CN102393342A

CN102393342A - 一种利用石英晶体微天平筛选端粒酶抑制剂的方法

Info

Publication number: CN102393342A
Application number: CN2011103268827A
Authority: CN
Inventors: 马宏伟; 朱志强; 汪杰
Original assignee: Suzhou Institute of Nano Tech and Nano Bionics of CAS
Current assignee: Suzhou Institute of Nano Tech and Nano Bionics of CAS
Priority date: 2011-10-25
Filing date: 2011-10-25
Publication date: 2012-03-28
Anticipated expiration: 2031-10-25
Also published as: CN102393342B

Abstract

本发明公开了一种利用石英晶体微天平筛选端粒酶抑制剂的方法，该方法为：一、芯片表面羧基功能化；二、芯片表面活化；三、芯片表面固定端粒酶引物；四、将固定有引物的芯片装入石英晶体微天平的反应器中，向反应器中通入工作液，读取监测到的频率F1，然后通入对照液，读取监测到的频率F2，计算F1和F2的差值ΔF；五、将固定有引物的芯片装入石英晶体微天平的反应器中，向反应器中通入工作液，读取监测到的频率F1′，然后通入待测液，读取监测到的频率F2′，计算频率F1′和频率F2′的差值ΔF′，当ΔF′/ΔF≤50％时，判定待测液中含有端粒酶抑制剂。本发明采用石英晶体微天平为检测工具，具有无标记，实时检测等优势。

Description

一种利用石英晶体微天平筛选端粒酶抑制剂的方法

技术领域

本发明属于药物筛选技术领域，具体涉及一种利用石英晶体微天平筛选端粒酶抑制剂的方法。

背景技术

端粒是染色体末端的DNA重复序列。上世纪九十年代，有研究者提出，人体中端粒的平均长度随年龄增大而变短，而体细胞端粒长度大大短于生殖细胞。细胞培养实验中也观察到端粒的长度随分裂次数增多而缩短，而且端粒长度和细胞分化程度呈反比。每次细胞复制时都会发生端粒的缩短，都伴随着端粒的缩短。端粒缩短到一定程度时，细胞染色体的稳定性就会降低，，细胞逐渐死亡。细胞复制的次数是有限的，正常人体细胞中为一般50次左右，端粒也被称作“生命时钟”。

端粒酶是一种反转录酶，由蛋白质和RNA两部分组成核糖蛋白复合体，其中RNA是一段模板序列，指导合成端粒DNA的重复序列片段。端粒酶可以催化DNA链的端粒不断延长，从而抵消因染色体复制、细胞分裂导致的脱氧核糖核酸缩短，使得染色体脱氧核糖核酸完好无损，细胞能够顺利地分裂繁殖。四膜虫的端粒酶发生突变时，其端粒缩短、细胞死亡，酵母端粒酶基因突变会导致端粒变短、细胞衰老。而人体细胞中端粒酶的激活和端粒延长的过程主要是在胚系细胞中完成的，当胚胎发育完成以后，端粒酶活性就受到抑制。每次细胞复制时都会发生端粒的缩短，都伴随着端粒的缩短。据报道，90％以上的肿瘤细胞中其端粒酶活性异常，癌症细胞可以无限制的分裂下去，形成肿瘤。端粒酶成为一个癌症治疗的潜在靶点，而端粒酶抑制剂也成为一种癌症治疗的潜在药物。1994年，kim等人提出了通过TRAPassay(Telomere Repeat AmplificationProtocol)的方法检测端粒酶活性。该方法往细胞提取物加入DNA引物，通过将端粒延伸后进行PCR扩增，根据PCR产物来评估端粒酶活性，达到很高的灵敏性，可以检测出50倍体细胞稀释体系中的10个癌症细胞。1996年，德国boehrioger公司推出了TRAP-ELISA试剂盒，其原理是利用Kim法处理细胞或组织并扩增端粒酶产物，引物TS含生物素，扩增产物与包被亲和素的微孔板结合，并与地高辛标记的探针结合，用酶标仪检测抗地高辛抗体标记的酶信号。最近，Anne De Cian等人研究发现，有部分端粒酶抑制剂会对PCR的过程产生影响。端粒结构中富含G序列，容易形成G4区域，而部分酶抑制剂通过与G4区域的结合从而抑制端粒延伸过程。但是该特殊结构也会抑制传统方法的PCR过程。寻找一种新的端粒酶抑制剂检测手段，对于肿瘤治疗有着重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种无标记，实时检测的利用石英晶体微天平筛选端粒酶抑制剂的方法。该方法避免了传统端粒酶活性检测中常用的聚合酶链式扩增反应及电泳等手段，可以降低因抑制聚合酶链式扩增反应而带来的假阳性问题，同时也能有效的节约人力，有望实现高度自动化的筛选体系。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种利用石英晶体微天平筛选端粒酶抑制剂的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

步骤一、对表面修饰有自组装层的QCM芯片表面进行羧基功能化；

步骤二、将碳化二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺按照1∶1的摩尔比溶解于去离子水中，得到溶质浓度为0.1M的活化液，将步骤一中经羧基功能化后的QCM芯片表面用所述活化液孵育0.5h～2h，然后用去离子水冲洗，再用氮气吹干；

步骤三、将步骤二中吹干后的QCM芯片表面用氨基功能化的端粒酶引物溶液孵育1h～2h，用去离子水冲洗后用氮气吹干，得到固定有引物的QCM芯片；所述氨基功能化的端粒酶引物溶液中氨基功能化的端粒酶引物的浓度为1μM～2μM；

步骤四、将步骤三中固定有引物的QCM芯片装入石英晶体微天平的反应器中，采用六通阀和蠕动泵作为进样装置，向反应器中通入工作液，待基线稳定后，读取石英晶体微天平监测到的频率F1，然后通过六通阀向反应器中加入对照液，待对照液全部进入反应器中，关闭蠕动泵，使对照液驻留在反应器中，反应0.5h～2h后，打开蠕动泵，通入工作液冲洗QCM芯片，读取石英晶体微天平监测到的频率F2，计算频率F1和频率F2的差值ΔF；所述工作液为Tris·HCl、KCl和MgCl₂的混合水溶液，工作液中Tris·HCl的浓度为30mM～70mM，KCl的浓度为30mM～70mM，MgCl₂的浓度为0.5mM～1.5mM；

步骤五、将步骤三中固定有引物的QCM芯片装入石英晶体微天平的反应器中，采用六通阀和蠕动泵作为进样装置，向反应器中通入工作液，待基线稳定后，读取石英晶体微天平监测到的频率F1′，然后通过六通阀向反应器中加入含待测试剂的待测液，待待测液全部进入反应器中，关闭蠕动泵，使待测液驻留在反应器中，反应0.5h～2h后，打开蠕动泵，通入工作液冲洗QCM芯片，读取石英晶体微天平监测到的频率F2′，计算频率F1′和频率F2′的差值ΔF′，计算ΔF′与步骤四中ΔF的比值，当ΔF′/ΔF≤50％时，判定待测试剂为端粒酶抑制剂；所述工作液为Tris·HCl、KCl和MgCl₂的混合水溶液，工作液中Tris·HCl的浓度为30mM～70mM，KCl的浓度为30mM～70mM，MgCl₂的浓度为0.5mM～1.5mM。

上述步骤一中所述表面修饰有自组装层的QCM芯片的制备方法为：将金基底的QCM芯片浸泡到总浓度为1mM～10mM的溴代异丁基十一硫醇与三羟基乙基十一硫醇的混合溶液中，其中溴代异丁基十一硫醇与三羟基乙基十一硫醇的比例为1∶10～100，室温下孵育15小时，然后将QCM芯片取出，用乙醇冲洗干净，再用氮气吹干，得到表面修饰有自组装层的QCM芯片。

上述步骤一中所述QCM芯片表面羧基功能化的方法为：配置去离子水与甲醇体积比为1∶1的混合溶液，向每升混合溶液中加入16mmol 2，2′-联吡啶，5mmol寡聚甲基丙烯酸寡乙二醇酯，5mmol甲基丙烯酸-2-羟基乙酯混合，并加入0.004mmol的氯化铜，得到淡蓝色的溶液，对淡蓝色溶液除氧10min～30min，随后向每升除氧后的淡蓝色溶液中加入0.004mmol抗坏血酸，保持氮气氛围，得到红色溶液，将QCM芯片置于红色溶液中，并将整个反应体系移至手套箱中，室温下反应4h～16h，将QCM芯片从反应液中取出，用甲醇和去离子水交替冲洗QCM芯片，然后用氮气吹干，最后将QCM芯片置于含10mg·mL^-1琥珀酐及15mg·mL^-14-二甲氨基吡啶的二甲基甲酰胺溶液中反应12小时，得到表面羧基功能化的QCM芯片。

上述步骤三中所述氨基功能化的端粒酶引物为5′端氨基功能化的端粒酶引物，所述端粒酶引物的序列(SEQ ID NO.1)为：5′-TTT TTT TTTTAA TCC GTC GAG CAG AGT T-3′。

上述步骤四中所述对照液由10μL含端粒酶的HeLa细胞提取物，80μL工作液，10μL水和2μL浓度为100μM的三磷酸脱氧核糖核苷混合而成。

上述步骤五中所述待测液由10μL浓度为1ng·mL^-1的待测试剂，10μL含端粒酶的HeLa细胞提取物，80μL工作液和2μL浓度为100μM的三磷酸脱氧核糖核苷混合而成。

本发明采用石英晶体微天平为检测工具，石英晶体微天平(Quartzcrystal microbalance，QCM)是一种利用单结晶石英的压电电效应的称重装置，当施加一个外部电场时，会产生机械振动，当晶片厚度为电极机械振荡波半波长的奇数倍时，发生共振。为简化QCM定量分析模型，本发明提出了QCM的固化水模型，在高频振动下，固定于QCM表面的生物分子能够带动周围的溶液一起振动，当QCM表面组装的分子密度超过临界状况时，认为QCM表面形成一层固化层，QCM频率的变化取决于固化层的厚度和密度。本发明对固化水模型进行了验证，发现0.18nm的厚度变化能造成1Hz响应。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明避免了传统端粒酶活性检测中常用的聚合酶链式扩增反应及电泳等手段，可以降低因抑制聚合酶链式扩增反应而带来的假阳性问题，同时也能有效的节约人力，有望实现高度自动化的筛选体系。

2、本发明采用石英晶体微天平为检测工具，区别于传统的QCM应用模式，提出QCM的固化水模型，从“固化水层”模型出发，充分利用了“固化水层”变化所导致的0.18nm造成1Hz响应的原理，具有无标记，实时检测等优势。

3、本发明根据待测试剂对端粒酶活性的抑制作用，降低端粒酶对固定于QCM芯片表面端粒酶引物的延伸效率，通过监测到的待测液频率变化与对照液频率变化的比值可直接筛选出端粒酶抑制剂。

4、本发明采用的羧基化的高分子膜具有很好的抗非特异性吸附的作用，从而使整个体系可以直接使用细胞提取物作为检测对象。

下面结合附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1为本发明实施例1的QCM检测图。

图2为本发明实施例2的QCM检测图。

图3为本发明实施例3的QCM检测图。

具体实施方式

实施例1

步骤一、将金基底的QCM芯片浸泡到总浓度为1mM的溴代异丁基十一硫醇与三羟基乙基十一硫醇的混合溶液中，其中溴代异丁基十一硫醇与三羟基乙基十一硫醇的比例为1∶10，室温下孵育15小时，然后将QCM芯片取出，用乙醇冲洗干净，再用氮气吹干，得到表面修饰有自组装层的QCM芯片；配置去离子水与甲醇体积比为1∶1的混合溶液，向每升混合溶液中加入16mmol 2，2′-联吡啶，5mmol寡聚甲基丙烯酸寡乙二醇酯，5mmol甲基丙烯酸-2-羟基乙酯混合，并加入0.004mmol的氯化铜，得到淡蓝色的溶液，对淡蓝色溶液除氧30min，随后向每升除氧后的淡蓝色溶液中加入0.004mmol抗坏血酸，保持氮气氛围，得到红色溶液，将表面修饰有自组装层的QCM芯片置于红色溶液中，并将整个反应体系移至手套箱中，室温下反应16h，将QCM芯片从反应液中取出，用甲醇和去离子水交替冲洗QCM芯片，然后用氮气吹干，最后将QCM芯片置于含10mg·mL^-1琥珀酐及15mg·mL^-14-二甲氨基吡啶的二甲基甲酰胺溶液中反应12小时，得到表面羧基功能化的QCM芯片；

步骤二、将碳化二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺按照1∶1的摩尔比溶解于去离子水中，得到溶质浓度为0.1M的活化液，将步骤一中经羧基功能化后的QCM芯片表面用所述活化液孵育0.5h，然后用去离子水冲洗，再用氮气吹干；

步骤三、采用序列(SEQ ID NO.1)为5′-TTT TTT TTT TAA TCC GTCGAG CAG AGT T-3′的端粒酶引物，采用常规方法对端粒酶引物的5′端进行氨基功能化，将步骤二中吹干后的QCM芯片表面用所述氨基功能化的端粒酶引物溶液孵育2h，用去离子水冲洗后用氮气吹干，得到固定有引物的QCM芯片；所述氨基功能化的端粒酶引物溶液中氨基功能化的端粒酶引物的浓度为1μM；

步骤四、将步骤三中固定有引物的QCM芯片装入石英晶体微天平的反应器中，采用六通阀和蠕动泵作为进样装置，向反应器中通入工作液(Tris·HCl、KCl和MgCl₂的混合水溶液，工作液中Tris·HCl的浓度为50mM，KCl的浓度为50mM，MgCl₂的浓度为1mM)，待基线稳定后，读取石英晶体微天平监测到的频率F1，然后通过六通阀向反应器中加入对照液(10μL含端粒酶的HeLa细胞提取物，80μL工作液，10μL水和2μL浓度为100μM的三磷酸脱氧核糖核苷混合而成)，待对照液全部进入反应器中，关闭蠕动泵，使对照液驻留在反应器中，反应2h后，打开蠕动泵，通入工作液冲洗QCM芯片，读取石英晶体微天平监测到的频率F2，计算频率F1和频率F2的差值ΔF；

步骤五、将步骤三中固定有引物的QCM芯片装入石英晶体微天平的反应器中，采用六通阀和蠕动泵作为进样装置，向反应器中通入工作液(Tris·HCl、KCl和MgCl₂的混合水溶液，工作液中Tris·HCl的浓度为50mM，KCl的浓度为50mM，MgCl₂的浓度为1mM)，待基线稳定后，读取石英晶体微天平监测到的频率F1′，然后通过六通阀向反应器中加入待测液(10μL浓度为1ng·mL^-1的待测试剂A(表没食子儿茶素没食子酸酯-Epigallocatechin Gallate)，10μL含端粒酶的HeLa细胞提取物，80μL工作液和2μL浓度为100μM的三磷酸脱氧核糖核苷混合而成)，待待测液全部进入反应器中，关闭蠕动泵，使待测液驻留在反应器中，反应2h后，打开蠕动泵，通入工作液冲洗QCM芯片，读取石英晶体微天平监测到的频率F2′，计算频率F1′和频率F2′的差值ΔF′，计算ΔF′与步骤四中ΔF的比值，得到ΔF′/ΔF为50％，判定待测试剂A(表没食子儿茶素没食子酸酯-Epigallocatechin Gallate)是端粒酶抑制剂。

本实施例根据待测试剂对端粒酶活性的抑制作用，降低端粒酶对固定于QCM芯片表面端粒酶引物的延伸效率，通过监测到的待测液频率变化与对照液频率变化的比值可直接筛选出端粒酶抑制剂，避免了传统端粒酶活性检测中常用的聚合酶链式扩增反应及电泳等手段，可以降低因抑制聚合酶链式扩增反应而带来的假阳性问题，同时也能有效的节约人力，有望实现高度自动化的筛选体系。

实施例2

步骤一、将金基底的QCM芯片浸泡到总浓度为10mM的溴代异丁基十一硫醇与三羟基乙基十一硫醇的混合溶液中，其中溴代异丁基十一硫醇与三羟基乙基十一硫醇的比例为1∶100，室温下孵育15小时，然后将QCM芯片取出，用乙醇冲洗干净，再用氮气吹干，得到表面修饰有自组装层的QCM芯片；配置去离子水与甲醇体积比为1∶1的混合溶液，向每升混合溶液中加入16mmol 2，2′-联吡啶，5mmol寡聚甲基丙烯酸寡乙二醇酯，5mmol甲基丙烯酸-2-羟基乙酯混合，并加入0.004mmol的氯化铜，得到淡蓝色的溶液，对淡蓝色溶液除氧20min，随后向每升除氧后的淡蓝色溶液中加入0.004mmol抗坏血酸，保持氮气氛围，得到红色溶液，将表面修饰有自组装层的QCM芯片置于红色溶液中，并将整个反应体系移至手套箱中，室温下反应10h，将QCM芯片从反应液中取出，用甲醇和去离子水交替冲洗QCM芯片，然后用氮气吹干，最后将QCM芯片置于含10mg·mL^-1琥珀酐及15mg·mL^-14-二甲氨基吡啶的二甲基甲酰胺溶液中反应12小时，得到表面羧基功能化的QCM芯片；

步骤二、将碳化二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺按照1∶1的摩尔比溶解于去离子水中，得到溶质浓度为0.1M的活化液，将步骤一中经羧基功能化后的QCM芯片表面用所述活化液孵育2h，然后用去离子水冲洗，再用氮气吹干；

步骤三、采用序列(SEQ ID NO.1)为5′-TTT TTT TTT TAA TCC GTCGAG CAG AGT T-3′的端粒酶引物，采用常规方法对端粒酶引物的5′端进行氨基功能化，将步骤二中吹干后的QCM芯片表面用氨基功能化的端粒酶引物溶液孵育1h，用去离子水冲洗后用氮气吹干，得到固定有引物的QCM芯片；所述氨基功能化的端粒酶引物溶液中氨基功能化的端粒酶引物的浓度为2μM；

步骤四、将步骤三中固定有引物的QCM芯片装入石英晶体微天平的反应器中，采用六通阀和蠕动泵作为进样装置，向反应器中通入工作液(Tris·HCl、KCl和MgCl₂的混合水溶液，工作液中Tris·HCl的浓度为30mM，KCl的浓度为30mM，MgCl₂的浓度为0.5mM)，待基线稳定后，读取石英晶体微天平监测到的频率F1，然后通过六通阀向反应器中加入对照液(由10μL含端粒酶的HeLa细胞提取物，80μL工作液，10μL水和2μL浓度为100μM的三磷酸脱氧核糖核苷混合而成)，待对照液全部进入反应器中，关闭蠕动泵，使对照液驻留在反应器中，反应0.5h后，打开蠕动泵，通入工作液冲洗QCM芯片，读取石英晶体微天平监测到的频率F2，计算频率F1和频率F2的差值ΔF；

步骤五、将步骤三中固定有引物的QCM芯片装入石英晶体微天平的反应器中，采用六通阀和蠕动泵作为进样装置，向反应器中通入工作液(Tris·HCl、KCl和MgCl₂的混合水溶液，工作液中Tris·HCl的浓度为30mM，KCl的浓度为30mM，MgCl₂的浓度为0.5mM)，待基线稳定后，读取石英晶体微天平监测到的频率F1′，然后通过六通阀向反应器中加入待测液(由10μL浓度为1ng·mL^-1的待测试剂B(meso-四(4-(N-甲基吡啶基))卟啉-TMPyP4)，10μL含端粒酶的HeLa细胞提取物，80μL工作液和2μL浓度为100μM的三磷酸脱氧核糖核苷混合而成)，待待测液全部进入反应器中，关闭蠕动泵，使待测液驻留在反应器中，反应0.5h后，打开蠕动泵，通入工作液冲洗QCM芯片，读取石英晶体微天平监测到的频率F2′，计算频率F1′和频率F2′的差值ΔF′，计算ΔF′与步骤四中ΔF的比值，得到ΔF′/ΔF为80％，判定待测试剂B(meso-四(4-(N-甲基吡啶基))卟啉-TMPyP4)不是端粒酶抑制剂。

实施例3

步骤一、将金基底的QCM芯片浸泡到总浓度为5mM的溴代异丁基十一硫醇与三羟基乙基十一硫醇的混合溶液中，其中溴代异丁基十一硫醇与三羟基乙基十一硫醇的比例为1∶50，室温下孵育15小时，然后将QCM芯片取出，用乙醇冲洗干净，再用氮气吹干，得到表面修饰有自组装层的QCM芯片；配置去离子水与甲醇体积比为1∶1的混合溶液，向每升混合溶液中加入16mmol 2，2′-联吡啶，5mmol寡聚甲基丙烯酸寡乙二醇酯，5mmol甲基丙烯酸-2-羟基乙酯混合，并加入0.004mmol的氯化铜，得到淡蓝色的溶液，对淡蓝色溶液除氧10min，随后向每升除氧后的淡蓝色溶液中加入0.004mmol抗坏血酸，保持氮气氛围，得到红色溶液，将表面修饰有自组装层的QCM芯片置于红色溶液中，并将整个反应体系移至手套箱中，室温下反应4h，将QCM芯片从反应液中取出，用甲醇和去离子水交替冲洗QCM芯片，然后用氮气吹干，最后将QCM芯片置于含10mg·mL^-1琥珀酐及15mg·mL^-14-二甲氨基吡啶的二甲基甲酰胺溶液中反应12小时，得到表面羧基功能化的QCM芯片；

步骤二、将碳化二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺按照1∶1的摩尔比溶解于去离子水中，得到溶质浓度为0.1M的活化液，将步骤一中经羧基功能化后的QCM芯片表面用所述活化液孵育1h，然后用去离子水冲洗，再用氮气吹干；

步骤三、采用序列(SEQ ID NO.1)为5′-TTT TTT TTT TAA TCC GTCGAG CAG AGT T-3′的端粒酶引物，采用常规方法对端粒酶引物的5′端进行氨基功能化，将步骤二中吹干后的QCM芯片表面用氨基功能化的端粒酶引物溶液孵育1.5h，用去离子水冲洗后用氮气吹干，得到固定有引物的QCM芯片；所述氨基功能化的端粒酶引物溶液中氨基功能化的端粒酶引物的浓度为1.5μM；

步骤四、将步骤三中固定有引物的QCM芯片装入石英晶体微天平的反应器中，采用六通阀和蠕动泵作为进样装置，向反应器中通入工作液(Tris·HCl、KCl和MgCl₂的混合水溶液，工作液中Tris·HCl的浓度为70mM，KCl的浓度为70mM，MgCl₂的浓度为1.5mM)，待基线稳定后，读取石英晶体微天平监测到的频率F1，然后通过六通阀向反应器中加入对照液(由10μL含端粒酶的HeLa细胞提取物，80μL工作液，10μL水和2μL浓度为100μM的三磷酸脱氧核糖核苷混合而成)，待对照液全部进入反应器中，关闭蠕动泵，使对照液驻留在反应器中，反应1h后，打开蠕动泵，通入工作液冲洗QCM芯片，读取石英晶体微天平监测到的频率F2，计算频率F1和频率F2的差值ΔF；

步骤五、将步骤三中固定有引物的QCM芯片装入石英晶体微天平的反应器中，采用六通阀和蠕动泵作为进样装置，向反应器中通入工作液(Tris·HCl、KCl和MgCl₂的混合水溶液，工作液中Tris·HCl的浓度为70mM，KCl的浓度为70mM，MgCl₂的浓度为1.5mM)，待基线稳定后，读取石英晶体微天平监测到的频率F1′，然后通过六通阀向反应器中加入待测液(由10μL浓度为1ng·mL^-1的待测试剂C(焦磷酸二乙酯)，10μL含端粒酶的HeLa细胞提取物，80μL工作液和2μL浓度为100μM的三磷酸脱氧核糖核苷混合而成)，待待测液全部进入反应器中，关闭蠕动泵，使待测液驻留在反应器中，反应1h后，打开蠕动泵，通入工作液冲洗QCM芯片，读取石英晶体微天平监测到的频率F2′，计算频率F1′和频率F2′的差值ΔF′，计算ΔF′与步骤四中ΔF的比值，得到ΔF′/ΔF为33％，判定待测试剂C(焦磷酸二乙酯)是端粒酶抑制剂。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何限制，凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

Claims

1.一种利用石英晶体微天平筛选端粒酶抑制剂的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种利用石英晶体微天平筛选端粒酶抑制剂的方法，其特征在于，步骤一中所述表面修饰有自组装层的QCM芯片的制备方法为：将金基底的QCM芯片浸泡到总浓度为1mM～10mM的溴代异丁基十一硫醇与三羟基乙基十一硫醇的混合溶液中，其中溴代异丁基十一硫醇与三羟基乙基十一硫醇的比例为1∶10～100，室温下孵育15小时，然后将QCM芯片取出，用乙醇冲洗干净，再用氮气吹干，得到表面修饰有自组装层的QCM芯片。

3.根据权利要求1所述的一种利用石英晶体微天平筛选端粒酶抑制剂的方法，其特征在于，步骤一中所述QCM芯片表面羧基功能化的方法为：配置去离子水与甲醇体积比为1∶1的混合溶液，向每升混合溶液中加入16mmol 2，2′-联吡啶，5mmol寡聚甲基丙烯酸寡乙二醇酯，5mmol甲基丙烯酸-2-羟基乙酯混合，并加入0.004mmol的氯化铜，得到淡蓝色的溶液，对淡蓝色溶液除氧10min～30min，随后向每升除氧后的淡蓝色溶液中加入0.004mmol抗坏血酸，保持氮气氛围，得到红色溶液，将QCM芯片置于红色溶液中，并将整个反应体系移至手套箱中，室温下反应4h～16h，将QCM芯片从反应液中取出，用甲醇和去离子水交替冲洗QCM芯片，然后用氮气吹干，最后将QCM芯片置于含10mg·mL^-1琥珀酐及15mg·mL^-14-二甲氨基吡啶的二甲基甲酰胺溶液中反应12小时，得到表面羧基功能化的QCM芯片。

4.根据权利要求1所述的一种利用石英晶体微天平筛选端粒酶抑制剂的方法，其特征在于，步骤三中所述氨基功能化的端粒酶引物为5′端氨基功能化的端粒酶引物，所述端粒酶引物的序列为：5′-TTT TTT TTT TAATCC GTC GAG CAG AGT T-3′。

5.根据权利要求1所述的一种利用石英晶体微天平筛选端粒酶抑制剂的方法，其特征在于，步骤四中所述对照液由10μL含端粒酶的HeLa细胞提取物，80μL工作液，10μL水和2μL浓度为100μM的三磷酸脱氧核糖核苷混合而成。

6.根据权利要求1所述的一种利用石英晶体微天平筛选端粒酶抑制剂的方法，其特征在于，步骤五中所述待测液由10μL浓度为1ng·mL^-1的待测试剂，10μL含端粒酶的HeLa细胞提取物，80μL工作液和2μL浓度为100μM的三磷酸脱氧核糖核苷混合而成。