CN102094079A - 原位qcm环介导恒温核酸扩增快速检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属分子生物学检测技术领域，公开了一种原位QCM环介导恒温核酸扩增快速检测方法，包括如下步骤：将环状介导恒温扩增反应体系中的4个引物(4个引物包括2个内引物FIP和BIP、2个外引物F3和B3)之一经巯基修饰后采用分子组装方法固定于QCM电极上；将配制好的核酸扩增反应物加到QCM检测池中；63-65℃恒温反应；用QCM仪器在线动态监测频率变化，可在10分钟内观察、分析判断出反应产物，判定试样为阳性或阴性。本发明的检测无需荧光标记、特异性高、灵敏度高、快速，可以实现样品原位检测并且鉴定简便。

Description

原位QCM环介导恒温核酸扩增快速检测方法
技术领域
本发明涉及一种恒温核酸扩增检测方法，特别是一种原位QCM环介导恒温核酸扩增快速检测方法，属分子生物学检测技术领域，可用于病原菌以及其他生物核酸的快速检测。
背景技术
常规的病原菌检测方法(例如，大量增殖菌数、菌落纯化分离、外部形态结构和生理生化鉴定以及血清学鉴定等)由于其耗时费力、步骤繁琐等不足之处，已经愈来愈满足不了人类对致病微生物快速、简易、高特异性的鉴定要求。因此，研究人员从分子生物学水平来研究病原菌的核酸结构和分子特征，以提高对病原菌的检测和研究能力。目前，在病原菌的分子生物学检测方法中，核酸扩增法是最有效的方法之一。
聚合酶链式反应(PCR)方法是至今使用最广泛的核酸扩增方法，它作为一种简便高效的基因扩增技术在病原菌检测过程中发挥着重大作用。但其操作过程必须有高精密的温度循环装置及配套检测装备，使得该方法难以在基层广泛推广应用。除此以外，还有其他核酸扩增方法，比如核酸序列扩增法(NASBA)、自序列复制法(3SR)和链置换复制法(SDA)。这些方法的检测水平都不少于10个拷贝，耗时1小时左右可将目标核酸扩增到相似的范围内，但它们对目标序列的扩增特异性不强，需要复杂的后续实验操作手段来检测扩增产物。
DNA环介导恒温核酸扩增(loop-mediated isothermal amplification of DNA，LAMP)技术，是日本荣研化学开发的替代PCR的简便、快速、准确并成本低廉的核酸检测方法，已在世界范围申请技术专利。LAMP技术克服以往基因扩增方法的不足，在等温条件下能够特异性、高效、快速地进行核酸的扩增，具有很多的优越性。虽然已公开的LAMP技术具有高灵敏性，能在等温条件下高效地扩增核酸，但是现有技术也有不足之处，主要是：1、为了满足扩增所需要的DNA的量，必须增殖病原菌的数量；但是，对于一些特殊的样品，细菌的增殖是很困难的；2、仅凭反应生成的乳白色沉淀物判断结果，不够清楚准确，也不易实现反应小型化，限制其进一步发展；3、需要对引物进行荧光标记，在荧光显微镜下观察判断结果；4、检测时间较长，需要0.5至1.5小时进行循环链置换反应。
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，在环介导恒温核酸扩增(LAMP)技术平台引入石英晶体微天平(QCM)技术，提供一种原位QCM环介导恒温核酸扩增快速检测方法，该方法特异性强、灵敏度高、检准率高、检测速度快、鉴定简便。
为达到本发明的目的，采用如下技术方案：
一种原位QCM环介导恒温核酸扩增快速检测方法，通过使用特异性引物，利用环介导恒温核酸扩增LAMP技术平台扩增靶基因的特定区域，其特征在于，将引物固定于石英晶体微天平QCM电极上，在安装该电极的QCM检测池中配置反应体系，在63-65℃恒温反应的同时，利用石英晶体微天平(QCM)技术进行在线检测，包括如下步骤：
(1)模板DNA提取：采用常规的方法提取DNA。如将试样细胞悬浮于磷酸缓冲液中，10000-12000rpm离心2-3分钟，去掉上清液，然后.加入样品提取液与沉淀的细胞均匀混合；在水浴中煮沸10min后，置冰水中冷却10min；10000--12000rpm离心分离2min，上清液即可作为模板DNA使用。
(2)引物固定：采用巯基化试剂分子组装方法，将环介导恒温扩增反应体系中的4个引物(4个引物包括2个内引物FIP和BIP、2个外引物F3和B3)之一固定于QCM电极上。
(3)反应体系配置：在安装上述步骤(2)所述电极的QCM检测池中加入10pmol/L的另三条引物、反应缓冲液、BstDNA聚合酶、模板DNA和双蒸水；
(4)核酸扩增反应与在线检测：在63-65℃恒温反应，用QCM仪器在线检测频率变化，在10分钟内观察到频率发生周期性波动变化，波动周期在2-5秒，频率曲线呈锯齿状，说明体系中发生了扩增反应，则判定试样为阳性(试样含有靶基因)，否则为阴性；
所述的样品提取液为20mMpH8.0的Tris-HCl、2mMEDTA、1.2％TritonX-100的混合液。
所述的引物包括两条外引物、两条内引物，其中一条内引物的5′端用巯基修饰。
所述的反应缓冲液组分为10x聚合酶反应缓冲液∶10mMdNTP∶150mMMgS04＝5∶1∶2。
本发明提供的原位QCM环介导恒温基因扩增快速检测方法，具有以下有益效果：检测之前不需要对待检菌进行培养，直接对样本中的病原微生物进行原位基因扩增；扩增和在线检测10分钟内即可同时完成；高特异性，假阳性检测率极低；灵敏度高，在复杂体系中可检测到单细胞的靶目标。
具体实施方式
下面提供具体实施例进一步阐述本发明的技术方法，但本发明不限于实施例。
实施例：用本发明的原位QCM环介导恒温基因扩增快速检测方法检测大肠杆菌O157，所用引物如下：
BIP：5′-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAATCATCGCACCGTCAA-3′
FIP：3′-TCATCGCACCGTCAAAGGAACCGTTACCGGGCAATAAGGAAC-5′
B3：5′-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3′
F3：3′-GTGAAATTATCGCCACGTTCGG-5′
按以下步骤进行：
(1)模板DNA提取：取120μl O157菌液于离心管中，10000r/min离心2min，去上清液，加入200μl样品提取液于离心管中，与沉淀所得菌体混合均匀；沸水中煮10分钟后立即置于冰上冷却10分钟；10000r/min离心2分钟，上清液即可作为模板DNA使用。
(2)引物固定：将内引物BIP进行巯基修饰，取浓度为10pmol/L经巯基修饰的BIP引物100μl，加到石英电极检测面的金膜上于室温反应1小时，然后用双蒸水洗涤两次，完成引物固定。
(3)反应体系配置：在安装步骤(2)所述石英电极的1#QCM检测池中加入10pmol/μl另三条引物各加40μl，，反应缓冲液480μl，BstDNA聚合酶40μl，模板DNA170μl，加双蒸水180μl。
(4)核酸扩增反应与在线检测：63-65℃恒温反应；用QCM仪器在线检测并记录频率变化，从加入反应液开始计时，10分钟内频率曲线出现两段特异性频率周期性波动变化，波动周期在3.1-3.3秒，频率曲线呈锯齿状，判定该试样为阳性(试样含有大肠杆菌O157靶基因)；对照2#QCM检测池(与1#QCM检测池平行加样，其中模板DNA2μl用非大肠杆菌O157DNA取代)频率曲线呈不规律变化，无锯齿状频率曲线出现，判定该试样为阴性(试样不含有大肠杆菌O157靶基因)。
经多次反复试验，未发现假阳性。

Claims (4)

1.一种原位QCM环介导恒温核酸扩增快速检测方法，通过使用特异性引物，利用环介导恒温核酸扩增LAMP技术平台扩增靶基因的特定区域，其特征在于，将引物固定于石英晶体微天平QCM电极上，在安装该电极的QCM检测池中配置反应体系，在63-65℃恒温反应的同时，利用石英晶体微天平(QCM)技术进行在线检测。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述引物固定是，采用巯基化试剂分子组装方法，将环介导恒温扩增反应体系中的4个引物(4个引物包括2个内引物FIP和BIP、2个外引物F3和B3)之一固定于QCM电极上。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述配置反应体系是，在安装所述电极的QCM检测池中分别加入另三条引物、反应缓冲液、BstDNA聚合酶、模板DNA及双蒸水。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述在线检测是，用QCM仪器在线检测频率变化，在10分钟内观察到频率发生周期性波动变化，频率曲线呈锯齿状，说明体系中发生了扩增反应，则判定试样含有靶基因即为阳性，否则为阴性。
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PB01 Publication
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Assignee: Henan Kerui Science and Technology Co., Ltd.

Assignor: Cui Xuechen

Contract record no.: 2012410000017

Denomination of invention: Fast detection method of loop-mediated isothermal nucleic acid amplification of in-situ QCM (Quartz Crystal Microbalance)

License type: Exclusive License

Open date: 20110615

Record date: 20120313

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