CN103536897A - 抑制淀粉样多肽聚集的复合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抑制淀粉样多肽聚集的复合物及其制备方法和应用,所述复合物由短肽抑制剂和佐剂按1:5~10:1的摩尔比组成,所述短肽抑制剂选自β-淀粉样多肽的3-10个氨基酸的片段、其突变体及衍生物;所述佐剂选自含氮杂环化合物及其衍生物,所述复合物通过将短肽抑制剂与佐剂按1:5~10:1的摩尔比,溶解到缓冲液中制备混合溶液,使短肽抑制剂的终浓度为10-100μM,再孵育制得;所述复合物用于制备抑制淀粉样多肽对细胞毒害作用的药物或用于制备治疗和/或预防与淀粉样多肽有关的疾病的药物。本发明在分子水平上揭示分子与淀粉样多肽的相互作用,为研究药物分子与淀粉样多肽相互作用机理,提供了有效方法。
Description
本申请要求2012年7月16号提交的名称为“抑制淀粉样多肽聚集的复合物及其制备方法和应用”,申请号为201210246344.1的发明专利申请的优先权。
技术领域
本发明属于生物医学技术领域。本发明一般地涉及一种复合物,尤其涉及一种抑制淀粉样多肽聚集的复合物。本发明还涉及所述抑制淀粉样多肽聚集的复合物的制备方法和应用。通过本发明的抑制淀粉样多肽聚集的复合物,可以大大提高对淀粉样多肽的聚集和毒性的抑制效果。
背景技术
淀粉样多肽的错误折叠和异常组装行为与人类很多退行性疾病的发病机制密切相关,如阿尔茨海默症(AD)、帕金森氏症(PD)、亨廷顿氏症(HD)、前额颞退行病变(FTLD)、脊索侧索硬化症(ALS)、II型糖尿病、牛海绵状脑病(BSE)、克罗伊茨费尔特-雅各布氏病(CJD)等以及某些癌症等。作为全球人口第一大国和老龄化社会的现状,退行性疾病造成严重的社会和家庭负担,成为我国必须面对的重大社会问题。以AD为例,它最重要的病理学特征之一为神经细胞外淀粉样物质沉积形成斑块,其主要组成成分β淀粉样蛋白(amyloid protein,Aβ),是由跨膜的淀粉样前体蛋白(APP)经β和γ分泌酶水解产生的含有39-42个氨基酸残基的多肽。研究结果表明,淀粉样多肽通过聚集形成的寡聚体、原纤维、纤维都对神经细胞有毒害。通过进一步的研究,人们了解到位于Aβ42中11-25这段疏水区域是Aβ聚集的核心片段,尤其Aβ16-20:KLVFF五肽片段尤为关键,不仅关系到Aβ的纤维化,而且可以识别Aβ相应区域,与Aβ发生特异性相互作用。(可参考Klein,W.L.等人,Neurochemistry International2002,41,345;Lambert,M.P.;Klein,W.L.等人,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America1998,95,6448.;Selkoe,D.J.,Nature2003,426,900.;Tjernberg,L.O.等人,Journal of Biological Chemistry1996,271(15),8545-8548.)
由此可知,如果以KLVFF等五肽序列为核心片段,设计一系列短肽类抑制剂,会有效的干扰Aβ-Aβ之间的相互作用,从而影响其聚集过程和神经毒性。目前的研究主要是利用有机合成的方法合成多肽抑制剂:(1)改变多肽序列,如在KLVFF的末端连接某些寡聚氨基酸成为KLVFF-寡聚氨基酸嵌段分子,可以增大KLVFF抑制Aβ聚集的能力,更有效地降低Aβ的神经毒性;(2)形成多聚体衍生物,如通过合成的方法连接成为树枝状多聚体,也可以有效与Aβ结合,抑制原纤维向纤维转化,并且促进聚集体的解聚;(3)末端增加有机配体,如在多肽的末端或者其他位置连接有效的有机小分子官能团,来增加多肽片段与Aβ的作用强度和对Aβ聚集以及神经毒性的抑制效果,也是效果显著的分子设计手段。(可参考Chafekar,S.M.等人,ChemBiochem2007,8(15),1857-1864.;Findeis,M.A.等人,Biochemistry1999,38(21),6791-6800.;Gibson,T.J.等人,Biochemistry2005,44(24),8898-8907.)由于涉及认知评价的模式动物评价过程复杂,对于淀粉样多肽的聚集和毒性抑制多采用细胞筛选的方法[可参考T.L.Lowe,等人,"Structure-function relationships for inhibitors of beta-amyloid toxicity containing the recognition sequence KLVFF,"Biochemistry,40(2001),7882-89;M.M.Pallitto,等人"Recognition sequence design for peptidyl modulators of beta-amyloid aggregation and toxicity,"Biochemistry,38(1999),3570-78.;T.Takahashi and H.Mihara,"Peptide and Protein Mimetics Inhibiting Amyloid beta-Peptide Aggregation,"Acc.Chem.Res.,41(2008),1309-18.]。
上述报道的几种抑制淀粉样多肽毒性的方法,均从合成短肽类抑制剂的角度来实现对淀粉样多肽的聚集调控和神经毒性抑制的效果,目前尚未有利用非共价键作用制备短肽类抑制剂的方法。
发明内容
有助于理解本发明,下面定义了一些术语。本文定义的术语具有本发明相关领域的普通技术人员通常所理解的含义。
除非另外说明,本文中的“抑制剂”指的是可以抑制淀粉样多肽的聚集和/或毒性的短肽。
除非另外说明,本文中的“短肽”指的是可以抑制淀粉样多肽的聚集和/或毒性的多肽片段。
除非另外说明,本文中的“佐剂”或“佐剂分子”指的是可以和抑制剂或者短肽相互作用,调节淀粉样多肽聚集行为和毒性的吡啶类和多酚类化合物。
除非另外说明,本文中的“抑制剂-佐剂复合物”指的是由短肽与吡啶类 和多酚类化合物通过非共价相互作用形成的组装单元或者复合物,它可以抑制淀粉样多肽聚集和/或毒性。
除非另外说明,本文中的“淀粉样多肽”指的是淀粉样多肽以及淀粉样多肽的片段。
除非另外说明,在本文中,“μM”是指“μmol/L”,“mM”是指“mmol/L”。
除非另外说明,本文中的“复合物”是指由两种或两种以上的不同物质所形成的结合体。例如,所述不同物质可通过相互结合,相互缔合或相互络合而形成结合体,如缀合物或络合物等。
除非另外说明,本文中的“Cl-Ter”是指“4’-氯-2,2’:6’,2”-三吡啶”,“EGCG”是指“(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯”。
针对现有技术的不足,本发明期望提供一种抑制淀粉样多肽毒性的新思路和新方法。因此,本文的一个目的是利用佐剂跟抑制剂形成的复合物及其在制备用于抑制淀粉样多肽对细胞毒害作用的药物中的用途。本文的另一个目的是提供该复合物在制备用于抑制淀粉样多肽对细胞毒害作用的抑制剂中的用途。本发明的又一个目的是提供该复合物在制备治疗和/或预防与淀粉样变有关的疾病药物中的用途。
针对上述目的,本发明的技术方案如下:
一方面,本发明提供一种抑制淀粉样多肽聚集的抑制剂-佐剂复合物,所述抑制剂-佐剂复合物由短肽抑制剂和佐剂按1:5~10:1的摩尔比组成,优选地,所述抑制剂-佐剂复合物由短肽抑制剂和佐剂按1:5~5:1组成,进一步优选地,所述抑制剂-佐剂复合物由短肽抑制剂和佐剂按1:5~1:1的摩尔比组成,更优选地,所述抑制剂-佐剂复合物由短肽抑制剂和佐剂按1:1的摩尔比组成;
所述短肽抑制剂选自β-淀粉样多肽的3-10个氨基酸的片段、其突变体及衍生物,优选地,该短肽抑制剂的序列含有下述SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列:KLVFF;
所述佐剂选自吡啶类和多酚类化合物。
优选地,所述短肽抑制剂为Aβ16-20和/或Aβ17-21,所述Aβ16-20的序列为下述SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列:KLVFF,所述Aβ17-21的序列为下述SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列:LVFFA。
更优选地,所述短肽抑制剂为Aβ16-20。
优选地,所述吡啶化合物选自4,4’-联吡啶、1,2-二(4-吡啶基)乙烯、三联吡啶和4’-氯-2,2’:6’,2”-三吡啶中的一种或多种,更优选地,所述吡啶化合物为4’-氯-2,2’:6’,2”-三吡啶,即Cl-Ter。
优选地,所述多酚类化合物及其衍生物可选自(-)-表没食子儿茶素没食 子酸酯、白藜芦醇、花青素、姜黄素和紫杉叶素中的一种或多种。更优选地,所述多酚类化合物及其衍生物可为(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯,即EGCG。
另一方面,本发明提供一种抑制淀粉样多肽聚集的抑制剂-佐剂复合物的制备方法,所述方法包括将短肽抑制剂与佐剂按1:5~10:1的摩尔比,溶解到缓冲液中制备混合溶液,使短肽抑制剂的终浓度为10-100μM,再将混合溶液于室温孵育形成抑制淀粉样多肽聚集的抑制剂-佐剂复合物,优选地,所述短肽抑制剂的浓度为50μM溶液,即得。
优选地,所述短肽抑制剂和佐剂的摩尔比为1:5~5:1,更优选地,所述短肽抑制剂和佐剂的摩尔比为1:5~1:1,再优选地,所述短肽抑制剂和佐剂的摩尔比为1:1。
优选地,所述缓冲液为pH6.8-7.5的磷酸盐缓冲液,更优选地,所述缓冲液为pH7.4的磷酸盐缓冲液。
优选地,所述混合溶液于室温孵育0.5-3小时,优选1小时。
再一方面,本发明提供一种抑制淀粉样多肽聚集的抑制剂-佐剂复合物在制备用于抑制淀粉样多肽聚集或对细胞毒害作用的药物中的应用。
又一方面,本发明提供一种抑制淀粉样多肽聚集的抑制剂-佐剂复合物在制备用于治疗和/或预防与淀粉样多肽有关的疾病的药物中的应用。
优选地,所述淀粉样多肽为阿尔茨海默氏病相关的β-淀粉样多肽(Aβ)、2型糖尿病相关的胰淀素(Amylin)、亨廷顿氏病相关的多聚谷氨酰胺(PolyQ)、帕金森氏病相关的核突触蛋白(-Synuclein)、牛海绵状脑病和克罗伊茨费尔特-雅各布氏病相关的朊病毒(Prion)。
优选地,所述淀粉样多肽为β-淀粉样多肽Aβ,更优选地,所述β-淀粉样多肽Aβ选自β-淀粉样多肽Aβ1-42(Aβ42)、β-淀粉样多肽Aβ1-40(Aβ1-40)、β-淀粉样多肽Aβ1-28(Aβ28)、β-淀粉样多肽Aβ33-42(Aβ33-42)、β-淀粉样多肽Aβ10-20(Aβ10-20)及其片段中的一种或多种,所述β-淀粉样多肽Aβ1-42的序列为SEQ ID NO:3(DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA)所示的氨基酸序列,所述β-淀粉样多肽Aβ1-40的序列为SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列(DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV),所述β-淀粉样多肽Aβ1-28的序列为SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列(DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK),所述β-淀粉样多肽Aβ33-42的序列为SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列(GLMVGGVVIA),所述β-淀粉样多肽Aβ10-20的序列为SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列 (YEVHHQKLVFF);最优选地,所述淀粉样多肽为β-淀粉样多肽Aβ1-42(Aβ1-42)。
再一方面,本发明提供一种抑制淀粉样多肽的聚集或神经毒性的方法,包括以下步骤:
步骤A:制备淀粉样多肽溶液,淀粉样多肽与短肽抑制剂的混合溶液、淀粉样多肽与佐剂的混合溶液,及淀粉样多肽与本发明所述的复合物的混合溶液,再将其于室温孵育;
步骤B:将孵育后的步骤A的溶液,利用原子力显微技术分别观察短肽抑制剂、佐剂、所述复合物对淀粉样多肽的聚集体形貌的影响。
步骤C:将孵育后的步骤A的溶液,利用荧光光谱技术(或连续光谱多功能酶标仪)分别测试短肽抑制剂、佐剂、所述复合物对淀粉样多肽聚集体的调控效果。
步骤D:将孵育后的步骤A的溶液,利用细胞毒性测试实验分别检测短肽抑制剂、佐剂、所述复合物对淀粉样多肽细胞毒性的抑制效果。
优选地,所述步骤A具体包括以下步骤:
步骤A.1:将淀粉样多肽溶解于缓冲液中,制成淀粉样多肽溶液,优选地,将淀粉样多肽溶解到pH=6.8-7.5的磷酸缓冲液中,进一步优选地,将淀粉样多肽溶解到pH=7.4的磷酸缓冲液中;
步骤A.2:将淀粉样多肽分别与短肽抑制剂、佐剂,溶解于缓冲液中,制得短肽抑制剂和淀粉样多肽混合溶液及佐剂和淀粉样多肽混合溶液,优选地,将淀粉样多肽分别与短肽抑制剂或佐剂溶解于pH=6.8-7.5的磷酸缓冲液中,于37℃孵育1-3天,进一步优选地,,更优选地,将淀粉样多肽分别与短肽抑制剂、佐剂溶解于pH=6.8-7.5的磷酸缓冲液中,于37℃孵育2天;
步骤A.3:将短肽抑制剂和佐剂,溶解于缓冲液中,制得混合溶液,使短肽抑制剂的浓度为10-125μM,优选10-100μM,再于室温孵育形成抑制淀粉样多肽聚集的抑制剂-佐剂复合物溶液,优选地,使短肽抑制剂的浓度为50μM或125μM,更优选地,将淀粉样多肽溶解于pH=6.8-7.5的磷酸缓冲液中,于室温孵育0.5-3小时,进一步优选地,将短肽抑制剂和佐剂溶解于pH=7.4的磷酸缓冲液中,于室温孵育1小时;
步骤A.4:将步骤A.3得到的抑制剂-佐剂复合物溶液与步骤A.1制得的淀粉样多肽溶液混合,然后将所得混合物溶解到缓冲液中,使抑制剂-佐剂复合物中的短肽抑制剂部分与淀粉样多肽的浓度均为10-125μM,优选10-100μM的溶液,得到复合物与淀粉样多肽的混合溶液,再将其孵育,优选地,使抑制剂-佐剂复合物中的短肽抑制剂部分与淀粉样多肽的浓度均 为50μM溶液,或者使抑制剂-佐剂复合物中的短肽抑制剂的浓度为125μM、淀粉样多肽的浓度为62.5μM,更优选地,所述缓冲液为pH=6.8-7.5的磷酸缓冲液,还优选地,所述混合溶液于37℃共同孵育1-3天,进一步优选地,所述混合溶液于37℃共同孵育2天。
优选地,在步骤A.1中,当利用原子力显微技术观察短肽抑制剂、佐剂、所述抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽的聚集体形貌的影响时,所述淀粉样多肽溶液的浓度为10-100μM,更优选地,所述淀粉样多肽溶液的浓度为50μM;或
当利用荧光光谱技术测试短肽抑制剂、佐剂、所述抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽聚集体的调控效果时,所述淀粉样多肽溶液的浓度为1-5μM,更优选地,所述淀粉样多肽溶液的浓度为2.5μM;或利用连续光谱多功能酶标仪测试短肽抑制剂、佐剂、所述抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽聚集体的调控效果,所述淀粉样多肽溶液的浓度为10-125μM,更优选地,所述淀粉样多肽溶液的浓度为62.5μM。
当利用细胞毒性测试实验检测短肽抑制剂、佐剂、所述抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽细胞毒性的抑制效果时,所述淀粉样多肽溶液的浓度为50-500μM,优选地,所述淀粉样多肽溶液的浓度为300μM。
优选地,在步骤A.2中,当利用原子力显微技术观察短肽抑制剂、佐剂、所述抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽的聚集体形貌的影响时,所述淀粉样多肽分别与短肽抑制剂、佐剂按1:1的摩尔比溶解于缓冲液中;或
当利用荧光光谱技术测试短肽抑制剂、佐剂、所述抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽聚集体的调控效果时,所述淀粉样多肽分别与短肽抑制剂、佐剂和所述抑制剂-佐剂复合物按1:1的摩尔比溶解于缓冲液中,优选地,所述淀粉样多肽分别与短肽抑制剂、佐剂和所述抑制剂-佐剂复合物按2.5μM:2.5μM的摩尔比溶解于缓冲液中,即将所述淀粉样多肽(2.5μM)分别与短肽抑制剂(2.5μM)、佐剂(2.5μM)和所述抑制剂-佐剂复合物(2.5μM)混合溶解于缓冲液中;当利用连续光谱多功能酶标仪测试短肽抑制剂、佐剂、所述抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽聚集体的调控效果时,所述淀粉样多肽分别与短肽抑制剂、佐剂按1:2的摩尔比溶解于缓冲液中,优选地,所述淀粉样多肽分别与短肽抑制剂、佐剂按62.5μM:125μM的摩尔比溶解于缓冲液中;即当利用连续光谱多功能酶标仪测试短肽抑制剂、佐剂、所述抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽聚集体的调控效果时,所述淀粉样多肽分别与短肽抑制剂、佐剂和所述抑制剂-佐剂复合物按1:1的摩尔比溶解于缓冲液中,优选地,所述淀粉样多肽(62.5μM)分别与短肽抑制剂(125μM)、佐剂(125μM)和所述抑制剂-佐剂复合物(125μM)混合 溶解于缓冲液中。
当利用细胞毒性测试实验检测短肽抑制剂、佐剂、所述抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽细胞毒性的抑制效果时,所述淀粉样多肽分别与短肽抑制剂、佐剂按5:1~1:1的摩尔比溶解于缓冲液中,优选地,所述淀粉样多肽分别与短肽抑制剂、佐剂按300μM:30μM、300μM:60μM、300μM:150μM、300μM:300μM的摩尔比溶解于缓冲液中。所述淀粉样多肽分别与短肽抑制剂、佐剂按10μM:20μM的摩尔比溶解于缓冲液中。
优选地,在步骤A.3中,将短肽抑制剂和佐剂按1:5~10:1的摩尔比,溶解到缓冲液中,制得混合溶液,室温孵育形成抑制淀粉样多肽聚集的抑制剂-佐剂复合物溶液,优选地,所述抑制剂-佐剂复合物由短肽抑制剂和佐剂按1:5~5:1组成,最优选地,所述抑制剂-佐剂复合物由短肽抑制剂和佐剂按1:1的摩尔比组成。
优选地,在步骤B中,还包括将步骤A.1、A.2、A.3、A.4得到的混合溶液分别滴加到云母、硅片等平整基底上,然后空气干燥后,在固/气界面获得各自的原子力显微镜图像的步骤。
优选地,在步骤C中,利用荧光光谱技术测试短肽抑制剂、佐剂、所述抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽聚集体的调控效果时,还包括制备荧光染料分子溶液,再将步骤A.1、A.2、A.3、A.4得到的中制备的溶液分别与所述的荧光染料分子溶液混合之后放入标准的石英池中,在荧光光谱仪中进行测试的步骤。利用连续光谱多功能酶标仪测试短肽抑制剂、佐剂、所述抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽聚集体的调控效果时,也包括制备荧光染料分子溶液,并将步骤A.1、A.2、A.3、A.4中制备的溶液分别与所述的荧光染料分子溶液混合之后接种到酶标板中,在连续光谱多功能酶标仪中进行荧光强度测试的步骤。
优选地,在步骤C中,还包括将步骤A.1、A.2、A.3、A.4得到的混合溶液分别取5μL加入培养好的神经肿瘤细胞中,孵育后,利用酶标仪测试细胞样品的吸光度值来测试神经肿瘤细胞的存活率,通过存活率判断淀粉样多肽对神经肿瘤细胞损伤的程度的步骤。
优选地,所述淀粉样多肽溶液的最终浓度为5-20μM,在淀粉样多肽和短肽抑制剂的混合溶液中及淀粉样多肽和佐剂的混合溶液中,所述短肽抑制剂和佐剂的最终浓度均为1μM,2μM,5μM,10μM,20μM;在淀粉样多肽和抑制剂-佐剂复合物的混合溶液中,所述短肽抑制剂和佐剂的摩尔比为1μM:1μM,2μM:2μM,5μM:5μM,10μM:10μM,1μM:10μM,1μM:10μM,10μM:5μM,20μM:20μM。
更优选地,所述淀粉样多肽溶液的最终浓度为10μM,进一步优选地, 孵育1-3天,还优选地,孵育2天。
以下是本发明的详细描述:
为了获得本发明的技术方法,本发明进行了以下几个方面的探索和研究:
1)将短肽抑制剂进行组装,获得短肽组装体的扫描隧道显微镜图像;
所述组装体的制备方法包括如下步骤:
a1.将所述短肽抑制剂制成溶液;
b1.将步骤a1得到的溶液滴加到导电性基底,例如石墨,金、银、铜、铂等金属基底以及硅等半导体基底表面,以形成组装体。
除去溶剂后,在固/气界面获得短肽抑制剂组装体的扫描隧道显微镜图像。
2)将短肽抑制剂和佐剂进行共组装,以获得抑制剂-佐剂复合物的扫描隧道显微镜图像;
所述抑制剂-佐剂复合物的制备方法包括如下步骤:
a2.将所述短肽抑制剂与佐剂充分混合,形成混合液;
b2.将步骤a2得到的混合液滴加到导电性基底,例如石墨,金、银、铜、铂等金属基底以及硅等半导体基底表面,以形成抑制剂-佐剂复合物。
除去溶剂后,在固/气界面获得抑制剂-佐剂复合物的扫描隧道显微镜图像。
在制备短肽抑制剂组装体、抑制剂-佐剂复合物中,采用超声来充分混合;所述导电性基底为石墨,优选为新解理的高定向热解石墨。高定向热解石墨具有原子级平整的表面,而且在很多环境中都很稳定,适于扫描隧道显微镜表征。
此外,在制备短肽抑制剂组装体和抑制剂-佐剂复合物中,还包括除去基底表面残留液的步骤,可以采用吹惰性气体(例如氮气)的方式来除去所述基底表面的残留液。
3)将淀粉样多肽溶解到磷酸缓冲液中,与抑制剂-佐剂复合物在37℃共同孵育2天,利用原子力显微技术观察短肽抑制剂、佐剂、抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽的聚集形貌的影响。
短肽抑制剂、佐剂、抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽的聚集形貌的影响的表征包括如下步骤:
a3.将淀粉样多肽溶解到pH=7.4的磷酸缓冲液中,制成50μM溶液;
b3.将短肽抑制剂与淀粉样多肽按摩尔比为1:1的比例,溶解到pH=7.4的磷酸缓冲液中制备混合溶液,各自的浓度为50μM溶液,在37℃共同孵育2天;
c3.将佐剂与淀粉样多肽按摩尔比为1:1的比例,溶解到pH=7.4的磷酸缓冲液中制备混合溶液,各自的浓度为50μM溶液,在37℃共同孵育2天;
d3.将短肽抑制剂与佐剂按不同的摩尔比,溶解到pH=7.4的磷酸缓冲液中制备混合溶液,室温孵育1小时以形成抑制剂-佐剂复合物,保持短肽抑制剂的浓度为50μM溶液;
e3.将步骤d3得到的抑制剂-佐剂复合物溶液与淀粉样多肽溶液混合,溶解到pH=7.4的磷酸缓冲液中,其中短肽抑制剂和淀粉样多肽的浓度均为50μM溶液,混合溶液在37℃共同孵育2天;
f3.将步骤a3、b3、c3和e3得到的混合溶液分别滴加到云母、硅片等平整基底上,然后空气干燥后,在固/气界面获得各自的原子力显微镜图像。
在制备短肽抑制剂组装体、抑制剂-佐剂复合物中,采用超声来充分混合;所述平整基底为云母、硅片、石墨等,优选为新解理的云母。云母具有原子级平整的表面,而且在很多环境中都很稳定,并且表面亲水性好,适于生物样品的原子力显微镜表征。
4)利用荧光光谱技术测试短肽抑制剂、佐剂、抑制剂-佐剂复合物在磷酸缓冲液中对淀粉样多肽聚集行为的调控效果。
所述荧光光谱所需样品的制备方法包括如下步骤:
a4.将淀粉样多肽制成2.5μM溶液;
b4.将淀粉样多肽和短肽抑制剂的混合溶液制成2.5μM:2.5μM溶液;
c4.将淀粉样多肽和佐剂的混合溶液制成2.5μM:2.5μM溶液;
d4.将短肽抑制剂与佐剂按不同的摩尔比,溶解到磷酸缓冲液中制备混合溶液,室温孵育1小时以形成抑制剂-佐剂复合物,保持短肽抑制剂的浓度为50μM溶液;
e4.制备淀粉样多肽和抑制剂-佐剂复合物的混合溶液,短肽抑制剂和淀粉样多肽的最终浓度均为2.5μM溶液;
f4.将荧光染料分子制成1mM溶液;
g4.将步骤a4、b4、c4、e4中制备的溶液分别与所述的荧光染料分子溶液混合之后放入标准的石英池中,在荧光光谱仪中进行测试。测试选取特定激发波长和发射波长,通过测试发射波长处其荧光强度反映溶液中淀粉样多肽的聚集程度,从而验证多肽抑制剂、佐剂、抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽聚集的调控。
所述荧光光谱仪为PerkinElmer LS55;所述石英池光路长度为1cm;所述测量条件为测试时激发光和检测的发射光波长分别为450nm和482 nm;使用时间驱动模式,光谱的带宽设置为1nm,狭缝宽度为2.5nm。荧光的强度值为15s的时间内所测得的荧光强度的平均值。
所述连续光谱多功能酶标仪测试ThT荧光强度所需样品的制备方法包括如下步骤:
a4.将淀粉样多肽制成62.5μM溶液;
b4.将淀粉样多肽和短肽抑制剂的混合溶液制成125μM:125μM溶液;
c4.将淀粉样多肽和佐剂的混合溶液制成62.5μM:125μM溶液;
d4.将短肽抑制剂与佐剂按不同的摩尔比,溶解到磷酸缓冲液中制备混合溶液,室温孵育1小时以形成抑制剂-佐剂复合物,保持短肽抑制剂的浓度为125μM溶液;
e4.制备淀粉样多肽和抑制剂-佐剂复合物的混合溶液,短肽抑制剂和淀粉样多肽的最终浓度均为125μM溶液;
f4.将ThT荧光染料分子制成1mM溶液;
g4.将步骤a4、b4、c4、e4中制备的溶液分别与所述的荧光染料分子溶液混合使得ThT荧光染料分子的终浓度为20μM,之后将混合液接种到酶标板中,每组样品三个平行样,利用连续光谱多功能酶标仪进行荧光强度的测试。测试选取特定激发波长和发射波长,通过测试发射波长处其荧光强度反映溶液中淀粉样多肽的聚集程度,从而验证多肽抑制剂、佐剂、抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽聚集的调控。
所述连续光谱多功能酶标仪为Tecan infinite M200;所述酶标板为Corning黑色低吸附量96孔酶标板;所述测量条件为测试时激发光和检测的发射光波长分别为450nm和482nm,增益值为100;所述实验条件为室温。每间隔10min-60min测试一次,荧光的强度值为所测三个平行样的平均值。
5)利用细胞毒性测试实验检测多肽抑制剂、佐剂、抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽细胞毒性的抑制效果。
所述淀粉样多肽细胞毒性测试的样品制备方法包括如下步骤:
a5.将所述淀粉样多肽分别制成300μM的溶液;
b5.将所述短肽抑制剂制成30μM,60μM,150μM,300μM,600μM的溶液;
c5.将所述佐剂制成30μM,60μM,150μM,300μM,600μM的溶液;
d5.将短肽抑制剂与佐剂按不同的摩尔比,溶解到磷酸缓冲液中制成30μM:30μM,60μM:60μM,150μM:150μM,300μM:300μM,300μM:30μM,300μM:60μM,300μM:150μM,600μM:600μM的混合溶液,室温孵育1小时以形成抑制剂-佐剂复合物;
e5.将步骤a5中所述的淀粉样多肽溶液取5μL加入到培养好的神经肿瘤细胞中,淀粉样多肽溶液的最终浓度为10μM;经过48小时的孵育后,利用酶标仪测试细胞样品的吸光度值来测试神经肿瘤细胞的存活率,通过存活率判断淀粉样多肽对神经肿瘤细胞损伤的程度。
f5.将步骤a5中所述的淀粉样多肽和步骤b5中不同浓度的短肽抑制剂的溶液各取5μL加入到培养好的神经肿瘤细胞中,淀粉样多肽溶液的最终浓度为10μM,短肽抑制剂的最终浓度为1μM,2μM,5μM,10μM,20μM;经过48小时的孵育后,利用酶标仪测试细胞样品的吸光度值来测试神经肿瘤细胞的存活率,通过存活率判断淀粉样多肽对神经肿瘤细胞损伤的程度。
g5.将步骤a5中所述的淀粉样多肽和步骤e5中所述不同浓度的佐剂的溶液各取5μL加入到培养好的神经肿瘤细胞中,佐剂溶液的最终浓度为1μM,2μM,5μM,10μM,20μM,淀粉样多肽的最终浓度为10μM;经过48小时的孵育后,利用步骤c5中的方法测定短肽抑制剂对淀粉样多肽神经毒性的抑制效果。
h5.将步骤a5中所述的淀粉样多肽和步骤d5中所述不同摩尔比的抑制剂-佐剂复合物溶液各取5μL加入到培养好的神经肿瘤细胞中,佐剂溶液的最终浓度和短肽抑制剂的最终浓度为1μM:1μM,2μM:2μM,5μM:5μM,10μM:10μM,1μM:10μM,1μM:10μM,5μM:10μM,20μM:20μM,淀粉样多肽的最终浓度为10μM。经过48小时的孵育后,利用步骤e5中的方法测定短肽抑制剂对淀粉样多肽神经毒性的抑制效果。
优选地,所述淀粉样多肽为β-淀粉样多肽。
优选地,所述β-淀粉样多肽为β-淀粉样多肽Aβ1-42(Aβ1-42)、β-淀粉样多肽Aβ10-20(Aβ10-20)、β-淀粉样多肽Aβ33-42(Aβ33-42)、β-淀粉样多肽Aβ1-28(Aβ1-28)或β-淀粉样多肽Aβ1-40(Aβ1-40),所述β-淀粉样多肽Aβ1-42的序列为SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列,所述β-淀粉样多肽Aβ1-40的序列为SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列,所述β-淀粉样多肽Aβ1-28的序列为SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列,所述β-淀粉样多肽Aβ33-42的序列为SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列,所述β-淀粉样多肽Aβ10-20的序列为SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
优选地,淀粉样多肽为β-淀粉样多肽1-42(Aβ1-42)。
优选地,所述短肽抑制剂可以选自β-淀粉样多肽的3-10个氨基酸的片段及其突变体和衍生物。
优选地,所述短肽抑制剂的序列含有下述SEQ ID NO:1所示氨基酸序列:KLVFF。
优选地,所述短肽抑制剂为β-淀粉样多肽Aβ16-20(Aβ16-20)和/或 β-淀粉样多肽Aβ17-21(Aβ17-21),所述Aβ16-20的序列为下述SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列:KLVFF,所述Aβ17-21的序列为下述SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列:LVFFA。
进一步优选地,所述短肽抑制剂为Aβ16-20。
优选地,所述佐剂选自吡啶类和多酚类化合物。
所述吡啶为4,4’-联吡啶、1,2-二(4-吡啶基)乙烯,三联吡啶、4’-氯-2,2’:6’,2”-三吡啶;进一步优选地,为4’-氯-2,2’:6’,2”-三吡啶,所述多酚类化合物及其衍生物可为(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯、白藜芦醇、花青素、姜黄素和紫杉叶素;进一步优选地,所述多酚类佐剂为(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯。
所述的神经肿瘤细胞为SH-SY5Y细胞,作为神经细胞的模型体系;根据淀粉样多肽的不同,可以选择相应的细胞系验证其毒性抑制效果。
综上所述,本发明的目的在于发展一种抑制淀粉样多肽毒性的新方法,通过加入佐剂在分子水平上调控短肽抑制剂的组装结构,形成全新的抑制剂-佐剂复合物,从而抑制淀粉样多肽的组装、聚集和毒性。
本发明的一个实施方案利用扫描隧道显微技术在分子水平上观察抑制剂-佐剂复合物的组装结构,利用原子力显微技术测试抑制剂-佐剂复合物对于淀粉样多肽聚集体形貌的改变,利用荧光技术测试淀粉样多肽对淀粉样多肽分子聚集行为的调控效果,利用细胞毒性测试技术检测淀粉样多肽对淀粉样多肽神经毒性的抑制。具体包括如下步骤:
步骤1:制备短肽抑制剂的溶液,超声30秒钟;
步骤2:在短肽抑制剂的溶液中,加入佐剂,使其充分混合,形成抑制剂-佐剂复合物;
步骤3:混合之后,将短肽抑制剂溶液、抑制剂-佐剂复合物的溶液各取15微升分别滴在两块新解理的高定向热解石墨表面,静置5分钟;
步骤4:用高纯氮气把残留在石墨表面的溶液吹走;
步骤5:用扫描隧道显微镜来进行观测,分别观察短肽抑制剂的组装结构和抑制剂-佐剂复合物的组装结构,通过观察分析,在单分子水平上确认抑制剂-佐剂复合物的形成。
步骤6:用原子力显微镜来进行观测,分别观察淀粉样多肽的聚集体形貌和短肽抑制剂、佐剂、抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽聚集体形貌的影响,通过观察分析,确认短肽抑制剂、佐剂、抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽的聚集抑制效果。
步骤7:用荧光技术检测50μM和62.5μM淀粉样多肽在溶液中的聚集行为,以及相同浓度短肽抑制剂、佐剂、抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽 加入后对淀粉样多肽聚集的影响。
步骤8:用神经细胞毒性测试方法检测淀粉样多肽的神经细胞毒性以及短肽抑制剂、佐剂、抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽神经毒性的抑制。
本发明利用扫描隧道显微技术在分子水平上观察到了佐剂对短肽抑制剂组装结构的调控,确认了抑制剂-佐剂复合物的形成。在分子水平上提供了佐剂与短肽抑制剂相互作用的位点。
本发明利用原子力显微技术在纳米尺度水平观察到了短肽抑制剂、佐剂、抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽聚集体形貌的调控。可以使人们直观地观察到短肽抑制剂、佐剂、抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽的聚集调控效果,特别是清楚地观察到抑制剂-佐剂复合物在抑制淀粉样多肽的聚集方面的良好效果。
本发明利用荧光光谱技术揭示了短肽抑制剂、佐剂、抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽分子聚集行为的调控效果。
本发明提出了一种利用非共价键相互作用制备淀粉样多肽聚集的抑制剂的新方法,并发现了一类新的高效抑制淀粉样多肽聚集的抑制剂-佐剂复合物。
本发明可以在分子水平上揭示分子与淀粉样多肽的相互作用,为研究药物分子与淀粉样多肽相互作用机理,提供了有效方法。
附图说明
以下,结合附图来详细说明本发明的实施方案,其中:
图1是短肽抑制剂Aβ16-20组装体的扫描隧道显微镜图像和Aβ16-20组装结构图;
图2是短肽抑制剂Aβ16-20与佐剂4’-氯-2,2’:6’,2”-三吡啶形成共组装结构的扫描隧道显微镜图像,图中a-d分别表示短肽抑制剂与佐剂的摩尔比分别为5:1,1:1,1:1,1:5的显微镜图像;
图3是短肽抑制剂Aβ16-20、佐剂4’-氯-2,2’:6’,2”-三吡啶及不同摩尔比的抑制剂-佐剂复合物的1H核磁共振(NMR)谱图,其中,图3a为短肽抑制剂的1H核磁共振(NMR)谱图,图3b为佐剂的1H核磁共振(NMR)谱图,图3c为短肽抑制剂和佐剂的摩尔浓度为5:1时形成的抑制剂-佐剂复合物的1H核磁共振(NMR)谱图,图3d为短肽抑制剂和佐剂的摩尔浓度为1:1时形成的抑制剂-佐剂复合物的1H核磁共振(NMR)谱图,图3e为短肽抑制剂和佐剂的摩尔浓度为1:5时形成的抑制剂-佐剂复合物的1H核磁共振(NMR)谱图;
图4是佐剂、短肽抑制剂、抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽Aβ1-42聚 集体形貌调控的原子力显微镜图像;其中,图4a为淀粉样多肽Aβ1-42聚集体的原子力显微镜图像;图4b为淀粉样多肽Aβ1-42与短肽抑制剂Aβ16-20形成的共组装体的原子力显微镜图像;图4c为淀粉样多肽Aβ1-42与佐剂4’-氯-2,2’:6’,2”-三吡啶形成的组装体的原子力显微镜图像;图4d为淀粉样多肽Aβ1-42与摩尔比为1:1的抑制剂-佐剂复合物调形成的共组装体的原子力显微镜图像,图中的1μm表示X和Y坐标轴的比例尺,30nm表示Z坐标轴的比例尺;
图5是佐剂、短肽抑制剂、抑制剂-佐剂复合物在溶液中对淀粉样多肽聚集调控的硫磺素(ThT)荧光结果;其中,图5a为淀粉样多肽Aβ1-42自聚集、短肽抑制剂Aβ16-20(KLVFF)抑制淀粉样多肽Aβ1-42的聚集、佐剂4’-氯-2,2’:6’,2”-三吡啶(Cl-Ter)加速淀粉样多肽Aβ1-42聚集的ThT荧光结果,图中的方块构成的曲线为淀粉样多肽Aβ1-42自聚集的结果,三角构成的曲线为短肽抑制剂Aβ16-20(KLVFF)抑制淀粉样多肽Aβ1-42的聚集,圆点构成的曲线为佐剂4’-氯-2,2’:6’,2”-三吡啶(Cl-Ter)加速淀粉样多肽Aβ1-42聚集的ThT荧光结果;图5b-f分别为Aβ1-42:Aβ16-20:4’-氯-2,2’:6’,2”-三吡啶的摩尔比为5:5:1、5:5:2.5、5:5:5、5:5:10、5:5:25时,抑制剂-佐剂复合物抑制淀粉样多肽Aβ1-42聚集的荧光结果,图中的方块构成的曲线为淀粉样多肽Aβ1-42自聚集的结果,星形构成的曲线为抑制剂-佐剂复合物抑制淀粉样多肽Aβ1-42聚集的荧光结果;图6是淀粉样多肽的神经细胞毒性以及短肽抑制剂、佐剂、抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽神经毒性的抑制的细胞毒性测试实验;其中,图6a为1μM,2μM,5μM和10μM不同浓度的短肽抑制剂Aβ16-20的神经细胞毒性测试结果;图6b为1μM,2μM,5μM和10μM不同浓度的佐剂4’-氯-2,2’:6’,2”-三吡啶的的神经细胞毒性测试结果;图6c为不同摩尔比(10μM:1μM、10μM:2μM、10μM:5μM、10μM:10μM)的短肽抑制剂Aβ16-20与佐剂4’-氯-2,2’:6’,2”-三吡啶形成的抑制剂-佐剂复合物的神经细胞毒性测试结果;图6d为淀粉样多肽Aβ1-42的浓度保持在10μM不变,不同浓度的短肽抑制剂Aβ16-20对淀粉样多肽神经细胞损伤的抑制效果(Aβ1-42/Aβ16-20:10μM:1μM、10μM:2μM、10μM:5μM、10μM:10μM)以及摩尔比为1:1的抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽神经细胞损伤的抑制效果(Aβ1-42/Aβ16-20/4’-氯-2,2’:6’,2”-三吡啶:10μM:1μM:1μM、10μM:2μM:2μM、10μM:5μM:5μM、10μM:10μM:10μM);e为淀粉样多肽Aβ1-42的浓度保持在10μM不变,不同浓度的短肽抑制剂Aβ16-20对淀粉样多肽神经细胞损伤的抑制效果(Aβ1-42/Aβ16-20:10μM:1μM、10μM:2μM、10μM:5μM、10μM:10μM);不同摩尔比的抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽神经细胞损伤的抑制效果,其中短肽抑制剂Aβ16-20与淀粉样多肽Aβ1-42 的摩尔比保持1:1(Aβ1-42/Aβ16-20/4’-氯-2,2’:6’,2”-三吡啶:10μM:10μM:1μM、10μM:10μM:2μM、10μM:10μM:5μM、10μM:10μM:10μM)。
图7为利用ThT荧光光谱技术在连续光谱多功能酶标仪中测试佐剂EGCG、短肽抑制剂、抑制剂-EGCG复合物在溶液中对淀粉样多肽聚集调控的硫磺素(ThT)荧光结果;具体的,图7为Aβ1-42:Aβ16-20:EGCG的摩尔比为1:2:2时,抑制剂-EGCG复合物抑制淀粉样多肽Aβ1-42聚集的荧光结果,图中的方块构成的曲线为淀粉样多肽Aβ1-42自聚集的ThT荧光强度结果,圆点构成的曲线为短肽抑制剂Aβ16-20抑制淀粉样多肽Aβ1-42聚集的ThT荧光强度结果,三角形构成的曲线为EGCG抑制淀粉样多肽Aβ1-42聚集的ThT荧光强度结果;星形构成的曲线为抑制剂-EGCG复合物抑制淀粉样多肽Aβ1-42聚集的荧光强度结果;
图8为10μM淀粉样多肽Aβ1-42、20μM短肽抑制剂Aβ16-20、20μMEGCG、20μM的抑制剂-EGCG复合物的神经细胞毒性测试结果,以及20μM的短肽抑制剂、20μM的EGCG、20μM的抑制剂-EGCG复合物对10μM淀粉样多肽Aβ1-42神经毒性的抑制效果(Aβ1-42/Aβ16-20/EGCG:10μM:20μM:20μM)。
具体实施方式
除非特别指明,以下实施例中所用的试剂均为分析纯级试剂,且可从正规渠道商购获得。
实施例1基于扫描探针显微镜来观察短肽抑制剂的组装结构以及佐剂1对短肽抑制剂组装结构的调控
1、所使用物质的化学结构
短肽抑制剂(Aβ16-20(SEQ ID NO:1),上海科肽生物技术有限公司,纯度为98%)和佐剂1(4’-chloro-2,2’:6’,2”-terpyridine,Acros),如下式所示:
短肽抑制剂,β-淀粉样多肽16-20(Aβ16-20)
佐剂1,(4’-chloro-2,2’:6’,2”-terpyridine)
2、具体方法
1)利用扫描隧道显微技术检测短肽抑制剂Aβ16-20的组装结构和佐剂1对短肽抑制剂Aβ16-20的组装结构的调控。
先将短肽抑制剂(Aβ16-20)和吡啶类佐剂1()混合于水溶液中,超声1分钟,充分混合之后,取出15微升溶液,滴到新解理的高定向热解石墨(ZYB级,Veeco,美国)表面,静置10分钟,使混合体系形成共组装体(抑制剂-佐剂1复合物)并沉积在石墨表面上之后,再用高纯氮气吹干。
利用商品化的多模式扫描探针显微镜(SPM,Nanoscope IIIa型,Veeco公司,美国),实验条件为大气下恒电流模式,对短肽抑制剂、抑制剂-佐剂1复合物分别进行扫描,得到高分辨STM图像(如图1和2所示);
如图1所示,我们发现Aβ16-20组装体的结构特征为片层结构,无头无尾的连续组装体,通过测量,我们得到相邻两条多肽链间的距离为0.47±0.01nm,这个距离与形成β折叠结构的多肽链间距相吻合。图中是根据所得的STM图像搭建的聚集结构示意图。
如图2中a所示,从图像中我们可以看出Aβ16-20/佐剂1体系形成的抑制剂-佐剂1复合物依然为片层结构,不同的是,佐剂1打破了Aβ16-20无头无尾的连续组装结构,以条陇结构存在,而佐剂1分子伴随在Aβ16-20的陇间,与Aβ16-20相互作用。此时是两个短肽抑制剂分子中间夹杂一个三吡啶分子的三明治结构,而且每个条陇中的短肽抑制剂分子可以看作是以平行的β折叠方式存在。基于这些结论,在图2中a的STM图中也搭建了一个结构示意图。通过测量,短肽抑制剂KLVFF分子轴线与条陇方向的夹角为33±2°,KLVFF和Cl-Ter的分子尺寸分别为1.6±0.2nm和1.0±0.1nm,这都与理论值相符,而结构单元的尺寸分别为:a=0.9±0.1nm,b=5.0±0.2nm,和α=42±1°。
如图2中b所示,Aβ16-20/佐剂1形成的抑制剂-佐剂1复合物结构发生了变化,有两种形式存在,第一种是一类边缘曲折的陇状片层结构;如图2 中c所示,第二种是梯型的陇状片层结构。与图2中a中的组装结构相比,这两种结构中的短肽抑制剂分子从头对头的形式转变成了互相交叉的形式,排列方式从平行变成了反平行。此外,图2中a中由两条短肽抑制剂多肽链与一个佐剂1形成的抑制剂-佐剂1复合物转变为佐剂1之间通过氢键相互作用组装成二聚体,再错位组装形成线形。佐剂1分子还与短肽抑制剂Aβ16-20的分子通过氢键相互作用形成抑制剂-佐剂1复合物。佐剂1分子中的Cl-和N-原子都可以与短肽抑制剂的端基相互作用,所以形成了短肽抑制剂分子交叉排列的组装结构。从高分辨图像里面,我们还以观测到更多的细节,第一种边缘曲折的陇状片层结构中相邻的两对佐剂1分子稍微错开了一点,相对来说较松散,因此整体看来边缘是参差不齐的曲折形状,为了使组装结构稳定,多出来一条KLVFF分子共吸附在了空隙位置,因此每个结构单元里面佐剂1相对于短肽抑制剂KLVFF的摩尔比为4:5。相对于这种松散的结构,第二种是一种紧密堆积的梯形陇状片层结构,像图2中c所看到的,条陇边缘是整齐的,相邻的两对佐剂1分子没有错开,每个结构单元里面佐剂1相对KLVFF的摩尔比为1:1。与之前的测量结果类似,KLVFF和佐剂1的分子尺寸也是1.6±0.2nm和1.0±0.1nm。
如图2中d所示,佐剂1相对KLVFF的摩尔比增大到5:1时,占主导的组装结构正是这种网格结构,每个佐剂1分子围成的菱形格子里面填充着两条KLVFF短肽分子,相邻的格子里短肽抑制剂的排列位置垂直。这两种相邻的格子交叉的位置是四个佐剂1分子通过C-H…N氢键旋转咬合在一起,然后再与KLVFF分子氢键相互作用。在这一部分,每四个格子组成一个结构单元,两种垂直方向的格子各占两个。测量得到的KLVFF和佐剂1的分子尺寸是1.7±0.2nm和1.0±0.1nm。
2)利用核磁共振技术(NMR)检测短肽抑制剂和佐剂1之间复合物的形成
利用BRUKER AVANCE400MHz的液体NMR谱仪对短肽抑制剂KVLFF、佐剂1,以及摩尔比为5:1,1:1和1:5的抑制剂-佐剂1复合物进行了1HNMR的测试,溶剂采用氘代DMSO-d6(99.9%)。
图3的1HNMR结果表明,与单纯的短肽抑制剂、单纯的佐剂1(图3a,3b)相比,在5:1,1:1和1:5的抑制剂-佐剂1复合物(图3c-e)中,出现了在短肽抑制剂和佐剂1中都没有出现的两组新峰,当摩尔比为5:1时,峰较弱,很难分辨,说明佐剂1对于短肽抑制剂的结合很弱;当摩尔比为1:1时, 两组新峰分别出现在δ=2.09ppm,和δ=1.08,1.06,1.04,1.02ppm,分别为单峰和四重裂分峰,并且两组峰的峰强在这三个摩尔比的抑制剂-佐剂1复合物中是最强的;当摩尔比为1:5时,两组新峰分别出现在δ=1.99ppm,和δ=1.20,1.18,1.16,1.14ppm。这两组新峰的出现充分说明了短肽抑制剂与佐剂1之间强的相互作用,说明了二者形成抑制剂-佐剂1复合物的可能(参见:基础有机化学,第5章(三)氢谱,作者邢其毅,裴伟伟,徐瑞秋,裴坚,第三版,高等教育出版社)。
3)利用原子力显微技术检测佐剂1、短肽抑制剂、抑制剂-佐剂1复合物对淀粉样多肽聚集体形貌的调控。
利用商品化的多模式扫描探针显微镜(SPM,Nanoscope IIIa型,Veeco公司,美国),实验条件为大气下轻敲模式,对淀粉样多肽、佐剂1与淀粉样多肽混合体系、短肽抑制剂与淀粉样多肽Aβ1-42((SEQ ID NO:3)American Peptide Co.Inc.,纯度为96.3%)混合体系、抑制剂-佐剂1复合物与淀粉样多肽混合体系分别进行扫描,得到高分辨AFM图像(如图4所示);
图4a是淀粉样多肽Aβ1-42的聚集体形貌,AFM图像中是典型的淀粉样多肽聚集形成的粗大纤维结构。图4b-4d所示分别为淀粉样多肽Aβ1-42与短肽抑制剂Aβ16-20、淀粉样多肽与佐剂1、淀粉样多肽Aβ1-42与抑制剂-佐剂1复合物混合体系的聚集体的形貌。在图4b中,短肽抑制剂起到了一定的抑制淀粉样多肽聚集的效果,但是纤维的形成仍然很明显;在图4c中,佐剂1与淀粉样多肽Aβ1-42相互作用后,聚集体的形貌表现为均匀的颗粒;在图4d中,抑制剂-佐剂1复合物大大抑制了淀粉样多肽Aβ1-42的聚集,只有薄膜结构的生成,图像中没有观察到纤维的存在。
4)利用荧光技术测试佐剂1、短肽抑制剂、抑制剂-佐剂1复合物在溶液中对淀粉样多肽分子聚集行为的调控效果。
利用PerkinElmer LS55荧光光谱仪;所述石英池长度为1cm;所述测量条件为测试时激发光和检测的发射光波长分别为450nm和482nm。使用时间驱动模式,光谱的带宽设置为1nm,狭缝宽度为2.5nm。荧光的强度值为测试15s中强度的平均值。整体测试使用衰减模式。得到的荧光结果如图5所示。
如图5所示,图中的由方块形成的曲线代表了Aβ1-42单独聚集的生长曲线,是一条典型的S型生长曲线,相对的,加入Aβ16-20后聚集过程稍微被抑制了,而加入佐剂1后却促进了Aβ1-42的聚集。当把不同比例的短肽 抑制剂Aβ16-20与佐剂1形成的抑制剂-佐剂1复合物加入到Aβ1-42中之后,聚集过程中的荧光信号强度明显的削弱,说明抑制剂-佐剂1复合物对Aβ1-42聚集的抑制效果相比于单独的短肽抑制剂Aβ16-20大大增强(图5b-5f)。
如图5b-5f所示,图中的荧光强度曲线表明,随着短肽抑制剂Aβ16-20与佐剂1的摩尔比的增加,获得的抑制剂-佐剂1复合物对淀粉样多肽的抑制效果增强,摩尔比达到1:1,抑制强度达到最大(图5d)。如果进一步加大佐剂1的比例,抑制效果反而下降。通过荧光技术,可以得出结论,优化抑制剂-佐剂1复合物中短肽抑制剂Aβ16-20与佐剂1的比例,可以优化抑制剂-佐剂1复合物对Aβ1-42聚集的抑制效果。
实施例2利用神经细胞毒性测试方法检测淀粉样多肽Aβ1-42神经毒性和佐剂1、短肽抑制剂、抑制剂-佐剂1复合物对淀粉样多肽神经毒性的抑制
将SH-SY5Y细胞(ECACC,英国)接种于96孔板中(购于Greiner Bio-One Inc.,Longwood,FL,USA),每孔100μL细胞培养液,放于孵箱中37℃下培养。待细胞大约有40%贴壁,且状态良好时,可向细胞培养液内加入淀粉样多肽、佐剂1、短肽抑制剂、抑制剂-佐剂1复合物及淀粉样多肽与他们各自的混合体系,进行细胞毒性测试,细胞浓度为10000个/孔。
将Aβ1-42、Aβ1-42/Aβ16-20/4’-氯-2,2’:6’,2”-三吡啶、Aβ16-20、4’-氯-2,2’:6’,2”-三吡啶、Aβ16-20/4’-氯-2,2’:6’,2”-三吡啶等分别加入细胞培养液内,其最终浓度分别为,Aβ1-42:10μM;Aβ1-42/Aβ16-20:10μM:1μM、10μM:2μM、10μM:5μM、10μM:10μM;Aβ1-42/Aβ16-20/4’-氯-2,2’:6’,2”-三吡啶:10μM:1μM:1μM、10μM:2μM:2μM、10μM:5μM:5μM、10μM:10μM:10μM;Aβ1-42/Aβ16-20/4’-氯-2,2’:6’,2”-三吡啶:10μM:10μM:1μM、10μM:10μM:2μM、10μM:10μM:5μM、10μM:10μM:10μM;Aβ16-20和佐剂1:1μM,2μM,5μM和10μM;Aβ16-20/佐剂1:10μM:1μM、10μM:2μM、10μM:5μM、10μM:10μM;作用48小时后,测试细胞存活率。我们采用WST-8细胞存活试验(Morita,Y.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97,5405;Takeda,K.等,J.Biol.Chem.2000,275,9805),检验淀粉样多肽的细胞毒性以及佐剂1、短肽抑制剂、抑制剂-佐剂1复合物对淀粉样多肽细胞毒性的抑制效果,并以不加任何抑制剂、佐剂1和抑制剂-佐剂1复合物的WST-8细胞作为空白对照。WST-8细胞存活试验中,主要应用CCK-8试剂(Dojindo,日本),其可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为:该试剂 中含有WST-8(其化学名称为:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐),它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被活细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒染料(Formazan dye)。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比,因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。细胞存活率通过测试的吸光度值(OD)显示,OD值越高,细胞存活越多。测试波长为450nm,参比波长为600nm。加入CCK-8后,3-4小时内进行测试。使用酶标仪进行OD值测试。数据分析:试验结果为三次试验的平均值,每次试验平行测试三次。数据为平均值±误差值。数据统计分析使用SPSS专业统计分析软件(SPSS,Chicago),利用配对样品t-检验。当P<0.05时,视为有差异,P<0.01时视为有显著差异。
图6a为1μM,2μM,5μM和10μM不同浓度的短肽抑制剂Aβ16-20的新配置溶液对神经细胞的毒害,通过比较不同浓度时神经细胞存活率来反映短肽抑制剂Aβ16-20的神经毒性。结果显示短肽抑制剂Aβ16-20本身的神经毒性不大。
图6b为1μM,2μM,5μM和10μM不同浓度的佐剂1佐剂1的新配置溶液对神经细胞的毒害,通过比较不同浓度时神经细胞存活率来反映佐剂1的神经毒性。结果显示随着浓度的增加,佐剂1本身的神经毒性逐渐变大。
图6c为:不同摩尔比(10μM:1μM、10μM:2μM、10μM:5μM、10μM:10μM)的短肽抑制剂Aβ16-20与佐剂14’-氯-2,2’:6’,2”-三吡啶形成的抑制剂-佐剂1复合物对神经细胞损伤的测试结果。结果显示,随着佐剂1浓度的增加,抑制剂-佐剂1复合物的神经毒性逐渐增大。
图6d为:淀粉样多肽Aβ1-42的浓度保持在10μM不变,不同浓度的短肽抑制剂Aβ16-20对淀粉样多肽神经细胞损伤的抑制效果(Aβ1-42/Aβ16-20:10μM:1μM、10μM:2μM、10μM:5μM、10μM:10μM)以及摩尔比为1:1的抑制剂-佐剂1复合物对淀粉样多肽神经细胞损伤的抑制效果(Aβ1-42/Aβ16-20/佐剂1:10μM:1μM:1μM、10μM:2μM:2μM、10μM:5μM:5μM、10μM:10μM:10μM)。结果显示,随着抑制剂-佐剂1复合物浓度的增加,抑制剂-佐剂1复合物对淀粉样多肽神经细胞损伤的抑制效果逐渐增强。
图6e为:淀粉样多肽Aβ1-42的浓度保持在10μM不变,不同浓度的短肽抑制剂Aβ16-20对淀粉样多肽神经细胞损伤的抑制效果(Aβ1-42/Aβ16-20: 10μM:1μM、10μM:2μM、10μM:5μM、10μM:10μM);不同摩尔比的抑制剂-佐剂1复合物对淀粉样多肽神经细胞损伤的抑制效果,其中短肽抑制剂Aβ16-20与淀粉样多肽Aβ1-42的摩尔比保持1:1(Aβ1-42/Aβ16-20/4’-氯-2,2’:6’,2”-三吡啶:10μM:10μM:1μM、10μM:10μM:2μM、10μM:10μM:5μM、10μM:10μM:10μM)。结果显示,在短肽抑制剂浓度与淀粉样多肽浓度相同或相近时,抑制剂-佐剂1复合物中佐剂1浓度较低时,可以将淀粉样多肽的神经细胞毒性完全抑制,细胞存活率和空白对照相同。
实施例3基于ThT荧光光谱来观察短肽抑制剂、多酚类佐剂、抑制剂-多酚类佐剂复合物在溶液中对淀粉样多肽Aβ1-42聚集动力学调控效应
事先用六氟乙丙醇分散淀粉样多肽Aβ1-42和短肽抑制剂Aβ16-20使其浓度为1mg/mL,用10mM的磷酸缓冲溶液配成1mM的ThT溶液,用DMSO配置100mM的EGCG佐剂溶液。提前1个小时制备抑制剂-EGCG复合物,其浓度比为1.25mM:1.25mM。分别取79μL用六氟乙丙醇分散的1mg/mL的淀粉样多肽Aβ1-42于四个0.6mL的离心管中分别编号A(62.5μMAβ1-42)、B(62.5μM Aβ1-42/125μM短肽抑制剂)、C(62.5μMAβ1-42/125μM佐剂2)、D(62.5μM Aβ1-42/125μM抑制剂-佐剂2复合物),室温下真空干燥30min,分别加入0.5μL的DMSO助溶;同时取1.25mM的短肽抑制剂28μL至B管;取0.875μLEGCG溶液加入至C管;取事先制备好的抑制剂-EGCG复合物28μL加入至D管;再向四个管中分别加入1mM的ThT溶液5.6μL,最后用PBS将各个离心管定容至280μL,涡旋振动混匀,然后在Corning黑色低吸附量96孔酶标板上,利用室温下用连续光谱多功能酶标仪(Tecan infinite M200)测试相应的荧光强度值测试ThT荧光强度,,选择激发光和检测光的发射光波长分别为450nm和482nm,增益值为100,每组测试液取三个平行样。随后。实验所得荧光结果如图7所示。
图7中,由方块形成的曲线代表了Aβ1-42单独聚集的生长曲线,是一条类似S型生长曲线。相对的,加入2倍的短肽抑制剂后Aβ1-42的聚集过程有所抑制,加入2倍的EGCG后Aβ1-42的聚集过程在很大程度上被抑制。相对的,加入2倍剂量抑制剂-EGCG复合物后,Aβ1-42的聚集过程基本被完全抑制,说明抑制剂-EGCG复合物对Aβ1-42聚集的抑制效果相比于单独的短肽抑制剂Aβ16-20以及单独的佐剂EGCG都要强。
实施例4利用神经细胞毒性测试方法检测淀粉样多肽Aβ1-42神经毒性和佐剂EGCG、短肽抑制剂、抑制剂-EGCG复合物对淀粉样多肽神经毒性的抑制
以人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系(ECACC,英国)为研究对象,将其接种于96孔板中(购于Greiner Bio-One Inc.,Longwood,FL,USA),每孔1万个细胞、100μL细胞培养液,使用RPMI-1640培养基(含15%胎牛血清,1%青链霉素)。在37℃、5%CO2下培养24个小时(细胞大约有40%贴壁,且状态良好),可向细胞培养液内加入淀粉样多肽、佐剂、短肽抑制剂、抑制剂-佐剂复合物及淀粉样多肽与他们各自的混合体系,进行细胞毒性测试。
将Aβ1-42、短肽抑制剂(Aβ16-20)、佐剂EGCG、抑制剂-EGCG复合物加入到已接种并在37℃、5%CO2下培养24个小时的细胞中,其终浓度分别为Aβ1-42:10μM、Aβ16-20:20μM、EGCG:20μM、抑制剂-EGCG复合物:20μM。同时,向Aβ1-42浓度为10μM的细胞中分别加入短肽抑制剂、EGCG和抑制剂-EGCG复合物,其终浓度均为20μM,即满足Aβ1-42、Aβ16-20、佐剂EGCG三者的浓度比为10μM:20μM:20μM。同时,以不加入淀粉样多肽和任何抑制剂,仅仅用上述培养基培养的细胞作为空白对照。作用48小时后,向培养板中每孔加入20μL的5mg/mL MTT生理盐水溶液,在37℃、5%CO2条件下作用4小时。作用完毕,将培养板中的溶液吸走,每孔用100μL的DMSO溶解MTT产生的甲瓒沉淀。利用连续光谱多功能酶标仪(Tecan infinite M200),测定其在490nm处的吸光度值(OD值)。细胞存活率通过测试的OD值显示,OD值越高,细胞存活越多。数据分析:试验结果为三次试验的平均值,每次试验平行测试三次。数据为平均值±误差值。数据统计分析使用SPSS专业统计分析软件(SPSS,Chicago),利用配对样品t-检验。当P<0.05时,视为有差异,P<0.01时视为有显著差异。
图8为10μM的Aβ1-42、20μM的短肽抑制剂、EGCG以及抑制剂-EGCG复合物的神经细胞毒性测试结果以及20μM的短肽抑制剂、EGCG以及抑制剂-EGCG复合物等三种调节剂对10μM的Aβ1-42神经毒性的抑制结果。
由图8可以看出当Aβ1-42浓度为10μM时,相同浓度的单一的短肽抑制剂和佐剂EGCG调控淀粉样多肽Aβ1-42神经毒性的效果明显低于同等浓度下抑制剂-EGCG复合物调节剂的调控效果,短肽抑制剂/EGCG复合物可使细胞存活率增加10%以上,达到94%。
综上所述,淀粉样多肽具有比较强的细胞毒性。将短肽抑制剂溶液和淀 粉样多肽溶液同时加入细胞培养液中,随后进行细胞存活率的检测,检测结果发现:与对照组实验相比,含有短肽抑制剂的体系中,细胞存活率有所提高,但不明显;而在不同浓度和不同摩尔比的抑制剂-佐剂复合物加入到淀粉样多肽溶液中时,细胞存活率大大提高。结合前面的原子力显微镜和荧光光谱结果说明:与短肽抑制剂相比,抑制剂-佐剂复合物大大提高了抑制淀粉样多肽聚集的效果,使得淀粉样多肽对细胞的损伤大大降低。只不过佐剂本身的神经毒性影响了抑制剂-佐剂复合物对于Aβ42神经毒性的抑制效果。当抑制剂-佐剂复合物中佐剂浓度较低时,可以将淀粉样多肽的神经细胞毒性完全抑制。因此为了降低佐剂自身的毒性,只需要少量的佐剂,抑制剂-佐剂复合物就可以大大加强短肽抑制剂对淀粉样多肽的聚集和细胞毒性的抑制,达到最优化的效果。
通过对细胞神经毒性的测试,我们确认了抑制剂-佐剂复合物可以有效抑制淀粉样多肽神经毒性的结果。
Claims (18)
1.一种抑制淀粉样多肽聚集的抑制剂-佐剂复合物,所述复合物由短肽抑制剂和佐剂按1:5~10:1的摩尔比组成,优选地,所述复合物由短肽抑制剂和佐剂按1:5~5:1组成,进一步优选地,所述抑制剂-佐剂复合物由短肽抑制剂和佐剂按1:5~1:1的摩尔比组成,更优选地,所述抑制剂-佐剂复合物由短肽抑制剂和佐剂按1:1的摩尔比组成;
所述短肽抑制剂选自β-淀粉样多肽的3-10个氨基酸的片段、其突变体及衍生物;优选地,所述短肽抑制剂的序列含有下述SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列:KLVFF;
所述佐剂选自吡啶类和多酚类化合物。
2.根据权利要求1所述的复合物,其特征在于,所述短肽抑制剂为Aβ16-20和/或Aβ17-21,所述Aβ16-20的序列为下述SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列:KLVFF,所述Aβ17-21的序列为下述SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列:LVFFA;优选地,所述短肽抑制剂为Aβ16-20。
3.根据权利要求1或2所述的复合物,其特征在于,所述多酚类化合物及其衍生物可选自(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯、白藜芦醇、花青素、姜黄素和紫杉叶素中的一种或多种。
4.根据权利要求1或2所述的复合物,其特征在于,所述吡啶类化合物为4,4’-联吡啶、1,2-二(4-吡啶基)乙烯、三联吡啶或4’-氯-2,2’:6’,2”-三吡啶。
5.根据权利要求3或4所述的复合物,其特征在于,所述吡啶类化合物为4’-氯-2,2’:6’,2”-三吡啶;
所述多酚类化合物为(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的复合物的制备方法,所述方法包括将短肽抑制剂与佐剂按1:5~10:1的摩尔比溶解到缓冲液中制备混合溶液,使短肽抑制剂的终浓度为10-100μM,再将混合溶液孵育形成抑制淀粉样多肽聚集的抑制剂-佐剂复合物,优选地,使短肽抑制剂的终浓度为50μM,即得。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述短肽抑制剂和佐剂的摩尔比为1:5~5:1,优选地,所述短肽抑制剂和佐剂的摩尔比为1:5~1:1,更优选地,所述短肽抑制剂和佐剂的摩尔比为1:1;再优选地,所述缓冲液为pH6.8-7.5的磷酸盐缓冲液,更优选地,所述缓冲液为pH7.4的磷酸盐缓冲液;进一步优选地,所述混合溶液于室温孵育0.5-3小时,优选1小时。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的复合物在制备用于抑制淀粉样多肽聚集或对细胞毒害作用的药物中的应用。
9.根据权利要求1至5中任一项所述的复合物在制备用于治疗和/或预防与淀粉样多肽有关的疾病的药物中的应用。
10.根据权利要求8或9所述的应用,其特征在于,所述淀粉样多肽为阿尔茨海默氏病相关的β-淀粉样多肽、2型糖尿病相关的胰淀素、亨廷顿氏病相关的多聚谷氨酰胺、帕金森氏病相关的核突触蛋白、牛海绵状脑病和克罗伊茨费尔特-雅各布氏病相关的朊病毒;
优选地,所述淀粉样多肽为β-淀粉样多肽Aβ,更优选地,所述β-淀粉样多肽Aβ为β-淀粉样多肽Aβ1-42、β-淀粉样多肽Aβ1-40、β-淀粉样多肽Aβ1-28、β-淀粉样多肽Aβ33-42、β-淀粉样多肽Aβ10-20及其片段,所述β-淀粉样多肽Aβ1-42的序列为SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列,所述β-淀粉样多肽Aβ1-40的序列为SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列,所述β-淀粉样多肽Aβ1-28的序列为SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列,所述β-淀粉样多肽Aβ33-42的序列为SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列,所述β-淀粉样多肽Aβ10-20的序列为SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列;还优选地,所述淀粉样多肽为β-淀粉样多肽Aβ1-42。
11.一种抑制淀粉样多肽的聚集或神经毒性的方法,包括以下步骤:
步骤A:制备淀粉样多肽溶液,淀粉样多肽与短肽抑制剂的混合溶液、淀粉样多肽与佐剂的混合溶液,及淀粉样多肽与权利要求1至5中任一项所述的复合物的混合溶液,再将其于室温孵育;
步骤B:将孵育后的步骤A的溶液,利用原子力显微技术观察短肽抑制剂、佐剂、所述复合物对淀粉样多肽的聚集体形貌的影响。
步骤C:将孵育后的步骤A的溶液,利用荧光光谱技术测试短肽抑制剂、佐剂、所述复合物对淀粉样多肽聚集体的调控效果。
步骤D:将孵育后的步骤A的溶液,利用细胞毒性测试实验检测短肽抑制剂、佐剂、所述复合物对淀粉样多肽细胞毒性的抑制效果。
12.根据权利要求11所述的方法,其特征在于,所述步骤A具体包括以下步骤:
步骤A.1:将淀粉样多肽溶解于缓冲液中,制成淀粉样多肽溶液,优选地,所述缓冲液为pH=6.8-7.5的磷酸缓冲液,进一步优选地,所述磷酸缓冲液的pH为7.4;
步骤A.2:将淀粉样多肽分别与短肽抑制剂或佐剂,溶解于缓冲液中,制得短肽抑制剂和淀粉样多肽混合溶液及佐剂和淀粉样多肽混合溶液,优选地,将淀粉样多肽分别与短肽抑制剂、佐剂溶解于pH=6.8-7.5的磷酸缓冲液中,于37℃孵育1-3天,更优选地,将淀粉样多肽分别与短肽抑制剂、佐剂溶解于pH=6.8-7.5的磷酸缓冲液中,于37℃孵育2天;
步骤A.3:将短肽抑制剂和佐剂,溶解于缓冲液中,制得混合溶液,使短肽抑制剂的终浓度为10-125μM,优选10-100μM的溶液,再室温孵育形成抑制淀粉样多肽聚集的抑制剂-佐剂复合物溶液,优选地,使短肽抑制剂的终浓度分别为50μM或125μM,更优选地,将短肽抑制剂和佐剂溶解于pH=6.8-7.5的磷酸缓冲液中,于室温孵育0.5-3小时,进一步优选地,将短肽抑制剂和佐剂溶解于pH=7.4的磷酸缓冲液中,于室温孵育1小时;
步骤A.4:将步骤A.3得到的复合物溶液与步骤A.1制得的淀粉样多肽溶液混合,然后将所得混合物溶解到缓冲液中,使抑制剂-佐剂复合物中的短肽抑制剂部分与淀粉样多肽的浓度均为10-125μM,优选10-100μM的溶液,再将其孵育,优选地,使抑制剂-佐剂复合物中的短肽抑制剂部分与淀粉样多肽的浓度均为50μM溶液,或者使抑制剂-佐剂复合物中的短肽抑制剂的浓度为125μM、淀粉样多肽的浓度为62.5μM,更优选地,所述缓冲液为pH=6.8-7.5的磷酸缓冲液,得到抑制剂-佐剂复合物与淀粉样多肽的混合溶液,还优选地,所述混合溶液于37℃共同孵育1-3天,进一步优选地,所述混合溶液于37℃共同孵育2天。
13.根据权利要求11或12所述的方法,其特征在于,在步骤A.1中,当利用原子力显微技术观察短肽抑制剂、佐剂、所述抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽的聚集体形貌的影响时,所述淀粉样多肽溶液的浓度为10-100μM,优选地,所述淀粉样多肽溶液的浓度为50μM;或利用连续光谱多功能酶标仪测试短肽抑制剂、佐剂、所述抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽聚集体的调控效果,所述淀粉样多肽溶液的浓度为10-125μM,更优选地,所述淀粉样多肽溶液的浓度为62.5μM;
当利用荧光光谱技术测试短肽抑制剂、佐剂、所述抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽聚集体的调控效果时,所述淀粉样多肽溶液的浓度为1-5μM,优选地,所述淀粉样多肽溶液的浓度为2.5μM;或
当利用细胞毒性测试实验检测短肽抑制剂、佐剂、所述复合物对淀粉样多肽细胞毒性的抑制效果时,所述淀粉样多肽溶液的浓度为50-500μM,优选地,所述淀粉样多肽溶液的浓度为300μM。
14.根据权利要求11至13中任一项所述的方法,其特征在于,在步骤A.2中,当利用原子力显微技术观察短肽抑制剂和佐剂对淀粉样多肽的聚集体形貌的影响时,所述淀粉样多肽分别与短肽抑制剂、佐剂按1:1的摩尔比溶解于缓冲液中;或
当利用荧光光谱技术测试短肽抑制剂和佐剂对淀粉样多肽聚集体的调控效果时,所述淀粉样多肽分别与短肽抑制剂、佐剂、所述抑制剂-佐剂复合物按1:1的摩尔比溶解于缓冲液中,优选地,所述淀粉样多肽(2.5μM)分别与短肽抑制剂(2.5μM)、佐剂(2.5μM)和所述抑制剂-佐剂复合物(2.5μM)混合溶解于缓冲液中;或当利用连续光谱多功能酶标仪测试短肽抑制剂、佐剂、所述抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽聚集体的调控效果时,所述淀粉样多肽分别与短肽抑制剂、佐剂、所述抑制剂-佐剂复合物按1:2的摩尔比溶解于缓冲液中,优选地,所述淀粉样多肽(62.5μM)分别与短肽抑制剂(125μM)、佐剂(125μM)和所述抑制剂-佐剂复合物(125μM)混合溶解于缓冲液中;
当利用细胞毒性测试实验检测短肽抑制剂和佐剂对淀粉样多肽细胞毒性的抑制效果时,所述淀粉样多肽分别与短肽抑制剂、佐剂按5:1~1:1的摩尔比溶解于缓冲液中,优选地,所述淀粉样多肽分别与短肽抑制剂、佐剂按300μM:30μM、300μM:60μM、300μM:150μM、300μM:300μM的摩尔比溶解于缓冲液中;所述淀粉样多肽分别与短肽抑制剂、佐剂按10μM:20μM的摩尔比溶解于缓冲液中。
15.根据权利要求11至14中任一项所述的方法,其特征在于,在步骤A.3中,将短肽抑制剂和佐剂按1:5~10:1的摩尔比,溶解到缓冲液中,制得混合溶液,室温孵育形成抑制淀粉样多肽聚集的抑制剂-佐剂复合物溶液,优选地,所述抑制剂-佐剂复合物由短肽抑制剂和佐剂按1:5~5:1组成,最优选地,所述抑制剂-佐剂复合物由短肽抑制剂和佐剂按1:1的摩尔比组成。
16.根据权利要求11至15中任一项所述的方法,其特征在于,在步骤B中,还包括将步骤A.1、A.2、A.3、A.4得到的混合溶液分别滴加到云母、硅片等平整基底上,然后空气干燥后,在固/气界面获得各自的原子力显微镜图像的步骤。
17.根据权利要求11至16中任一项所述的方法,其特征在于,在步骤C中,还包括制备荧光染料分子溶液,再将步骤A.1、A.2、A.3、A.4得到的中制备的溶液分别与所述的荧光染料分子溶液混合之后放入标准的石英池中,在荧光光谱仪中进行测试的步骤,优选地,在利用荧光光谱技术测试短肽抑制剂、佐剂、所述抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽聚集体的调控效果时,使用该步骤;或
利用连续光谱多功能酶标仪测试短肽抑制剂、佐剂、所述抑制剂-佐剂复合物对淀粉样多肽聚集体的调控效果时,也包括制备荧光染料分子溶液,并将步骤A.1、A.2、A.3、A.4中制备的溶液分别与所述的荧光染料分子溶液混合之后接种到酶标板中,在连续光谱多功能酶标仪中进行荧光强度测试的步骤。
18.根据权利要求11至17中任一项所述的方法,其特征在于,在步骤C中,还包括将步骤A.1、A.2、A.3、A.4得到的混合溶液分别取5μL加入培养好的神经肿瘤细胞中,孵育后,利用酶标仪测试细胞样品的吸光度值来测试神经肿瘤细胞的存活率,通过存活率判断淀粉样多肽对神经肿瘤细胞损伤的程度的步骤;
优选地,所述淀粉样多肽溶液的最终浓度均为5-20μM,在淀粉样多肽和短肽抑制剂的混合溶液中及淀粉样多肽和佐剂的混合溶液中,所述短肽抑制剂和佐剂的最终浓度均为1μM,2μM,5μM,10μM,20μM;在淀粉样多肽和抑制剂-佐剂复合物的混合溶液中,所述短肽抑制剂和佐剂的摩尔比为1μM:1μM,2μM:2μM,5μM:5μM,10μM:10μM,1μM:10μM,1μM:10μM,10μM:5μM,20μM:20μM;更优选地,所述淀粉样多肽溶液的最终浓度为10μM,进一步优选地,孵育1-3天,还优选地,孵育2天。
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