CN101575642A - 竞争性交替结合猝灭探针环介导等温扩增快速检测方法 - Google Patents

竞争性交替结合猝灭探针环介导等温扩增快速检测方法 Download PDF

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CN101575642A CNA2009100404023A CN200910040402A CN101575642A CN 101575642 A CN101575642 A CN 101575642A CN A2009100404023 A CNA2009100404023 A CN A2009100404023A CN 200910040402 A CN200910040402 A CN 200910040402A CN 101575642 A CN101575642 A CN 101575642A
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石磊
常彦磊
姜晓冰
王秋艳
闫鹤
鲁曦
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South China University of Technology SCUT
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Abstract

本发明公开了一种竞争性交替结合猝灭探针环介导等温扩增快速检测方法，本发明采用竞争性交替结合猝灭探针环介导等温扩增方法，通过检测反应前后的荧光量，可实现对样品中生物大分子聚合物的定量检测，该方法特异性强、灵敏度高、检准率高。该方法可定量分析细胞的RNA和DNA。本发明竞争性交替结合猝灭探针环介导等温扩增方法可在极短时间内完成。本发明方法可用来定量检测样品中的微生物或细胞基因的存在。

Description

竞争性交替结合猝灭探针环介导等温扩增快速检测方法
技术领域
本发明涉及一种恒温核酸扩增检测方法，特别是一种竞争性交替结合猝灭探针环介导等温扩增快速检测方法。
背景技术
基因检测是指从待检样品内提取DNA或者RNA，然后利用分子生物学方法来判断待检样品是否有基因异常或携带病原微生物。目前，基因检测可用于对病原微生物的病原检测、各种肿瘤的生物学特性判断、以及遗传病的基因异常分析等。在分子生物学水平上来研究样品的核酸结构和分子特征可实现对病原微生物和细胞基因快速而准确的检测，可大大提高检测水平和研究能力。目前，在分子生物学检测方法中，核酸扩增法是最有效的工具之一。
聚合酶链式反应(PCR)方法是至今使用最广泛的核酸扩增方法，它作为一种简便高效的基因扩增技术在病原菌诊断过程中发挥着重大作用。PCR方法尽管操作起来比较简单易行，扩增产物在短时间内能够大量聚集，但是操作过程必须有高精密的温度循环装置，从而使得这种强有力的方法不能在实地广泛应用。除了PCR方法以外，还有其他核酸扩增方法，比如核酸序列扩增法(NASBA)、自序列复制法(3SR)和链置换复制法(SDA)。这三种方法的检测水平都不少于10个拷贝，耗时1h左右就可以将目标核酸扩增到相似的范围内，尽管如此，它们对目标序列的扩增特异性不强，使得扩增后还需要详尽的实验操作手段来检测扩增产物。免疫学检测技术快速简便成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则准确性不够，目前只能是辅助检测手段。所以，及时将生物技术发展的最新成果应用于病原微生物检测，具有重要意义。
DNA环介导恒温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification of DNA，LAMP)克服以往基因扩增方法的不足，在等温条件下能够特异性、高效、快速地进行核酸的扩增，具有很多的优越性，见文献Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，Yonekawa T，Watanabe K，Amino N，Hase T.Loop-mediated isothermal amplification of DNA，Nucleic Acids Res.2000 Jun 15；28(12)：E63。该方法通常是按如下步骤进行：步骤一、对被检标本进行预处理，快速提取被检标本的DNA或RNA；步骤二、特异性引物的制备：确定待测标本的靶基因后，取得特异性引物2对，内引物和外引物各一对；步骤三、进行环介导等温扩增技术(LAMP)反应：将经前处理的样品、引物、反应缓冲液与Bst DNA聚合酶混合，在63～65℃保温0.5至1.5小时进行循环链置换反应；步骤四、分析判断反应产物结果。虽然已公开的LAMP技术具有高灵敏性，能在等温条件下高效地扩增核酸，但是现有技术也有不足之处，主要是：1、其特殊引物要求极为苛刻限制该方法的广泛应用；2、仅凭反应生成的乳白色沉淀物判断结果，不够清楚准确，也不易实现反应小型化，限制其进一步发展。3.只可以对待见样品进行定性，而无法实现定量，从而限制了该技术的应用范围。为了克服以上这些缺点有必要对现有的LAMP技术进行改进。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种竞争性交替结合猝灭探针环介导等温扩增快速检测方法，通过荧光探针的设计和竞争性DNA的作用，经过检测反应前后的荧光量，可实现对样品的定量检测，该方法特异性强、灵敏度高、检准率高。
为达到本发明的目的，采用如下技术方案：
本发明的一种竞争性交替结合猝灭探针环介导等温扩增快速诊断方法，包括如下步骤：
(1)将细胞悬浮于生理盐水中，离心，去掉上清，然后用磷酸缓冲液冲洗细胞，加入样品预处理液200～500μl，剧烈震荡混匀；
(2)将震荡混匀后的细胞溶液在100℃加热10～20分钟，冰浴10～20分钟，离心，取上清作为模板DNA；
(3)在PCR反应管中加入模板DNA，目标DNA序列的上游引物和下游引物，dNTPs，rTaq酶，10×PCR反应缓冲液，加双蒸水，进行反应，PCR产物即为目标DNA；
(4)竞争DNA序列上游序列的扩增，在PCR反应管中加入模板DNA，竞争DNA上游序列的上游引物和下游引物，dNTPs，rTaq酶，10×PCR反应缓冲液，加双蒸水，进行反应，PCR产物即为竞争DNA序列的上游序列；
(5)竞争DNA序列下游序列的扩展，在PCR反应管中加入模板DNA、竞争DNA序列下游序列的上游引物和下游引物，dNTPs，rTaq酶，10×PCR反应缓冲液，加双蒸水，进行反应，PCR产物即为竞争DNA序列的下游序列；
(6)竞争DNA的获得，分别回收纯化竞争DNA序列的上游序列和下游序列，混合后稀释，取5μl作为模板加入到PCR反应管中，然后依次加入上游序列的上游引物和下游序列的下游引物，dNTPs，Taq Plus扩增酶，10×PCR反应缓冲液，加双蒸水，进行反应，PCR产物即为竞争DNA，稀释后，通过分光光度计测定竞争DNA的浓度C；
(7)在PCR管加入交替结合淬灭探针，环介导等温扩增引物混合物，反应缓冲液，Bst DNA聚合酶，竞争DNA，加水，65～70℃反应45～50分钟，测定反应前Fb和反应后的荧光强度Fe，计算FC，FC＝Fe/Fb；
(8)在PCR管加入交替结合淬灭探针，环介导等温扩增引物混合物，反应缓冲液，BstDNA聚合酶，目标DNA，加水，65～70℃反应45～50分钟，测定反应前Fb和反应后的荧光强度Fe，计算FT，FT＝Fe/Fb；
(9)在PCR管加入交替结合淬灭探针，环介导等温扩增引物混合物，反应缓冲液，Bst DNA聚合酶，浓度为X的模板DNA，加水，65～70℃反应45～50分钟，测定反应前Fb和反应后的荧光强度Fe；
(10)根据以下公式计算模板DNA的浓度
Fe/Fb＝FT[X/(X+C)]+FC[C/(X+C)]＝[C(FC-FT)/(X+C)]+FT。
所述的进行反应为95～100℃预变性10～15min；94～100℃变性30～35s，50～60℃退火30～35s，72～75℃延伸30～35s，进行30个循环；最后于72～75℃延伸5～10min。
所述交替结合淬灭探针的3’末端由氟硼荧光染料进行标记，5’末端为磷酸化处理。
所述的荧光为氟硼荧光染料。
所述的Bst DNA聚合酶的浓度为8000U/ml，dNTPs浓度为10mmol/L，Taq Plus扩增酶浓度为5000U/ml，rTaq酶浓度为5000U/ml；所述的磷酸缓冲液冲洗细胞的次数为2～3次；步骤(1)中所述的每1L样品预处理液含有1mol盐酸、0.5mol pH为8.0的Tris-盐酸和20ml曲拉通100。
步骤(7)、(8)、(9)中所述的环介导等温扩增引物混合物包括上游外引物、下游外引物、上游内引物、下游内引物。
步骤(1)所述离心的转速为10000～12000转/分钟，时间为5～10分钟，步骤(2)所述离心的转速为14000～16000转/分钟，时间为5～10分钟。
步骤(7)、(8)、(9)所述的反应缓冲液中组分的体积比为：10×聚合酶反应缓冲液∶10mMdNTP∶150mM MgSO4＝5∶1∶2。
所述生理盐水的浓度为0.009g/ml；步骤(3)、(4)、(5)所述的加入模板DNA的量为5μl，上游引物和下游引物各3μl，dNTPs为2μl，rTaq酶为0.25μl，10×PCR反应缓冲液为5μl，加双蒸水至50μl；步骤(6)所述的稀释为用水稀释1000倍，所述的上游引物和下游引物的加入量均为3μl，dNTPs为2μl，TaqPlus扩增酶为0.25μl，10×PCR反应缓冲液为5μl，加双蒸水至50μl；步骤(7)所述的环介导等温扩增引物混合物的加入量为1.5μl，反应缓冲液为9.5μl，Bst DNA聚合酶为1μl，竞争DNA为2μl，加水至25μl。
步骤(8)所述的环介导等温扩增引物混合物的加入量为1.5μl，反应缓冲液为9.5μl，Bst DNA聚合酶为1μl，目标DNA为2μl，加水至25μl；步骤(9)所述的环介导等温扩增引物混合物的加入量为1.5μl，反应缓冲液为9.5μl，BstDNA聚合酶为1μl，浓度为X的模板DNA为2μl，加水至25μl。
所述交替结合淬灭探针的设计要求是探针序列必须位于环介导等温扩增产物的成环处，与目标DNA序列完全互补，以使探针与目标DNA互补后，探针5’末端荧光标记物氟硼荧光染料发生淬灭。利用oligo软件设计探针后，要求探针的5’端第一个碱基为C，3’末端最后一个碱基也必须C，以便于竞争性DNA的设计和末端荧光的标记。
所述竞争DNA序列的设计要求，必须含有与探针序列互补的DNA片段，但是与探针序列5’端第一个碱基互补位置的碱基也为C，即与探针DNA序列5’端第一个碱基不产生碱基配对，以使探针与竞争DNA互补后，探针5’端荧光标记物氟硼荧光染料不发生淬灭。竞争DNA长度与目标DNA相同，通过重叠延伸PCR法，得到的竞争DNA序列。
本发明相对于现有技术具有以下优点及有益效果：
(1)快速：竞争性交替结合猝灭探针环介导等温扩增反应可在1小时内完成；
(2)灵敏度高：在复杂体系中可检测到10个单位的靶目标；
(3)实现样品的定量检测：在极短的时间内实现对样品的定量检测，准确高效。
(4)鉴定简便：仅需要检测反应前后的荧光量即可实现对样品的定量。
具体实施方式
下面提供具体实施例进一步阐述本发明的技术方法，但本发明不限于实施例。
实施例1
用本发明的竞争性交替结合猝灭探针环介导等温扩增快速检测方法检测人类非小细胞肺癌(Homo sapiens)微转移，按以下步骤进行：
(1)被检样品的预处理
将细胞悬浮于0.009g/ml生理盐水中，10000转/分钟离心5分钟，去掉上清，然后用磷酸缓冲液冲洗细胞3次，加入样品预处理液500μl，剧烈震荡混匀，将震荡混匀后的细胞溶液在100℃加热10分钟，冰浴10分钟，16000转/分钟离心10分钟，取上清作为以下反应的模板DNA；
(2)目标DNA的制备
在PCR反应管中加入模板DNA5μl，目标DNA序列的上游引物和下游引物各3μl，10m mol/L的dNTPs(脱氧核糖核苷酸)2μl，0.25μl rTaq酶，10×PCR反应缓冲液5μl，加双蒸水至50μl，95℃预变性10min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，进行30个循环；最后于72℃延伸5min结束反应，PCR产物即为目标DNA；
所用引物序列如下：
SEQ.ID.NO1：上游引物：GCTGGCTGGTCACCAGAG
SEQ.ID.NO2：下游引物：GCTTTTTAAAAATGTAATG
(3)竞争DNA序列的制备
①竞争DNA序列上游序列的扩增，在PCR反应管中加入模板DNA5μl，竞争DNA上游序列的上游引物和下游引物各3μl，10m mol/L的dNTPs(脱氧核糖核苷酸)2μl，5000U/ml的0.25μl rTaq酶，10×PCR反应缓冲液5μl，加双蒸水至50μl，95℃预变性10min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，进行30个循环；最后于72℃延伸5min结束反应，PCR产物即为竞争DNA序列的上游序列；
所用引物序列如下：
SEQ.ID.NO3：上游引物：GCTGGCTGGTCACCAGAG
SEQ.ID.NO4：下游引物：TATGGGAAAGTAATACAG CTGCG GGGGGCAC
②竞争DNA序列下游序列的扩展，在PCR反应管中加入模板DNA5μl、竞争DNA序列下游序列的上游引物和下游引物各3μl，10m mol/L的dNTPs(脱氧核糖核苷酸)2μl，5000U/ml的0.25μlrTaq酶，10×PCR反应缓冲液5μl，加双蒸水至50μl，95℃预变性10min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，进行30个循环；最后于72℃延伸5min结束反应，PCR产物即为竞争DNA序列的下游序列；
所用引物序列如下：
SEQ.ID.NO5：上游引物：TGATGTCTATCAGGCGC
SEQ.ID.NO6：下游引物：CGGTACCTGCGCGCGGCTGCGGGGGGCACCAG
③竞争DNA的获得，分别回收纯化竞争DNA序列的上游序列和下游序列，混合后稀释1000倍，取5μl作为模板加入至PCR反应管中，然后依次加入上游序列的上游引物和下游序列的下游引物各3μl，10m mol/L的dNTPs(脱氧核糖核苷酸)2μl，5000U/ml的Taq Plus扩增酶0.25μl，10×
PCR反应缓冲液5μl，加双蒸水至50μl，95℃预变性10min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，进行30个循环；最后于72℃延伸5min结束反应，PCR产物即为竞争DNA，用水稀释1000倍后，通过分光光度计测定竞争DNA的浓度C；
所用引物序列如下：
SEQ.ID.NO7：上游引物：GCTGGCTGGTCACCAGAG
SEQ.ID.NO8：下游引物：GCTTTTTAAAAATGTAATG
(4)竞争性交替结合猝灭探针环介导等温扩增反应
所用引物及探针：
SEQ.ID.NO9：上游内引物：ATAGTTACGGTCGGAGGTCGACAACTCCGCCACTCGAACG
SEQ.ID.NO10：下游内引物：CCGAACAACGTCGTACACGCGCGGAGTTTAATTGCGCCG
SEQ.ID.NO11：上游外引物：ATAGTTACGGTCGGAGGTCG
SEQ.ID.NO12：下游外引物：AACACCACCAACGTATCCAA
SEQ.ID.NO13：交替结合淬灭探针：氟硼荧光-GAGTGGCGGAGTTGTTG-磷酸化
①数据FC的获得：在PCR管加入交替结合淬灭探针，环介导等温扩增引物混合物1.5μl，反应缓冲液9.5μl，8000U/ml的BstDNA聚合酶1μl，已知浓度为C的竞争DNA2μl，加水至25μl，65℃反应45分钟，测定反应前Fb和反应后的荧光强度Fe，计算两数值的比例FC，即FC＝Fe/Fb；
②数据FT的获得：在PCR管加入交替结合淬灭探针，环介导等温扩增引物混合物1.5μl，反应缓冲液9.5μl，8000U/ml的BstDNA聚合酶1μl，目标DNA2μl，加水至25μl，65℃反应45分钟，测定反应前Fb和反应后的荧光强度Fe，计算两数值的比例FT，即FT＝Fe/Fb；
③数据Fe/Fb的获得：PCR管加入交替结合淬灭探针，环介导等温扩增引物混合物1.5μl，反应缓冲液9.5μl，8000U/ml的BstDNA聚合酶1μl，模板DNA(浓度为X)2μl，加水至25μl，65℃反应45分钟，测定反应前Fb和反应后的荧光强度Fe；
(5)根据荧光强度计算DNA模板的量。
Fe/Fb＝FT[X/(X+C)]+FC[C/(X+C)]＝[C(FC-FT)/(X+C)]+FT
其中，Fe/Fb＝0.7；FT＝0.5；FC＝0.9；C＝10拷贝；计算得X＝10拷贝
通过测定反应前后荧光探针荧光量的变化，计算可得该样本中的DNA量为10拷贝，与实时荧光PCR检测结果(24拷贝，3小时，昂贵的仪器)比较，该方法检测结果准确可靠，快速(10拷贝，1小时，无需昂贵的设备)，成本低廉不需要贵重的仪器设备，可应用于临床样本的核酸定量检测。
实施例2
用本发明的竞争性交替结合猝灭探针环介导等温扩增快速检测方法按以下步骤对大肠杆菌O157(Escherichia coli)进行定量测定，
(1)被检样品的预处理
将平板上生长大肠杆菌O157(Escherichia coli)菌落悬浮于0.009g/ml生理盐水中，10000转/分钟离心10分钟，去掉上清，然后用磷酸缓冲液冲洗细胞3次，加入样品预处理液500μl，剧烈震荡混匀，将震荡混匀后的细胞溶液在100℃加热20分钟，冰浴20分钟，16000转/分钟离心10分钟，取上清作为以下反应的模板DNA；
(2)目标DNA的制备
在PCR反应管中加入模板DNA5μl，目标DNA序列的上游引物和下游引物各3μl，10m mol/L的dNTPs(脱氧核糖核苷酸)2μl，5000U/ml的0.25μl rTaq酶，10×PCR反应缓冲液5μl，加双蒸水至50μl，100℃预变性15min；100℃变性35s，60℃退火35s，75℃延伸35s，进行30个循环；最后于75℃延伸10min，结束反应，PCR产物即为目标DNA；
所用引物序列如下：
SEQ.ID.NO14：上游引物：TGATGTCTATCAGGCGC
SEQ.ID.NO15：下游引物：TATGGGAAAGTAATACAG
(3)竞争DNA序列的制备
①竞争DNA序列上游序列的扩增，在PCR反应管中加入模板DNA5μl，竞争DNA上游序列的上游引物和下游引物各3μl，10m mol/L的dNTPs(脱氧核糖核苷酸)2μl，5000U/ml的0.25μl rTaq酶，10×PCR反应缓冲液5μl，加双蒸水至50μl，100℃预变性15min；100℃变性35s，60℃退火35s，75℃延伸35s，进行30个循环；最后于75℃延伸10min，结束反应，，PCR产物即为竞争DNA序列的上游序列；所用引物序列如下：
SEQ.ID.NO16：上游引物：TGATGTCTATCAGGCGC
SEQ.ID.NO17：下游引物：GCAGAAGCCTTACGGTTCAGGCAAATACAGAG
②竞争DNA序列下游序列的扩展，在PCR反应管中加入模板DNA5μl、竞争DNA序列下游序列的上游引物和下游引物各3μl，10m mol/L的dNTPs(脱氧核糖核苷酸)2μl，5000U/ml的0.25μl rTaq酶，10×PCR反应缓冲液5μl，加双蒸水至50μl，100℃预变性15min；100℃变性35s，60℃退火35s，75℃延伸35s，进行30个循环；最后于75℃延伸10min，结束反应，PCR产物即为竞争DNA序列的下游序列；
所用引物序列如下：
SEQ.ID.NO18：上游引物：GCAGTTCTTCGTTTTGTCACTGTTACAGCAGAAGCC
SEQ.ID.NO19：下游引物：TTATGGGAAAGTAATACAG
③竞争DNA的获得，分别回收纯化竞争DNA序列的上游序列和下游序列，混合后稀释1000倍，取5μl作为模板加入至PCR反应管中，然后依次加入上游序列的上游引物和下游序列的下游引物各3μl，10m mol/L的dNTPs(脱氧核糖核苷酸)2μl，5000U/ml的Taq Plus扩增酶0.25μl，10×PCR反应缓冲液5μl，加双蒸水至50μl，100℃预变性15min；100℃变性35s，60℃退火35s，75℃延伸35s，进行30个循环；最后于75℃延伸10min，结束反应，PCR产物即为竞争DNA，用水稀释1000倍后，通过分光光度计测定竞争DNA的浓度C；
所用引物序列如下：
SEQ.ID.NO20：上游引物：TGATGTCTATCAGGCGC
SEQ.ID.NO21：下游引物：TTATGGGAAAGTAATACAG
(4)竞争性交替结合猝灭探针环介导等温扩增反应
所用引物及探针：
SEQ.ID.NO22：
上游内引物：GGAGCAGTITCAGACAGTGCCATTTTTCACTGTTACAGCAGAAGCC
SEQ.ID.NO23：
下游内引物：ATACGATGACGCCGGAAGACGTTTTCCCGATACTCCGGAAGCA
SEQ.ID.NO24：
上游外引物：CGCATCCAGAGCAGTTCTT
SEQ.ID.NO25：
下游外引物：TTCTCCCCACTCTGACACT
SEQ.ID.NO26：
交替结合淬灭探针：氟硼荧光-GCACTGTCTGAAACTGCTCCTGTTTA-磷酸化
①数据FC的获得：在PCR管加入交替结合淬灭探针，环介导等温扩增引物混合物1.5μl，反应缓冲液9.5μl，8000U/ml的BstDNA聚合酶1μl，已知浓度为C的竞争DNA2μl，加水至25μl，70℃反应50分钟，测定反应前Fb和反应后的荧光强度Fe，计算两数值的比例FC，即FC＝Fe/Fb；
②数据FT的获得：在PCR管加入交替结合淬灭探针，环介导等温扩增引物混合物1.5μl，反应缓冲液9.5μl，8000U/ml的Bst DNA聚合酶1μl，目标DNA2μl，加水至25μl，70℃反应50分钟，测定反应前Fb和反应后的荧光强度Fe，计算两数值的比例FT，即FT＝Fe/Fb；
③数据Fe/Fb的获得：PCR管加入交替结合淬灭探针，环介导等温扩增引物混合物1.5μl，反应缓冲液9.5μl，8000U/ml的BstDNA聚合酶1μl，模板DNA(浓度为X)2μl，加水至25μl，70℃反应50分钟，测定反应前Fb和反应后的荧光强度Fe；
(5)根据荧光强度计算DNA模板的量。
Fe/Fb＝FT[X/(X+C)]+FC[C/(X+C)]＝[C(FC-FT)/(X+C)]+FT
其中，Fe/Fb＝0.9；FT＝0.3；FC＝0.96；C＝102拷贝；计算得X＝10拷贝，通过测定反应前后荧光探针荧光量的变化，计算可得该复杂体系中大肠杆菌O157的DNA量为10拷贝，经过与传统稀释涂板计数方法所得结果(8拷贝，3～4天)比较，该计数方法准确可靠，耗时短(1小时)，成本低廉，鉴定简便，适用于食品中致病微生物的的快速计数检测。
SEQUENCE LISTING
<110>华南理工大学
<120>竞争性交替结合猝灭探针环介导等温扩增快速检测方法
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<213>人工序列
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ccgaacaacg tcgtacacgc gcggagttta attgcgccg    39
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
atagttacgg tcggaggtcg    20
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
aacaccacca acgtatccaa    20
<210>13
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
gagtggcgga gttgttg    17
<210>14
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
tgatgtctat caggcgc    17
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<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
tatgggaaag taatacag    18
<210>16
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
tgatgtctat caggcgc    17
<210>17
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
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gcagaagcct tacggttcag gcaaatacag ag    32
<210>18
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<212>DNA
<213>人工序列
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gcagttcttc gttttgtcac tgttacagca gaagcc    36
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<212>DNA
<213>人工序列
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ttatgggaaa gtaatacag    19
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<212>DNA
<213>人工序列
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tgatgtctat caggcgc    17
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<213>人工序列
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ttatgggaaa gtaatacag    19
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<212>DNA
<213>人工序列
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ggagcagttt cagacagtgc catttttcac tgttacagca gaagcc    46
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<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
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atacgatgac gccggaagac gttttcccga tactccggaa gca    43
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<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
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cgcatccaga gcagttctt    19
<210>25
<211>19
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<213>人工序列
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ttctccccac tctgacact    19
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>26
gcactgtctg aaactgctcc tgttta    26

Claims (10)

1、一种竞争性交替结合猝灭探针环介导等温扩增的快速检测方法，其特征在于，按如下步骤进行：
(1)将细胞悬浮于生理盐水中，离心，去掉上清，然后用磷酸缓冲液冲洗细胞，加入样品预处理液200～500μl，剧烈震荡混匀；
(2)将震荡混匀后的细胞溶液在100℃加热10～20分钟，冰浴10～20分钟，离心，取上清作为模板DNA；
(3)在PCR反应管中加入模板DNA，目标DNA序列的上游引物和下游引物，dNTPs，rTaq酶，10×PCR反应缓冲液，加双蒸水，进行反应，PCR产物即为目标DNA；
(4)竞争DNA序列上游序列的扩增，在PCR反应管中加入模板DNA，竞争DNA上游序列的上游引物和下游引物，dNTPs，rTaq酶，10×PCR反应缓冲液，加双蒸水，进行反应，PCR产物即为竞争DNA序列的上游序列；
(5)竞争DNA序列下游序列的扩展，在PCR反应管中加入模板DNA、竞争DNA序列下游序列的上游引物和下游引物，dNTPs，rTaq酶，10×PCR反应缓冲液，加双蒸水，进行反应，PCR产物即为竞争DNA序列的下游序列；
(6)竞争DNA的获得，分别回收纯化竞争DNA序列的上游序列和下游序列，混合后稀释，取5μl作为模板加入到PCR反应管中，然后依次加入上游序列的上游引物和下游序列的下游引物，dNTPs，Taq Plus扩增酶，10×PCR反应缓冲液，加双蒸水，进行反应，PCR产物即为竞争DNA，稀释后，通过分光光度计测定竞争DNA的浓度C；
(7)在PCR管加入交替结合淬灭探针，环介导等温扩增引物混合物，反应缓冲液，BstDNA聚合酶，竞争DNA，加水，65～70℃反应45～50分钟，测定反应前Fb和反应后的荧光强度Fe，计算FC，FC＝Fe/Fb；
(8)在PCR管加入交替结合淬灭探针，环介导等温扩增引物混合物，反应缓冲液，Bst DNA聚合酶，目标DNA，加水，65～70℃反应45～50分钟，测定反应前Fb和反应后的荧光强度Fe，计算FT，FT＝Fe/Fb；
(9)在PCR管加入交替结合淬灭探针，环介导等温扩增引物混合物，反应缓冲液，BstDNA聚合酶，浓度为X的模板DNA，加水，65～70℃反应45～50分钟，测定反应前Fb和反应后的荧光强度Fe；
(10)根据以下公式计算模板DNA的浓度
Fe/Fb＝FT[X/(X+C)]+FC[C/(X+C)]＝[C(FC-FT)/(X+C)]+FT。
2、根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于所述的进行反应为95～100℃预变性10～15min；94～100℃变性30～35s，50～60℃退火30～35s，72～75℃延伸30～35s，进行30个循环；最后于72～75℃延伸5～10min。
3、根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，所述交替结合淬灭探针的3’末端由氟硼荧光染料进行标记，5’末端为磷酸化处理。
4、根据权利要求3所述的快速检测方法，其特征在于所述的荧光为氟硼荧光染料。
5、根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于所述的Bst DNA聚合酶的浓度为8000U/ml，dNTPs浓度为10mmol/L，Taq Plus扩增酶浓度为5000U/ml，rTaq酶浓度为5000U/ml；所述的磷酸缓冲液冲洗细胞的次数为2～3次；步骤(1)中所述的每1L样品预处理液含有1mol盐酸、0.5molpH为8.0的Tris-盐酸和20ml曲拉通100。
6、根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于步骤(7)、(8)、(9)中所述的环介导等温扩增引物混合物包括上游外引物、下游外引物、上游内引物、下游内引物。
7、根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于步骤(1)所述离心的转速为10000～12000转/分钟，时间为5～10分钟，步骤(2)所述离心的转速为14000～16000转/分钟，时间为5～10分钟。
8、根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，步骤(7)、(8)、(9)所述的反应缓冲液中组分的体积比为：10×聚合酶反应缓冲液∶10mMdNTP∶150mMMgSO4＝5∶1∶2。
9、根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，所述生理盐水的浓度为0.009g/ml；步骤(3)、(4)、(5)所述的加入模板DNA的量为5μl，上游引物和下游引物各3μl，dNTPs为2μl，rTaq酶为0.25μl，10×PCR反应缓冲液为5μl，加双蒸水至50μl；步骤(6)所述的稀释为用水稀释1000倍，所述的上游引物和下游引物的加入量均为3μl，dNTPs为2μl，Taq Plus扩增酶为0.25μl，10×PCR反应缓冲液为5μl，加双蒸水至50μl；步骤(7)所述的环介导等温扩增引物混合物的加入量为1.5μl，反应缓冲液为9.5μl，Bst DNA聚合酶为1μl，竞争DNA为2μl，加水至25μl。
10、根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，步骤(8)所述的环介导等温扩增引物混合物的加入量为1.5μl，反应缓冲液为9.5μl，Bst DNA聚合酶为1μl，目标DNA为2μl，加水至25μl；步骤(9)所述的环介导等温扩增引物混合物的加入量为1.5μl，反应缓冲液为9.5μl，Bst DNA聚合酶为1μl，浓度为X的模板DNA为2μl，加水至25μl。
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