CN104502219A - 一种淀粉样多肽聚集抑制剂及其抑制效果评估和验证方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及淀粉样多肽的抑制剂,特指二硫化钼。本发明中将二硫化钼溶液和多肽水溶液混合后,利用石英晶体微天平(QCM)、原子力显微镜(AFM)和圆二色谱(CD)表征二硫化钼对淀粉样多肽Aβ(33-42)的抑制效果。实验证明二硫化钼作为抑制剂可以调控淀粉样蛋白(多肽)集聚过程。
Description
技术领域
本发明涉及淀粉样多肽抑制剂,特指二硫化钼;本发明中将二硫化钼溶液和多肽水溶液混合后,利用石英晶体微天平(QCM)、原子力显微镜(AFM)和圆二色谱(CD)表征二硫化钼对淀粉样多肽Aβ(33-42)的抑制效果。实验证明二硫化钼作为抑制剂可以调控淀粉样蛋白(多肽)集聚过程。
背景技术
目前已知蛋白质及多肽的异常集聚和40多种疾病相关,如神经退行性疾病阿尔茨海默氏病和帕金森综合症等;淀粉样蛋白质(多肽)的寡聚体及其集聚所形成的斑块被认为是这些疾病的主要病因之一;基础医学以淀粉样蛋白为靶点开始进行研究,发展药物减少淀粉样多肽的产生和降低淀粉样多肽的集聚及毒性;目前在科研和医药产业中,针对疾病的相关靶多肽和蛋白的特效药物开发是十分重要的研究领域,具有极其重要的研究价值和经济价值。目前,淀粉样多肽聚集抑制剂的研究已经取得了一些研究进展,发现了一系列的有抑制作用的分子,如碳纳米管,碳量子点,树枝状高分子等。
Aβ(33-42)是阿尔茨海默氏病相关淀粉样多肽Aβ(1-42)中的片段之一,它在阿尔茨海默氏病淀粉样多肽的异常聚集中发挥重要的作用,在目前研究中常用来作为靶标来研究相关抑制剂作为潜在药物供临床治疗使用。
二硫化钼,英文名称molybdenum disulfide,外观上有金属光泽的黑色固体粉末,化学式为:MoS2。密度为4.80g/cm3(14℃)。二硫化钼是重要的固体润滑剂,特别适用于高温高压下;另外它还有抗磁性,可用作线性光电导体及具有P型或N型导电性能的半导体;二硫化钼还可用作复杂烃类脱氢的催化剂,常用在石油化工生产过程中脱硫过程和水解制氢。在研究中,我们发现二硫化钼对于淀粉样多肽集聚有较强抑制作用。
发明内容
本发明首次公开了二硫化钼作为抑制剂可以调控淀粉样蛋白(多肽)集聚,二硫化钼在本发明体外实验中表现出对淀粉样多肽集聚的抑制能力,因而二硫化钼有可能作为潜在药物进行生物医学临床治疗相关淀粉样多肽疾病;以下是相关体外测量结果证实二硫化钼作为抑制剂可以调控淀粉样蛋白(多肽)集聚过程:
1) QCM 测量淀粉样蛋白(多肽)的自集聚及二硫化钼的抑制效果;
具体的实验步骤如下:
淀粉样多肽水溶液制备:将淀粉样多肽溶解在六氟异丙醇中得到溶液A,每1ml六氟异丙醇中加入1mg淀粉样多肽,晃动溶液A使多肽干粉能够充分溶解分散,得到浓度为1mg/mL 多肽溶液A;然后将溶液A置入真空干燥箱中干燥,将干燥后的淀粉样多肽使用去离子水进行溶解,配置成浓度为200-1000 μg/mL的溶液B。
取溶液B通入石英晶体微天平传感器中,随着多肽分子在芯片表面的吸附集聚,QCM频率信号和能量耗散将发生改变,检测到的信号作为阳性对照。
同样,在得到QCM基线后,将聚集抑制剂二硫化钼的水溶液通入QCM传感器得到的QCM 频率和能量耗散信号作为聚集抑制剂评价的阴性对照使用,二硫化钼的水溶液称之为溶液C,浓度为100-200μg/mL。
得到QCM基线后,将淀粉样多肽水溶液与二硫化钼的水溶液混合得到混合溶液D,混合溶液D中淀粉样多肽的浓度与前述阳性对照——溶液B的浓度一致,二硫化钼的浓度与阴性对照——溶液C的浓度一致;将混合液D所得到的QCM能量频率信号与阳性对照B及阴性对照C进行比较,QCM 频率变化值的绝对值越大,证明在表面上集聚的多肽越多;如果:阴性对照组的频率变化>抑制剂组的频率变化>阳性对照组的频率变化,说明该抑制剂对于多肽集聚具有抑制效果。
进一步的,所述得到QCM基线指:将去离子水通入QCM 传感器,待去离子水进入传感器使QCM频率曲线达到稳定状态后即为基线状态。
进一步的,晃动溶液A以使之充分溶解的时间为24h。
2) 原子力显微镜(AFM)检测多肽集聚的形貌特征
在表面上完成QCM试验后,将QCM芯片干燥后,对抑制剂组和对照组芯片进行AFM形貌观测,验证QCM结果;如果AFM图中有大量多肽纤维出现,则证明多肽抑制效果差,反之,如果所得AFM图中见到很少的多肽纤维,证明多肽抑制剂抑制作用很强。
3) 圆二色谱 CD 的结果验证
将上述新配制溶液B、C、D同时置于温度为37℃的恒温震荡器中24小时,
然后进行CD测定;CD 光谱198 nm 处对应于蛋白质β折叠结构,观测该处CD信号的强弱可以判断蛋白质(多肽)的聚集状态。
本发明的优点:
本发明公开了一种有效的淀粉样蛋白及多肽的聚集抑制剂二硫化钼,所附的实验结果证实二硫化钼可降低多肽的纤维化集聚程度。
如下面实际应用案例所示,本发明证实二硫化钼可适用于疾病相关的淀粉样蛋白及多肽的聚集;二硫化钼抑制剂生产成本低,具有潜在的药物应用潜力,因而具有广泛的生物医学应用前景和开发意义。
附图说明
图1是Aβ(33-42)的氨基酸序列。
图2是二硫化钼抑制剂和对照多肽Aβ(33-42)组用本QCM检测结果;曲线2为二硫化钼与Aβ 33-42 多肽混合作用;曲线3为Aβ33-42多肽阳性对照;曲线1为二硫化钼阴性对照;实验结果证实了二硫化钼对于Aβ 33-42多肽集聚具有抑制作用,抑制剂实验组,阳性对照及阴性对照组所得频率下降分别是:-12.8 Hz,-25.4 Hz及3.2 Hz。
图3是采用AFM方法检验二硫化钼对于多肽Aβ(33-42)的抑制作用。
图4是采用CD检测不同浓度的二硫化钼对Aβ(33-42)多肽的聚集抑制作用效果;曲线1为纯多肽Aβ 33-42阳性对照;曲线2为Aβ 33-42(1 mM)+ 二硫化钼12.5 μg/mL; 曲线3为Aβ 33-42(1 mM)+ 二硫化钼25 μg/mL;曲线4为Aβ 33-42(1 mM)+ 二硫化钼100 μg/mL。在198nmCD 信号随二硫化钼浓度变化产生CD信号的下降证实了二硫化钼对于多肽集聚具有抑制作用。
具体实施方式
实施例1:
所用淀粉样多肽为阿尔茨海默氏病淀粉样多肽Aβ(33-42),Aβ(33-42)可从多肽合成公司购买,Aβ(33-42)的序列见图2;六氟异丙醇(1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol)从Sigma-Aldrich公司购买,用于溶解Aβ(33-42)。
具体的实验步骤如下:
QCM 实验结果:
步骤一:多肽溶液制备:将淀粉样多肽溶解在六氟异丙醇中得到溶液A,每1ml六氟异丙醇中加入1mg淀粉样多肽,晃动溶液 24h使多肽干粉能够充分溶解分散,得到浓度为1mg/mL 的多肽溶液A;然后将上述得到的溶液A置入真空干燥箱中干燥,将干燥后的淀粉样多肽使用去离子水进行溶解,配置成浓度为200-1000 μg/mL的溶液B;溶液B为阳性对照样本;这里采用的是Aβ(33-42)1 mg/mL。
溶液C即多肽抑制剂的水溶液,作为阴性对照;这里采用二硫化钼的水溶液(浓度为100 μg/mL)。
混合溶液D为多肽抑制剂实验组,混合溶液D中淀粉样多肽的浓度与前述阳性对照——溶液B的多肽浓度保持一致,即Aβ(33-42)1 mg/mL,抑制剂的浓度与阴性对照——溶液C的浓度一致,即二硫化钼的浓度为100 μg/mL。
步骤二:将QCM 芯片放置于紫外臭氧清洗机中30分钟,然后用去离子水和乙醇进行清洗后干燥;将去离子水通入QCM 传感器,待QCM频率曲线达到稳定状态后(基线状态)。
步骤三:分别取200 μL上述溶液B、C和D 通入石英晶体微天平传感器三个通道中,随着多肽分子在芯片表面的吸附集聚,QCM频率信号和能量耗散将发生改变,QCM将自动同时检测抑制剂实验组,阳性对照及阴性对照的频率信号变化,如图2,通过比较抑制剂实验组和对照组的频率下降数值可评价抑制剂的效果。
如图2中二硫化钼对于Aβ(33-42)多肽的聚集具有抑制作用,抑制剂实验组,阳性对照及阴性对照组所得频率变化分别是:-12.8 Hz,-25.4 Hz及3.2 Hz;抑制剂组的频率变化-12.8>阳性对照组的频率变化-25.4,同时该频率变化-12.8<阴性对照组的频率变化3.2,这说明该抑制剂对于多肽集聚具有抑制效果。
AFM实验:将QCM 芯片干燥后置于AFM 显微镜下进行观测,所得抑制剂组及对照形貌如图3所示;由所得图可见到:二硫化钼加入后减少了多肽聚集纤维形成,证实了二硫化钼的抑制效果。
CD 实验:分别取用新配制的350 μL溶液B,C,D,置于恒温震荡器中24小时,温度设置为37 ℃,使用圆二色谱对溶液中多肽的集聚进行观测并与QCM 结果进行比较;198nm位置的CD 信号随二硫化钼浓度变化产生CD信号的下降显示了二硫化钼对于多肽集聚具有抑制作用,所得结果见图4。
Claims (7)
1.一种淀粉样多肽聚集抑制剂,其特征在于:所述抑制剂为二硫化钼。
2.如权利要求1所述的一种淀粉样多肽聚集抑制剂,其特征在于:所述淀粉样多肽为阿尔茨海默氏病淀粉样多肽Aβ(33-42)。
3.如权利要求1所述的一种淀粉样多肽聚集抑制剂的抑制效果评估方法,其特征在于具体步骤如下:
将淀粉样多肽充分溶解分散在六氟异丙醇中得到溶液A,对溶液A进行干燥,干燥后的淀粉样多肽使用去离子水进行溶解,配置成浓度为200-1000 μg/mL的淀粉样多肽水溶液,称为溶液B;
取溶液B通入石英晶体微天平传感器中,随着多肽分子在芯片表面的吸附集聚,QCM频率信号和能量耗散将发生改变,检测到的信号作为阳性对照B;
同样,在得到QCM基线后,将聚集抑制剂二硫化钼的水溶液通入QCM传感器得到的QCM 频率和能量耗散信号作为聚集抑制剂评价的阴性对照C使用,二硫化钼的水溶液称之为溶液C,浓度为100-200μg/mL;
得到QCM基线后,将淀粉样多肽水溶液与二硫化钼的水溶液混合得到混合溶液D,混合溶液D中淀粉样多肽的浓度与前述阳性对照——溶液B的浓度一致,二硫化钼的浓度与阴性对照——溶液C的浓度一致;将混合液D所得到的QCM能量频率信号与阳性对照B及阴性对照C进行比较,QCM 频率变化值的绝对值越大,证明在表面上集聚的多肽越多;如果:阴性对照组的频率变化>抑制剂组的频率变化>阳性对照组的频率变化,说明该抑制剂对于多肽集聚具有抑制效果。
4.如权利要求3所述的一种淀粉样多肽聚集抑制剂的抑制效果评估方法,其特征在于将淀粉样多肽充分溶解分散在六氟异丙醇中得到溶液A指:每1ml六氟异丙醇中加入1mg淀粉样多肽,晃动溶液A使多肽干粉能够充分溶解分散,得到浓度为1mg/mL 多肽溶液A。
5.如权利要求4所述的一种淀粉样多肽聚集抑制剂的抑制效果评估方法,其特征在于:所述晃动溶液A以使之充分溶解的时间为24h。
6.如权利要求3所述的一种淀粉样多肽聚集抑制剂的抑制效果评估方法,其特征在于所述得到QCM基线指:将去离子水通入QCM 传感器,待去离子水进入传感器使QCM频率曲线达到稳定状态后即为基线状态。
7.对如权利要求3所述评估方法验证的方法,其特征在于:采用原子力显微镜检测多肽集聚的形貌特征,在表面上完成QCM试验后,将QCM芯片干燥后,对抑制剂组和对照组芯片进行AFM形貌观测,验证QCM结果;如果AFM图中有大量多肽纤维出现,则证明多肽抑制效果差,反之,如果所得AFM图中见到很少的多肽纤维,证明多肽抑制剂抑制作用很强。
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