CN104818226A - 一种具有抑制Aβ聚集活性的化合物的制备方法与用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有抑制Aβ聚集活性的化合物的制备方法与用途，属于微生物药物领域。具有抑制Aβ聚集活性的化合物的结构如式Ⅰ所示，该化合物可通过保藏编号为CCTCC NO：M 2015103的链霉菌X210408发酵分离制备得到。式Ⅰ所示化合物具有较强的抑制Aβ聚集的活性，且具有良好的剂量依赖性。其可用于制备Aβ聚集抑制剂，并用于制备阿尔茨海默症以及其他形式痴呆的治疗药物。本发明为治疗阿尔茨海默症提供了新的途径。

Description

一种具有抑制Aβ聚集活性的化合物的制备方法与用途

技术领域

本发明属于微生物药物领域，特别涉及一种具有抑制Aβ聚集活性的化合物的制备方法与用途。

背景技术

阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease，AD)是一种慢性的大脑退行性疾病，由于大脑器质性损害引起脑功能障碍，使记忆、理解、自我控制能力等发生进行性退化和持续性智能损害，影响到日常的生活运动，是老年期痴呆的最常见类型。近年来随着我国人口老龄化的加重，AD的发病率及患病率也逐渐增高，AD的发病机制和防治渐渐成为了国内外研究的热点，也得到了越来越多的医学关注。

目前，关于AD的发病机制尚不完全清楚，但临床发现AD患者脑中的标志性病理特征表现为区域性神经元丧失、细胞内神经元纤维缠(neurofibrillary tangles，NFTs)和主要由β-淀粉样蛋白(amyloidβ-protein，Aβ)组成的老年斑。淀粉样蛋白级联假说强调毒性Aβ是AD病变的始发因子，在AD病程中发挥关键作用。大量实验证实，Aβ对神经元具有神经营养和神经毒双重作用，低浓度Aβ对未成熟分化的神经元表现出营养作用，随Aβ逐渐积累浓度升高，对成熟分化的神经元则呈现出神经毒性，使树突和轴突退缩，导致神经元减少或缺失。

目前针对AD的临床治疗药物主要为胆碱酯酶抑制剂、自由基清除剂、抗炎药、脑细胞代谢和血液循环改善剂、钙拮抗剂等，但这些药物均存在一定的毒副作用和使用限制。因而筛选具有抑制Aβ聚集的小分子先导化合物正成为研制AD治疗药物的热点。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种生产具有抑制Aβ聚集活性的化合物的链霉菌。本发明的另一目的在于提供所述的化合物的制备方法。本发明的再一目的在于提供所述的化合物或链霉菌的用途。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种生产具有抑制Aβ聚集活性的化合物的链霉菌，为保藏编号为CCTCC NO：M2015103的链霉菌X210408(Streptomyces sp.X210408)。所述的具有抑制Aβ聚集活性的化合物的结构如式Ⅰ所示：

所述的链霉菌X210408从采自中国海南省文昌红树林的土壤样品中分离，并与2015年03月12日保藏于中国典型培养物保藏中心。该菌株的16S rRNA基因序列的GenBank登录号为FJ261963，序列如SEQ ID NO.1所示。

一种利用链霉菌X210408制备具有抑制Aβ聚集活性的化合物的方法，包括如下步骤：

(1)将链霉菌X210408经平板活化后接种于ISP2液体培养基中培养，再转接到OB培养基中进行发酵。所述的OB培养基的配方为：燕麦粉20g/L，牛肉提取物3g/L，葡萄糖20g/L，FeSO₄0.4g/L，MgCl₂·4H₂O 0.4g/L，CaCO₃3g/L，海盐3g/L，pH值为7.0。

(2)将步骤(1)获得的发酵液用乙酸乙酯萃取、浓缩得粗提物。

(3)将步骤(2)获得的粗提物在硅胶中用二氯甲烷和甲醇组成的洗脱液进行洗脱，收集洗脱液。

(4)将步骤(3)获得的含有目的化合物的洗脱液浓缩，通过柱层析以及半制备液相分离纯化得到式Ⅰ所示的具有抑制Aβ聚集活性的化合物。

步骤(3)中所述的硅胶优选为300～400目的硅胶。

优选的，所述的制备具有抑制Aβ聚集活性的化合物的方法，包括如下步骤：

(1)将链霉菌X210408经平板活化后接种于ISP2液体培养基中，28℃、220r/min条件下振荡培养3d，再以5％的接种量接种到OB培养基中，28℃、220r/min条件下振荡培养7d。

(2)将步骤(1)获得的发酵液用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，减压浓缩获得乙酸乙酯提取物。

(3)将步骤(2)获得的提取物在硅胶中进行梯度洗脱，依次用体积比分别为100:1、90:1、80:1、60:1、40:1、20:1、10:1的二氯甲烷和甲醇组成的七个洗脱液进行洗脱，依次获得七个洗脱液洗出的组分。

(4)将步骤(3)获得含有目的化合物的组分合并后，减压浓缩，再将浓缩后的合并组分进行羟丙基葡聚糖凝胶LH20柱层析以及C18半制备液相分离纯化，得到式Ⅰ所示的具有抑制Aβ聚集活性的化合物。

步骤(2)和(4)中所述减压浓缩的温度优选为40～100℃。

步骤(4)中所述的LH20柱层析所用洗脱液优选为体积比1:1的二氯甲烷和甲醇；所述的C18半制备液相分离纯化所用的流动相优选为体积比85:15的甲醇和水。

上述式Ⅰ所示的具有抑制Aβ聚集活性的化合物具有抑制Aβ聚集的作用。

基于该作用，上述链霉菌X210408或式Ⅰ所示的化合物可用于制备Aβ聚集抑制剂和/或治疗阿尔茨海默症以及其他形式痴呆的药物。

一种Aβ聚集抑制剂或治疗痴呆症的药物，包含式Ⅰ所示的化合物。

上述式Ⅰ所示环肽类结构的化合物未见其作为制备抗Aβ聚集制剂用途的报道，本发明发现了该化合物的一种新的来源，并通过生物活性测试实验表明该化合物具有较强的抑制Aβ聚集的活性，且具有良好的剂量依赖性。该化合物由于具有抗Aβ聚集的作用表明其可用来制备治疗阿尔茨海默氏症以及其他形式痴呆的药物。本发明为治疗阿尔茨海默症提供了新的途径。

附图说明

图1是荧光分光光度计检测式Ⅰ所示化合物抑制Aβ聚集的结果图。

具体实施方式

以下实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

实施例1链霉菌X210408的分离、鉴定与保藏

从采自中国海南省文昌红树林的土壤样品中分离得到菌株X210408，并经分类学研究和分子生物学研究鉴定为链霉菌(Streptomyces sp.)，将该菌株于2015年03月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，其保藏编号为CCTCC NO：M 2015103，分类命名为链霉菌X210408Streptomyces sp.X210408。链霉菌X210408的16S rRNA基因序列的GenBank登录号为FJ261963，序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2链霉菌X210408大量发酵及其发酵物样品前处理方法

将链霉菌X210408经平板活化后接种于ISP2液体培养基中，28℃、220r/min振荡培养3d，按照5％接种量接种到5L OB培养基中，28℃、220r/min振荡培养7d，获得发酵液。将发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，减压浓缩至干得粗提取物。所述的ISP2液体培养基的配方为：葡萄糖4g/L，酵母提取物4g/L，麦芽提取物10g/L，pH值为7.2；所述的OB培养基的配方为：燕麦粉20g/L，牛肉提取物3g/L，葡萄糖20g/L，FeSO₄0.4g/L，MgCl₂·4H₂O 0.4g/L，CaCO₃3g/L，海盐3g/L，pH值为7.0。

实施例3式Ⅰ所示化合物的分离及结构确认

(1)化合物分离

将实施例2中获得的粗提取物经二氯甲烷和甲醇混合液(二氯甲烷:甲醇＝1:1，体积比)溶解后在300～400目的硅胶中进行梯度洗脱，依次用体积比(二氯甲烷:甲醇)分别为100:1、90:1、80:1、60:1、40:1、20:1、10:1的二氯甲烷和甲醇组成的七个洗脱液进行洗脱，每个梯度洗脱体积为1L，合并体积比为60:1和40:1的洗脱液，再将减压浓缩后的合并组分进行羟丙基葡聚糖凝胶LH20柱层析，洗脱液为1:1(体积比)的二氯甲烷和甲醇，收集含有目的化合物的组分，浓缩后再利用C18半制备液相分离纯化，采用的流动相比例为85:15(体积比)的甲醇和水，得到目标化合物(30mg)。

(2)结构确认

通过UV、IR、MS和NMR多种波谱学手段，结合文献信息确定了目标化合物的结构如式Ⅰ所示，即目标化合物鉴定为棘霉素(Echinomycin)。

目标化合物的理化性质与波谱数据如下：

白色粉末；

旋光度：(c＝0.145,MeOH)；

分子式：C₅₁H₆₄N₁₂O₁₂S₂；

分子量：1100.4；

HRESI-MS(m/z)：1100.4280[M+H]⁺(Calcd.For：1101.4246)；

最大紫外吸收为242、320nm；

红外光谱数据：

3390,2967,2927,1741,1654,1515,1490,1407,1369,1259,1180,1097,1010,776cm^-1；

核磁共振数据：

实施例4式Ⅰ所示化合物抑制Aβ聚集的活性评价

试剂来源：Aβ蛋白(1-42，M＝4514.1)购自上海楚肽生物科技有限公司，硫磺素T(ThT)购自TCI公司。

活性评价试验方法参考文献Naiki,H.；Higuchi,K.；Hosokawa,M.；Takeda,T.Fluorometricdetermination of amyloid fibrils in vitro using the fluorescent dye,thioflavin t1.Analyticalbiochemistry 1989,177,244-249和李光武,任振华,唐敏,王培源,汪华侨.银杏叶中单体活性成分抑制Aβ_1-42聚集和纤维的形成.解剖学杂志,2007,30(1):47-49，优化步骤后进行，具体步骤如下：

(1)Aβ_1-42工作液配制

1mg Aβ_1-42粉末用1mL六氟异丙醇完全溶解后，按0.1mL分装成10管，真空冷冻抽干后于-80℃保存。取出1管Aβ_1-42，加入40μL二甲基亚砜，溶解后再加入400μL PBS，即成50μMAβ_1-42工作液。

(2)15μM硫磺素T溶液配制

称取0.031885g的硫磺素T(ThT)溶于20mL 50mM甘氨酸-NaOH(pH＝8.5)溶液中即得5mM ThT母液。取0.3mL 5mM ThT溶液加入100mL 50mM甘氨酸-NaOH(pH＝8.5)溶液中即可得到15μM硫磺素T溶液。

(3)实验分组

空白对照组：29μL磷酸缓冲液PBS，5μL二甲基亚砜；Aβ_1-42聚集模型组：17μL Aβ_1-42工作液，12μL磷酸缓冲液PBS，5μL二甲基亚砜；化合物实验组：17μL Aβ_1-42工作液，12μL磷酸缓冲液PBS，5μL浓度分别为1.25、2.5或5.0μM的上述式Ⅰ所示化合物(溶剂为二甲基亚砜)；阳性对照组：17μL Aβ_1-42工作液，12μL磷酸缓冲液PBS，5μL EGCG(表没食子儿茶素没食子酸酯)；96孔荧光板中充分混匀各组，37℃孵育24h。

(4)荧光测量

24小时后，向96孔荧光板的孔中加入15μM硫磺素T溶液166μL，总体积为200μL，2min后检测通过荧光分光光度计检测，Ex＝453nm，Em＝485nm，记录485nm处最大发射波长的荧光值，实验重复3次。

(5)统计方法：用SPSS统计软件方差分析P<0.01。

(6)实验结果

用上述方法，检测的荧光强度结果见附图1。可以看出，与未加式Ⅰ所示化合物的模型组对比，1.25～5.0μM化合物实验组的荧光强度均明显低于模型组Aβ_1-42聚集后产生的荧光强度且具有统计学意义(P<0.01)，表明上述化合物可以显著的抑制Aβ_1-42聚集，且呈现良好的剂量依赖关系，说明该化合物具有较强的抑制Aβ聚集活性，可用于治疗阿尔茨海默症或其他形式的神经退行性疾病。

Claims (10)

1.一种生产具有抑制Aβ聚集活性的化合物的链霉菌，其特征在于：所述的具有抑制Aβ聚集活性的化合物的结构如式Ⅰ所示：

所述的链霉菌的保藏编号为CCTCC NO：M 2015103。

2.一种利用权利要求1所述的链霉菌制备式Ⅰ所示化合物的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将权利要求1所述的链霉菌经平板活化后接种于ISP2液体培养基中培养，再转接到OB培养基中进行发酵；所述的OB培养基的配方为：燕麦粉20g/L，牛肉提取物3g/L，葡萄糖20g/L，FeSO₄0.4g/L，MgCl₂·4H₂O 0.4g/L，CaCO₃3g/L，海盐3g/L，pH值为7.0；

(2)将步骤(1)获得的发酵液用乙酸乙酯萃取、浓缩得粗提物；

(3)将步骤(2)获得的粗提物在硅胶中用二氯甲烷和甲醇组成的洗脱液进行洗脱，收集洗脱液；

(4)将步骤(3)获得的含有目的化合物的洗脱液浓缩，通过柱层析以及半制备液相分离纯化得到式Ⅰ所示化合物。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的硅胶为300～400目的硅胶。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将权利要求1所述的链霉菌经平板活化后接种于ISP2液体培养基中，28℃、220r/min条件下振荡培养3d，再以5％的接种量接种到OB培养基中，28℃、220r/min条件下振荡培养7d；

(2)将步骤(1)获得的发酵液用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，减压浓缩获得乙酸乙酯提取物；

(3)将步骤(2)获得的提取物在硅胶中进行梯度洗脱，依次用体积比分别为100:1、90:1、80:1、60:1、40:1、20:1、10:1的二氯甲烷和甲醇组成的七个洗脱液进行洗脱，依次获得七个洗脱液洗出的组分；

(4)将步骤(3)获得含有目的化合物的组分合并后，减压浓缩，再将浓缩后的合并组分进行羟丙基葡聚糖凝胶LH20柱层析以及C18半制备液相分离纯化，得到式Ⅰ所示化合物。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于包括如下步骤：步骤(2)和(4)中所述减压浓缩的温度为40～100℃。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于包括如下步骤：步骤(4)中所述的LH20柱层析所用洗脱液为体积比1:1的二氯甲烷和甲醇；所述的C18半制备液相分离纯化所用的流动相为体积比85:15的甲醇和水。

7.权利要求1所述的链霉菌在制备Aβ聚集抑制剂和/或治疗痴呆症的药物中的应用。

8.权利要求1中式Ⅰ所示化合物在制备Aβ聚集抑制剂和/或治疗痴呆症的药物中的应用。

9.一种Aβ聚集抑制剂或治疗痴呆症的药物，其特征在于：包含式Ⅰ所示化合物。

10.根据权利要求7或8所述的应用或权利要求9所述的药物，其特征在于：所述的痴呆症为阿尔茨海默症。