行皮试试验，若第二次检测皮厚差大于或等于2mm，则判定为结核病阳性。
2、基于CFP-10/ESAT-6/TB10.4的皮试试验：
在牛颈部上1/3处剃毛，皮内注射重组蛋白CFP-10/ESAT-6/TB10.4(重组蛋白的浓度为0.5mg/ml，CFP-10、ESAT-6和TB10.4之间比例为1:1:1)0.1mL。分别于注射前和注射后72h由同一操作人员用游标卡尺测量注射部位皮肤厚度，计算皮厚差。当皮厚差大于或等于2mm时，该牛为结核病阳性；当皮厚差小于2mm时，则判定为结核病阴性。
3、γ-干扰素释放试验：
采集肝素锂抗凝血10ml，16h内室温(22±4℃)运送到实验室，首先将抗凝血加入到24孔组织培养板，1.5ml/孔，各孔分别无菌加入提纯牛型结核菌素(PPD-B)、提纯禽型结核菌素(PPD-A)、PBS各100μl，震荡混匀后37℃CO2培养箱中孵育20～24h。小心吸取200μl的上层血浆，转入1.5ml离心管中备用(血浆可在2～8℃贮存7天，-20℃可贮存几个月)，按照牛IFN-γ检测试剂盒(购自Prionics公司)说明书进行操作，PPD-B、PPD-A和PBS刺激样品的OD450nm值分别记作OD450nm(PPD-B)、OD450nm(PPD--A)、OD450nm(PBS)，当OD450nm(PPD-B)－OD450nm(PPD--A)≥0.1且OD450nm(PPD-B)－OD450nm(PBS)≥0.1时，判定为牛结核病阳性，当OD450nm(PPD-B)－OD450nm(PPD--A)＜0.1或OD450nm(PPD-B)－OD450nm(PBS)＜0.1时，判定为牛结核病阴性。
4、基于CFP-10-ESAT-6的γ-干扰素释放试验：
采集肝素锂抗凝血10ml，16h内室温(22±4℃)运送到实验室，首先将抗凝血加入到24孔组织培养板，1.5ml/孔，各孔分别无菌加入重组蛋白ESAT-6-CFP-10(CE，20μg/ml，内毒素＜10EU/mg)、PBS各100μl，震荡混匀后37℃CO2培养箱中孵育20～24h。小心吸取200μl的上层血浆，转入1.5ml离心管中备用(血浆可在2～8℃贮存7天，-20℃可贮存几个月)，按照牛IFN-γ检测试剂盒(购自Prionics公司)说明书进行操作，ESAT-6-CFP-10和PBS刺激样品的OD450nm值分别记作OD450nm(CE)、OD450nm(PBS)，当OD450nm(CE)－OD450nm(PBS)≥0.1时，判定为牛结核病阳性，当OD450nm(CE)－OD450nm(PBS)＜0.1时，判定为牛结核病阴性。
5、鼻拭子分泌物的巢氏PCR检测：
将无菌管中放入2～4ml无菌PBS，用植绒拭子伸入牛鼻腔内部，转动5-8圈，立即放于无菌管中，将拭子头浸入PBS中，折断拭子头，旋紧盖子，低温保存。4℃13000r/min离心15min，弃去上清，用细菌基因组提取试剂盒(购自TAKARA公司)提取基因组，冻存于-20℃备用。以提取的基因组DNA为模板，用M70F和M70R扩增结核分枝杆菌群mpb70基因的特异性目的序列(372bp)，反应体系：DDW19μL，2×PCR Mix 25μL，M70F(10μM)2μL,M70R(10μM)2μL,基因组DNA模板2μL。
PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s，60℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃再延伸5min。分别取1μL的PCR产物作为第二轮PCR反应的模板，其50μLPCR反应体系：DDW 20μL，2×PCR Mix 25μL，M22F(10μM)2μL，M22R(10μM)2μL，PCR产物模板1μL。第二轮PCR用touch down循环参数扩增。
表1巢氏PCR引物名称、序列及扩增产物大小
Figure BDA0001972111410000081
6、利用上述步骤1-4的方法进行检测，筛选结核病阳性牛和结核病阴性牛，利用上述步骤5方法将结核病牛分为PCR阳性牛和PCR阴性牛。
表2临床样品分组
Figure BDA0001972111410000082
Figure BDA0001972111410000091
7、样品采集及制备:
无菌采集牛的静脉血10ml，注入肝素锂抗凝采血管(10ml)。将抗凝血加入到24孔组织培养板，1.5ml/孔，各孔分别无菌加入提纯牛型结核菌素(PPD-B)、提纯禽型结核菌素(PPD-A)、PBS和重组蛋白ESAT-6-CFP-10(CE，20μg/ml，内毒素＜10EU/mg)各100μl，震荡混匀后37℃CO2培养箱中孵育20～24h。小心吸取上层血浆，转入1.5ml离心管中，冻存于备用-80℃。
实施例2分子标志物的筛选
1、样品预处理：随机筛选实施例1确定的结核病牛PCR阳性(bTB PCR-P)、结核病牛PCR阴性(bTBPCR-N)和结核病阴性牛(NC)各20头。以bTBPCR-P组为例，每10个血浆样品等体积混合，从而成为2个生物学重复的血浆混合样品(bTBPCR-P P1为1-10号牛的血浆样品混合样，bTBPCR-P P2为11-20号牛的血浆样品混合样)。依此方法，制备bTBPCR-N(bTBPCR-N P1和bTBPCR-NP2)和NC组(NC P1和NC P2)的血浆混合样品。
2、高丰度蛋白去除：由于血浆中IgG、BSA等占样品中总蛋白的85％以上，会影响低丰度蛋白的检测，因此用高丰度蛋白去除试剂盒(购自伯乐公司)去除血浆样品中的高丰度蛋白。利用SDS-PAGE检测高丰度蛋白去除效果，Bradford蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。结果表明6个血浆样品(bTBPCR-P P1、bTBPCR-P P2、bTBPCR-N P1、bTBPCR-N P2、NC P1和NC P2)成功去除高丰度蛋白(见图1)，且蛋白浓度均大于2mg/ml，可以用于质谱检测。
3、蛋白质的酶切与脱盐：取100μg蛋白质，用三乙基碳酸氢铵溶液(TEAB)将蛋白质体积整体调节到100μl，然后加入500μl 50mM NH4HCO3稀释，加入2μg胰蛋白酶液，37℃消化过夜，然后加入等体积的0.1％甲酸(FA)进行酸化；取出Strata–X C18柱子先用1ml甲醇活化，然后加入1ml 0.1％FA平衡；将上述酸化后的酶解液加入到Strata-X C18柱子中，连续过3次，然后加入0.1％FA+5％乙腈清洗Strata-X C18柱子，连续清洗2次；取一个新的离心管，往Strata-X C18柱子中加入1ml 0.1％FA+80％乙腈洗脱1次，收集1ml液体；冷冻抽干后用20μl 0.5M TEAB复溶。
4、iTRAQ LC-MS/MS检测：根据说明书采用8-plex标记，具体标记如下：bTBPCR-P组：113，114；bTBPCR-N：115，116；NC：117，118。标记后将6个待检血浆样品分别等量混合。将混合后的样品分成16个组分，以AB SCIEX nanoLC-MS/MS(Triple TOF 5600plus)进行质谱检测，以Proteinpilot TMV4.5进行数据搜索和鉴定。将unused score≥1.3(即可信度水平在95％以上)，至少包含一个unique肽段的蛋白认为是可信蛋白。利用重复样品间两两比较的比值的均值经过中位数归一化后作为待比较样品的差异倍数，其次利用重复样品间两两比较单样本Student’s t检验的p-value中的最小值作为待比较样品间的显著性差异检验p值。当差异倍数达到1.5倍及以上(即up_regulate≥1.5和down_regulate≤0.67)，且其p-value≤0.05时，视为显著差异蛋白。结果显示，血浆样品中共鉴定到719个蛋白，其中531个蛋白鉴定到2个以上肽段。根据鉴定到的差异蛋白倍数和功能，筛选了15个血浆蛋白进行平行反应监测技术(Parallel ReactionMonitoring，PRM)鉴定(见表3)，根据iTRAQ和PRM检测结果，筛选蛋白结果一致，可用于牛结核病诊断的蛋白进行ELISA验证。
表3 iTRAQ和PRM鉴定到的PPD-B刺激后的血浆中的差异蛋白
Figure BDA0001972111410000111
Figure BDA0001972111410000121
实施例3本发明中分子标志物的验证
1、PRM鉴定差异蛋白：参照实施例2的方法处理样品，采用质谱PRM的靶向分析策略，通过DDA检测后，将鉴定到的目标蛋白的肽段加入质谱采集方法的inclusion list中，使质谱针对这些特定肽段进行数据采集，通过抽提碎片离子信息进行相对定量分析(结果见表4)，根据iTRAQ和PRM鉴定结果(见表3)，IL-8、agp和TF在结核病牛血浆中的含量是健康牛血浆中含量的1.3倍以上，而CRP在排菌期结核病牛血浆中含量是非排菌期结核病牛血浆中的2倍以上，并且iTRAQ和PRM的检测结果吻合，因此筛选血浆蛋白IL-8、CRP、agp、TF，并增加文献报道的IL-17A和IP-10，利用ELISA方法进行检测。
2、ELISA验证分子标志物：利用实施例1的步骤1-5的方法随机筛选结核病牛PCR阳性(bTBPCR-P)21头，结核病牛PCR阴性(bTBPCR-N)21头和结核病阴性牛(NC)19头，并按照实施例1步骤7的方法制备每头牛的血浆样品。
利用商品化ELISA试剂盒检测血浆中的转铁蛋白(Serotransferrin，TF)、酸性糖蛋白(Alpha-1-acid glycoprotein，agp)、C反应蛋白(Pentaxin，CRP)、IL-8、IL-17和IP-10。结果显示PPD-B刺激后，bTBPCR-P组血浆中的TF显著高于NC组，而bTBPCR-N组血浆中TF水平与NC组相近(见图2)；bTBPCR-P组血浆中的agp显著低于bTBPCR-N组和NC组，而bTBPCR-N组血浆中agp水平与NC组相近(见图3)。bTBPCR-P组和bTBPCR-N组血浆中的IL-8、IP-10和IL-17显著高于NC组(见图4-6)，并且IL-8的浓度显著高于IP-10和IL-17(见图7)，而bTBPCR-P组血浆中的CRP显著高于bTBPCR-N组和NC组(见图8)。由此可知，PPD-B刺激后血浆中的IL-8、IP-10和IL-17均有潜力用于区分结核病牛和非感染牛，且IL-8浓度较高，其检测潜力优于IP-10和IL-17。我们同时检测牛分枝杆菌抗原CFP-10-ESAT-6刺激后血浆中的IL-8、IP-10和IL-17的水平，发现CFP-10-ESAT-6刺激后，bTBPCR-P组和bTBPCR-N组血浆中IL-8和IP-10显著高于NC组(见图9-10)，bTBPCR-N组血浆中IL-17显著高于bTBPCR-P组和NC组(见图11)，因此，特异性抗原CFP-10-ESAT-6作为刺激抗原时，IL-8和IP-10优于IL-17，且由于IL-8的浓度高于IP-10，IL-8更有优势作为牛结核病的检测标志物。
以上结果表明，PPD-B和CFP-10-ESAT-6刺激后血浆IL-8有区分结核病牛和阴性牛的能力，而PPD-B刺激后的CRP能够区分排菌期结核病牛和非排菌期结核病牛。因此牛分枝杆菌特异性抗原(PPD-B、CE)诱导的IL-8和CRP可用于牛结核病的诊断，且能够用于区分牛结核病的排菌期和非排菌期。
3、PPD-B诱导的IL-8、CRP检测牛结核病方法cutoff值的确定
皮试试验和γ-干扰素释放试验是OIE推荐牛结核病检测方法，而近期的研究报道IL-17A和IP-10也具有作为牛结核病诊断标志物的潜力，因此，本研究通过结核菌素皮试试验、基于CFP-10/ESAT-6/TB10.4皮试试验、γ-干扰素释放试验、基于CFP-10-ESAT-6的γ-干扰素释放试验以及鼻拭子分泌物的巢式PCR检测方法，筛选结核病牛PCR阳性牛(bTBPCR-P)21头、结核病牛PCR阴性牛(bTBPCR-N)21头、以及19头结核病阴性牛。
无菌采集牛的静脉血10ml，注入肝素锂抗凝采血管(10ml)。将抗凝血加入到24孔组织培养板，1.5ml/孔，无菌加入提纯牛型结核菌素(PPD-B)和CFP-10-ESAT-6各100μl，震荡混匀后37℃CO2培养箱中孵育20～24h。小心吸取上层血浆，转入1.5ml离心管中，检测血浆中IFN-γ、IL-8、CRP、IP-10和IL-17的浓度。利用受试者工作特征曲线分析IL-8、IP-10和IL-17区分结核病阳性牛和阴性牛的cutoff值(包含42头结核病阳性牛和19头阴性牛)，分析CRP用于区分排菌期和非排菌期结核病牛的cutoff值(包含21头排菌期结核病牛和21头非排菌期牛)。
结果表明，在区分结核病阳性牛和阴性牛时，以PPD-B作为刺激原时，IL-8的AUC高于IP-10和IL-17，且选择特异性为100％时，其检测敏感性可达96.62％，而IP-10和IL-17的特异性为100％时，其检测敏感性仅为52.38％和28.57％。在CFP-10-ESAT-6作为刺激原时，IL-8的AUC为0.9561，其特异性为100％，敏感性为85.71％，其检测效果弱于PPD-B作为刺激原的检测效果。在区分排菌期和非排菌期结核病牛时，CRP的AUC为1，当特异性为100％时，其检测敏感性可达100％。因此，PPD-B诱导的IL-8和CRP比IP-10、IL-17以及CFP-10-ESAT-6诱导的IL-8更具作为牛结核病分子标志物的潜力。
表4 cutoff值的确立
Figure BDA0001972111410000141
Figure BDA0001972111410000151
4、IL-8、CRP与IFN-γ、IP-10、IL-17A的相关性：用spearman r方法检测细胞因子表达水平的相关性。结果显示，IL-8的表达水平显著高于IFN-γ、IP-10和IL-17(见图7)，且其与IFN-γ的相关性最高，其相关系数大于0.75(表5)，表明IL-8相对于IP-10和IL-17更适合作为牛结核病的检测标志物。CRP用于区分排菌期结核病牛和非排菌期结核病牛，其与IL-8、IFN-γ、IP-10和IL-17的相关性不如其他因子之间高，但是与IL-8和IP-10呈显著正相关关系。
表5细胞因子表达水平的相关性分析
Figure BDA0001972111410000152
*：p＜0.05
实施例4本发明中牛结核病IL-8、CRP检测试剂盒的构建1、样本采集及制备：无菌采集牛静脉血10ml，注入肝素锂抗凝采血管，轻轻颠倒3～5次，室温下20h送回实验室。将抗凝血加入到24孔组织培养板，1.5ml/孔，无菌加入PPD-100μl，轻轻震荡混匀后37℃CO2培养箱中孵育20～24h。小心吸取上层血浆，转入1.5ml离心管中，冻存于-80℃备用。
2、IL-8、CRP单克隆抗体包被酶标板的制备：将IL-8单克隆抗体用的PBS(pH值7.2～7.4)稀释至2μg/ml，100μl/孔，加入酶标板奇数列中；将CRP单克隆抗体用的PBS(pH值7.2～7.4)稀释至2μg/ml，100μl/孔，加入酶标板偶数列中，置2～8℃包被16小时，次日弃去包被液，拍干，用洗涤液洗板6次，250μl/孔；弃去洗涤液，加入封闭液(1％BSA的PBST，pH值7.2～7.4)，200μl/孔，置2～8℃封闭12小时，次日弃去封闭液，拍干，用洗涤液洗板3次，250μl/孔；弃去洗涤液，拍干，铝箔袋包装，置2～8℃保存。
3、HRP标记鼠抗牛IL-8、CRP单克隆抗体的制备：按照EZ-连接激活过氧化物酶抗体标记试剂盒(EZ-Link Activated Peroxides Antibody Labeling Kit，ThermoScientific Pierce#31497)说明书操作，采用HRP分别标记鼠抗牛IL-8和CRP单抗。将标记的单抗用PBS稀释，通过夹心ELISA法测定其最佳稀释度，加入Thermo公司商品化酶标抗体稳定剂(货号37548)配成100×酶标抗体储存液，0.22μm滤膜过滤除菌，无菌适量分装，2～8℃避光保存。
4、标准品制备：取浓度为1μg/ml重组表达的IL-8，用样品稀释液(0.1％BSA的PBST，pH值7.2～7.4)稀释为8个梯度(0,1,5,10,50,100,500，1000pg/ml)，检测前15min配制。取浓度为1μg/ml重组表达的CRP，用样品稀释液(0.1％BSA的PBST，pH值7.2～7.4)稀释为8个梯度(0,6.25,12.5,25,50,100,200,400ng/ml)，检测前15min配制。
5、加样：将PPD-B刺激后的血浆融化后，轻轻颠倒混匀，用样品稀释液(0.1％BSA的PBST，pH值7.2～7.4)稀释成5倍、8倍和200倍。取单抗包被板(根据样品多少，可拆开分次使用)，第一列加入稀释的IL-8标准品，第二列加入稀释的CRP标准品，第三列第四列加入稀释后的样品，每孔100μl，充分混匀，封板，室温下(22～26℃)避光反应60分钟。取出反应板，弃去反应液，每孔加入250μl 1×洗涤液，洗涤5次，最后1次轻轻拍干。加样操作示意如下：
表6加样示意表
样品 IL-8标准品 CRP标准品 样品 样品
1 1000pg/ml 400ng/ml 1-PPDB 20× 1-PPDB 5×
2 500pg/ml 200ng/ml 1-PPDB200× 1-PPDB20×
3 100pg/ml 100ng/ml 2-PPDB 20× 2-PPDB 5×
4 50pg/ml 50ng/ml 2-PPDB200× 2-PPDB20×
5 10pg/ml 25ng/ml 3-PPDB 20× 3-PPDB 5×
6 5pg/ml 12.5ng/ml 3-PPDB200× 3-PPDB20×
7 1pg/ml 6.25ng/ml 样品稀释液 样品稀释液
8 0pg/ml 0ng/ml
6、加入酶标抗体：用酶标抗体稀释液(0.1％BSA的PBST，pH值7.2～7.4)分别100倍稀释100×HRP-抗牛IL-8单抗和100×HRP-抗牛CRP单抗，奇数列加入抗IL-8抗体，偶数列加入抗CRP抗体，100μl/孔，室温下(22～26℃)避光反应60分钟。取出反应板，弃去反应液，每孔加入250μl 1×洗涤液，洗涤5次，最后1次轻轻拍干。
7、显色与终止：加入底物显色液，100μl/孔，从加入第1孔即开始计时，室温(22～26℃)避光反应30分钟。按底物显色液加入顺序，向各孔依次加入50μl终止液，轻轻混匀，10分钟内用酶标仪测定OD450nm值。
8、数据分析：当空白对照的OD450nm＜0.3时，结果有效。将各孔的OD450nm读值减去空白对照的平均值，以标准品的OD450nm与空白对照的差值为横坐标，标准品浓度作为纵坐标，绘制标准品的线性回归曲线，根据样品的OD450nm与空白对照的差值计算样品浓度，再乘以其稀释倍数，即为该样品血浆中IL-8和CRP的浓度。
9、诊断标准的确定：根据实施例1步骤1-5的方法筛选结核病牛PCR阳性(bTB PCR-P)21头、结核病牛PCR阴性(bTB PCR-N)21头和结核病阴性牛(NC)19头，无菌采集肝素锂抗凝血，加入到24孔组织培养板，1.5ml/孔，无菌加入PPD-B(300IU/ml)100μl，轻轻震荡混匀后37℃CO2培养箱中孵育20～24h。小心吸取上层血浆，转入1.5ml离心管中，用本发明中的IL-8、CRP夹心ELISA检测试剂盒检测血浆中IL-8浓度。对结核病牛(包括PCR阳性和阴性，42头)与对照牛(19头)的PPD-B刺激后血浆中IL-8浓度作ROC分析，评价其对结核病牛的检测阈值；对结核病PCR-阳性牛与PCR阴性牛的PPD-B刺激后血浆中CRP浓度作ROC分析，评价其对排菌期结核病牛的检测阈值。
表7 ROC分析
Figure BDA0001972111410000181
结果显示，PPD-B特异性刺激下的IL-8能够区分结核病阳性牛和阴性牛，其检测特异性为100％时，其检测敏感性可达96.62％，其AUC为0.9662。在区分排菌期和非排菌期结核病牛时，CRP的AUC为1，当特异性为100％时，其检测敏感性可达100％。(表7)。
表8方差分析
Figure BDA0001972111410000182
Figure BDA0001972111410000191
诊断标准：为了保证结核病牛的检测特异性，根据ROC的分析结果将检测特异性设为100％，其敏感性高于90％，PPD-B刺激后血浆中IL-8浓度≥42ng/ml时判定为结核病阳性；PPD-B刺激后血浆中IL-8浓度＜42ng/ml时判定为结核病阴性。结核病阳性牛PPD-B刺激后血浆中CRP浓度≥790ng/ml时判为排菌期牛，当PPD-B刺激后血浆中CRP浓度＜790ng/ml时判为非排菌期牛。由于样本量的不同可能会影响检测阈值的准确性，但结核病牛PPD-B刺激后血浆中IL-8平均浓度是结核病阴性牛的5-6倍以上，显著高于阴性牛；排菌期结核病牛PPD-B刺激后的CRP浓度是非排菌期结核病牛和阴性牛的3-4倍以上，显著高于非排菌期结核病牛和阴性牛。因此，样本量的差别对阈值的整体范围影响不大。
实施例5本发明的牛结核病IL-8、CRP检测试剂盒的临床评价
在牛场用实施例1中的结核菌素皮试试验检测84头牛，无菌采集牛静脉血10ml，注入肝素锂抗凝采血管，轻轻颠倒3～5次，室温下20h送回实验室。将抗凝血加入到24孔组织培养板，1.5ml/孔，各孔分别无菌加入提纯牛型结核菌素(PPD-B)、提纯禽型结核菌素(PPD-A)、PBS各100μl，震荡混匀后37℃CO2培养箱中孵育20～24h。小心吸取200μl的上层血浆，转入1.5ml离心管中备用(血浆可在2～8℃贮存7天，-20℃可贮存几个月)。按照牛IFN-γ检测试剂盒(购自Prionics公司)说明书，检测PPD-B、PPD-A和PBS刺激样品。利用本发明实施例4构建的试剂盒检测PPD-B刺激后的血浆中IL-8和CRP浓度。参照实施例1中鼻拭子分泌物的巢氏PCR检测方法采集并检测每头牛的鼻拭子。
表9
Figure BDA0001972111410000201
IL-8、CRP牛结核病检测方法相对于结核菌素皮试试验和γ-干扰素释放试验的灵敏度＝A/(A+C)×100％＝97％
IL-8、CRP牛结核病检测方法相对于结核菌素皮试试验和γ-干扰素释放试验的特异性＝D/(B+D)×100％＝98％
IL-8、CRP牛结核病检测方法与结核菌素皮试试验和和γ-干扰素释放试验测符合率＝(A+D)/(A+B+C+D)×100％＝97.65％
阳性牛：经和γ-干扰素释放试验、结核菌素皮试试验检测判定为双阳性的牛共35头；
阴性牛：经γ-干扰素释放试验、结核菌素皮试试验检测判定为双阴性的牛共50头。
实验结果表明：本发明的IL-8、CRP牛结核病检测方法与传统的γ-干扰素释放试验、结核菌素皮试试验的检测符合率可达97.65％，检测的灵敏度可以达到97％，特异性达到98％。这些试验数据表明IL-8、CRP牛结核病检测方法具有较高的灵敏度和特异性，可以用于区分结核病阳性牛和阴性牛。
表10
Figure BDA0001972111410000202
IL-8、CRP牛结核病检测方法相对于鼻拭子分泌物的巢式PCR检测的灵敏度＝A/(A+C)×100％＝93％
IL-8、CRP牛结核病检测方法相对于鼻拭子分泌物的巢式PCR检测的特异性＝D/(B+D)×100％＝100％
IL-8、CRP牛结核病检测方法与鼻拭子分泌物的巢式PCR检测符合率＝(A+D)/(A+B+C+D)×100％＝97.14％
阳性牛：经和γ-干扰素释放试验、结核菌素皮试试验检测判定为双阳性的牛共35头；
排菌期结核病牛：经鼻拭子分泌物的巢式PCR检测为阳性的牛共计14头；
非排菌期结核病牛：经鼻拭子分泌物的巢式PCR检测为阳性的牛共计21头。
实验结果表明：IL-8、CRP牛结核病检测方法与鼻拭子分泌物的巢式PCR的检测符合率可达97.14％，检测的灵敏度可以达到93％，特异性达到100％。这些试验数据表明IL-8、CRP牛结核病检测方法具有较高的灵敏度和特异性，可以用于区分排菌期结核病牛和非排菌期结核病牛。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120> 牛结核病诊断标志物及其应用
<130> KHP181119093.3
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaacaatccg gagttgacaa 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agcacgctgt caatcatgta 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gctgacggct gcactgtcgg gc 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgttggccgg gctggtttgg cc 22

Claims (3)

1.IL-8和CRP或其检测试剂在制备排菌期结核病牛和非排菌期结核病牛诊断试剂盒中的应用，
其特征在于，牛结核菌素PPD-B刺激后血浆中IL-8浓度≥42ng/ml时判定为结核病阳性；牛结核菌素PPD-B刺激后血浆中IL-8浓度＜42ng/ml时判定为结核病阴性；
牛结核菌素PPD-B刺激后血浆中CRP浓度≥790ng/ml时判为结核病阳性排菌期牛，当牛结核菌素PPD-B刺激后血浆中CRP浓度＜790ng/ml时判为非排菌期牛；
当牛结核菌素PPD-B刺激后血浆中IL-8浓度≥42ng/ml，且血浆中CRP浓度＜790ng/ml时判为结核病阳性非排菌期牛。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，排菌期结核病牛经牛结核菌素PPD-B刺激后血浆中的CRP浓度是非排菌期结核病牛和阴性牛的3倍以上。
3.根据权利要求1-2任一所述的应用，其特征在于，所述试剂盒为ELISA试剂盒。
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