CN102391968A - 一株链霉菌及其在生产棘霉素中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株链霉菌及其在生产棘霉素中的应用。本发明提供的菌株为链霉菌(Streptomyces sp.)LS462，它的保藏编号为CGMCC No.5453。本发明提供的链霉菌LS462在没有经过任何培养基及发酵条件优化的前提下，其棘霉素的产量可达61.82mg/l，高于目前已见报道的棘霉素生产菌株的产量。本发明所提供的生产棘霉素的方法是发酵链霉菌LS462，发酵稳定、化合物分离工艺简便、产率高。本发明提供的菌株具有很好的工业化潜力和前景。

Description

一株链霉菌及其在生产棘霉素中的应用

技术领域

本发明涉及一株链霉菌及其在生产棘霉素中的应用。

背景技术

癌症是一种非常古老的疾病，伴随着整个人类发展的历史，严重威胁着人类的健康与生命。

棘霉素(Echinomycin)自1998年以来就一直作为一种抗肿瘤药物在进行II期临床试验。棘霉素是一个DNA双插入试剂，能够与肿瘤细胞的DNA发生相互作用从而抑制其复制和转录。棘霉素还涉及对细胞凋亡的促进作用。除了抗肿瘤作用外，棘霉素对许多病原微生物也具有显著的抑制作用，如结核分枝杆菌、炭疽杆菌等。

除了长期被作为一种抗肿瘤抗生素进行研究外，近年来，棘霉素的抗微生物活性和发色团的荧光性质也逐渐引起人们的关注，利用其喹喔啉环发色团在插入双链DNA后能引起电信号发生变化的性质，可用来研制电化学DNA传感器，用于鉴别单链和双链DNA。另外，棘霉素还有望作为一种高灵敏度和专一性的DNA荧光探针，用于与核酸分子成像有关的研究。

发明内容

本发明的目的是提供一株链霉菌及其在生产棘霉素中的应用。

本发明提供的链霉菌(Streptomyces sp.)LS462，已于2011年11月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo.5453。

本发明还保护所述链霉菌LS462在生产棘霉素中的应用。

本发明还保护一种种子培养基，是通过如下方法制备得到的培养基：将20-30g可溶性淀粉、0.2-0.6gL-天冬酰胺、0.5-1.0g KNO₃、0.2-0.6g K₂HPO₄·H₂O、0.2-0.6gNaCl和0.2-1.0g MgSO₄·7H₂O用水定容至1L。所述种子培养基的pH可为7.0-7.5。所述种子培养基具体可通过如下方法制备得到：将25g可溶性淀粉、0.4g L-天冬酰胺、0.8g KNO₃、0.4g K₂HPO₄·H₂O、0.4g NaCl和0.6g MgSO₄·7H₂O用水定容至1L。

本发明还保护一种发酵培养基，是通过如下方法制备得到的培养基：将5-15g葡萄糖、10-30g稷粉、10-30g棉籽蛋白粉和10-30g 3-(N-吗啉基)丙磺酸用水定容至1L。所述发酵培养基的pH可为7.0-7.5。所述发酵培养基培养基具体可通过如下方法制备得到：将10g葡萄糖、20g稷粉、20g棉籽蛋白粉和20g 3-(N-吗啉基)丙磺酸用水定容至1L。

本发明还保护一种制备棘霉素的方法，是发酵所述链霉菌LS462，得到棘霉素。所述发酵的条件具体可为25-30℃、140-200rpm、6-15天。所述发酵的条件具体可为28℃、180rpm、10天。

所述方法具体可包括如下步骤：将所述链霉菌LS462的种子液接种至所述发酵培养基中发酵并收获发酵液。

所述方法中，可将5ml所述种子液接种至100ml所述发酵培养基中。所述种子液具体可通过如下方法制备：将所述链霉菌LS462接种于所述种子培养基中，25-30℃(如28℃)、140-200rpm(如180rpm)培养2-6天(如96小时)，得到种子液。

所述方法还可包括如下步骤：

(1)将所述发酵液离心(离心参数具体可为：4℃、8000转/min、15min)，分别收集上清液和沉淀；

(2)将步骤(1)获得的沉淀用丙酮浸提(可室温静置10小时)，离心(离心参数具体可为：4℃、8000转/min、15min)并收集上清液；

(3)将步骤(1)的上清液和步骤(2)的上清液合并，即为棘霉素粗提液(菌株粗提液)；

(4)将所述棘霉素粗提液上样于HP-20大孔吸附树脂，依次用体积百分比为40％和60％的丙酮水溶液洗脱(各一升)，收集用60％丙酮水溶液洗脱得到的过柱后洗脱液；

(5)将步骤(4)收集的过柱后洗脱液蒸干并用丙酮重新溶解，过滤后进行反相HPLC；反相HPLC参数：采用Agilent ZORBAX XDB C-18 column(5μm，9.4×250mm)；流动相为体积百分比为70％的甲醇水溶液，流速为2.0ml/min；收集保留时间为26.3-27.2min的过柱后洗脱液，蒸干后得到棘霉素。

本发明提供的链霉菌LS462在没有经过任何培养基及发酵条件优化的前提下，其棘霉素的产量可达61.82mg/l，高于目前已见报道的棘霉素生产菌株的产量。本发明所提供的生产棘霉素的方法是发酵链霉菌LS462，发酵稳定、化合物分离工艺简便、产率高。本发明提供的菌株具有很好的工业化潜力和前景。

附图说明

图1为菌株LS462在斜面培养基上28℃培养20天的照片。

图2为菌株LS462在扫描电镜(Quanta 200)10000×下观察的照片。

图3为菌株粗提液的HPLC分析图。

图4为活性组分的ESI-MS质谱图。

图5为活性组份的紫外光谱图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。可溶性淀粉购自北京化工厂，产品目录号为K0800034。葡萄糖购自北京现代东方精细化学品有限公司(HG)。稷粉购自农贸市场。棉籽蛋白粉(药媒)购自北京中棉紫光生物科技有限公司。MOPS即3-(N-吗啉基)丙磺酸，购自北京江晨生物。HP-20大孔吸附树脂(三菱)：购自北京慧德易科技有限公司。Agilent ZorbaxXDB C-8column：购自北京慧德易科技有限公司。Agilent ZORBAX XDB C-18 column：购自北京慧德易科技有限公司。

实施例1、链霉菌(Streptomyces sp.)LS462的分离和鉴定

一、链霉菌LS462的分离

菌株分离培养基的组成如下(以下均为质量百分比)：淀粉2％、L-天冬素0.05％、KNO₃ 0.1％、K₂HPO₄·H₂O 0.05％、NaCl 0.05％、MgSO₄·7H₂O 0.05％、CaCO₃ 0.1％、琼脂1.8％和H₂O；pH值为7.5。

取1.0g土样(采自中国江西瑶里原始森林的泥土样品)，放入装有9.0ml无菌水的50ml离心管中，180rpm摇2h，于20KHz、100W功率超声2min；取1.0ml悬浊液，放入装有9.0ml无菌水的50ml离心管中，混匀；取1.0ml悬浊液，放入装有9.0ml无菌水的50ml离心管中，混匀；系列稀释10^-3和10^-4；盖紧管盖，于100℃保温1h，取0.2ml涂板。获得了一株菌，将其命名为菌株LS462。

菌株LS462的保藏方法：于25％甘油冻存管-80℃保藏。

二、链霉菌LS462的鉴定

菌株LS462在斜面培养基上28℃培养20天的照片见图1。菌株LS462在扫描电镜(Quanta 200)10000×下观察的照片见图2。在斜面培养基上培养20天产生卵圆形孢子，表面刺状，大小均匀(0.5-0.7μm×1.1-1.3μm)。气生菌丝呈棕色，表面光滑，基内菌丝呈棕色，有棕色色素产生。

根据菌落形态特征，将菌株LS462鉴定为链霉菌。

链霉菌(Streptomyces sp.)LS462已于2011年11月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.5453。

实施例2、应用链霉菌LS462生产棘霉素

斜面培养基的制备方法如下(pH7.0)：将25g可溶性淀粉、0.4g L-天冬酰胺、0.8g KNO₃、0.4g K₂HPO₄·H₂O、0.4g NaCl、0.6g MgSO4·7H₂O和18g琼脂溶于水并用水定容至1L。

种子培养基的制备方法如下(pH7.5)：将25g可溶性淀粉、0.4g L-天冬酰胺、0.8g KNO₃、0.4g K₂HPO₄·H₂O、0.4g NaCl和0.6g MgSO₄·7H₂O溶于水并用水定容至1L。

发酵培养基的制备方法如下(pH7.0)：将10g葡萄糖、20g稷粉、20g棉籽蛋白粉和20g MOPS溶于水并用水定容至1L。

一、菌株发酵

1、种子培养

(1)将链霉菌LS462的孢子接种于斜面培养基，28℃培养8天(到气生菌丝丰满)，即得到斜面菌种。

(2)在500ml玻璃瓶中装入100ml种子培养基。

(3)从步骤(1)的斜面挖块接种至步骤(2)的培养基，28℃、180rpm培养96小时，得到种子液。

2、发酵培养

(1)在500ml的三角瓶中装100ml发酵培养基。

(2)在步骤(1)的培养基中接种5ml步骤1得到的种子液，28℃、180rpm培养10天，收获发酵液(发酵液为容器内的所有物质)。

二、有效成分的分离纯化

1、将1升步骤一得到的发酵液4℃条件下离心15min(8000转/min)，分别收集上清液和沉淀(菌体)。

2、将步骤1获得的菌体用350mL丙酮室温条件下浸泡过夜(约10小时)，4℃条件下离心15min(8000转/min)，收集上清液。

3、将步骤1的上清液和步骤2的上清液合并，即为棘霉素粗提液(菌株粗提液)。

4、将50ml棘霉素粗提液上样于HP-20大孔吸附树脂，用100％丙酮洗脱，浓缩洗脱液，并进行HPLC分析。

HPLC参数：Agilent Zorbax XDB C-8column(5μm，4.6×150mm)；体积百分比为70％的甲醇水溶液为流动相，流速为1.0ml/min；检测波长为254nm。

HPLC图谱见图3。主要活性成分的保留时间约为7.32min。

5、将步骤3得到的菌株粗提液(约1300ml)上样于300ml HP-20大孔吸附树脂，先用800ml水洗脱，然后依次用体积百分比为40％、60％和80％的丙酮水溶液(各1升)洗脱，收集用60％丙酮水溶液洗脱得到的过柱后洗脱液(约1升)。

6、将步骤5收集的过柱后洗脱液通过旋转蒸发仪除去丙酮并蒸干，用5mL丙酮重新溶解，过滤后进行反相HPLC。

反相HPLC参数：Agilent ZORBAX XDB C-18 column(5μm，9.4×250mm)；体积百分比为70％的甲醇水溶液为流动相，流速为2.0ml/min；检测波长为254nm。

收集保留时间为26.3-27.2min的过柱后洗脱液，用旋转蒸发仪蒸干，得到活性组分(每升步骤一得到的发酵液中含有61.82mg活性组分)。

三、有效成分的鉴定

1、外观

白色粉末。

2、溶解性

易溶于氯仿、DMSO，微溶于丙酮、甲醇，不溶于水。

3、质谱

ESI-MS质谱见图4，检测其分子离子峰[M+H]⁺为1101.3，[M+Na]⁺为1123.3。与文献报道棘霉素的结果一致。

4、紫外光谱

紫外光谱测试仪器为Mariner System 5304 instrument。

活性组份的紫外光谱图见图5，在204nm、243.0nm和323nm处有最大吸收峰。与文献报道棘霉素紫外特征一致。

5.核磁图谱碳信号归属

核磁图谱测试仪器为Varian Inova 600MHz，所用溶剂为DMSO-d6。活性组分碳信号归属如表1所示。与文献报道一致。

表1活性组份的碳谱核磁信号归属

综合上述结果，所述活性组份的结构式见式(I)，为棘霉素。

式(I)。

Claims (9)

1.链霉菌(Streptomyces sp.)LS462，它的保藏编号为CGMCC No.5453。

2.权利要求1所述链霉菌LS462在生产棘霉素中的应用。

3.用于培养权利要求1所述链霉菌LS462的培养基，是通过如下方法制备得到的培养基：将20-30g可溶性淀粉、0.2-0.6gL-天冬酰胺、0.5-1.0g KNO₃、0.2-0.6gK₂HPO₄·H₂O、0.2-0.6gNaCl和0.2-1.0g MgSO₄·7H₂O用水定容至1L。

4.用于培养权利要求1所述链霉菌LS462的培养基，是通过如下方法制备得到的培养基：将5-15g葡萄糖、10-30g稷粉、10-30g棉籽蛋白粉和10-30g 3-(N-吗啉基)丙磺酸用水定容至1L。

5.一种制备棘霉素的方法，是发酵权利要求1所述链霉菌LS462，得到棘霉素。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述发酵的条件为25-30℃、140-200rpm、6-15天。

7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：将权利要求1所述链霉菌LS462的种子液接种至权利要求4所述培养基中发酵并收获发酵液。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述种子液的制备方法如下：将权利要求1所述链霉菌LS462接种于权利要求3所述培养基中，25-30℃、140-200rpm培养2-6天，得到种子液。

9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤：

(1)将所述发酵液离心，分别收集上清液和沉淀；

(2)将步骤(1)获得的沉淀用丙酮浸提，离心并收集上清液；

(3)将步骤(1)的上清液和步骤(2)的上清液合并，即为棘霉素粗提液；

(4)将所述棘霉素粗提液上样于HP-20大孔吸附树脂，依次用体积百分比为40％和60％的丙酮水溶液洗脱，收集用60％丙酮水溶液洗脱得到的过柱后洗脱液；

(5)将步骤(4)收集的过柱后洗脱液蒸干并用丙酮重新溶解，过滤后进行反相HPLC；反相HPLC参数：采用Agilent ZORBAX XDB C-18 column；流动相为体积百分比为70％的甲醇水溶液，流速为2.0ml/min；收集保留时间为26.3-27.2min的过柱后洗脱液，得到棘霉素。

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