CN113227117B - 类肽化合物以及表面偶联有类肽化合物的检测芯片 - Google Patents

类肽化合物以及表面偶联有类肽化合物的检测芯片 Download PDF

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Abstract

本公开的实施例提供一种包含式I所示的结构的类肽化合物以及表面偶联有该类肽化合物的检测芯片。该类肽化合物与循环肿瘤细胞表面的EpCAM蛋白的结合能力较强，以该类肽化合物为基础的结直肠腺癌、胃腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、前列腺癌、胰腺癌、干细胞癌、视网膜母细胞癌或者食管原发鳞状细胞癌诊断技术能够实现快速检测或诊断，此外，该类肽化合物的合成方法简单，制备效率高，且制作成本低。
Figure DDA0002296655950000011

Description

类肽化合物以及表面偶联有类肽化合物的检测芯片
技术领域
本公开的实施例涉及一种类肽化合物以及表面偶联有类肽化合物的检测芯片。
背景技术
上皮特异性黏附分子(epithelialcelladhesionmolecule，EpCAM)属于黏附分子家族，是由肿瘤相关钙信号转导1(tumor-associated calcium signal transducer 1,TACSTD1)基因编码的一个单次跨膜蛋白，参与调节细胞间细胞黏附，介导信号转导、细胞迁移、增殖和分化等功能。病理情况下，EpCAM几乎表达于所有的腺癌中，包括结直肠腺癌、胃腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、前列腺癌、胰腺癌以及干细胞癌和视网膜母细胞瘤。EpCAM通过参与β-连环蛋白依赖的Wnt级联反应激活c-myc基因、cyclinA/E等原癌基因的表达，具有致瘤作用。同时，EpCAM也是肿瘤预后的一个重要指标，如正常情况下，EpCAM在食管鳞状上皮呈阴性表达，而在食管原发鳞状细胞癌中，几乎80％的肿瘤出现EpCAM不同程度的表达，EpCAM强阳性的食管鳞癌术后复发的平均时长间隔为9个月，而EpCAM阴性、弱阳性及阳性的术后复发平均时间间隔为43个月，表明EpCAM的过表达影响食管鳞癌的预后。除此以外，乳腺癌、胃癌等EpCAM的过表达也是癌细胞转移的重要指标。
由于肿瘤具有异质性，对于癌细胞已发生转移的患者而言，仅仅取某个部位的肿瘤组织并不足以反映患者整体的状况，然而对患者体内所有的肿瘤组织都取样又不切实际，因此，组织活检技术具有一定的局限性。液体活检技术不需要取出患者体内的肿瘤组织，只需要取出患者的血液或者分泌物即可进行检测，因此，研究者们对于液体活检技术的关注和研究越来越多。液体活检技术包括采用类肽化合物对循环肿瘤细胞(CTC)、循环肿瘤DNA(ctDNA)和外泌体(Exosome)等进行检测。
循环肿瘤细胞(CTC，CirculatingTumorCell)是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称，因自发或者诊疗操作从实体瘤病灶(原发灶、转移灶)脱落，大部分CTC进入外周血后发生凋亡或者被吞噬，少数能够逃逸并发展成为转移灶，增加恶性肿瘤患者死亡风险。CTC存在与否及数量的多少是癌症进展和转移的重要指标，检测和跟踪外周血中CTC的数量有助于对患者进行早期筛查、疗效监控、预后判断和复发预测。
针对CTC的检测技术能够预测早期肿瘤的发生，又能够在患者采用药物进行治疗的过程中对肿瘤转移的情况进行检测，此外，还能对后续的治疗进行指导用药。CTC来源于原发肿瘤或者转移肿瘤，CTC脱离基底膜之后可以进入血管中。由于CTC在血液中的含量极低，且其尺寸与白细胞的尺寸相近，这样就导致CTC很难采用液体活检技术进行检测。但是，CTC的表面带有相关癌症特异性高表达的蛋白。
在癌症发展的早期，可以采用CTC(循环肿瘤细胞)筛选技术对癌症进行诊断。CTC筛选检测需要从血液中捕获出循环肿瘤细胞，该检测过程与捕获器件表面偶联的探针分子有着密不可分的关系，通过探针分子与CTC表面蛋白的亲和作用实现特异性捕获。抗体作为探针分子具有与生物传感器紧密结合的特点，但是，抗体分子的排列是无序的，其在传感器表面的排布方向随机难以控制，从而导致其特异性较低，且抗体的成本较高。因此，需要开发一种新的探针分子用于CTC筛选检测或者诊断癌症。
发明内容
本公开至少一实施例提供一种类肽化合物，其包括1,4-丁二胺亚单位、联苯乙胺亚单位、丙酸胺亚单位和苯乙胺亚单位，包含如式I所示的结构：
Figure BDA0002296655930000021
在一种实施方案中，在本公开至少一实施例提供的类肽化合物中，所述类肽化合物的分子结构式为
Figure BDA0002296655930000031
在另一种实施方案中，在本公开至少一实施例提供的类肽化合物中，所述类肽化合物具有30-100个亚单位。例如，在本公开至少一实施例提供的类肽化合物中，式I所示的结构不位于所述类肽化合物的结构的两端。
例如，在本公开至少一实施例提供的类肽化合物中，所述类肽化合物的分子结构式为：
Figure BDA0002296655930000032
其中，10≥n1≥3，10≥n2≥3，n1和n2均为自然数。例如，在一种实施方案中，n1＝n2。在一种优选的实施方案中，n1＝n2，并且n1为3、5或7。
例如，在本公开至少一实施例提供的类肽化合物中，所述类肽化合物的分子结构式为：
Figure BDA0002296655930000041
本公开至少一实施例还提供一种检测芯片，该检测芯片的表面偶联有上述任一种类肽化合物。在一种实施方案中，芯片的表面偶联的类肽化合物是式III所示的类肽化合物，优选式IV所示的类肽化合物。
在一种优选的实施方案中，所述检测芯片是微流控芯片。
在一种实施方案中，上述芯片可用于检测或者诊断与EpCAM蛋白相关的疾病。例如，所述疾病包括结直肠腺癌、胃腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、前列腺癌、胰腺癌、干细胞癌、视网膜母细胞癌或者食管原发鳞状细胞癌。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅涉及本发明的一些实施例，而非对本发明的限制。
图1为本公开一实施例提供的一种类肽化合物的制备方法的流程图；
图2为本公开一实施例提供的类肽纳米片层的形成过程示意图；
图3a为本公开一实施例提供的类肽纳米片层自组装后的结构示意图；
图3b为本公开一实施例提供的类肽纳米片层自组装后的荧光显微镜表征图；
图4a为本公开一实施例提供的式IV类肽化合物与浓度为5.68nM、11.4nM、22.8nM、45.6nM和91.2nM的EpCAM蛋白结合的表面等离基元共振检测的结果图；
图4b为本公开一实施例提供的式I类肽化合物与浓度为5.68nM、11.4nM、22.8nM、45.6nM和91.2nM的EpCAM蛋白结合的表面等离基元共振检测的结果图；以及
图5为类肽纳米片层用在检测芯片上的结构示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本公开提及的各类文献和出版物在此引入作为参考。除非另外定义，本公开使用的技术术语或者科学术语应为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。“包括”或者“包含”等类似的词语意指出现该词前面的要素涵盖出现在该词后面列举的要素及其等同，而不排除其他要素。
本公开的类肽化合物包括类肽小分子和类肽大分子，其中类肽小分子具有小于10个亚单位，而类肽大分子具有10个以上亚单位，例如10-100个亚单位。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。例如EpCAM蛋白购自北京义翘神州科技有限公司。
下述实施例中的SPRi仪器为Plexera Kx5V2，Plexera Bioscience LLC,USA，该仪器主要装配有660nmLED光源、CCD图像采集器和带微流通道的传感芯片，仪器显示每个监测点上反射光强度随时间的变化并记录为SPR曲线。
除非特殊说明，本文中的“nM”指的是“nmol/L”，“mM”指的是“mmol/L”。
针对CTC的检测技术能够预测早期肿瘤的发生，又能够在患者采用药物进行治疗的过程中对肿瘤转移的情况进行检测，此外，还能对后续的治疗进行指导用药。CTC来源于原发肿瘤或者转移肿瘤，CTC脱离基底膜之后可以进入血管中。由于CTC在血液中的含量极低，且其尺寸与白细胞的尺寸相近，这样就导致CTC很难采用液体活检技术进行检测。但是，CTC的表面带有相关癌症特异性高表达的蛋白。例如，病理情况下，EpCAM常见表达于结直肠腺癌、胃腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、前列腺癌、胰腺癌以及干细胞癌和视网膜母细胞瘤中。因此，通过特异性地识别EpCAM高表达的结直肠腺癌、胃腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、前列腺癌、胰腺癌以及干细胞癌和视网膜母细胞瘤患者CTC表面的EpCAM蛋白为高灵敏度地捕获相应的CTC提供了有利的保障，例如，可以设计对EpCAM蛋白具有高亲和、高灵敏度的分子探针。
多肽以α氨基酸为结构单元，而类肽(peptoid)以N-取代甘氨酸为结构单元的多肽模拟物。相较于多肽，类肽的侧链从α-碳上转移到了N上。不同于传统的多肽只有20种氨基酸，类肽由亚单元合成法进行合成，其组成单元是由不同的胺所决定的，胺的种类成千上万，因此类肽的序列种类就极为丰富，可以针对不同的靶标开发不同的化学序列结构。由于类肽不被酶所识别，类肽能够有效地抵抗体内的蛋白酶解作用，这使得类肽在作为分子探针上具有更加明显的优势。
类肽小分子具有免疫原性低、组织渗透性好、分子量小、稳定性高、易于修饰且制造成本低等特点。抗体具有与生物传感器紧密结合的特点，但是，抗体分子的排列是无序的，其在传感器表面的排布方向随机难以控制，从而导致其特异性较低，且抗体的成本较高。
本公开的发明人发现，具有30-100个亚单位的类肽大分子能够很好地结合类肽小分子和抗体的特点，即该类肽大分子既具有抗体的与生物传感器结合紧密的特点，又能够将类肽小分子有序地形成在传感器的表面。此外，与类肽小分子相比，该类肽大分子形成的分子探针与肿瘤细胞的亲和作用更强，且该类肽大分子更不易被酶解，能够保证天然活体样本的活性。
本公开至少一实施例提供一种类肽化合物，该类肽化合物包括：1,4-丁二胺亚单位、联苯乙胺亚单位、3-氨基丙酸亚单位和β-苯乙胺亚单位。各亚单位源自如下所示的亚单位供体：
Figure BDA0002296655930000061
(1,4-丁二胺)，
Figure BDA0002296655930000062
(联苯乙胺)，
Figure BDA0002296655930000063
(3-氨基丙酸)，
Figure BDA0002296655930000071
(β-苯乙胺)。
例如，在本公开至少一实施例提供的类肽化合物中，该类肽化合物具有式I所示的结构：
Figure BDA0002296655930000072
在一种实施方案中，该类肽化合物是具有4个亚单位的类肽小分子，即其结构式为
Figure BDA0002296655930000073
在一种实施方案中，类肽化合物是类肽大分子，具有30-100个亚单位。优选地，式I所示的结构不位于所述类肽大分子的结构的两端。例如，类肽化合物的分子结构式为：
Figure BDA0002296655930000074
其中，10≥n1≥3，10≥n2≥3，n1和n2均为自然数。在一种优选的实施方案中，n1＝n2。例如，n1＝n2，并且n1为3、5或7。在一种更优选的实施方案中，所述类肽化合物的分子结构式为：
Figure BDA0002296655930000081
上述类肽化合物能作为探针分子，特异性识别EpCAM蛋白，即该类肽化合物可以结合结直肠腺癌、胃腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、前列腺癌、胰腺癌、干细胞癌、视网膜母细胞癌或者食管原发鳞状细胞癌的标志物EpCAM蛋白，可用于结直肠腺癌、胃腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、前列腺癌、胰腺癌、干细胞癌、视网膜母细胞癌或者食管原发鳞状细胞癌的检测。
本公开的类肽化合物可以通过如下所示的固相合成法合成。固相合成法是本领域技术人员所熟知的，例如，J.Am.Chem.Soc.1992,114,10646-10647报道一种固相合成类肽的方法。
Figure BDA0002296655930000082
上述反应式1中，溴乙酸也可以用溴乙酰氯代替。
本公开至少一实施例还提供一种类肽化合物的制备方法。例如，图1为本公开一实施例提供的类肽化合物的制备方法的流程图，如图1所示，该制备方法包括以下步骤：
步骤S01：按照类肽化合物的亚单位的连接顺序，将类肽化合物的第一个亚单位连接至固相载体上；
步骤S02：将溴乙酸在活化剂的活化下与连接至固相载体上的第一个亚单位的氨基进行反应以形成酰胺键；
步骤S03：将类肽化合物的第二个亚单位的供体与步骤S02得到的产物进行反应，取代掉溴原子，完成第二个亚单位的连接；
步骤S04：重复进行溴乙酸以及后续亚单位的连接，直至完成所有亚单位的连接；
步骤S05：从固相载体上将合成得到的类肽化合物裂解下来得到该类肽化合物。
亚单位的供体是指类肽亚单位的化合物，例如1,4-丁二胺亚单位的供体为1,4-丁二胺、联苯乙胺亚单位的供体为联苯乙胺、3-氨基丙酸亚单位的供体为3-氨基丙酸，β-苯乙胺亚单位的供体为β-苯乙胺。
作为氨基保护基团，可以不受限制地使用本领域中已知用于蛋白、多肽或类肽合成的氨基保护基团，例如Peter G.M.Wuts著的《Greene’s Protective Groups in OrganicSynthesis》第5版中列举的氨基保护基团。在一些实施方式中，氨基保护基团为9-芴甲氧羰基(Fmoc)或叔丁氧羰基(Boc)。例如，在一些实施方式中，氨基保护基团为叔丁氧羰基。例如，Boc(叔丁氧羰基，t-Butyloxy carbonyl)保护的丁二胺作为1,4-丁二胺亚单位的供体。
脱去侧链氨基保护基团与将类肽从树脂上裂解下来可以采用本领域中用于进行蛋白、多肽或类肽合成的常规条件，只要能够实现目的并且不破坏类肽的功能即可。在一种实施方式中，可以采用以体积比计含95％三氟乙酸、2.5％超纯水和2.5％三异丙基硅烷的裂解液在脱去侧链氨基保护基团的同时将类肽从树脂上裂解下来。
例如，为了制备式II的类肽小分子，亚单位供体投入顺序例如为：Boc保护的丁二胺、联苯乙胺、3-氨基丙酸和β-苯乙胺。
例如，固相载体为Rink amide AM树脂。
例如，将类肽的第一个亚单位连接至固相载体上之前将固相载体进行溶胀处理。
例如，当固相载体为Rink amide AM树脂时，将其溶胀，并利用六氢吡啶脱保护使得Rink amide AM树脂裸露出氨基。
例如，类肽的第一个亚单位连接至固相载体上的过程中，在缩合剂和活化剂的作用下进行。
例如，该缩合剂为2-(3'-N-氧代-苯并三唑)-1,1',3,3'-四甲基脲六氟磷酸盐、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸或1-羟基苯并三唑中的任意一种或至少两种的组合。
例如，在步骤S01中使用的活化剂为N-甲基吗啡啉。
例如，在步骤S02中所使用的活化剂为N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)或二环己基碳二亚胺。
例如，步骤S02中反应的温度为20-40℃，例如20℃、21℃、23℃、24℃、25℃、33℃、34℃、36℃、38℃或者40℃。
例如，步骤S02中的反应时间为10-100min，例如10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、50min、60min、70min、80min、90min或者100min。
例如，步骤S03中反应的温度为20-40℃，例如20℃、21℃、23℃、24℃、25℃、33℃、34℃、36℃、38℃或者40℃。
例如，步骤S03中的反应时间为30-180min，例如30min、35min、45min、50min、55min、60min、65min、70min、80min、90min、100min、120min、140min、150min、160min、170min或者180min。
例如，在步骤S04中重复进行溴乙酸以及后续亚单位的连接即重复步骤S04和步骤S03，仅仅是连接的亚单位是后续亚单位。
例如，步骤S05裂解时使用的裂解剂包括质量百分含量如下的成分：质量百分含量分别为95％的三氟乙酸，2.5％的超纯水和2.5％的三异丙基硅烷。
例如，在类肽化合物的制备过程中，可以将不参与连接反应的基团进行基团保护，以确保连接位点的准确性，使反应更加准确而顺利地进行，而后在完成所有亚单位的连接后，再进行脱保护脱除保护基。
例如，通过固相亚单位合成法合成类肽化合物，具体包括以下步骤：
(1)将Rink amide AM树脂(取代水平0.3mmol/g)溶胀后用六氢吡啶脱保护，将半胱氨酸与2-(3'-N-氧代-苯并三唑)-1,1',3,3'-四甲基脲六氟磷酸盐等摩尔混合，在N-甲基吗啡啉的活化下进行偶联；
(2)将10mL浓度为2mol/L的溴乙酸和10mL浓度为3.2mol/L的N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)加入Rink amide AM树脂(多肽合成的起始树脂，取代水平为0.3mmol/g)中，在37℃下反应30min，将树脂末端的氨基酰化；
(3)再加入10mL浓度为2mol/L伯胺在37℃下反应90min，通过亲核取代反应替换掉溴原子，完成一个亚单位的合成；
(4)重复步骤(2)和(3)直至完成其余单位的合成；
(5)待合成完毕后，侧链保护基团被除去，并用质量百分含量分别为95％的三氟乙酸，2.5％的超纯水和2.5％的三异丙基硅烷将类肽化合物从树脂上裂解下来以备用。
例如，在本公开的实施例提供的类肽化合物的制备方法中，还可以视需要包括将所得产物进行纯化的步骤。该纯化的方法没有特殊限制，可以采用本领域中已知的纯化相应类似产物的方法，例如沉淀、过滤、透析、凝胶渗透色谱等。
本公开至少一实施例还提供一种类肽大分子，该类肽大分子的分子结构式为：
Figure BDA0002296655930000111
其中，10≥n1≥3，10≥n2≥3，n1和n2均为自然数。
例如，各亚单位供体的分子结构式如下所示：
Figure BDA0002296655930000112
(1,4-丁二胺)或者Boc保护的1,4-丁二胺，
Figure BDA0002296655930000113
(联苯乙胺)，
Figure BDA0002296655930000114
(3-氨基丙酸)，
Figure BDA0002296655930000115
(β-苯乙胺),
Figure BDA0002296655930000116
(乙二胺)或者Boc保护的乙二胺。
例如，在本公开至少一实施例提供的类肽大分子中，该类肽大分子包含的亚单位按照以下顺序进行排列：[β-苯乙胺亚单位—3-氨基丙酸亚单位—联苯乙胺亚单位—3-氨基丙酸亚单位]n2—β-苯乙胺亚单位—3-氨基丙酸亚单位—1,4-丁二胺亚单位—联苯乙胺亚单位—3-氨基丙酸亚单位—β-苯乙胺亚单位—联苯乙胺亚单位—乙二胺亚单位—[β-苯乙胺亚单位—乙二胺亚单位—联苯乙胺亚单位—乙二胺亚单位]n1。
本公开至少一实施例还提供一种类肽大分子的制备方法，该类肽大分子也是通过固相亚单位的合成法合成，与制备式II的类肽小分子的不同之处在于亚单位供体投入顺序。
例如，该类肽大分子还包括形成在式I的类肽小分子结构左右两侧的助链，该左侧助链上均含有氨基，右侧助链上均含有羧基，该助链有助于该类肽大分子形成二维层状结构，这样可以使得中间的类肽结构暴露在传感器的表面作为探针分子对EpCAM蛋白进行检测，该助链还可以使得该类肽大分子的排列更加整齐。
例如，该类肽大分子的制备过程中各个步骤用到的缩合剂和活化剂可以参见上述类肽化合物的制备过程的相关描述，在此不再赘述。
例如，在该类肽大分子中，n1＝n2＝3，n1＝n2＝4，n1＝n2＝5，n1＝n2＝6，n1＝n2＝7，n1＝n2＝8，n1＝n2＝9，或者n1＝n2＝10。
需要说明的是，当n1和n2小于3时，会出现链长太短无法组装的问题；当n1和n2大于10时，形成的链太长，该类肽大分子中间插入的式I的类肽小分子结构的密度太低，会出现亲和力减弱，从而无法实现与CTC上的EpCAM蛋白特异性结合的问题。
示例一
分子结构为：
Figure BDA0002296655930000131
式ΙV的类肽大分子的制备方法具体包括以下步骤：
(1)将Rink amide AM树脂(多肽合成的起始树脂，取代水平0.3mmol/g)溶胀后用六氢吡啶脱保护，将β-苯乙胺与1-羟基苯并三唑等摩尔混合，在N-甲基吗啡啉的活化下进行偶联；
(2)将10mL浓度为2mol/L的溴乙酸和10mL浓度为3.2mol/L的N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)加入Rink amide AM树脂中，在38℃下反应30min，将树脂末端的氨基酰化；
(3)加入2mol/L伯胺在37℃下反应90min，通过亲核取代反应替换掉溴原子，完成一个亚单位的合成；
(4)重复步骤(2)和(3)直至完成其余单位的合成；
(5)待合成完毕后，侧链保护基团被除去，并用质量百分含量分别为95％的三氟乙酸，2.5％的超纯水和2.5％的三异丙基硅烷将类肽大分子从树脂上裂解下来备用。
形成上述结构的类肽大分子的过程中，亚单位供体投入顺序为：
β-苯乙胺—3-氨基丙酸—联苯乙胺—3-氨基丙酸-β-苯乙胺—3-氨基丙酸—联苯乙胺—3-氨基丙酸-β-苯乙胺—3-氨基丙酸—联苯乙胺—3-氨基丙酸—β-苯乙胺—3-氨基丙酸—Boc保护的1,4-丁二胺—联苯乙胺—3-氨基丙酸—β-苯乙胺—联苯乙胺—Boc保护的乙二胺—β-苯乙胺—Boc保护的乙二胺—联苯乙胺—Boc保护的乙二胺—β-苯乙胺—Boc保护的乙二胺—联苯乙胺—Boc保护的乙二胺—β-苯乙胺—Boc保护的乙二胺—联苯乙胺—Boc保护的乙二胺。
例如，该类肽大分子可以溶解到物质的量之比为二甲基亚砜:水＝2:1的二甲基亚砜(DMSO)和水(H2O)的混合溶液中，使其浓度为2mM。
示例二
分子结构为：
Figure BDA0002296655930000141
的类肽大分子的制备方法具体包括以下步骤：
(1)将Rink amide AM树脂(多肽合成的起始树脂，取代水平0.3mmol/g)溶胀后用六氢吡啶脱保护，将β-苯乙胺与1-羟基苯并三唑等摩尔混合，在N-甲基吗啡啉的活化下进行偶联；
(2)将20mL浓度为2mol/L的溴乙酸和15mL浓度为3.2mol/L的N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)加入Rink amide AM树脂中，在38℃下反应30min，将树脂末端的氨基酰化；
(3)加入2mol/L伯胺在37℃下反应90min，通过亲核取代反应替换掉溴原子，完成一个亚单位的合成；
(4)重复步骤(2)和(3)直至完成其余单位的合成；
(5)待合成完毕后，侧链保护基团被除去，并用质量百分含量分别为95％的三氟乙酸，2.5％的超纯水和2.5％的三异丙基硅烷将类肽大分子从树脂上裂解下来备用。
例如，形成上述结构的类肽大分子的过程中，亚单位供体投入顺序为：
β-苯乙胺—3-氨基丙酸—联苯乙胺—3-氨基丙酸-β-苯乙胺—3-氨基丙酸—联苯乙胺—3-氨基丙酸-β-苯乙胺—3-氨基丙酸—联苯乙胺—3-氨基丙酸-β-苯乙胺—3-氨基丙酸—联苯乙胺—3-氨基丙酸-β-苯乙胺—3-氨基丙酸—联苯乙胺—3-氨基丙酸—β-苯乙胺—3-氨基丙酸—Boc保护的1,4-丁二胺—联苯乙胺—3-氨基丙酸—β-苯乙胺—联苯乙胺—Boc保护的乙二胺—β-苯乙胺—Boc保护的乙二胺—联苯乙胺—Boc保护的乙二胺—β-苯乙胺—Boc保护的乙二胺—联苯乙胺—Boc保护的乙二胺—β-苯乙胺—Boc保护的乙二胺—联苯乙胺—Boc保护的乙二胺—β-苯乙胺—Boc保护的乙二胺—联苯乙胺—Boc保护的乙二胺—β-苯乙胺—Boc保护的乙二胺—联苯乙胺—Boc保护的乙二胺。
例如，该类肽大分子可以溶解到物质的量之比为二甲基亚砜：水＝2:1的二甲基亚砜(DMSO)和水(H2O)的混合溶液中，使其浓度为2mM。
示例三
分子结构为：
Figure BDA0002296655930000151
的类肽大分子的制备方法具体包括以下步骤：
(1)将Rink amide AM树脂(多肽合成的起始树脂，取代水平0.3mmol/g)溶胀后用六氢吡啶脱保护，将β-苯乙胺与1-羟基苯并三唑等摩尔混合，在N-甲基吗啡啉的活化下进行偶联；
(2)将25mL浓度为2mol/L的溴乙酸和22mL浓度为3.2mol/L的N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)加入Rink amide AM树脂中，在38℃下反应30min，将树脂末端的氨基酰化；
(3)加入3mol/L伯胺在37℃下反应90min，通过亲核取代反应替换掉溴原子，完成一个亚单位的合成；
(4)重复步骤(2)和(3)直至完成其余单位的合成；
(5)待合成完毕后，侧链保护基团被除去，并用质量百分含量分别为95％的三氟乙酸，2.5％的超纯水和2.5％的三异丙基硅烷将类肽大分子从树脂上裂解下来备用。
例如，形成上述结构的类肽大分子的过程中，亚单位供体投入顺序为：
β-苯乙胺—3-氨基丙酸—联苯乙胺—3-氨基丙酸-β-苯乙胺—3-氨基丙酸—联苯乙胺—3-氨基丙酸-β-苯乙胺—3-氨基丙酸—联苯乙胺—3-氨基丙酸-β-苯乙胺—3-氨基丙酸—联苯乙胺—3-氨基丙酸-β-苯乙胺—3-氨基丙酸—联苯乙胺—3-氨基丙酸-β-苯乙胺—3-氨基丙酸—联苯乙胺—3-氨基丙酸-β-苯乙胺—3-氨基丙酸—联苯乙胺—3-氨基丙酸—β-苯乙胺—3-氨基丙酸—Boc保护的1,4-丁二胺—联苯乙胺—3-氨基丙酸—β-苯乙胺—联苯乙胺—Boc保护的乙二胺—β-苯乙胺—Boc保护的乙二胺—联苯乙胺—Boc保护的乙二胺—β-苯乙胺—Boc保护的乙二胺—联苯乙胺—Boc保护的乙二胺—β-苯乙胺—Boc保护的乙二胺—联苯乙胺—Boc保护的乙二胺—β-苯乙胺—Boc保护的乙二胺—联苯乙胺—Boc保护的乙二胺—β-苯乙胺—Boc保护的乙二胺—联苯乙胺—Boc保护的乙二胺—β-苯乙胺—Boc保护的乙二胺—联苯乙胺—Boc保护的乙二胺—β-苯乙胺—Boc保护的乙二胺—联苯乙胺—Boc保护的乙二胺。
例如，该类肽大分子可以溶解到物质的量之比为二甲基亚砜：水＝2:1的二甲基亚砜(DMSO)和水(H2O)的混合溶液中，使的类肽大分子的浓度为2mM。
图2为本公开一实施例提供的二维类肽大分子的形成过程示意图，如图2所示，形成二维的类肽大分子的过程为：将本公开的实施例提供的类肽大分子放置于朗格缪尔槽中，该类肽大分子包括亲水的一端和疏水的一端，在无外界作用力的情况下，该类肽大分子无序的排列在气液的界面处；然后对该无序排列的类肽大分子施加外力，该类肽大分子在气液界面处有序地排列；进一步地对该有序排列的类肽大分子施加外力，该类肽大分子被挤压至气液界面之下，在气液界面之下，亲水的一端暴露在外侧，疏水的一端形成在内侧，从而形成二维结构。
图3a为类肽大分子自组装后形成纳米片层结构的示意图。以示例一的式IV的类肽化合物为例说明类肽大分子纳米片层的形成过程如下：将浓度为2mM的类肽大分子溶于10mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，100mM氯化钠，pH＝8.0的溶液中，稀释到片层形成缓冲液，至最终浓度为1-100μM，例如，为20μM，然后采用手动摇晃法：将类肽溶液在室温下稳定存放22小时，然后手动轻轻摇晃30秒，再稳定1分钟，重复摇晃-稳定过程5次；或者机器摇晃法：将类肽溶液在管中自水平至垂直缓慢旋转(0.6rpm)，每隔450秒旋转一次；将得到的类肽纳米片层溶液加入尼罗红，至最终浓度为1μM，将溶液放在1％的琼脂上，使用荧光显微镜(Vert.A1,Carl Zeiss Far East,Germany)观察，结果如图3b所示，可以观察到明显的纳米片层结构。
本公开的实施例提供的类肽化合物的合成过程简单并且与EpCAM蛋白的结合能力较强，能够有效地通过血清中的EpCAM蛋白来对结直肠腺癌、胃腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、前列腺癌、胰腺癌、干细胞癌、视网膜母细胞癌或者食管原发鳞状细胞癌患者和正常人的血清进行筛查，可以特异性地识别结直肠腺癌、胃腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、前列腺癌、胰腺癌、干细胞癌、视网膜母细胞癌或者食管原发鳞状细胞癌CTC表面的EpCAM蛋白，为高灵敏度地捕获相应的CTC提供了有利的保障，例如，可以设计对EpCAM蛋白具有高亲和、高灵敏度的分子探针。
例如，利用表面等离子体共振成像技术分别对类肽大分子和式I的类肽化合物与EpCAM蛋白间结合能力进行测试的步骤如下：
(1)将类肽大分子或式I的类肽化合物溶解到ddH2O中至类肽大分子或式I的类肽化合物的浓度为1-1000μM；
(2)将上述类肽大分子或式I的类肽化合物溶液点在一张3D芯片的表面上，每种样品重复3个点，在4℃下放置12小时后，用10XPBS，1XPBS，超纯水清洗干净，然后将芯片用1M的盐酸氨基乙醇封闭30分钟，然后用超纯水清洗5次，最后用氮气吹干；
(3)将芯片安装在SPRi仪器上，测定SPRi角并调节至最佳光学位置，在检测区域选取相关的检测点，包括样品点与空白点，设置实验流速为2μL/s；
(4)选择PBS为缓冲液通入流通池至基线稳定后依次通过浓度为5.68nM、11.4nM、22.8nM、45.6nM和91.2nM的EpCAM溶液进行检测，结合时间为300秒，解离时间为300秒，每个浓度间通入磷酸进行重生。
图4a为本公开的式IV的类肽大分子与浓度分别为5.68nM、11.4nM、22.8nM、45.6nM和91.2nM的EpCAM蛋白结合的表面等离基元共振检测的结果图，其中，△RU代表流动相通过阵列后的结合信号减去初始PBS缓冲液的基线信号，曲线是PlexArray HT的测试结果，拟合直线是BIAevalution4.1拟合得到，△RU是在表面等离子体共振成像中用来反映结合信号强度的单位，是一种无量纲单位。经拟合，平衡解离常数KD为2.18×10-10摩尔/升，这表明该类肽大分子与EpCAM蛋白具有相当高的亲和力水平。
图4b为本公开的式II的类肽小分子与浓度分别为5.68nM、11.4nM、22.8nM、45.6nM和91.2nM的EpCAM蛋白结合的表面等离基元共振检测的结果图，经拟合，平衡解离常数KD为1.87×10-8摩尔/升。
与式II的类肽小分子相比，式IV的类肽大分子的平衡解离常数由10-8摩尔/升数量级提升到了10-10摩尔/升数量级。这表明本公开的类肽大分子能够有效提高分子探针与靶标蛋白的亲和力，本公开的类肽大分子在发病早期就可进行检测，且无需给病人造成创伤，而且能够有效降低芯片表面的非特异性吸附，检测准确性高，特异性好。此外本公开的类肽大分子合成简单，成本低。
利用表面等离子体共振成像技术测试类肽大分子对结直肠腺癌、胃腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、前列腺癌、胰腺癌、干细胞癌、视网膜母细胞癌或者食管原发鳞状细胞癌患者的血清和正常人的血清进行检测具体步骤如下：
(1)将类肽大分子溶液点在一张3D芯片的表面上，每种样品重复3个点，在4℃下放置12小时后，用10XPBS，1XPBS，超纯水清洗干净，然后将芯片用1M的盐酸氨基乙醇封闭30分钟，然后用超纯水清洗5次，最后用氮气吹干；将上述芯片安装在SPRi仪器上，测定SPRi角并调节至最佳光学位置，在检测区域选取相关检测点，包括样品点与空白点，设置实验流速为2μL/s；
(2)选择PBS为缓冲液通入流通池至基线稳定后，分别通入不同病人与正常人的血清(1:5000)稀释，结合时间为300秒，解离时间为300秒，每个样品间通入磷酸和蛋白酶K进行重生。
根据类肽大分子与表面等离子体共振成像的信号的结合强度，区分结直肠腺癌、胃腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、前列腺癌、胰腺癌、干细胞癌、视网膜母细胞癌或者食管原发鳞状细胞癌患者与正常人。
例如，利用表面等离子体共振成像技术测试结直肠腺癌、胃腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、前列腺癌、胰腺癌、干细胞癌、视网膜母细胞癌或者食管原发鳞状细胞癌诊断系统检测血清的灵敏度，具体步骤如下：(1)将类肽大分子溶于双蒸水中，将该溶液点在一张3D芯片的表面上，每种样品重复3个点，在4℃下放置12小时后，用10XPBS，1XPBS，超纯水清洗干净，然后将芯片用1M的盐酸氨基乙醇封闭30分钟，然后用超纯水清洗5次，最后用氮气吹干；将上述芯片安装在SPRi仪器上，测定SPRi角并调节至最佳光学位置，在检测区域选取相关检测点，包括样品点与空白点，设置实验流速为2μL/s；
(2)选择PBS为缓冲液通入流通池至基线稳定后，分别通入不同病人与正常人的血清稀释液，稀释浓度分别为1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000，结合时间为300秒，解离时间为300秒，每个样品间通入磷酸和蛋白酶K进行重生。
检测结果表明，血清稀释比例小于或等于1:8000时，可以明显区分EpCAM高表达的结直肠腺癌、胃腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、前列腺癌、胰腺癌、干细胞癌、视网膜母细胞癌或者食管原发鳞状细胞癌患者与正常人，展示了其具有极高的灵敏度。
例如芯片为购自美国Plexera Bioscience公司的PlexArray HT 3D芯片。
例如，该类肽大分子在气-液界面上自组装形成表面带有特异性识别EpCAM蛋白的类肽纳米片层，类肽纳米片层作为支架展示和支撑类肽化合物作为分子探针对EpCAM蛋白进行识别。利用该类肽纳米片层，结合表面等离激元共振技术可用于结直肠腺癌、胃腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、前列腺癌、胰腺癌、干细胞癌、视网膜母细胞癌或者食管原发鳞状细胞癌的检测。
例如，该类肽大分子为二维纳米片层材料，这样可以实现类肽大分子耦合在传感器上，并将具有亲和作用的类肽化合物展示在传感器的表面。
本公开至少一实施例还提供一种检测芯片，其中芯片的表面偶联有上述任一种的类肽化合物。例如，检测芯片的表面偶联有上述任一种类肽大分子，优选式IV的类肽大分子。例如，图6示出了类肽纳米片层偶联在检测芯片的表面形成生物层，该生物层位于亲水性的化学层之上。
例如，上述检测芯片可以是微流控芯片。
例如，该微流控芯片包括微阀控制层和微阀薄膜层。该微阀控制层上设有六个贯通控制层的孔以及三条气体通道，该三个孔为加样孔，连通基板，用于样品和试剂流入和流出；其余三个孔分别连接三条气体通道，用于注入气体，控制微阀的开启与闭合。微阀薄膜层上设有三个贯通薄膜层的孔，分别与上述微阀控制层的三个加样孔对应连通。
例如，该微阀控制层和微阀薄膜层的外廓尺寸应与基板相匹配。
本公开的类肽化合物还可以标记了荧光分子。对荧光基团的类型没有特别限制，只要修饰后能够赋予类肽化合物荧光性能并且还能够实现类肽化合物的基本功能即可。根据本公开的类肽化合物可以用一个或多个荧光基团进行修饰。例如，用一个荧光基团修饰得到单荧光标记类肽化合物，或者用两个荧光基团标记得到的双荧光标记类肽化合物。在一些实施方式中，荧光基团可以非限制性地选自蓝色荧光染料、近红外荧光染料，绿色荧光染料等，例如含香豆素荧光基团、含蒽荧光基团、罗丹明荧光基团、菲并咪唑荧光基团、含萘荧光基团、异硫氰酸荧光素、羧基荧光素(FAM)、硫氰酸荧光素(FITC)、丹磺酰氯(dansylchloride)、2,4-二硝基苯(Dnp)、羧基罗丹明110(carbo-xyrhodamine110)、德克萨斯红(Texas Red)、五甲川菁染料(Cy5)和七甲川菁染料(Cy7)等。
上述检测芯片可用于检测或者诊断与EpCAM蛋白相关的疾病。例如所述疾病为结直肠腺癌、胃腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、前列腺癌、胰腺癌、干细胞癌、视网膜母细胞癌或者食管原发鳞状细胞癌。
在不冲突的情况下，本发明的实施方案及实施方案中的特征可以相互组合以得到新的实施方案。本发明的保护范围并不局限于上述的实施方案，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (11)

1.一种类肽化合物，其分子结构式为：
Figure FDA0003790982280000011
2.一种类肽化合物，其分子结构式为：
Figure FDA0003790982280000012
其中，10≥n1≥3，10≥n2≥3，n1和n2均为自然数。
3.根据权利要求2所述的类肽化合物，其中，n1＝n2。
4.根据权利要求3所述的类肽化合物，其中，n1为3、5或7。
5.根据权利要求4所述的类肽化合物，其中，所述类肽化合物的分子结构式为：
Figure FDA0003790982280000013
Figure FDA0003790982280000021
6.一种检测芯片，其中芯片的表面偶联有如权利要求1-5中任一项所述的类肽化合物。
7.根据权利要求6所述的检测芯片，其芯片的表面偶联的类肽化合物是式ΙV所示的类肽化合物，
Figure FDA0003790982280000022
8.根据权利要求6所述的检测芯片，其是微流控芯片。
9.根据权利要求7所述的检测芯片，其是微流控芯片。
10.根据权利要求6-9中任一项所述的检测芯片，其中所述芯片用于检测或者诊断与EpCAM蛋白相关的疾病。
11.根据权利要求10所述的检测芯片，其中，所述疾病为结直肠腺癌、胃腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、前列腺癌、胰腺癌、干细胞癌、视网膜母细胞癌或者食管原发鳞状细胞癌。
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类肽与金属蛋白酶抑制剂类抗肿瘤药物研究进展;宿莉等;《中国科学(B辑:化学)》;20081215;第38卷(第12期);第1043-1058页 *

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