CN105753940A - 一种类肽抑制剂、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

一种类肽抑制剂、其制备方法及应用。本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种类肽，尤其涉及一种抑制Aβ1?42多肽聚集的类肽抑制剂，所述类肽抑制剂包括Npip、Nmba、Nlys和Nleu亚单位。本发明的类肽抑制剂API 1是一种高水溶性、低细胞毒性和与β?淀粉样多肽高结合性的抑制剂，为研究阿尔茨海默症疾病的治疗药物提供了新的选择。

Description

一种类肽抑制剂、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种类肽，尤其涉及一种抑制Aβ1-42多肽聚集的类肽抑制剂。

背景技术

淀粉样蛋白疾病是由淀粉样蛋白聚集引起的二十多种疾病的总称，它包括阿尔茨海默病(俗称老年性痴呆)(Alzheimer’ disease,AD)、帕金森病(Parkinson’ disease,PD)、舞蹈病(Huntington’s disease，HD)等。不同淀粉样蛋白疾病发生病变的部位有所不同，主要涉及神经系统、心脏、肝脏、肾脏等。某些蛋白质单体本身无毒性或毒性很小，但它们可聚集成具有毒性作用的寡聚物(oligomer)或纤维状物(fibril)而引起一系列疾病，如β-amyloid(Aβ)可引起AD，α-synuclein可引起PD，朊病毒蛋白(Prion protein PrP)可引起包括疯牛病在内的人和动物的至少十余种脑病，含有多聚谷氨酰胺(PolyQ)的多肽可引起包括HD在内的至少9种遗传性神经退行性疾病，胰岛淀粉样多肽(islet amyloidpolypeptide，IAPP,amylin)可引起II型糖尿病及长时间透析导致的溶菌酶(lysozyme)聚集沉积所引起的疾病等。其中，对人类健康危害最大的为AD、PD及II型糖尿病。医学统计表明，我国和欧美国家中65岁以上老年人中5～6％患有AD，并且发病率逐年上升。该病已被列为导致死亡的第四大疾病，仅次于心脏病、癌症和中风。另有约1％的65岁以上老年人患有PD。而患有II型糖尿病的人数可达总人口的5％以上。这些疾病对人类的健康造成了很大危害，其发病的根本原因(或部分原因)在于某些蛋白质自身的聚集。

研究表明，不同蛋白质的聚集最先始于错误折叠或变性的蛋白质单体，单体多肽链间氢键的形成导致了蛋白分子的聚合。首先形成由电子或原子力显微镜 可观察到的大小约为3-10nm的可溶性球形寡聚物，某些寡聚物进一步可聚集成弯曲柔韧的丝状物(protofibril)，进而形成直径为6-10nm的表面光滑或呈螺旋状的纤维。非同源性的蛋白质最终可形成具有相似结构的蛋白聚合物。过去人们一直认为淀粉样蛋白疾病的发生是由蛋白质聚集成的不溶性的纤维状物引起的。近年来大量的研究表明，引起致病的关键因素是体积较小的水溶性的寡聚物。由蛋白寡聚物引起的退行性疾病存在着相似的机理，即细胞膜损伤、氧化应激、线粒体功能失调、信号传递异常、细胞死亡等。寡聚物形成的机理及怎样才能有效地抑制其细胞毒性等都是人们亟待探讨和解决的问题。

类肽(peptoid)是以N-取代甘氨酸为单元，与多肽结构相似的非天然折叠体。它可以折叠成高生物活性和高特异性的功能单元，且其组成单元比多肽更丰富，并能够耐受蛋白酶；因此，类肽化合物具有良好的生物活性和药理性质，它能够有效地抑制活体实验中的恶化情况并且具有良好的细胞膜穿透性。类肽分子较好的药理性能被越来越多研究人员所关注，目前已有报道其可被应用于阿尔茨海默症疾病的诊断与治疗。

阿尔茨海默症是一种由淀粉样多肽的错误折叠和异常聚积造成的以进行性记忆力减退和认知功能障碍为发病症状的老年期高发病率的神经系统变性疾病。根据中国阿尔茨海默病协会2011年公布的调查结果显示，全球约有3650万人患有阿尔茨海默症，他们的平均生存期只有5.9年。我国的老龄化社会现象越来越严重且作为全球人口第一大国，65岁以上的老人患阿尔茨海默症病率为6.6％，而在85岁以上的老人中发病率高达30％以上。阿尔茨海默症给社会和家庭带来了严重的负担，成为了我们必须要面对的重大社会问题。在众多AD的致病机理假说中，人民所信服的AD的发病机制——淀粉样蛋白级联假说，被越来越多的研究所证实。淀粉样蛋白级联假说认为脑内淀粉样蛋白前体(amyloid proteinprecursor,APP)的异常代谢使得Aβ的产量增多、降解减少，引起Aβ的大量聚集，形成寡聚体、原纤维和纤维等聚集体，进而形成淀粉样斑块，产生神经细胞毒素。

与AD的致病机理相对应，针对AD的治疗方法主要有抑制Aβ的生成和抑制制其聚集。目前，研究报道可以通过加入刚果红类、硫磺素T类和多酚类等小分子抑制剂和引入多肽类调节剂来抑制Aβ的聚集和其神经毒性。刚果红通过抑制纤维的形成来抑制Aβ的聚集。但是，硫磺素T抑制Aβ的聚集方式与刚果红相反，其通过结合Aβ所形成的纤维来实现。多酚类分子通过形成没食子酸酯(EGGG)来有效的抑制Aβ的聚集。此外，多肽类调节剂，KLVFF五肽片段常被用于识别Aβ的相应区域并与其发生特异性相互作用来抑制它的聚集。

尽管刚果红类、硫磺素T类和多酚类等小分子抑制剂与KLVFF多肽类调节剂用于AD的标记与治疗的研究受到很大的重视，但是它们也因为自身的细胞毒性较高、溶解性较低和结合能力较弱等因素，导致了其在实际应用中受到了很大的限制。因此，仍然需要发展了一种自身细胞毒性较低、溶解性好并且与Aβ结合能力较强的抑制剂。

CN 104818226 A公开了一种具有抑制Aβ聚集活性的化合物的制备方法与用途，该化合物可通过链霉菌X210408发酵分离制备得到，所述化合物具有较强的抑制Aβ聚集的活性，且具有良好的剂量依赖性。但是该化合物的制备步骤过于复杂，难于实现工业化生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种类肽抑制剂、其制备方法及应用，该类肽抑制剂自身细胞毒性较低、溶解性好并且与Aβ结合能力较强。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种类肽抑制剂，所述类肽抑制剂包括3,4-亚甲二氧基苄胺(Npip)、R(+)-α-甲基苄胺(Nmba)、四亚甲基二胺(Nlys)和异丁胺(Nleu)亚单位。

所述各亚单位的分子式如式II所示：

作为优选技术方案，所述类肽抑制剂包含的亚单位的顺序为Nlys-Nlys-Nmba-Nleu-Npip-Nlys。

优选地，所述类肽抑制剂具有式I所示的结构：

本发明中，将带有式I所示结构的类肽抑制剂取名为API 1。

第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的类肽抑制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法通过固相亚单元合成法合成。

优选地，所述制备方法包括以下步骤：

(1)溴乙酸在N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)的活化下与前一亚单位的氨基反应形成酰胺键；

(2)加入伯胺通过亲核置换反应替换掉溴原子；

(3)重复步骤(1)和(2)直至完成所有亚单位的合成。

第三方面，本发明提供一种淀粉样蛋白细胞毒性抑制剂，所述抑制剂包含如第一方面所述的类肽。

优选地，所述抑制剂在抑制Aβ1-42的细胞毒性上的应用。

优选地，所述细胞为SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞。

本发明中，所述对细胞毒害作用一般是由Aβ1-42的错误折叠和聚积造成的。

第四方面，本发明提供一种淀粉样蛋白聚集抑制剂，所述抑制剂包含如第一方面所述的类肽。

优选地，所述抑制剂在抑制Aβ1-42的聚集上的应用。

第五方面，本发明提供一种药物组合物，包含如第一方面所述的类肽。

优选地，所述药物组合物还包含药学上接受的辅料。

优选地，所述辅料为赋形剂、稀释剂、载体、调味剂、粘合剂和填充剂中的任意一种或至少两种的组合。

第六方面，本发明提供一种如第五方面所述的药物组合物在制备检测、诊断和/或治疗与淀粉样蛋白相关的疾病的药物中的应用。

优选地，所述疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病或II型糖尿病中的任意一种或至少两种的组合。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明的类肽抑制剂与Aβ1-42多肽结合能力较强，通过表面等离基元共振技术得到的本发明的类肽抑制剂与Aβ1-42多肽的结合动力学常数中的平衡解离常数K_D为10^-8摩尔/升数量级；

(2)利用ThT荧光技术检测本发明的类肽抑制剂对Aβ1-42多肽的聚集抑 制效果，可发现对Aβ1-42多肽的聚集抑制效果显著；

(3)利用本发明的类肽抑制剂做神经细胞毒性实验，实验显示类肽抑制剂能过有效降低Aβ1-42多肽对神经细胞的毒害作用；

(4)本发明的类肽抑制剂自身的毒性较低且其溶解性好。

附图说明

图1(a)为Aβ1-42的原子力显微镜图像；图1(b)为API 1与Aβ1-42摩尔比为1:10的原子力显微镜图像；

图2利用ThT荧光技术检测本发明的类肽抑制剂API 1对Aβ1-42多肽的聚集抑制效果；

图3为本发明的类肽抑制剂API 1分子与β-淀粉样多肽Aβ1-42结合的表面等离基元共振检测的结果；其中，Aβ1-42分别在4.4μM、8.8×10^-1μM、1.8×10^-1μM、3.5×10^-2μM和7.0×10^-3μM浓度下与API 1的结合过程；

图4为本发明的类肽抑制剂API 1对β-淀粉样多肽神经毒性的抑制效果；其中，Aβ1-42浓度保持在20μM与浓度比为1:0、1:1、1:5和1:10的API 1的神经细胞毒性测试结果。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所述SPRi仪器为Plexera Kx5V2，Plexera Bioscience LLC,USA，该仪器主要装配有660nmLED光源、CCD图像采集器和带微流通道的传感芯片，仪器显示每个监测点上反射光强度随时间的变化并记录为SPR曲 线。

除非特殊说明，本文中的“抑制剂”指的是可以抑制β-淀粉样多肽的聚集和造成神经细胞毒害作用的类肽。

除非特殊说明，本文中的“β-淀粉样多肽”指的是全长的β-淀粉样多肽Aβ1-42。

除非特殊说明，本文中的“聚集体”指的是β-淀粉样多肽自聚集形成的单组分聚集体；“共聚集体”指的是β-淀粉样多肽与抑制剂分子或标记分子共聚集形成的多组分聚集体。

除非特殊说明，本文中的“μM”指的是“μmol/L”，“mM”指的是“m mol/L”。

实验例1类肽抑制剂API 1的制备

本发明类肽抑制剂API 1通过固相亚单元合成法合成，所述方法包括以下步骤：

(1)将2M溴乙酸和3.2M N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)加入Rink酰胺AM树脂(取代水平0.3mmol/g)中，在37℃下反应30min，将树脂末端的氨基酰化；

(2)再加入2M伯胺在37℃下反应90min，通过亲核置换反应替换掉溴原子，完成一个亚单位的合成；

(3)重复步骤(1)和(2)直至完成其余亚单位的合成；

(4)待合成完毕后，侧链保护基团被除去，并用95％三氟乙酸，2.5％超纯水，2.5％三异丙基硅烷将API 1从树脂上裂解下来备用。

制备得到的API 1的分子式如下：

本发明的类肽抑制剂API 1可以溶解到缓冲液中制备混合溶液，可以使API 1的最终浓度为1-50μM，优选为20μM。所述缓冲液可以是pH6.8-7.5的磷酸盐缓冲液，优选pH7.2的磷酸盐缓冲液。

本发明中，β-淀粉样多肽为全长的β-淀粉样多肽Aβ1-42。

实验例2类肽抑制剂API 1对β-淀粉样多肽Aβ1-42聚集体形貌的改变

将β-淀粉样多肽Aβ1-42溶解到磷酸盐缓冲液中与类肽抑制剂API 1在37℃下恒温摇晃共同孵育48小时，利用原子力显微技术观察API 1对Aβ1-42聚集形貌的影响。所述API1对Aβ1-42聚集形貌影响的表征包括如下步骤：

(1)将Aβ1-42溶解到pH 7.2的磷酸盐缓冲液中，制成20μM溶液；

(2)将API 1与Aβ1-42等摩尔混合，溶解到pH 7.2的磷酸盐缓冲液中制备成混合缓冲液，浓度分别为200μM和20μM，在37℃共同孵育24小时；

(3)将步骤(1)和(2)得到的混合溶液分别滴加到云母、硅片等平整基底上，然后空气干燥后，在固气界面获得原子力显微镜图像。

结果如图1(a)和1(b)所示，分别为Aβ1-42孵育48h的聚集形貌和相同条件下API 1与Aβ1-42共孵育的形貌，后者明显抑制了Aβ1-42的聚集。

实验例3类肽抑制剂API 1对Aβ1-42多肽的聚集抑制效果

利用ThT荧光技术检测本发明的类肽抑制剂API 1对Aβ1-42多肽的聚集抑制效果的具体步骤如下：

(1)分别配置20μM Aβ1-42溶液，Aβ1-42：API 1＝1:1、1:5和1:10的混合缓冲液；

(2)向步骤(1)所配置溶液中加入THT荧光染料；

(3)将步骤(2)得到的混合溶液分别进行测试。选取特定的激发波长和发射波长，通过测试发射波长处其荧光强度反映溶液中Aβ1-42的聚集程度。

实验条件为37℃，每间隔15分钟测试一次，结果如图2所示，API 1：Aβ1-42＝1:1，1:5，1:10分别逐渐加强了对Aβ1-42多肽的聚集抑制效果。

实验例4类肽抑制剂API 1与β-淀粉样多肽Aβ1-42间结合能力

利用表面等离子体共振成像技术测试类肽抑制剂API 1与β-淀粉样多肽Aβ1-42间结合能力的具体步骤如下：

(1)将API 1溶解到ddH₂O中，浓度为100μg/mL；

(2)将样品点在一张裸金芯片表面上，每种样品重复3个点，4℃孵育12小时后将芯片侵入5％脱脂奶中4℃封闭12小时，用10X PBS 1XPBS超纯水清洗干净，氮气吹干；

(3)将芯片安装在SPRi仪器上，测定SPRi角并调节至最佳光学位置，在检测区域选取相关检测点，包括样品点与空白点，设置实验流速为2μL/s；

(4)选择PBS为缓冲液通入流通池至基线稳定后依次通过浓度为4.4μM、8.8×10^-1μM、1.8×10^-1μM、3.5×10^-2μM和7.0×10^-3μM进行检测，结合时间为300秒，解离时间为300秒，每个浓度间通入磷酸进行重生。

检测见过如图3所示，经拟合，平衡解离常数K_D为1.99×10^-8摩尔/升。

实验例5类肽抑制剂API 1对β-淀粉样多肽Aβ1-42神经毒性的抑制

利用细胞毒性测试技术检测类肽抑制剂API 1对β-淀粉样多肽Aβ1-42神经毒性的抑制具体步骤如下：

(1)将Aβ1-42配制成300μM溶液，将API 1配制成600μM溶液；

(2)将步骤(1)中的Aβ1-42溶液加入到培养好的神经肿瘤细胞中制成20μM的Aβ1-42神经肿瘤细胞溶液；经过48小时孵育，用酶标仪检测细胞样品的吸光度测试神经肿瘤细胞的存活率；

(3)将步骤(1)中的Aβ1-42与API 1溶液按比例分别加入到神经肿瘤细胞溶液中，使最终Aβ1-42的浓度为20μM，并且Aβ1-42与API 1的浓度比例分别为1:1、1:5和1:10；经过48小时的孵育后，利用酶标仪测试细胞样品的吸光度值来检测神经肿瘤细胞的存活率；

所述的神经肿瘤细胞为作为神经细胞的模型体系的SH-SY5Y细胞，将SH-SY5Y细胞接种于96孔板中，每孔150μL细胞培养液，于37℃下孵育培养，待细胞约有60％贴壁时，加入API 1与β-淀粉样多肽Aβ1-42的混合体系，进行细胞毒性测试，细胞浓度为15000个/孔。

将Aβ1-42/API 1加入到细胞培养液中，最终浓度为Aβ1-42为固定的20μM，API 1浓度分别为0、20μM、100μM和200μM，作用24个小时后，测试细胞存活率，如图4所示，随着API1浓度的提高，细胞的存活率明显上升，API 1:Aβ1-42＝1:10时，细胞存活率提高到了75％左右。

综上所述，本发明的类肽抑制剂API 1是一种高水溶性、低细胞毒性和与β-淀粉样多肽高结合性的抑制剂，为研究阿尔茨海默症疾病的治疗药物提供了新的选择。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范 围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种类肽抑制剂，其特征在于，所述类肽抑制剂包括3,4-亚甲二氧基苄胺(Npip)、R(+)-α-甲基苄胺(Nmba)、四亚甲基二胺(Nlys)和异丁胺(Nleu)亚单位。

2.根据权利要求1所述的类肽抑制剂，其特征在于，所述类肽抑制剂包含的亚单位的顺序为Nlys-Nlys-Nmba-Nleu-Npip-Nlys。

3.根据权利要求1或2所述的类肽抑制剂，其特征在于，所述类肽抑制剂具有式I所示的结构：

4.一种如权利要求1-3中任一项所述的类肽抑制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法通过固相亚单元合成法合成；

优选地，所述制备方法包括以下步骤：

(1)将溴乙酸在N,N’-二异丙基碳二亚胺的活化下与前一亚单位的氨基反应形成酰胺键；

(2)加入伯胺通过亲核置换反应替换掉溴原子；

(3)重复步骤(1)和(2)直至完成所有亚单位的合成。

5.一种淀粉样蛋白细胞毒性抑制剂，其特征在于，所述抑制剂包含如权利要求1-3中任一项所述的类肽；

优选地，所述抑制剂在抑制Aβ1-42的细胞毒性上的应用；

优选地，所述细胞为SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞。

6.一种淀粉样蛋白聚集抑制剂，其特征在于，所述抑制剂包含如权利要求1-3中任一项所述的类肽；

优选地，所述抑制剂在抑制Aβ1-42的聚集上的应用。

7.一种药物组合物，其特征在于，包含如权利要求1-3中任一项所述的类肽。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含药学上接受的辅料；

优选地，所述辅料为赋形剂、稀释剂、载体、调味剂、粘合剂和填充剂中的任意一种或至少两种的组合。

9.一种如权利要求7或8所述的药物组合物在制备检测、诊断和/或治疗与淀粉样蛋白相关的疾病的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病或II型糖尿病中的任意一种或至少两种的组合。