CN110981936B - 类肽化合物及其制备方法、寡聚物、药物组合物和试剂盒 - Google Patents

类肽化合物及其制备方法、寡聚物、药物组合物和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本公开的实施例提供一种类肽化合物、类肽化合物的制备方法、寡聚物、药物组合物、药物组合物在制备检测或者诊断与酪氨酸激酶HER2相关的疾病的药物中的用途以及用于鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒，该类肽化合物包括：半胱氨酸(Cys)亚单位、丁二胺(Nlys)亚单位、3,4‑亚甲二氧基苄胺(Npip)亚单位、3‑氨基丙酸(Nce)亚单位和1‑萘胺亚单位。该类肽化合物和寡聚物与CTC表面的HER2蛋白的结合能力较强，以该类肽化合物为基础的乳腺癌诊断技术能够实现无创无标记的快速诊断，此外，该类肽化合物和寡聚物的合成方法简单，制备效率高，且制作成本低。

Description

类肽化合物及其制备方法、寡聚物、药物组合物和试剂盒
技术领域
本公开的实施例涉及一种类肽化合物、类肽化合物的制备方法、寡聚物、药物组合物、药物组合物在制备检测或者诊断与酪氨酸激酶HER2相关的疾病的药物中的用途以及用于鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒。
背景技术
乳腺癌和卵巢癌是女性患者易患的恶性肿瘤之一，占到了女性癌症的15％，胃癌也是发病率比较高的疾病。针对乳腺癌、卵巢癌和胃癌，目前，临床上多采用抗肿瘤药物进行治疗，例如，细胞毒类化疗药物和抗体等蛋白类药物。但是，细胞毒类化疗药物的选择性差、毒副作用大、容易引起不良反应；抗体等蛋白类药物虽然特异性高、毒副作用小，但由于其分子质量大、结构复杂、容易引起免疫反应和对药物产生依赖性，且其制备工艺复杂以至于价格高昂，难以为普通肿瘤患者所承受。
在癌症发展的早期，可以采用CTC(循环肿瘤细胞)筛选技术对癌症进行诊断。CTC筛选检测需要从血液中捕获出循环肿瘤细胞，该检测过程与捕获器件表面偶联的探针分子有着密不可分的关系，通过探针分子与CTC表面蛋白的亲和作用实现特异性捕获。例如，该分子探针包括抗体、多肽、类肽和核酸适配体等肿瘤部位特定受体蛋白的靶向分子。在各种靶向分子中，类肽小分子具备了很多的优势，例如免疫原性低、组织渗透性好、分子量小、稳定性高、易于修饰且经济等。
发明内容
本公开至少一实施例提供一种类肽化合物，该类肽化合物包括：半胱氨酸(Cys)亚单位、丁二胺(Nlys)亚单位、3,4-亚甲二氧基苄胺(Npip)亚单位、3-氨基丙酸(Nce)亚单位和1-萘胺亚单位。
例如，在本公开至少一实施例提供的类肽化合物中，所述类肽化合物包含的亚单位的顺序为半胱氨酸(Cys)亚单位—丁二胺(Nlys)亚单位—丁二胺(Nlys)亚单位—丁二胺(Nlys)亚单位—3,4-亚甲二氧基苄胺(Npip)亚单位—3-氨基丙酸(Nce)亚单位—1-萘胺亚单位。
例如，在本公开至少一实施例提供的类肽化合物中，所述类肽化合物具有式I所示的结构：
Figure BDA0001815242780000021
本公开至少一实施例还提供一种类肽化合物的制备方法，其中，所述制备方法包括固相合成法合成亚单位。
例如，在本公开至少一实施例提供的制备方法中，所述制备方法包括以下步骤：
(1)按照所述类肽化合物的亚单位的连接顺序，将所述类肽化合物的第一个亚单位连接至固相载体上；
(2)将溴乙酸在活化剂的活化作用下与连接至所述固相载体上的第一个亚单位的氨基进行反应形成酰胺键；
(3)将所述类肽化合物的第二个亚单位的供体与步骤(2)得到的产物进行反应，取代掉溴原子，完成第二个亚单位的连接；
(4)重复进行所述溴乙酸以及后续亚单位的连接，直至完成所有亚单位的连接；
(5)从所述固相载体上将合成得到的类肽化合物裂解下来得到该类肽化合物。
本公开至少一实施例还提供一种寡聚物，其中，所述寡聚物的分子结构式为：
Figure BDA0001815242780000022
其中，10≥n1≥3，10≥n2≥3，n1＝n2，n1和n2均为自然数。
例如，在本公开至少一实施例提供的寡聚物中，所述寡聚物的分子结构式为：
Figure BDA0001815242780000031
本公开至少一实施例还提供一种药物组合物，该药物组合物包括：上述任一种寡聚物；以及药学上接受的辅料。
例如，在本公开至少一实施例提供的药物组合物中，所述辅料为赋形剂、稀释剂、载体、调味剂、粘合剂和填充剂中的任意一种或至少两种的组合。
本公开至少一实施例还提供一种上述任一种药物组合物在制备检测或者诊断与酪氨酸激酶HER2相关的疾病的药物中的用途。
例如，在本公开至少一实施例提供的用途中，所述疾病包括乳腺癌、胃癌和卵巢癌。
本公开至少一实施例还提供一种用于鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒，包括：盒体、设置在所述盒体内的微流控芯片，以及设置在所述盒体内的荧光探针，所述荧光探针为带有荧光标记的如上任一种寡聚物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅涉及本发明的一些实施例，而非对本发明的限制。
图1为本公开一实施例提供的一种类肽化合物的制备方法的流程图；
图2为本公开一实施例提供的一种寡聚物的制备方法的流程图；
图3为本公开一实施例提供的二维寡聚物的形成过程示意图；
图4a为本公开一实施例提供的一种寡聚物的原子力显微图像；
图4b为本公开一实施例提供的另一种寡聚物的原子力显微图像；以及
图5为本公开一实施例提供的一种寡聚物与浓度为2.2μM、4.6×10-1μM、9.1×10-2μM、1.8×10-2μM和3.6×10-3μM的HER2蛋白结合的表面等离基元共振检测的结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另外定义，本公开使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本公开中使用的“第一”、“第二”以及类似的词语并不表示任何顺序、数量或者重要性，而只是用来区分不同的组成部分。“包括”或者“包含”等类似的词语意指出现该词前面的要素涵盖出现在该词后面列举的要素及其等同，而不排除其他要素。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的SPRi仪器为Plexera Kx5V2，Plexera Bioscience LLC,USA，该仪器主要装配有660nmLED光源、CCD图像采集器和带微流通道的传感芯片，仪器显示每个监测点上反射光强度随时间的变化并记录为SPR曲线。
除非特殊说明，本文中的“μM”指的是“μmol/L”，“mM”指的是“mmol/L”。
由于肿瘤具有异质性，对于癌细胞已发生转移的患者而言，仅仅取某个部位的肿瘤组织并不足以反映患者整体的状况，然而对患者体内所有的肿瘤组织都取样又不切实际，因此，组织活检技术具有一定的局限性。液体活检技术不需要取出患者体内的肿瘤组织，只需要取出患者的血液或者分泌物即可进行检测，因此，研究者们对于液体活检技术的关注和研究越来越多。液体活检技术包括采用类肽化合物对循环肿瘤细胞(CTCs)、循环肿瘤DNA(ctDNA)和外泌体(Exosome)等进行检测。
循环肿瘤细胞(CTC,Circulating Tumor Cell)是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称，因自发或者诊疗操作从实体瘤病灶(原发灶、转移灶)脱落，大部分CTC进入外周血后发生凋亡或者被吞噬，少数能够逃逸并发展成为转移灶，增加恶性肿瘤患者死亡风险。CTC存在与否及数量的多少是癌症进展和转移的重要指标，检测和跟踪外周血中CTC的数量有助于对患者进行早期筛查、疗效监控、预后判断和复发预测。
针对CTCs的检测技术能够预测早期肿瘤的发生，又能够在患者采用药物进行治疗的过程中对肿瘤转移的情况进行检测，此外，还能对后续的治疗进行指导用药。CTCs来源于原发肿瘤或者转移肿瘤，CTCs脱离基底膜之后可以进入血管中。由于CTCs在血液中的含量极低，且其尺寸与白细胞的尺寸相近，这样就导致CTCs很难采用液体活检技术进行检测。但是，CTCs的表面带有相关癌症特异性高表达的蛋白。例如，人表皮生长因子受体(Humanepithelial growth factor receptor，简称HER)包括EGFR/ErbB1/HER1，ErbB2/HER2，ErbB3/HER3和ErbB4/HER4，其中，人表皮生长因子受体-2(HER2)高表达乳腺癌是最主要的一类乳腺癌，HER2高表达的卵巢癌和胃癌也很常见，因此，通过特异性地识别HER2高表达的乳腺癌、卵巢癌和胃癌患者CTC表面的HER2蛋白为高灵敏度地捕获相应的CTC提供了有利的保障，例如，可以设计对HER2蛋白具有高亲和、高灵敏度的分子探针。
类肽小分子具有免疫原性低、组织渗透性好、分子量小、稳定性高、易于修饰且制造成本低等特点，但是，在分子探针的应用上，类肽小分子和生物传感器的结合能力不强，从而导致类肽小分子无法作为探针分子；抗体具有与生物传感器紧密结合的特点，但是，抗体分子的排列是无序的，其在传感器表面的排布方向随机难以控制，从而导致其特异性较低，且抗体的成本较高。本公开的发明人发现，由类肽小分子和类抗体形成的寡聚物能够很好地结合类肽小分子和抗体的特点，即该寡聚物既具有抗体的与生物传感器结合紧密的特点，又可以将类肽小分子有序地形成在传感器的表面，此外，该寡聚物形成的分子探针与肿瘤细胞的亲和作用强，且该寡聚物不能被酶解，能够保证天然活体样本的活性。
类肽(peptoid)与多肽相比，多肽以α氨基酸为结构单元，类肽以N-取代甘氨酸为结构单元。类肽化合物具有良好的生物活性和药理性质，它能够有效地检测或者抑制活体实验中的恶化情况并且具有良好的细胞膜穿透性。目前，已有成熟的类肽合成技术为“亚单位合成”技术。
本公开至少一实施例提供一种类肽化合物，该类肽化合物包括：半胱氨酸(Cys)亚单位、丁二胺(Nlys)亚单位、3,4-亚甲二氧基苄胺(Npip)亚单位、3-氨基丙酸(Nce)亚单位和1-萘胺亚单位。
例如，各亚单位的分子结构式如下所示：
Figure BDA0001815242780000061
(半胱氨酸，Cys),
Figure BDA0001815242780000062
(丁二胺，Nlys),
Figure BDA0001815242780000063
(3-氨基丙酸，Nce),
Figure BDA0001815242780000064
(3,4-亚甲二氧基苄胺，Npip)，
Figure BDA0001815242780000065
(1-萘胺)。
例如，在本公开至少一实施例提供的类肽化合物中，该类肽化合物包含的亚单位按照以下顺序进行排列：半胱氨酸(Cys)亚单位—丁二胺(Nlys)亚单位—丁二胺(Nlys)亚单位—丁二胺(Nlys)亚单位—3,4-亚甲二氧基苄胺(Npip)亚单位—3-氨基丙酸(Nce)亚单位—1-萘胺亚单位。
例如，该类肽化合物具有式I所示的结构：
Figure BDA0001815242780000071
例如，该类肽化合物能作为探针分子特异性识别HER2蛋白，即该类肽化合物可以结合乳腺癌的标志物HER2蛋白，可用于乳腺癌的检测。
本公开至少一实施例还提供一种类肽化合物的制备方法，该制备方法包括固相合成法合成亚单位。
例如，图1为本公开一实施例提供的类肽化合物的制备方法的流程图，如图1所示，该制备方法包括以下步骤：
步骤S01：按照类肽化合物的亚单位的连接顺序，将类肽化合物的第一个亚单位连接至固相载体上；
步骤S02：将溴乙酸在活化剂的活化下与连接至固相载体上的第一个亚单位的氨基进行反应以形成酰胺键；
步骤S03：将类肽化合物的第二个亚单位的供体与步骤S02得到的产物进行反应，取代掉溴原子，完成第二个亚单位的连接；
步骤S04：重复进行溴乙酸以及后续亚单位的连接，直至完成所有亚单位的连接，其中，亚单位投入顺序为：半胱氨酸(Cys)、Boc(叔丁氧羰基，t-Butyloxy carbonyl)保护的丁二胺(Nlys)、Boc保护的丁二胺(Nlys)、Boc保护的丁二胺(Nlys)、3,4-亚甲二氧基苄胺(Npip)、3-氨基丙酸(Nce)和1-萘胺。
步骤S05：从固相载体上将合成得到的类肽化合物裂解下来得到该类肽化合物。
例如，固相载体为Rink amide AM树脂。
例如，将类肽的第一个亚单位连接至固相载体上之前将固相载体进行溶胀处理。
例如，当固相载体为Rink amide AM树脂时，将其溶胀，并利用六氢吡啶脱保护使得Rink amide AM树脂裸露出氨基。
例如，类肽的第一个亚单位连接至固相载体上的过程中，在缩合剂和活化剂的作用下进行。
例如，该缩合剂为2-(3'-N-氧代-苯并三唑)-1,1',3,3'-四甲基脲六氟磷酸盐、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸或1-羟基苯并三唑中的任意一种或至少两种的组合。
例如，在步骤S01中使用的活化剂为N-甲基吗啡啉。
例如，在步骤S02中所使用的活化剂为N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)或二环己基碳二亚胺。
例如，步骤S02中反应的温度为20-40℃，例如20℃、21℃、23℃、24℃、25℃、33℃、34℃、36℃、38℃或者40℃。
例如，步骤S02中的反应时间为10-100min，例如10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、50min、60min、70min、80min、90min或者100min。
例如，步骤S03中的供体是指类肽亚单位的化合物，例如半胱氨酸亚单位的供体为半胱氨酸，丁二胺亚单位的供体为丁二胺、3,4-亚甲二氧基苄胺亚单位的供体为3,4-亚甲二氧基苄胺、3-氨基丙酸亚单位的供体为3-氨基丙酸，1-萘胺亚单位的供体为1-萘胺。
例如，步骤S03中反应的温度为20-40℃，例如20℃、21℃、23℃、24℃、25℃、33℃、34℃、36℃、38℃或者40℃。
例如，步骤S03中的反应时间为30-180min，例如30min、35min、45min、50min、55min、60min、65min、70min、80min、90min、100min、120min、140min、150min、160min、170min或者180min。
例如，在步骤S04中重复进行溴乙酸以及后续亚单位的连接即重复步骤S04和步骤S03，仅仅是连接的亚单位是后续亚单位。
例如，步骤S05裂解时使用的裂解剂包括质量百分含量如下的成分：质量百分含量分别为95％的三氟乙酸，2.5％的超纯水和2.5％的三异丙基硅烷。
例如，在类肽化合物的制备过程中，可以将不参与连接反应的基团进行基团保护，以确保连接位点的准确性，使反应更加准确而顺利地进行，而后在完成所有亚单位的连接后，再进行脱保护脱除保护基。
例如，通过固相亚单位合成法合成类肽化合物，具体包括以下步骤：
(1)将Rink amide AM树脂(取代水平0.3mmol/g)溶胀后用六氢吡啶脱保护，将半胱氨酸与2-(3'-N-氧代-苯并三唑)-1,1',3,3'-四甲基脲六氟磷酸盐等摩尔混合，在N-甲基吗啡啉的活化下进行偶联；
(2)将10mL浓度为2mol/L的溴乙酸和10mL浓度为3.2mol/L的N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)加入Rink amide AM树脂(多肽合成的起始树脂，取代水平为0.3mmol/g)中，在37℃下反应30min，将树脂末端的氨基酰化；
(3)再加入10mL浓度为2mol/L伯胺在37℃下反应90min，通过亲核取代反应替换掉溴原子，完成一个亚单位的合成；
(4)重复步骤(2)和(3)直至完成其余单位的合成；
(5)待合成完毕后，侧链保护基团被除去，并用质量百分含量分别为95％的三氟乙酸，2.5％的超纯水和2.5％的三异丙基硅烷将类肽化合物从树脂上裂解下来以备用。
例如，在本公开的实施例提供的类肽化合物的制备方法中，还可以视需要包括将所得产物进行纯化的步骤。该纯化的方法没有特殊限制，可以采用本领域中已知的纯化相应类似产物的方法，例如沉淀、过滤、透析、凝胶渗透色谱等。
本公开至少一实施例还提供一种寡聚物，该寡聚物的分子结构式为：
Figure BDA0001815242780000091
其中，10≥n1≥3，10≥n2≥3，n1＝n2，n1和n2均为自然数。
例如，该寡聚物包括：β-苯乙胺亚单位、联苯乙胺亚单位、半胱氨酸(Cys)亚单位、丁二胺(Nlys)亚单位、3,4-亚甲二氧基苄胺(Npip)亚单位、3-氨基丙酸(Nce)亚单位、1-萘胺亚单位和乙二胺亚单位。
例如，各亚单位的分子结构式如下所示：
Figure BDA0001815242780000101
(β-苯乙胺),
Figure BDA0001815242780000102
(联苯乙胺),
Figure BDA0001815242780000103
(半胱氨酸，Cys),
Figure BDA0001815242780000104
(丁二胺，Nlys),
Figure BDA0001815242780000105
(3-氨基丙酸，Nce),
Figure BDA0001815242780000106
(乙二胺)
Figure BDA0001815242780000107
(3,4-亚甲二氧基苄胺，Npip)，
Figure BDA0001815242780000111
(1-萘胺)。
例如，在本公开至少一实施例提供的寡聚物中，该寡聚物包含的亚单位按照以下顺序进行排列：[β-苯乙胺亚单位—3-氨基丙酸亚单位—联苯乙胺亚单位—3-氨基丙酸亚单位]n2—β-苯乙胺亚单位—半胱氨酸(Cys)亚单位—丁二胺(Nlys)亚单位—丁二胺(Nlys)亚单位—丁二胺(Nlys)亚单位—3,4-亚甲二氧基苄胺(Npip)亚单位—3-氨基丙酸(Nce)亚单位—1-萘胺亚单位—联苯乙胺亚单位—乙二胺亚单位—[β-苯乙胺亚单位—乙胺亚单位—联苯乙胺亚单位—乙胺亚单位]n1。
本公开至少一实施例还提供一种寡聚物的制备方法，该寡聚物通过固相亚单位的合成法合成。
例如，图2为本公开一实施例提供的类肽化合物的制备方法的流程图，如图2所示，该制备方法包括以下步骤：
步骤S11：按照该寡聚物的亚单位的连接顺序，将寡聚物的第一个亚单位连接至固相载体上；
步骤S12：将溴乙酸在活化剂的活化下与连接至固相载体上的第一个亚单位的氨基反应形成酰胺键；
步骤S13：将类肽化合物的第二个亚单位的供体与步骤S12得到的产物进行反应，取代掉溴原子，完成第二个亚单位的连接；
步骤S14：重复进行溴乙酸以及后续亚单位的连接，直至完成所有亚单位的连接；
步骤S15：从固相载体上将合成得到的寡聚物裂解下来得到该类肽化合物。
例如，该寡聚物包括上述任一项类肽化合物，还包括形成在该类肽化合物左右两侧的助链，该左侧助链上均含有氨基，右侧助链上均含有羧基，该助链有助于该寡聚物形成二维层状结构，这样可以使得中间的类肽化合物暴露在传感器的表面作为探针分子对HER2蛋白进行检测，该助链还可以使得该寡聚物的排列更加整齐。
例如，该寡聚物的制备过程中各个步骤用到的缩合剂和活化剂可以参见上述类肽化合物的制备过程的相关描述，在此不再赘述。
例如，在该寡聚物中，n1＝n2＝3，n1＝n2＝4，n1＝n2＝6，n1＝n2＝8，或者n1＝n2＝10。
需要说明的是，当n1和n2小于3时，会出现链长太短无法组装的问题；当n1和n2大于10时，形成的链太长，该寡聚物中间插入的类肽化合物的密度太低，会出现亲和力减弱，从而无法实现与CTCs上的HER2蛋白特异性结合的问题。
示例一
分子结构为：
Figure BDA0001815242780000121
的寡聚物的制备方法具体包括以下步骤：
(1)将Rink amide AM树脂(多肽合成的起始树脂，取代水平0.3mmol/g)溶胀后用六氢吡啶脱保护，将β-苯乙胺与1-羟基苯并三唑等摩尔混合，在N-甲基吗啡啉的活化下进行偶联；
(2)将10mL浓度为2mol/L的溴乙酸和10mL浓度为3.2mol/L的N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)加入Rink amide AM树脂中，在38℃下反应30min，将树脂末端的氨基酰化；
(3)加入2mol/L伯胺在37℃下反应90min，通过亲核取代反应替换掉溴原子，完成一个亚单位的合成；
(4)重复步骤(2)和(3)直至完成其余单位的合成；
(5)待合成完毕后，侧链保护基团被除去，并用质量百分含量分别为95％的三氟乙酸，2.5％的超纯水和2.5％的三异丙基硅烷将寡聚物从树脂上裂解下来备用。
形成上述结构的寡聚物的过程中，亚单位投入顺序为：
β-苯乙胺、3-氨基丙酸、联苯乙胺、3-氨基丙酸；β-苯乙胺、3-氨基丙酸、联苯乙胺、3-氨基丙酸；β-苯乙胺、3-氨基丙酸、联苯乙胺、3-氨基丙酸；β-苯乙胺、半胱氨酸(Cys)、Boc保护的丁二胺(Nlys)、Boc保护的丁二胺(Nlys)、Boc保护的丁二胺(Nlys)、3,4-亚甲二氧基苄胺(Npip)、3-氨基丙酸(Nce)、1-萘胺、联苯乙胺、Boc保护的乙二胺；β-苯乙胺、Boc保护的乙二胺、联苯乙胺、Boc保护的乙二胺；β-苯乙胺、Boc保护的乙二胺、联苯乙胺、Boc保护的乙二胺；β-苯乙胺、Boc保护的乙二胺、联苯乙胺、Boc保护的乙二胺。
例如，该寡聚物可以溶解到物质的量之比为二甲基亚砜：水＝2:1的二甲基亚砜(DMSO)和水(H2O)的混合溶液中，使其浓度为2mM。
示例二
分子结构为：
Figure BDA0001815242780000131
的寡聚物的制备方法具体包括以下步骤：
(1)将Rink amide AM树脂(多肽合成的起始树脂，取代水平0.3mmol/g)溶胀后用六氢吡啶脱保护，将β-苯乙胺与1-羟基苯并三唑等摩尔混合，在N-甲基吗啡啉的活化下进行偶联；
(2)将20mL浓度为2mol/L的溴乙酸和15mL浓度为3.2mol/L的N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)加入Rink amide AM树脂中，在38℃下反应30min，将树脂末端的氨基酰化；
(3)加入2mol/L伯胺在37℃下反应90min，通过亲核取代反应替换掉溴原子，完成一个亚单位的合成；
(4)重复步骤(2)和(3)直至完成其余单位的合成；
(5)待合成完毕后，侧链保护基团被除去，并用质量百分含量分别为95％的三氟乙酸，2.5％的超纯水和2.5％的三异丙基硅烷将寡聚物从树脂上裂解下来备用。
例如，形成上述结构的寡聚物的过程中，亚单位投入顺序为：
β-苯乙胺、3-氨基丙酸、联苯乙胺、3-氨基丙酸；β-苯乙胺、3-氨基丙酸、联苯乙胺、3-氨基丙酸；β-苯乙胺、3-氨基丙酸、联苯乙胺、3-氨基丙酸；β-苯乙胺、3-氨基丙酸、联苯乙胺、3-氨基丙酸；β-苯乙胺、3-氨基丙酸、联苯乙胺、3-氨基丙酸；β-苯乙胺、半胱氨酸(Cys)、Boc保护的丁二胺(Nlys)、Boc保护的丁二胺(Nlys)、Boc保护的丁二胺(Nlys)、3,4-亚甲二氧基苄胺(Npip)、3-氨基丙酸(Nce)、1-萘胺、联苯乙胺、Boc保护的乙二胺；β-苯乙胺、Boc保护的乙二胺、联苯乙胺、Boc保护的乙二胺；β-苯乙胺、Boc保护的乙二胺、联苯乙胺、Boc保护的乙二胺；β-苯乙胺、Boc保护的乙二胺、联苯乙胺、Boc保护的乙二胺；β-苯乙胺、Boc保护的乙二胺、联苯乙胺、Boc保护的乙二胺；β-苯乙胺、Boc保护的乙二胺、联苯乙胺、Boc保护的乙二胺。
例如，该寡聚物可以溶解到物质的量之比为二甲基亚砜：水＝2:1的二甲基亚砜(DMSO)和水(H2O)的混合溶液中，使其浓度为2mM。
示例三
分子结构为：
Figure BDA0001815242780000141
的寡聚物的制备方法具体包括以下步骤：
(1)将Rink amide AM树脂(多肽合成的起始树脂，取代水平0.3mmol/g)溶胀后用六氢吡啶脱保护，将β-苯乙胺与1-羟基苯并三唑等摩尔混合，在N-甲基吗啡啉的活化下进行偶联；
(2)将25mL浓度为2mol/L的溴乙酸和22mL浓度为3.2mol/L的N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)加入Rink amide AM树脂中，在38℃下反应30min，将树脂末端的氨基酰化；
(3)加入3mol/L伯胺在37℃下反应90min，通过亲核取代反应替换掉溴原子，完成一个亚单位的合成；
(4)重复步骤(2)和(3)直至完成其余单位的合成；
(5)待合成完毕后，侧链保护基团被除去，并用质量百分含量分别为95％的三氟乙酸，2.5％的超纯水和2.5％的三异丙基硅烷将寡聚物从树脂上裂解下来备用。
例如，形成上述结构的寡聚物的过程中，亚单位投入顺序为：
β-苯乙胺、3-氨基丙酸、联苯乙胺、3-氨基丙酸；β-苯乙胺、3-氨基丙酸、联苯乙胺、3-氨基丙酸；β-苯乙胺、3-氨基丙酸、联苯乙胺、3-氨基丙酸；β-苯乙胺、3-氨基丙酸、联苯乙胺、3-氨基丙酸；β-苯乙胺、3-氨基丙酸、联苯乙胺、3-氨基丙酸；β-苯乙胺、3-氨基丙酸、联苯乙胺、3-氨基丙酸；β-苯乙胺、3-氨基丙酸、联苯乙胺、3-氨基丙酸；β-苯乙胺、半胱氨酸(Cys)、Boc保护的丁二胺(Nlys)、Boc保护的丁二胺(Nlys)、Boc保护的丁二胺(Nlys)、3,4-亚甲二氧基苄胺(Npip)、3-氨基丙酸(Nce)、1-萘胺、联苯乙胺、Boc保护的乙二胺；β-苯乙胺、Boc保护的乙二胺、联苯乙胺、Boc保护的乙二胺；β-苯乙胺、Boc保护的乙二胺、联苯乙胺、Boc保护的乙二胺；β-苯乙胺、Boc保护的乙二胺、联苯乙胺、Boc保护的乙二胺；β-苯乙胺、Boc保护的乙二胺、联苯乙胺、Boc保护的乙二胺；β-苯乙胺、Boc保护的乙二胺、联苯乙胺、Boc保护的乙二胺；β-苯乙胺、Boc保护的乙二胺、联苯乙胺、Boc保护的乙二胺；β-苯乙胺、Boc保护的乙二胺、联苯乙胺、Boc保护的乙二胺。
例如，该寡聚物可以溶解到物质的量之比为二甲基亚砜：水＝2:1的二甲基亚砜(DMSO)和水(H2O)的混合溶液中，使的寡聚物的浓度为2mM。
本公开的实施例提供的寡聚物的合成过程简单并且与HER2蛋白的结合能力较强，能够有效地通过血清中的HER2蛋白来对乳腺癌患者和正常人的血清进行筛查，可以特异性地识别乳腺癌CTC表面的HER2蛋白为高灵敏度地捕获相应的CTC提供了有利的保障，例如，可以设计对HER2蛋白具有高亲和、高灵敏度的分子探针。
例如，利用表面等离子体共振成像技术对寡聚物与HER2蛋白间结合能力进行测试的步骤如下：
(1)将寡聚物溶解到ddH2O中至寡聚物的浓度为1-1000μM；
(2)将上述寡聚物溶液点在一张3D芯片的表面上，每种样品重复3个点，在4℃下放置12小时后，用10XPBS，1XPBS，超纯水清洗干净，然后将芯片用1M的盐酸氨基乙醇封闭30分钟，然后用超纯水清洗5次，最后用氮气吹干；
(3)将芯片安装在SPRi仪器上，测定SPRi角并调节至最佳光学位置，在检测区域选取相关的检测点，包括样品点与空白点，设置实验流速为2μL/s；
(4)选择PBS为缓冲液通入流通池至基线稳定后依次通过浓度为2.2μM、4.6×10-1μM、9.1×10-2μM、1.8×10-2μM和3.6×10-3μM进行检测，结合时间为300秒，解离时间为300秒，每个浓度间通入磷酸进行重生。
例如，图3为本公开一实施例提供的二维寡聚物的形成过程示意图，如图3所示，形成二维的寡聚物的过程为：将本公开的实施例提供的寡聚物放置于朗格缪尔槽中，该寡聚物包括亲水的一端和疏水的一端，在无外界作用力的情况下，该寡聚物无序的排列在气液的界面处；然后对该无序排列的寡聚物施加外力，该寡聚物在气液界面处有序地排列；进一步地对该有序排列的寡聚物施加外力，该寡聚物被挤压至气液界面之下，在气液界面之下，亲水的一端暴露在外侧，疏水的一端形成在内侧，从而形成二维结构。
寡聚物纳米片层的形成的形成过程如下：将以上示例一至示例三中任一示例得到的浓度为2mM的寡聚物溶于10mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，100mM氯化钠，pH＝8.0的溶液中，稀释到片层形成缓冲液，至最终浓度为1-100μM，例如，为20μM，然后采用手动摇晃法：将类肽溶液在室温下稳定存放22小时，然后手动轻轻摇晃30秒，再稳定1分钟，重复摇晃-稳定过程5次；或者机器摇晃法：将类肽溶液在管中自水平至垂直缓慢旋转(0.6rpm)，每隔450秒旋转一次；将得到的类肽纳米片层溶液加入尼罗红，至最终浓度为1μM，将溶液放在1％的琼脂上，使用荧光显微镜(Vert.A1,Carl Zeiss Far East,Germany)观察，结果如图4a和图4b所示，可以观察到明显的纳米片层结构。
例如，图5为本公开的示例一中的寡聚物与浓度分别为2.2μM、4.6×10-1μM、9.1×10-2μM、1.8×10-2μM和3.6×10-3μM的HER2蛋白结合的表面等离基元共振检测的结果图，其中，△RU代表流动相通过阵列后的结合信号减去初始PBS缓冲液的基线信号，曲线是PlexArray HT的测试结果，拟合直线是BIAevalution 4.1拟合得到，△RU是在表面等离子体共振成像中用来反映结合信号强度的单位，是一种无量纲单位，经拟合，平衡解离常数KD为3.76×10-10摩尔/升，这表明该寡聚物与HER2蛋白具有相当高的亲和力水平。
利用表面等离子体共振成像技术测试寡聚物对乳腺癌病人、胃癌病人或者卵巢癌病人的血清和正常人的血清进行检测具体步骤如下：
(1)将寡聚物溶液点在一张3D芯片的表面上，每种样品重复3个点，在4℃下放置12小时后，用10XPBS，1XPBS，超纯水清洗干净，然后将芯片用1M的盐酸氨基乙醇封闭30分钟，然后用超纯水清洗5次，最后用氮气吹干；将上述芯片安装在SPRi仪器上，测定SPRi角并调节至最佳光学位置，在检测区域选取相关检测点，包括样品点与空白点，设置实验流速为2μL/s；
(2)选择PBS为缓冲液通入流通池至基线稳定后，分别通入不同病人与正常人的血清(1:5000)稀释，结合时间为300秒，解离时间为300秒，每个样品间通入磷酸和蛋白酶K进行重生。
根据寡聚物与表面等离子体共振成像的信号的结合强度，区分乳腺癌病人、胃癌病人或者卵巢癌病人与正常人。
例如，利用表面等离子体共振成像技术测试该乳腺癌诊断系统检测血清的灵敏度，具体步骤如下：
(1)将寡聚物溶液点在一张3D芯片的表面上，每种样品重复3个点，在4℃下放置12小时后，用10XPBS，1XPBS，超纯水清洗干净，然后将芯片用1M的盐酸氨基乙醇封闭30分钟，然后用超纯水清洗5次，最后用氮气吹干；将上述芯片安装在SPRi仪器上，测定SPRi角并调节至最佳光学位置，在检测区域选取相关检测点，包括样品点与空白点，设置实验流速为2μL/s；
(2)选择PBS为缓冲液通入流通池至基线稳定后，分别通入不同病人与正常人的血清稀释液，稀释浓度分别为1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000，结合时间为300秒，解离时间为300秒，每个样品间通入磷酸和蛋白酶K进行重生。
检测结果表明，血清稀释比例小于或等于1:8000时，可以明显区分HER2高表达的乳腺癌、卵巢癌、胃癌病人与正常人，展示了其具有极高的灵敏度。
例如，该芯片为购自美国Plexera Bioscience公司的PlexArray HT 3D芯片。
例如，该寡聚物在气-液界面上自组装形成表面带有特异性识别HER2蛋白的类肽纳米片层，类肽纳米片层作为支架展示和支撑类肽化合物作为分子探针对HER2蛋白进行识别。利用该类肽纳米片层，结合表面等离激元共振技术可用于乳腺癌的检测。
例如，该寡聚物为二维纳米片层材料，这样可以实现寡聚物耦合在传感器上，并将具有亲和作用的类肽化合物展示在传感器的表面。
二维的类肽纳米材料在生物学和电子学上扮演着越来越重要的角色，例如传感、模板的生长和过滤以及作为蛋白质的模拟物测试蛋白质的分子识别和催化能力。通过朗缪尔槽实验装置揭示了类肽纳米片层的形成是一个类肽分子的自组装和把外界机械能转换为类肽分子化学能的一个不寻常的热力学平衡过程。
例如，该药物组合物还包括：上述任一项所述的寡聚物；以及药学上接受的辅料。
例如，该辅料包括赋形剂、稀释剂、载体、调味剂、粘合剂和填充剂中的任意一种或至少两种的组合。
例如，赋形剂可以例如是乳剂或油性混悬剂，或聚亚烷二醇类如聚丙二醇。
本公开至少一实施例还提供一种上述任一项药物组合物在制备检测或者诊断与酪氨酸激酶HER2相关的疾病的药物中的用途。
例如，该疾病包括乳腺癌、胃癌和卵巢癌。
本公开至少一实施例还提供一种用于鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒，包括：盒体、设置在所述盒体内的微流控芯片，以及设置在所述盒体内的荧光探针，所述荧光探针为带有荧光标记的如上任一项所述的寡聚物。
例如，该微流控芯片包括微阀控制层和微阀薄膜层。该微阀控制层上设有六个贯通控制层的孔以及三条气体通道，该三个孔为加样孔，连通基板，用于样品和试剂流入和流出；其余三个孔分别连接三条气体通道，用于注入气体，控制微阀的开启与闭合。微阀薄膜层上设有三个贯通薄膜层的孔，分别与上述微阀控制层的三个加样孔对应连通。
例如，该微阀控制层和微阀薄膜层的外廓尺寸应与基板相匹配。
例如，荧光探针用于鉴定细胞，本公开的实施例中带有荧光的分子探针是标记了荧光分子的寡聚物。
例如，对荧光基团的类型没有特别限制，只要修饰后能够赋予寡聚物荧光性能并且还能够实现寡聚物的基本功能即可。根据本公开的实施例中的寡聚物可以用一个或多个荧光基团进行修饰。例如，用一个荧光基团修饰得到单荧光标记寡聚物，或者用两个荧光基团标记得到的双荧光标记寡聚物。在一些实施方式中，荧光基团可以非限制性地选自蓝色荧光染料、近红外荧光染料，绿色荧光染料等，例如含香豆素荧光基团、含蒽荧光基团、罗丹明荧光基团、菲并咪唑荧光基团、含萘荧光基团、异硫氰酸荧光素、羧基荧光素(FAM)、硫氰酸荧光素(FITC)、丹磺酰氯(dansyl chloride)、2,4-二硝基苯(Dnp)、羧基罗丹明110(carbo-xyrhodamine110)、德克萨斯红(Texas Red)、五甲川菁染料(Cy5)和七甲川菁染料(Cy7)等。
例如，除了微流控芯片和荧光探针(Probe)之外，该试剂盒还可以包括荧光显微镜(荧光成像系统)、自主开发的图像分析软件(分析计数系统)、泵构成完整的系统，完成对血液样品的处理和循环肿瘤细胞的分离和计数。
例如，荧光显微镜用于检测微V形定位阵列中的细胞是否有荧光，并对该功能区进行全覆盖荧光成像，获取多通道荧光图像。
例如，自主开发的图像处理软件用于分析荧光显微镜获取的图像并获得相应的CTC数量。该软件通过对图像中细胞的大小、面积、长宽比、圆度等参数进行精确计算，筛选出符合要求的CTC，并对CTC进行计数。根据自主编写的算法对定位细胞进行筛选鉴定，鉴定出符合标记荧光特性的循环肿瘤细胞，并进行计数，报告细胞位置和放大细胞图像。
本公开的实施例提供一种类肽化合物、类肽化合物的制备方法、寡聚物、药物组合物、药物组合物在制备检测或者诊断与酪氨酸激酶HER2相关的疾病的药物中的用途以及用于鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒，具有以下至少一项
有益效果：
(1)在本公开至少一实施例提供的寡聚物中，寡聚物与CTC表面的HER2蛋白的结合能力较强，通过表面等离基元共振技术得到该寡聚物与HER2蛋白的结合动力学常数中的平衡解离常数KD为10-10摩尔/升数量级；
(2)在本公开至少一实施例提供的寡聚物中，利用表面等离基元共振技术检测寡聚物对乳腺癌病人与正常人的血液信号强度对比，可发现利用此寡聚物可以明显鉴别病人与正常人；
(3)在本公开至少一实施例提供的寡聚物中，以该寡聚物为基础的乳腺癌诊断诊断技术能够实现无创无标记的快速诊断；
(4)本公开至少一实施例提供的类肽化合物和寡聚物的合成方法简单，制备的效率高，且制作成本低。
有以下几点需要说明：
(1)本发明实施例附图只涉及到与本发明实施例涉及到的结构，其他结构可参考通常设计。
(2)为了清晰起见，在用于描述本发明的实施例的附图中，层或区域的厚度被放大或缩小，即这些附图并非按照实际的比例绘制。
(3)在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合以得到新的实施例。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种类肽化合物，其由半胱氨酸(Cys)亚单位、丁二胺(Nlys)亚单位、3,4-亚甲二氧基苄胺(Npip)亚单位、3-氨基丙酸(Nce)亚单位和1-萘胺亚单位组成，其中，所述类肽化合物包含的亚单位的顺序为半胱氨酸(Cys)亚单位—丁二胺(Nlys)亚单位—丁二胺(Nlys)亚单位—丁二胺(Nlys)亚单位—3,4-亚甲二氧基苄胺(Npip)亚单位—3-氨基丙酸(Nce)亚单位—1-萘胺亚单位。
2.根据权利要求1所述的类肽化合物，其中，所述类肽化合物具有式I所示的结构：
Figure FDA0003123483800000011
3.一种如权利要求1或2所述的类肽化合物的制备方法，其中，所述制备方法包括固相合成法。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其中，所述制备方法包括以下步骤：
(1)按照所述类肽化合物的亚单位的连接顺序，将所述类肽化合物的第一个亚单位连接至固相载体上；
(2)将溴乙酸在活化剂的活化作用下与连接至所述固相载体上的第一个亚单位的氨基进行反应形成酰胺键；
(3)将所述类肽化合物的第二个亚单位的供体与步骤(2)得到的产物进行反应，取代掉溴原子，完成第二个亚单位的连接；
(4)重复进行所述溴乙酸以及后续亚单位的连接，直至完成所有亚单位的连接；
(5)从所述固相载体上将合成得到的类肽化合物裂解下来得到该类肽化合物。
5.一种寡聚物，其中，所述寡聚物的分子结构式为：
Figure FDA0003123483800000021
其中，10≥n1≥3，10≥n2≥3，n1＝n2，n1和n2均为自然数。
6.根据权利要求5所述的寡聚物，其中，所述寡聚物的分子结构式为：
Figure FDA0003123483800000022
7.一种药物组合物，包括：
如权利要求5所述的寡聚物；以及
药学上接受的辅料。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其中，所述辅料为赋形剂、稀释剂、载体、调味剂、粘合剂和填充剂中的任意一种或至少两种的组合。
9.一种如权利要求7或8所述的药物组合物在制备检测或者诊断与酪氨酸激酶HER2相关的疾病的药物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其中，所述疾病包括乳腺癌、胃癌和卵巢癌。
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