CN102892901A - 利用竞争性引物的目标碱基序列的检测方法 - Google Patents

利用竞争性引物的目标碱基序列的检测方法 Download PDF

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Abstract

一种具有多态性碱基的目标碱基序列的检测方法，该检测方法包括：（a）在具有由包括目标碱基序列的碱基序列组成的目标核酸的核酸试样中，添加至少一种检测用引物、至少一种竞争性引物以及至少一种共用引物的步骤；（b）使所述检测用引物与所述竞争性引物通过竞争与所述目标核酸进行退火，从而合成延伸产物A的步骤、（c）使通过所述步骤（b）或后述步骤（d）而得到的所述延伸产物A与所述共用引物进行退火，从而合成延伸产物B的步骤、（d）使通过所述步骤（c）得到的延伸产物B与所述检测用引物或所述竞争性引物进行退火，从而合成延伸产物A的步骤以及（e）检测所述延伸产物A或B的步骤。

Description

利用竞争性引物的目标碱基序列的检测方法
技术领域
本发明涉及具有多态性碱基的目标碱基序列的检测方法以及用于所述方法的试剂盒。更详细地说，涉及一种通过引物的竞争高精度地检测出目标碱基序列的检测方法、以及用于所述方法的试剂盒。
本发明基于2010年3月24日向日本专利局提出的申请号为特愿2010-68490的发明专利主张优先权，并将该内容引用于本申请。
背景技术
近年来，根据全球性的人类基因组解析，已确定出31亿个碱基对序列，且确定出人类基因数量大概为3~4万个。
人类的不同个体之间存在着不同的碱基序列，若该碱基序列以特定人群1%以上的频率存在，则称为基因多态。其中，对于基因碱基序列之间的不同点仅在于单个碱基的单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）而言，被认为其与各种疾病的发生具有相关性。例如，人类遗传病的病因，被认为是一个基因中单个碱基的差异。另外，生活方式病或癌症等疾病，被认为是受到了多个基因中单个碱基不同的影响而发生。由此，认为SNP的解析在药物靶标的探索或副作可的预见性等的药品开发方面非常有效。因此，SNP的解析作为全球性的重大课题而被向前推进。
作为药物效果或副作用程度因人而异的原因之一，可举出每个人的与药物代谢相关的酶群的不同。最近还确定了这种差异也是因基因上的略小差异而引起。
因此，提出了通过预先对患者的基因进行分析后，选出对患者最适宜的药并给予患者的方法。进而，不仅是单基因遗传病（monogenic disease），对多因子疾病(multifactorial disorder)，基因诊断的意义也正在得到迅速提高。
另外，对于以病原细菌或病毒为目标的药物效果来说，即便是相同种类，在每个个体之间也存在差异，这些差异大多数是由于每个个体基因上的细微差异产生的。这种作为外来因子的病原细菌或病毒的基因诊断，预计今后也增加为检测对象。
如此地，在后基因时代，能够检测出人类或病原微生物基因上的微小差异、尤其是能够检测出单个碱基的差异是一件非常重要的事情，而且预计今后会越来越重要。
至今，对检测出碱基序列中的细微差异、尤其是对单碱基差异的检测方法进行了各种研究（参照非专利文献1~2）。
然而，为了使检测达到实用水平，要求该方法为成本低、方法简便、检测时间短以及检测结果的准确度等方面都均非常优异的检测方法。但到现在为止，还没有能够满足上述要求的检测方法。
在检测基因的细微差异、尤其是检测单碱基差异时，通常来讲，试样中仅含有少量的作为目标的基因片段。此时，必须通过某些方法，预先对目标基因进行扩增。作为这种基因扩增法，例如、可举出聚合酶链反应（PCR，Polymerase Chain Reaction）法。
通常来说，为了检测出目标基因中的单个碱基差异，需要进行两个步骤，即基因扩增步骤和检测扩增基因中的单个碱基差异的步骤（参照非专利文献2）。然而，对于需要经过两个步骤的检测方法来说，由于包括多个步骤，因此处理起来比较复杂。
为了改善这种包括两个步骤的检测方法的复杂性，例如，报道了采用附着有荧光色素和淬灭剂的探针的TaqMan法（参照非专利文献3）、或利用通过质谱仪进行DNA质量分析的基体辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/MS）法（参照非专利文献4）等。另外，作为不需要进行基因扩增的检测方法，报道了采用对DNA结构进行识别并切割的酶侵入(invader)法（参照非专利文献5）。然而，若要实施这些方法，仍需要高成本，而且探针的设计也很复杂。
另一方面，报道了同时进行基因扩增和单碱基识别的方法（参照非专利文献6）。该方法是，在DNA聚合酶的延伸反应中，利用了延伸反应的发生取决于引物的3’末端是否与试样中的模板DNA相互补（以下称为匹配）的原理的方法。即，在用于PCR反应的一对引物组中，如果将一引物设计成在3’末端具有与单碱基多态相互补的碱基的引物时，若引物与模板完全匹配，则发生延伸反应，且在与另一个引物之间发生扩增反应。但是，如果一个引物与模板之间存在单碱基的不匹配现象，则该引物难以发生延伸反应，且在与另一个引物之间也难以发生扩增反应。由此，根据通过扩增反应而产生的扩增产物量，能够进行单碱基的识别。根据该方法，进行扩增反应后，无需进行用于识别单碱基的进一步操作。
然而，该方法中，反应容易受到反应条件例如模板量、温度、引物量、或用作反应底物的dNTP浓度等的影响。因此经常获得有再现性的数据并不容易。
作为其他方法，例如研究过：在引物3’末端附近引入人工变异（与模板不匹配的碱基）的方法（参照非专利文献7）。然而，在该方法中，为了引物的优化也需要付出一定的劳动，且识别精度也受到试样品质的影响。
为了解决这些问题，提出了一种使至少两种被荧光色素等标记的引物发生竞争的方法（参照专利文献1~4）。
如专利文献1~3所记载，被称为等位基因特异性PCR（ASP-PCR）的检测方法是利用下述特性：使引物的3’末端或末端附近与需要检测的碱基位置相互补、且与试样中的目标核酸碱基相匹配时发生延伸反应，不匹配时难以发生延伸反应的特性来进行检测。
进行等位基因特异性PCR反应时，可知：在使两个以上的等位基因特异性引物发生竞争的状态下，其碱基识别精度高于对各个等位基因特异性引物分别进行扩增时的碱基识别精度（非专利文献8）。其原因在于，当存在与需要检测的等位基因不同的等位基因时，与不同的等位基因相匹配的引物优先与目标碱基序列结合，从而抑制了需要检测的引物的非特异性延伸反应。而且，由于与不同的等位基因相匹配的引物进行有效的延伸反应，进而消耗掉延伸反应所需的材料，因此，也能够抑制通过与需要检测的等位基因不匹配的引物所引起的引物二聚体的生成。如此的使引物之间发生竞争的检测方法称为竞争性寡核苷酸引发（COP，Competitive Oligonucleotide Priming），在专利文献1~4中采用COP。
专利文献1所提出的方法是利用了当相对于目标核酸使用不匹配碱基数量不同的多个竞争性引物时，不匹配碱基数量少的竞争性引物与目标核酸容易形成双链的性质的方法，该方法是简便地检测出目标核酸中的单碱基变异的好方法。
然而，在该方法中，进行SNP解析时有可能发生假阳性反应。其原因认为，由于只针对目标核酸中的单碱基变异而设计竞争性引物，因此，对不匹配碱基数量多的竞争性引物延伸的抑制能力不够充分的缘故。
用于等位基因特异性PCR反应的等位基因特异引物中，其与目标核酸在3’末端附近的双链的稳定性非常重要，在3’末端附近，以除了需要识别的碱基以外，其它碱基与目标核酸不形成互补的方式进行设置，能够进一步提高碱基识别能力。
在专利文献2的SNP检测方法中，为了减少存在于专利文献1中的假阳性问题，在竞争性引物的3’末端引入用于识别SNP的碱基，而且在3’末端的第2~5个碱基中的至少一个碱基上引入人工变异。
另外，由专利文献3所提出的碱基多态检测方法中，在竞争性引物的3’末端第5个碱基上引入人工变异。
专利文献2~3所提出的方法是在竞争性引物之间的相同位置上引入相同变异的方法，该方法利用了下述特性：如果引物的3’末端附近与目标核酸相匹配，则能够有效地进行延伸反应，不匹配碱基数量越多，延伸效率越低的性质。另外，随着不匹配碱基的增加，引物与目标核酸之间的双链在整体上变得不稳定，这也与延伸效率的降低有关。
专利文献4所提出的碱基多态的检测方法中，记载有在竞争性引物之间的相同位置上引入不同变异的方式。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第2760553号公报
专利文献2：日本特开2003-52372号公报
专利文献3：日本特开2005-287499号公报
专利文献4：日本专利第4228041号公报
非专利文献
非专利文献1：Landegren，Laboratory protocols for mutation detection，Oxford university press，1996年
非专利文献2：Ahmadian等，Biotechniques,第32卷，第1122~1137页，2002年
非专利文献3：Livak等,PCR Methods Appl，第5卷，第357~362页，1995年
非专利文献4：Griffin等，Trends Biotechnol，第18卷，第77~84页，2000年
非专利文献5：Ryan等，Molecular diagnosis，第4卷，第135~144页，1999年
非专利文献6：Okayama等，J.Lab.Clin.Med，第114卷，第105~113页，1989年
非专利文献7：Newton等，Nucleic Acids Res，第17卷，第2503~2516页，1989年
非专利文献8：Myakishev等，Genome Res，第11卷，第163~169页，2001年
非专利文献9：Shinozuka等，J.Chem.Soc,，Chem.Commun，第10卷，第1377~1378页，1994年
发明内容
发明要解决的课题
然而，在这些方法中，对3’末端附近与模板不匹配的竞争性引物延伸进的抑制能力依然还是不够充分。
本发明是鉴于上述问题而完成，其目的在于，提供一种不仅具有与以往方法相同的简便性、而且识别精度高的目标碱基序列的检测方法，以及用于该方法的试剂盒。
解决课题的方法
本发明人等为了解决上述问题进行了深入研究，结果发现：通过对引入到竞争性引物上的变异位置进行探讨，能够解决上述课题。
即、本发明提供下述（1）~（14）的技术方案。
（1）一种具有多态性碱基的目标碱基序列的检测方法，该检测方法包括：
（a）在具有由包含目标碱基序列的碱基序列组成的目标核酸的核酸试样中，添加本质上与所述目标碱基序列互补的至少一种检测用引物、本质上与所述目标碱基序列互补且通过与所述检测用引物竞争与所述目标核酸发生退火的至少一种竞争性引物、以及至少一种共用引物的步骤；（b）作为模板采用包含所述核酸试样中的多态性碱基的目标碱基序列，使所述检测用引物与所述竞争性引物通过竞争与所述目标核酸发生退火并进行延伸反应，从而合成延伸产物A的步骤；（c）使通过所述步骤（b）或后述步骤（d）而得到的所述延伸产物A与所述共用引物进行退火并进行延伸反应，从而合成延伸产物B的步骤；（d）使通过所述步骤（c）得到的延伸产物B与所述检测用引物或所述竞争性引物进行退火，从而合成延伸产物A的步骤；以及（e）检测所述延伸产物A或B的步骤，而且，所述检测用引物包括与多态性碱基互补的匹配碱基、以及与所述目标序列中的除多态性碱基以外的碱基非互补的至少一个不匹配碱基；所述竞争性引物包括与多态性碱基非互补的不匹配碱基、以及与所述目标序列中的除多态性碱基以外的碱基非互补的至少一个不匹配碱基；所述检测用引物所具有的至少一个不匹配碱基的位置，不同于所述竞争性引物所具有的与除多态性碱基以外的碱基非互补的至少一个不匹配碱基的位置；所述共用引物是与所述检测用引物或所述竞争性引物形成引物对，从而能够使所述目标核酸扩增的引物。
（2）在所述（1）的目标碱基序列的检测方法中，所述检测用引物的3’末端或3’末端的第2个碱基上，也可以具有与多态性碱基相互补的匹配碱基。
（3）在所述（1）或（2）的目标碱基序列的检测方法中，对于所述检测用引物和所述竞争性引物而言，与除多态性碱基以外的碱基非互补的不匹配碱基，在所述检测用引物中位于与多态性碱基相互补的匹配碱基的第17个碱基以内，而在所述竞争性引物中则位于与多态性碱基非互补的不匹配碱基的第17个碱基以内，在各个引物中不匹配碱基的位置可以不同。
（4）在所述（1）~（3）的目标碱基序列的检测方法中，所述竞争性引物和所述检测用引物的链长之差可以为16个碱基以内。
（5）在所述（1）~（3）的目标碱基序列的检测方法中，对所述检测用引物和所述竞争性引物而言，第1个不匹配碱基位于3’末端的第6个碱基以内，第2个不匹配碱基位于3’末端的第7个碱基以上且5’末端侧的位置上；所述检测用引物的第1个不匹配碱基的位置与所述竞争性引物的第1个不匹配碱基的位置不同，所述检测用引物的第2个不匹配碱基与所述竞争性引物的第2个不匹配碱基可以互不相同。
（6）在所述（5）的目标碱基序列的检测方法中，所述检测用引物和所述竞争性引物所具有的所述第2个不匹配碱基的位置可以相同。
（7）在所述（1）~（6）的目标碱基序列的检测方法中，所述步骤（b）~（d）可以是通过由PCR、LAMP、NASBA、ICAN、TRC、SDA、TMA、SMAP、RPA、HAD所组成的组中选出的一种方法进行的步骤。
（8）在所述（1）~（7）中任一项所述的目标碱基序列的检测方法中，可以对所述检测用引物、所述竞争性引物或所述共用引物中的至少一个进行标记。
（9）在所述（8）的目标碱基序列的检测方法中，用于所述标记的标记物质可以为选自由荧光色素和吸能物质所组成的组中的至少一种。
（10）在所述（8）或（9）所述的目标碱基序列的检测方法中，用不同种类的标记物质分别标记所述检测用引物和所述竞争性引物，所述步骤（e）可以为分别检测所述检测用引物的延伸产物和所述竞争性引物的延伸产物的步骤。
（11）在所述（8）~（10）中任一项所述的目标碱基序列的检测方法中，所述步骤（e）可以是与所述步骤（a）~（d）同时进行的步骤，是检测被标记引物的延伸产物形成双链的状态的步骤。
（12）在所述（8）~（10）中任一项所述的目标碱基序列的检测方法中，所述步骤（e）是在所述步骤（d）之后进行的步骤，可以为采用所述延伸产物的熔解曲线或扩增曲线进行检测的步骤。
（13）在所述（8）~（12）中任一项所述的目标碱基序列的检测方法中，所述步骤（e）可以是采用QP(Quenching Probe/Primer)法进行检测的步骤。
（14）用于具有多态性碱基的目标碱基序列的检测方法中的试剂盒，该试剂盒包括：本质上与所述目标碱基序列互补的至少一种检测用引物；本质上与所述目标碱基序列互补且通过与所述检测用引物竞争与所述目标核酸进行退火的至少一种竞争性引物；以及至少一种共用引物，而且，所述检测用引物包括与多态性碱基互补的匹配碱基、以及与所述目标序列中的除多态性碱基以外的碱基非互补的至少一个不匹配碱基；所述竞争性引物包括与多态性碱基非互补的不匹配碱基、以及与所述目标序列中的除多态性碱基以外的碱基非互补的至少一个不匹配碱基；所述检测用引物所具有的至少一个不匹配碱基的位置不同于所述竞争性引物所具有的与除多态性碱基以外的碱基非互补的至少一个不匹配碱基的位置；所述共用引物是与所述检测用引物或所述竞争性引物形成引物对，从而使所述目标核酸扩增的引物，所述方法包括：（a）在具有所述目标核酸的核酸试样中添加所述检测用引物和所述竞争性引物的步骤、（b）作为模板采用包括所述核酸试样中的多态性碱基的目标碱基序列，且使所述检测用引物和所述竞争性引物通过竞争与所述目标核酸发生退火并进行延伸反应，从而合成延伸产物A的步骤、（c）使通过所述步骤（b）或后述步骤（d）而得到的所述延伸产物A与所述共用引物进行退火并进行延伸反应，从而合成延伸产物B的步骤、（d）使通过所述步骤（c）得到的延伸产物B与所述检测用引物或所述竞争性引物发生退火，从而合成延伸产物A的步骤、以及（e）检测出所述延伸产物A或B的步骤。
发明的效果
根据本发明的目标碱基序列的检测方法，该方法不仅具有与以往方法相同的简便性，且能够高精度地识别出单碱基多态性和单个碱基的体细胞变异。
另外，根据本发明的目标碱基序列的检测试剂盒，能够更简便地进行本发明的目标碱基序列的检测方法。
附图说明
图1表示以往的目标碱基序列检测方法的一实施方式的示意图。
图2表示以往的目标碱基序列检测方法的一实施方式的示意图。
图3表示本发明的目标碱基序列检测方法的一实施方式的示意图。
图4表示本发明的目标碱基序列检测方法的一实施方式的示意图。
图5表示本发明的目标碱基序列检测方法的一实施方式的示意图。
图6表示本发明的目标碱基序列检测方法的一实施方式的示意图。
图7A表示引物[1]和[2]之间发生竞争时，每一轮从引物延伸的产物量的图。
图7B表示引物[1]和[2]之间发生竞争时，每一轮从引物延伸的产物量的图。
图8A表示引物[1]和[3]之间发生竞争时，每一轮从引物延伸的产物量的图。
图8B表示引物[1]和[3]之间发生竞争时，每一轮从引物延伸的产物量的图。
图9A表示引物[1]和[4]之间发生竞争时，每一轮从引物延伸的产物量的图。
图9B表示引物[1]和[4]之间发生竞争时，每一轮从引物延伸的产物量的图。
图10表示用于区分单链状态和双链状态的方法的示意图。
〇：吖啶◇：荧光素
图11是用熔解曲线的负一次微分曲线来表示比较例1的结果的图。
图12是用熔解曲线的负一次微分曲线来表示比较例2的结果的图。
图13是用熔解曲线的负一次微分曲线来表示实施例1的结果的图。
图14是用熔解曲线的负一次微分曲线来表示实施例2的结果的图。
图15是用熔解曲线的负一次微分曲线来表示实施例3的结果的图。
图16是用熔解曲线的负一次微分曲线来表示实施例4的结果的图。
图17是用熔解曲线的负一次微分曲线来表示实施例5的结果的图。
图18是用熔解曲线的负一次微分曲线来表示实施例6的结果的图。
图19是用熔解曲线的负一次微分曲线来表示实施例7的结果的图。
图20是用熔解曲线的负一次微分曲线来表示实施例8的结果的图。
图21是用熔解曲线的负一次微分曲线来表示实施例9的结果的图。
图22是用熔解曲线的负一次微分曲线来表示实施例10的结果的图。
图23是用熔解曲线的负一次微分曲线来表示实施例11的结果的图。
图24是用熔解曲线的负一次微分曲线来表示实施例12的结果的图。
图25是用熔解曲线的负一次微分曲线来表示实施例13的结果的图。
图26是用熔解曲线的负一次微分曲线来表示实施例14的结果的图。
图27是用熔解曲线的负一次微分曲线来表示实施例15的结果的图。
图28是用熔解曲线的负一次微分曲线来表示实施例16的结果的图。
图29是用熔解曲线的负一次微分曲线来表示实施例17的结果的图。
图30是用熔解曲线的负一次微分曲线来表示实施例18的结果的图。
图31是用扩增曲线表示实施例19~27的结果的图。
图32是用扩增曲线表示实施例28~35的结果的图。
具体实施方式
本发明的目标碱基序列的检测方法，是检测具有多态性碱基的目标核酸的方法。
在本发明中，目标碱基序列是指包含多态性碱基的碱基序列。
在本发明中，检测目标碱基序列是指，检测包含在核酸试样中的核酸碱基序列是否与已知的碱基序列是相同的序列。
在本说明书和权利要求书中，将具有作为识别对象的多态性碱基的核酸称为“目标核酸”。
目标核酸由包含多态性碱基的碱基序列组成，只要该碱基序列的明确程度达到能够设计出可与所述目标核酸进行退火的引物即可，没有特别的限制。
另外，目标碱基序列所具有的多态性碱基，只要是单碱基多态即可，可以是如SNP的先天性多态，也可以是体细胞变异等的后天性多态。
SNP（单碱基多态）被定义为：在属于相同种的生物个体之间的基因组碱基序列中存在单碱基差异，且该变异以1％以上的频率出现在集团内部的现象。
另一方面，体细胞变异是指：在相同个体内存在于后天生成的基因细胞之间的差异。另外，变异部位是指序列中碱基的不同部位。碱基序列中的变异不仅表现为单碱基取代，还表现为多个碱基的取代、缺失或插入。
作为检测对象的多态，例如，可举出遗传病、生活方式病、癌症等各种疾病以及与药物代谢有关的基因多态等。本发明特别适合用于检测：与华法林最佳用量相关的基因即维生素K环氧化物还原酶复合体1（VKORC1）的内含子1区域中1173位点的基因多态（1173C>T）、K-Ras癌基因的第12或第13个密码子的变异。
本发明中，检测用引物是指用于检测目标碱基序列的引物。
检测用引物包括：与多态性碱基相互补的匹配碱基；以及相对于所述目标碱基序列中除了多态碱基以外的碱基的至少1个不匹配碱基。检测用引物所含有的不匹配碱基数量可以为1个，也可以为2个以上。优选为1~5个，进一步优选为1~3个，特别优选为1个或2个。
本发明中，竞争性引物是指，通过与所述检测用引物的竞争与目标核酸中包含多态性碱基的区域进行退火的引物，具有与多态性碱基非互补的不匹配碱基。在竞争性引物中，由于具有与多态性碱基非互补的不匹配碱基，因此，在与目标核酸进行退火后，不会与目标核酸中的多态性碱基形成碱基对。另外，在竞争性引物中，不仅具有与多态性碱基非互补的不匹配碱基，还具有相对于所述目标碱基序列中除了多态碱基以外的碱基的至少1个不匹配碱基。
竞争性引物所具有的不匹配碱基数量可以为1个，也可以为2个以上。优选为1~5个，进一步优选为1~3个，特别优选为1个或2个。
另外，在本发明中，匹配是指双链状态的DNA碱基对形成为沃森-克里克（Watson-Crick）碱基对的状态，不匹配是指，没有形成沃森-克里克碱基对的状态。沃森-克里克碱基对是指，脱氧核糖核酸的两个多核苷酸分子组成腺嘌呤（A）和胸腺嘧啶（T）（或者是尿嘧啶（U））、鸟嘌呤（G）和胞核嘧啶（C）组，并通过氢键来连接的碱基对。不匹配碱基可以为天然碱基也可以为人工碱基，但必须与模板碱基不同。
检测用引物所含有的至少一个不匹配碱基的位置，与所述竞争性引物所含有的不匹配碱基的位置不同。因此，在检测用引物与竞争性引物之间，碱基序列中至少存在3个不同的碱基。
在此，不匹配碱基的位置是指模板与引物形成了双键时，将与多态性碱基相对应的碱基设为基准的状态下，所述不匹配碱基在引物中的位置。
对于目标核酸，两者通过竞争与其进行退火，由此能够提高多态性碱基的检测精度。其原因在于，当存在与需要检测的等位基因（本发明的目标核酸）不同的等位基因时，若将能够检测出目标等位基因的引物设为检测用引物、将能够检测出不同等位基因的引物作为竞争性引物来使用，竞争性引物优先与所述不同的等位基因相结合，由此能够抑制检测用引物的非特异性反应。另外，由于3’末端附近的稳定性互不同，因此，能够有效地进行竞争性引物的延伸反应，进而延伸反应所需的材料被消耗掉，从而也可以抑制由检测用引物所引起的非特异扩增。
在本发明中，检测用引物和竞争性引物本质上与目标碱基序列相互补。在此，本发明中的本质上的互补是指，寡核苷酸具有在延伸反应的条件下能够与包括特定序列的目标核酸形成双键状态的碱基序列，但并不要求完全互补，也可以含有几个不匹配碱基对。
另外，对于检测用引物和竞争性引物来说，退火区域只要位于目标碱基序列中即可，其退火区域可以互不相同。从竞争性地与目标核酸进行退火的方面考虑，优选按照目标核酸和竞争性引物在检测用引物发生退火的同一个区域进行退火反应的方式设计两个引物。
本发明中，优选检测用引物在3’末端或3’末端的第2个碱基上具有与多态性碱基相互补的碱基。从竞争性地与目标核酸进行退火的方面考虑，优选竞争性引物在3’末端或3’末端的第2个碱基上具有与多态性碱基非互补的碱基。
例如，当目标碱基序列为5’-ATGCATGC-3’、且5’末端5碱基的A为多态性碱基时，作为用来检测该多态性碱基A的检测用引物，可将其3’末端附近的序列设置成5’-GCAT-3’或者5’-GCATG-3’。此时，作为竞争性引物，可将其3’末端附近的序列设为5’-GCAG-3’或者5’-GCAGG。上述仅是一例，不匹配碱基可以从除1种匹配碱基以外的3种碱基中进行选择。检测用引物中，用于识别模板碱基的位置优选为3’末端或3’末端的第2个碱基位置，但也可以是远离3’末端的位置。
对于竞争性引物中的、与多态性碱基不匹配的碱基种类而言，优选与除目标碱基序列以外的基因型多态互相匹配的碱基种类。例如，在检测野生型为C、变异型为A的多态的情况下，若检测变异型，当将含有多态性碱基A的碱基序列作为目标碱基序列时，竞争性引物可以选择A、G、C中的任一个作为与多态性碱基A非互补的碱基，但优选与野生型相互补的G。
本发明中，竞争性引物可以使用一种，也可以使用两种以上。例如，如后述的K-ras，当为存在多个基因型的多态时，优选使用分别与除检测对象的基因型以外的各基因型相匹配的多种竞争性引物。
本发明中的共用引物是指，与检测用引物或竞争性引物进行配对，从而能够扩增目标核酸的引物，该共用引物具有与检测用引物或竞争性引物的延伸产物的3’末端侧第10~30个碱基相匹配的序列，且具有在PCR反应中能够以检测用引物或竞争性引物的延伸产物作为模板进行延伸的能力。本发明中，可以使用两种以上的共用引物，且该两种以上的共用引物可以具有竞争关系。具有竞争关系的两种以上的共用引物可以含有多态性碱基序列。
对与检测用引物和竞争性引物所具有的多态性碱基以外的碱基形成非互补的不匹配碱基而言，优选该不匹配碱基在检测用引物中位于从与多态性碱基相互补的匹配碱基开始的第17个碱基以内，更优选位于第8个碱基以内；优选该不匹配碱基在竞争性引物中位于从与多态性碱基非互补的不匹配碱基开始的第17个碱基以内，更优选位于第8个碱基以内。
检测用引物和竞争性引物可分别包括多个不匹配碱基。当检测用引物和竞争性引物分别包括2个不匹配碱基时，优选在上述检测用引物和上述竞争性引物中，第1个不匹配碱基位于3’末端的第6个碱基以内，第2个不匹配碱基位于3’末端的第7个碱基以上且5’末端侧的位置上。
而且，优选检测用引物的第1个不匹配碱基的位置，不同于所述竞争性引物所具有的第1个不匹配碱基的位置。
另外，在检测用引物和竞争性引物中，第2个不匹配碱基可以位于不同的位置，碱基种类也可以不相同。即，位于相同位置时，碱基种类也可以不同。
本发明中，“所述检测用引物的第2个不匹配碱基与所述竞争性引物的第2个不匹配碱基互不相同”，具体来说，是指两者位于不同的位置、或两者位于相同位置但碱基种类不同的状态。
本发明的检测引物和竞争性引物中，第2个不匹配碱基可以位于相同的位置。
检测用引物和竞争性引物中，优选第2个不匹配碱基离3’末端有7个碱基以上，进一步优选离3’末端有9个碱基以上。
另外，从提高检测用引物的扩增反应效率方面来说，优选第2个不匹配碱基位于引物的中心附近。
例如，使用20~25个碱基的引物的情况下，优选第2个不匹配碱基位于3’末端的第7~15个碱基的位置上，更优选位于第9~15个碱基的位置上。
检测用引物和竞争性引物的长度有时会影响识别能力或反应性。例如，引物链越长，就具有优先与目标核酸退火的倾向。因此，为了高精度地检测出目标碱基序列，优选所述竞争性引物与所述检测用引物的链长差异为16个碱基以内，更优选为2个碱基以内，特别优选为1个碱基以内。
例如，检测用引物和竞争性引物链的长度有差异的情况下，当竞争性引物链的长度较长时，竞争性引物比检测用引物优先进行退火，从而阻碍检测用引物的退火。相反，当检测用引物链的长度较长时，检测用引物比竞争性引物优先进行退火，从而阻碍竞争性引物的退火。因此，优选检测用引物和竞争性引物的链长属于相同程度。
以下，利用图1~图6，对本发明的目标碱基序列的检测方法进行进一步的详细说明。
图1是以往目标碱基序列的检测方法的一实施方式的示意图。
在图1中，作为反应组合物的一部分，可举出具有基因多态（C>T）的模板S、检测用引物（引物A：相当于正向引物）、竞争性引物（引物B：相当于正向引物）和共用引物（相当于反向引物）。
对检测用引物和竞争性引物退火时与模板S不匹配的部位画下划线。
引物A为检测用引物，在引物A中，在3’末端引入了鸟嘌呤用作检测多态性碱基的碱基，作为与除多态性碱基以外的碱基非互补的不匹配碱基，在3’末端的第2个碱基上引入胸腺嘧啶。
另外，引物B为竞争性引物，在引物B中，作为与多态性碱基非互补的不匹配碱基，在3’末端引入了腺嘌呤；作为与除多态性碱基以外的碱基非互补的不匹配碱基，在3’末端的第2个碱基上引入了胸腺嘧啶。
在此，引物A与引物B所引入的变异碱基和其引入位置均相同。
由于使四种脱氧核糖核酸(deoxynucleotide triphosphate，dNTP)、DNA聚合酶和共用引物、与两种引物（引物A和引物B）同时作用于模板S上，因此，基因在检测用引物或竞争性引物与共用引物之间被扩增。
在此，本说明书中，轮（Round）是指PCR中的两次循环。例如，一轮是指下述步骤：检测用引物或竞争性引物与模板进行退火后发生延伸反应，改性后检测用引物或竞争性引物的延伸产物与共用引物发生退火，且以检测用引物或竞争性引物的延伸产物作为模板，进行共用引物的延伸反应的步骤。
图1的第一轮中，引物A与模板S形成的双链比引物B与模板S形成的双链更稳定，因此引物A的延伸反应效率更高。通过在两个引物的3’末端的第2个碱基位置引入与模板S不匹配的胸腺嘧啶，由此能够加大引物A的特异延伸效率与引物B的非特异延伸效率之间的差异。然而，在低频率下通过非特异性延伸反应而生成的延伸产物，其在下一个循环中成为共用引物的模板（模板b）而被复制，进而合成包括与引物B序列相互补的序列的DNA（模板b’）。模板a’或模板b’，分别与引物A或引物B形成完全互补，且在下一轮中均可以有效地延伸。
而且，在下一轮中，与引物B中的、除了多态性碱基以外的碱基非互补的不匹配碱基变得与模板a’互补。因此，引物B与模板a’形成双键并进行延伸反应。由此，第二轮以后，为了提高引物A与引物B的特异性而引入的不匹配碱基的效果会消失掉。模板a’通过每一轮的重复呈指数关系增加，因此，虽然与特异性延伸反应相比效率较低，但随着模板a或模板a’的增加，b和b’增加。因此，对本发明而言，在如何加大引物A与引物B相对于模板的延伸效率的差异的方面，还存在改良的余地。
作为以往的目标碱基序列的检测方法，利用图2，对检测用引物和竞争性引物之间的同一个位置上引入不同变异时的情形进行更详细的说明。
图2是表示以往目标碱基序列的检测方法的一实施方式的示意图。引物A中，作为用来检测多态性碱基的碱基，在3’末端引入有鸟嘌呤，作为与除多态性碱基以外的碱基非互补的不匹配碱基，在3’末端的第2个碱基位置上引入有胸腺嘧啶。另外，在引物B中，作为与多态性碱基非互补的不匹配碱基，在3’末端上引入有腺嘌呤，作为与除多态性碱基以外的碱基非互补的不匹配碱基，在3’末端的第2个碱基位置上引入有胞核嘧啶。
在此，引物A和引物B中所引入的变异位置虽然相同，但碱基不同。与图1相比较，在对模板a’的非特异性延伸反应中，3’末端与两个碱基不匹配，因此在用于检测多态性碱基的位置以外的位置上引入不匹配碱基的效果将持续，非特异性反应被抑制。
然而，模板a’在扩增过程中继续增加，因此，有必要采取更有效的方法来抑制非特异性的延伸反应。
接下来，利用图3~图5，对本发明的检测方法进行说明。
本发明的图3、图4表示：除了检测多态性的碱基以外所引入的不匹配碱基的位置在检测用引物和竞争性引物之间不同时的状态。除了引物的构成，其他的内容与图1中的说明相同，因此省略该说明。对检测用引物和竞争性引物退火时与模板S或模板a’不匹配的部位画下划线。
图3中，引物A的3’末端虽然与模板S相匹配，但3’末端的第2个碱基处于不匹配状态。另一方面，引物B的3’末端与3’末端的第3个碱基与模板S处于不匹配状态。此时，第二轮之后，引物B在3’末端有3个碱基与模板a’处于不匹配状态，从而能够非常有效地抑制非特异性延伸反应。用于检测多态性碱基的碱基之外引入的不匹配碱基，虽然是单碱基，但通过在竞争的引物之间变换位置，能够带来非常大的效果。
图4中，引物A的3’末端虽然与模板S匹配，但3’末端的第2个碱基处于不匹配状态。另一方面，引物B的3’末端和3’末端的第5个碱基与模板S处于不匹配状态。即使在这种情况下，引物B的3’末端的两个碱基和3’末端的第5个碱基的单碱基与模板a’处于不匹配状态，因此能够有效地抑制非特异性延伸反应。
图5表示本发明中将用于检测多态性碱基的碱基设置在引物3’末端的第2个碱基位置上的图。在该状态下，虽然用于检测多态性碱基的碱基之外引入的不匹配碱基在各引物中为单碱基，但引物B在3’末端就有3个碱基与模板a’不匹配，因此能够有效地抑制非特异性反应。
图6表示本发明中使用三种竞争性引物时的图。除了引物的构成以外，其他部分的内容与图1中的说明相同，因此省略该说明。对检测用引物和竞争性引物退火时与模板S或模板a’不匹配部位画了下划线。
通常的SNP中，多数情况下等位基因种类有两种，偶尔会有三种。而且，在癌基因的K-ras中，在一处出现了所有可能的变异。在这种情况下，优选使分别对应于4种碱基的4种引物进行竞争。
图6中，将用于检测K-ras变异的位置作为引物的3’末端。
引物A是用于检测胞核嘧啶碱基的引物，其3’末端与模板S相匹配，在3’末端的第2个碱基上引入与模板S不匹配的碱基胸腺嘧啶。
引物B是用于检测胸腺嘧啶碱基的引物，其3’末端与模板S不匹配，而且在3’末端的第3个碱基上引入与模板S不匹配的碱基胸腺嘧啶。
引物C是用于检测鸟嘌呤碱基的引物，其3’末端与模板S不匹配，而且在3’末端的第4个碱基上引入与模板S不匹配的碱基胸腺嘧啶。
同样，引物D是用于检测腺嘌呤碱基的引物，其3’末端与模板S不匹配，而且在3’末端的第5个碱基位置上引入与模板S不匹配的碱基胸腺嘧啶。
此时，引物B、C和D分别有3个碱基与模板a’不匹配，因此，各引物的非特异延伸反应均受到有效抑制。
因此，本发明中，即使是使两种以上的等位基因特异性引物发生竞争的情况下，通过在各引物中改变用于识别变异的碱基以外所导入的变异位置，从而能够在实用水平上抑制非特异性延伸反应。
对于图3所示的本发明的效果，用微软的Excel通过计算进行了模拟。首先，假设所检测的SNP不是胞核嘧啶就是胸腺嘧啶，然后设计4种的引物。模板和引物的序列如表1所示。
表1
Figure BDA00002172795800171
粗体字：多态性碱基位置下划线：与模板（C等位基因）不匹配的碱基
引物［1］用于检测C等位基因，其3’末端是鸟嘌呤，3’末端的第2个碱基是与模板不匹配的胸腺嘧啶。
引物［2］用于检测T等位基因，其3’末端是腺嘌呤，并与引物［1］相同地，3’末端的第2个碱基是与模板不匹配的胸腺嘧啶。
与引物［2］相同地，引物［3］用于检测T等位基因，但3’末端的第2个碱基上引入的不匹配碱基为胞核嘧啶，这点与引物［1］不同。
引物［4］用于检测T等位基因，其在3’末端的第3个碱基上引入了作为不匹配碱基的胸腺嘧啶，使其与引物［1］中引入不匹配碱基的位置不同。
模拟之前，进行以下的设定。
·将初期的模板浓度（模板S）设为1。
·将模板S或延伸产物（模板a’、模板b’）分别与引物形成双链的比率设为相等。
·将共用引物的延伸效率设为1。
表2是使引物［1］与引物［2］、引物［3］或引物［4］发生竞争后所假设的引物延伸效率。虽然延伸效率是非常大胆的假设，但对各个不匹配数和延伸反应效率的顺序是合理的假设。其中假设的是模板S为C等位基因的情况。双链的［1］、［2］、［3］和［4］相当于引物［1］、引物［2］、引物［3］和引物［4］，S表示模板S、［1］’表示以引物［1］的延伸产物作为模板而从共用引物延伸的产物、［2］’表示以引物［2］的延伸产物作为模板而从共用引物延伸的产物、以下［3］和［4］也与上述说明相同。序列中的上段表示引物、下段表示模板的序列。
另外，对引物中的与模板不匹配的碱基下面画了下划线。
表2
Figure BDA00002172795800191
在表3~表8中，表示了引物［1］与引物［2］、引物［3］或引物［4］发生竞争的情况下，反应进行到第20轮时的计算结果。其中，用斜体表示引物中与模板不匹配的碱基。
另外，图7A~9B是表示各轮中引物延伸而产生的产物量的图表。图7A表示从引物［1］延伸的延伸产物的模板的详细情况，图7B从引物［2］延伸的延伸产物的模板的详细情况。
Figure BDA00002172795800211
Figure BDA00002172795800221
Figure BDA00002172795800231
Figure BDA00002172795800241
Figure BDA00002172795800251
Figure BDA00002172795800261
根据图7A和图7B可知，在引物［1］和［2］的组合中，即使在模板和引物不匹配的情况下，也能够以高频率进行延伸，因此，来自引物［2］的延伸产物量多。特别是，若［1］’和引物［2］形成双链而引起延伸反应（图7B：将［1］’作为模板的延伸）时，则从下一轮开始可成为与引物［2］相匹配的模板（图7B：将［2］’作为模板的延伸），结果引物［2］的延伸产物进一步增加。另外，［2］’也可以成为引物［1］的模板（图7A：将［2］’作为模板的延伸），因此来自引物［1］的假阳性延伸产物量也会增多。
根据图8A和8B可知，在引物［1］和［3］的组合中，当模板与引物不匹配时，延伸反应受到一定程度的抑制，因此，来自引物［3］的延伸产物量较少。若［1］’和引物［3］形成双链而引起延伸反应（图8B：将［1］’作为模板的延伸），则下一轮开始可成为与引物［3］相匹配的模板（图8B：以［3］’作为模板的延伸），导致引物［3］的延伸产物进一步增加。
根据9A和9B可知，在引物［1］和［4］的组合中，当模板与引物不匹配时，几乎不会引起延伸反应，由此，以［1］’作为模板的引物［4］的延伸产物量（图9B：将［1］’作为模板的延伸）极少。因此，即使来自引物［1］的延伸产物量在增加，来自引物［4］的延伸产物量还是几乎不会增加。
根据模拟结知果可，引物［1］和［4］的组合在识别精度方面高于引物［1］和［2］的组合、引物［1］和［3］的组合。由此，确认了：改变检测用引物和竞争性引物的双方中不匹配碱基的引入位置，关系到识别精度的提高。
本发明的目标碱基序列的检测方法，包括：（a）在具有由包括目标碱基序列的碱基序列组成的目标核酸的核酸试样中，添加本质上与所述目标碱基序列互补的至少一种检测用引物、本质上与所述目标碱基序列互补且通过与所述检测用引物竞争与所述目标核酸发生退火的至少一种竞争性引物、以及至少一种共用引物的步骤；（b）作为模板采用包括所述核酸试样中的多态性碱基的目标碱基序列，使所述检测用引物与所述竞争性引物通过竞争与所述目标核酸发生退火并进行延伸反应，从而合成延伸产物A的步骤；（c）使通过所述步骤（b）或后述步骤（d）而得到的所述延伸产物A与所述共用引物进行退火并进行延伸反应，从而合成延伸产物B的步骤；（d）使通过所述步骤（c）得到的延伸产物B与所述检测用引物或所述竞争性引物进行退火，从而合成延伸产物A的步骤；以及（e）检测所述延伸产物A或B的步骤。
以下，对各个步骤进行说明。
首先，在步骤（a）中，（a）在具有由包括目标碱基序列的碱基序列组成的目标核酸的核酸试样中，添加一种检测用引物、至少一种竞争性引物以及至少一种共用引物。
对于核酸试样而言，只要其包括核酸即可，没有特别的限定，优选从动物、植物、微生物和培养细胞等中提取核酸的试样。从动物等提取核酸时，可采用酚/氯仿等公知的方法。其中，当核酸试样所包含的核酸为双链核酸时，优选预先使其调整为单链核酸。通过使用单链核酸，能够在后述的步骤（b）中，使该单链核酸与检测用引物、竞争性引物进行退火。所提取的双链核酸的单链化，可通过施加热能等公知的方法来进行。
核酸试样中的核酸，只要其为DNA或RNA即可，没有特别的限定，可以使用天然核酸也可以使用人工合成核酸。作为天然核酸，例如有从生物回收的基因组DNA、mRNA、rRNA、hnRNA等。另外，作为合成核酸，可举出通过β-氰乙基亚磷酰胺法、DNA固相合成法等公知的化学合成法合成的DNA、通过PCR等公知的核酸合成法合成的核酸以及通过逆转录反应合成的cDNA等。
另外，在本发明中，寡核苷酸是指，不限于天然或非天然的、具有与脱氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（RNA）同样功能的核酸，也包括PNA或LNA等人工核酸。
本发明中，引物是指能够与模板形成双链状态，并且DNA聚合酶或逆转录酶在合成DNA时起到提供3’羟基的功能的短核酸片段。
接着，在步骤（b）中，作为模板采用包括所述核酸试样中的多态性碱基的目标碱基序列，使所述检测用引物和所述竞争性引物通过竞争与所述目标核酸发生退火并进行延伸反应，由此合成延伸产物A。
对于检测用引物或竞争性引物与目标核酸发生退火的反应条件，没有特别的限制，在考虑各个引物的Tm值等的基础上，可以在温度、PH、盐浓度、缓冲液等的一般条件下进行反应。
本发明中的延伸反应是指，利用dNTP、DNA聚合酶等试剂进行的核酸合成反应，也包括以RNA作为模板且通过逆转录酶所进行的延伸反应。
DNA聚合酶是指，引物与模板发生退火，从而合成具有与模板DNA相互补的碱基序列的DNA链的酶的总称。
作为本发明所采用的DNA聚合酶没有特别的限定，但优选使用Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶等热稳定性DNA聚合酶，为了防止试验开始前的延伸，更优选使用具有热启动功能的DNA聚合酶。进而，在本发明中，为了在引物3’末端附近识别碱基，特别优选使用不具有3’→5’外切核酸酶活性的DNA聚合酶。
对于进行该延伸反应时的反应条件等具体方法，可使用实验医学第8卷第9号（羊土社，（1990））、PCR技术斯托克顿出版社（PCR Technology，Stockton Press）(1989)等文献所记载的公知的方法。
接着，在步骤（c）中，使通过所述步骤（b）或后述步骤（d）得到的所述延伸产物A与所述共用引物发生退火并进行延伸反应，从而合成延伸产物B；在步骤（d）中，使通过所述步骤（c）得到的延伸产物B与所述检测用引物或所述竞争性引物进行退火，从而合成延伸产物A。通过这些步骤，目标核酸得到扩增。
作为所述核酸扩增步骤，可举出PCR (Polymerase Chain Reaction)、LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification)、NASBA(Nucleic AcidSequence Based Amplification)、ICAN(Isothermal and Chimericalprimer-initiated Amplification of Nucleic acids)、TRC(TranscriptionReverse-Transcription Concerted)、SDA(Strand Displacement Amplification)、TMA(Transcription Mediated Amplification)、SMAP(SMart AmplificationProcess)、RPA(Recombines polymerase  amplification)、HDA(Helicase-dependent amplification)等。
在例示的所述核酸扩增步骤中，采用等温扩增反应时，使用通常使用的方法。
在PCR反应中，通过研究可选择检测用引物、竞争性引物或共用引物的最佳浓度，但优选将共用引物的浓度设定为检测用浓度和竞争性引物的总浓度以下，更优选将上述共用引物的浓度设定为检测用引物和竞争性引物总浓度的25%以下。这是因为防止出现下述情况：随着PCR反应的进行，与模板匹配的检测用引物优先被消耗掉，而使与模板不匹配的竞争性引物的相对浓度增加，从而导致识别精度的下降。通过降低共用引物的浓度，在消耗与模板匹配的检测用引物的同时，共用引物也被消耗掉，由此能够维持识别精度。
接着，通过步骤（e）检测所述延伸产物A或B。
步骤（e）中，对于引物延伸产物的检测方法没有特别的限制，可举出通过荧光色素等的引物标记、电泳、高效液相色谱或质谱、熔解曲线分析和生长曲线分析等可分析出核酸的所有方法。
利用标记物质预先对检测用引物、竞争性引物或共用引物进行标记，能够以该标记物质作为指标检测出延伸产物。作为这种标记物质，例如可举出荧光色素、吸能性物质、放射性同位素、化学发光体、酶和抗体等。对于引物中的标记位置没有特别的限定，但优选在不妨碍延伸反应的位置上进行标记。
用不同的荧光色素标记引物以辨别哪一个引物发生扩增，这种方法是对特异性的影响较少，也无需测量熔解曲线的简便方法，因此是优选的。
更优选的是，可举出在引物5’末端引入荧光素和吖啶的方法（参照非专利文献9）。该引物在处于单链状态时，即使照射具有荧光素激发波长的光，也会被吸能物质即吖啶淬灭掉，因此无法观察到荧光素所发出的荧光。
另一方面，当形成有双链时，还作为嵌入剂的吖啶与双链核酸相结合，因此其与荧光素之间距离变大而无法吸收由荧光素发出的荧光。由此，只有发生延伸反应的引物才能发出荧光（参照图10）。
因此，通过用不同的荧光色素标记检测用引物和竞争性引物，可以判断出是哪个引物的延伸产物。
例如，在本发明的检测方法中，由野生型和变异型的两种基因组成的多态基因中，将用于检测变异型等位基因的引物用作检测用引物、将用于检测野生型等位基因的引物用作竞争性引物，且用不同的荧光色素分别标记检测用引物和竞争性引物，分别检测出各个引物的延伸产物，由此，不仅能够检测出试样中是否存在1个多态，而且还可以检测出试样中的多个多态。
对于引入荧光色素的位置，没有特别的限定，但因标记在竞争性引物上，优选在不妨碍聚合酶反应的位置上引入荧光色素。
另外，也可以使用芘来代替吖啶。芘也具有吸能性，且可以与双键相结合，因此与吖啶一样，可检测出双链形成反应。
除此之外，作为检测两个以上等位基因特异性引物中的哪一个发生延伸的方法，有LUX（商标名称）引物（英杰生命技术公司，invitrogen社）、Amplifluor（商标名称）UNI引物（商标名称）（日本贵弥功株式会社，CHEMICON社）等，只要是能够判断出引物的单链状态和双链状态的方法（Ranasinghe，Chem.Commun，第四卷第5487~5502页），均可适用。
作为采用荧光色素的优选的检测方法，可举出采用QP（淬火探针/引物（Quenching Probe/Primer））法的检测方法。
QP法是利用鸟嘌呤碱基在空间上靠近某种荧光色素而使荧光淬灭的特征的检测方法。
通过利用靠近鸟嘌呤碱基而淬灭的荧光色素来标记本发明的检测用引物，能够检测出检测用引物与目标核酸是否在靠近。其中，检测用引物或目标核酸都可以包括该鸟嘌呤碱基，但优选检测用引物具有该鸟嘌呤碱基。
作为上述通过靠近鸟嘌呤碱基而被淬灭的荧光色素，可以采用通常用于QP法的荧光色素进行检测，例如，可举出BODIPY FL（产品名称，由英杰生命技术公司（invitrogeninvitrogen）制造）、PACFIC BLUE（产品名称，由英杰生命技术公司（invitrogeninvitrogen）制造）、GR6G（产品名称，由英杰生命技术公司（invitrogeninvitrogen）制造）和TAMRA（产品名称，由英杰生命技术公司（invitrogeninvitrogen）制造）等。
利用电泳进行检测时，改变两个需要竞争的引物长度，进而改变延伸产物的长度，由此根据电泳迁移率的差异可以检测出碱基序列。然而，重要的是，不能因改变引物长度而影响其特异性。
作为电泳检测方法中所使用的试剂，由于需要与双链DNA结合并发出荧光，因此更优选溴化乙锭或SYBR Green。
另外，SYBR Green是一种荧光色素，因此，通过测量后述的熔解曲线，能够分辨出来自哪个引物的延伸产物。
通过高效液相色谱，同样也可以分辨出来自哪个引物的延伸产物。
另外，当利用质量分析法进行检测时，两个引物的延伸产物可具有不同长度，且也可以用不同质量的物质来标记引物。采用后者时，对特异性的影响较少，因此优选。
所述步骤（e），可被设置成与由所述步骤（b）~（d）组成的核酸扩增步骤同时进行，也可设置成在核酸扩增步骤后进行。
作为核酸扩增步骤中的识别方法，可举出通过测量被标记的引物、或其延伸产物的双链状态的方法。该识别方法利用了与模板形成了双链的竞争性引物或竞争性引物的延伸产物形成双链时的能力差。
另外，也可以在形成双链的温度条件下，对引物的延伸产物进行荧光测量。该方法中，由于只能检测出由竞争性引物延伸的延伸产物，因此能够以更高的精度进行识别。
作为核酸扩增步骤后的识别方法，可举出测量熔解曲线的方法。这是一种利用扩增产物从双链过渡到单链的温度依赖性的方法。该方法中，由于只能检测出两个竞争性引物的扩增产物，因此能够进行更高精度的识别。
本发明的检测方法可用于如实时聚合酶链反应（PCR）装置等的DNA序列检测仪上。此时，向添加有上述PCR中所需的试剂和引物的容器内加入检测体DNA，进行实时聚合酶链反应（PCR），对检测用引物的延伸产物进行检测。加入检测体DNA后，在密封的条件下进行检测，由此，能够防止扩增产物的飞散或污染。
本发明的目标碱基序列检测试剂盒，其是对包括多态性碱基的目标碱基序列进行检测的上述方法中所使用的试剂盒，其特征在于，包有上述检测用引物、竞争性引物和共用引物。
除此之外，也可以与试样预处理用细胞破坏试剂、用于检测标记物质标记的试剂等组合使用。
如此地，通过将在本发明的目标碱基序列检测方法中所需的试剂等做成试剂盒，从而能够更简便且在短时间内识别出单碱基多态。
以下，根据实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明并不限定在下述的实施例。
实施例
在比较例1~2和实施例1~2中，将与华法林最佳用量相关的基因即维生素K环氧化物还原酶复合体1（VKORC1）的内含子1区域1173位的基因多态（1173C>T）设为识别对象。
如表9所示，制造出用于检测VKORC1的上述基因多态的两种检测用引物（VK1Wat-Acridine和VK1Mtg-Acridine）和共用引物（VK1R2）。作为检测用引物，从日本生物服务株式会社（Japan Bio Services Co）购买利用吖啶磷酰胺（由Glen research公司制造）在5’末端引入吖啶，且将6-荧光素（由Glen research公司制造）引入到其5’末端的检测用引物。关于表9所示的4种竞争性引物（VK1Mtg、VK1Mat、VK1Mac、VK1Wat）和共用引物（VK1R2），从葛莱娜日本公司（Greiner Bio-One）购买通过通常的合成方法合成的引物。作为模板的基因组DNA，使用从美国coriell医学研究所购买的基因。
表9中，用粗体表示1173位和多态性碱基识别部位，在不匹配碱基的引入部位画了下划线。另外，“Acridine”表示吖啶、“6-FAM”表示6-荧光素标记、右栏的数字表示与序列表中表示的标记前序列相对应的序列号。
Figure BDA00002172795800341
（比较例1）
将作为模板的VK1ORC1基因多态的C等位基因或T等位基因、作为检测用引物的VKIWat-Acridine和作为竞争性引物的VK1Mat与作为共用引物的VK1R2混合后，将反应液调制成如表10所记载的组成。将上述反应液装入实时聚合酶链反应（PCR）系统（由罗氏（Roche）公司制造，荧光定量PCR仪LightCycler）中，在95℃温度下保持1分钟，使DNA聚合酶的抗体发生改性，然后将包括两个步骤即62℃温度下反应20秒、95℃温度下反应5秒的PCR反应重复55个循环，且进行95℃~40℃的熔解曲线分析。另外，作为阴性对照，模板中使用了蒸馏水（D、W）。将结果表示在图11中。
表10
  5X colorless Go Taq Flexi Buffer（由美国普洛麦格（Promega）公司制造)   2.0μl
  25mM MgCl2（由美国普洛麦格（Promega）公司制造））   1.0μl
  2.5mM each dNTP（由美国普洛麦格（Promega）公司制造））   0.8μl
  2.5uM检测用引物   1.3μl
  2.5uM竞争性引物   1.3μl
  2.5uM共用引物   0.7μl
  5U/ul Go Taq Hot Start Polymerase(由美国普洛麦格（Promega)公司制造))   0.1μl
  3ng/ul模板（由美国coriell医学研究所制造）   1.0ul
  蒸馏水   适量
  总反应液量   10.0ul
图11是将比较例1的结果哟熔解曲线的负一次微分曲线表示的图。
若检测用引物（VK1Wat-Acridine）形成双链，则吸能物质即吖啶被嵌入到双链核酸中，吖啶的吸能量变小，从而来自6-荧光素的荧光强度变大。
熔解曲线是指，通过从低温开始逐步上升温度，测定由PCR法扩增的双链核酸改性为单链状态为止的荧光强度而得到的曲线。熔解曲线的负一次微分曲线表示相对于温度变化的荧光变化量，变化量最大的位置成为双链DNA的Tm。
在比较例1中，已知WK1Wat-Acridine的延伸产物在83℃~86℃的范围内，其单链状态与双链状态的变化量最多。由此，当在熔解曲线的负一次微分曲线中，若在83℃~86℃的范围内出现峰值，能够判断已发生了VK1Wat-Acridine的延伸反应。
采用比较例1的检测用引物和竞争性引物的组合时，作为模板无论采用C等位基因还是采用T等位基因，都得到了相同的结果。这表示，在上述引物组中延伸反应并不具有C等位基因特异性。
（比较例2）
除了作为检测用引物使用VK1Wat-Acridine、作为竞争性引物使用VK1Mac以外，进行与比较例1相同的反应和相同的分析。将其结果表示在图12中。
图12是将比较例2的结果以熔解曲线的负一次微分曲线表示的图。
在采用比较例2的检测用引物和竞争性引物的组合的情况下，优先观察到作为模板采用C等位基因时的VK1Wat-Acridine的扩增。然而，作为模板采用T等位基因时，只看到微小的峰值。这表示，将T等位基因作为试样使用时，对VK1Wat-Acridine延伸反应的抑制不够充分。
（实施例1）
除了作为检测用引物使用VK1Wat-Acridine、作为竞争性引物使用VK1Mtg以外，进行与比较例1相同的反应和相同的分析。将其结果表示在图13中。
图13是将实施例1的结果以熔解曲线的负一次微分曲线表示的图。
采用实施例1的检测用引物和竞争性引物的组合时，优先观察到了作为模板采用C等位基因时的VK1Wat-Acridine的扩增。而且，与比较例2的结果相比，作为模板采用T等位基因时的VK1Wat-Acridine的扩增得到了更好的抑制，由此可知在上述引物组中，C等位基因的特异性更优异。
（实施例2）
除了作为检测用引物使用VK1Mtg-Acridine、作为竞争性引物使用VK1Wat以外，进行与比较例1相同的反应和相同的分析。将其结果表示在图14中。
图14是将实施例2的结果以熔解曲线的负一次微分曲线表示的图。
在实施例2中，已知VK1Mtg-Acridine的延伸产物在83℃~86℃的范围内其单链状态与双链状态的变化量最多。由此，当在熔解曲线的负一次微分曲线的83℃~86℃的范围内出现峰值时，可判断为被荧光标记的VK1Mtg-Acridine发生了延伸反应。
在采用实施例2的检测用引物和竞争性引物的组合时，优先观察到了作为模板采用T等位基因时的VK1Mtg-Acridine的扩增。这表示，在上述引物组中的延伸反应具有T等位基因特异性。
实施例2的引物组与实施例1的引物组之间的不同点仅在于，荧光标记被引入到变异型引物中，而作为碱基序列组是相同的。由此，根据实施例1和实施例2的结果可知，无论对VK1Wat和VK1Mtg中的哪一个进行荧光标记，均可以判断出被荧光标记的引物是否发生了延伸反应。
因此，通过在VK1Wat和VK1Mtg中引入具有相互不同荧光波长的荧光色素，能够同时测量出各个荧光标记引物的延伸反应。
在实施例3~5中，与上述相同地、将与华法林最佳用量相关的基因即维生素K环氧化物还原酶复合体1（VKORC1）的内含子1区域1173位的基因多态（1173C>T）设为识别对象，评价竞争性引物中除多态性碱基以外引入的不匹配碱基的位置对检测精度的影响。
如表11所示，重新制造出用于识别VKORC1基因多态的检测用引物（VK1Mtg-pyren）。作为检测用引物，采用：从日本生物服务株式会社（JapanBio Services Co）购买在5’末端的第2个碱基的腺嘌呤上引入Amino-modifer（氨基改良剂）C6dA（由Glen research公司制造）、且将6-荧光素（由Glenresearch公司制造）引入到5’末端的物质，并通过1-芘丁酸琥珀酰亚胺酯（由Invitrogen公司制造）对氨基进行芘修饰，从而作为检测用引物。
对于竞争性引物和共用引物，使用从葛莱娜日本公司（Greiner Bio-One）购买的通过常规的合成方法合成的引物。作为竞争性引物，制造出多个改变了不匹配碱基的引入位置的竞争性引物。其他部分与比较例1的记载相同。
表11中，用粗体表示多态性碱基识别部位，用下划线表示不匹配碱基的引入部位、用双下划线表示经过芘修饰的碱基。另外，[pyrene]表示芘、[6-FAM]表示6-荧光素标记、右栏的数字表示与序列表中的标记前序列相对应的序列号。其中，所使用的模板与表9所记载的序列相同。
（实施例3）
将作为模板的VK1ORC1基因多态的C等位基因或T等位基因、作为检测用引物的VKIWat-pyrene和作为竞争性引物的VK14t，与作为共用引物的VK1R2混合后，将反应液调制成如表12所记载的组成。将上述反应液装入实时聚合酶链反应（PCR）系统（由罗氏（Roche）公司制造的荧光定量PCR仪LightCycler）中，在95℃温度下保持1分钟，使DNA聚合酶的抗体发生改性，然后将包括两个步骤即58℃温度下反应20秒、95℃温度下反应5秒的PCR反应重复55个循环，且进行95℃~40℃的熔解曲线分析。另外，作为阴性对照，在模板中使用了蒸馏水（D、W）。其结果表示在图15中。
表12
  5X Colorless Go Taq Flexi Buffer（由美国普洛麦格(Promega)公司制造)   2.0μl
  25mM  MgCl2（美国普洛麦格（Promega）公司制造））   1.0μl
  2.5mM each dNTP（美国普洛麦格（Promega）公司制造））   0.8μl
  2.5uM检测用引物   1.3μl
  2.5uM竞争性引物   1.3μl
  2.5uM共用引物   1.3μl
  5U/ul Go Taq Hot Start Polymerase(美国普洛麦格(Promega)公司制造)）   0.1μl
  3ng/ul模板（美国coriell医学研究所制造）   1.0ul
  蒸馏水   适量
  总反应液量   10.0ul
图15是将实施例3的结果以熔解曲线的负一次微分曲线表示的图。
当使用实施例3的检测用引物和竞争性引物的组合时，得到与实施例1相同的结果。由此可知，当竞争性引物的不匹配碱基位于3’末端的第4个碱基上时，也与在实施例1中位于3’末端的第3个碱基上时同样，显示出C等位基因特异性更优异。
（实施例4）
除了作为竞争性引物使用VK1M5t以外，进行与实施例3相同的反应和相同的分析。将其结果表示在图16中。
图16是将实施例4的结果以熔解曲线的负一次微分曲线表示的图。
当采用实施例4的检测用引物和竞争性引物的组合时，得到与实施例3相同的结果。由此可知，当竞争性引物的不匹配碱基位于3’末端的第5个碱基上时，也与实施例1中位于3’末端的第3个碱基上的情况一样，C等位基因特异性更优异。
（实施例5）
除了作为竞争性引物使用VK1M8t以外，进行与实施例3相同的反应和相同的分析。将其结果表示在图17中。
图17是将实施例5的结果以熔解曲线的负一次微分曲线表示的图。
当采用实施例5的检测用引物和竞争性引物的组合时，得到与实施例3相同的结果。由此可知，当竞争性引物的不匹配碱基位于3’末端的第8个碱基上时，也与实施例1中位于3’末端的第3个碱基上的情况一样，C等位基因特异性更优异。
（实施例6）
除了作为检测用引物使用VK1Mtg-pyrene、作为竞争性引物使用VK1W4t以外，进行与实施例3相同的反应和相同的分析。其结果表示在图18中。
图18是将实施例6的结果以熔解曲线的负一次微分曲线表示的图。
当采用实施例6的检测用引物和竞争性引物的组合时，得到与实施例2相同的结果。由此可知，即使在用于检测变异的引物组中，在竞争性引物的3’末端的第4个碱基上引入不匹配碱基，T等位基因特异性也更优异。
（实施例7）
除了作为竞争性引物使用VK1W5t以外，进行与实施例6相同的反应和相同的分析。将其结果表示在图19中。
图19是将实施例7的结果以熔解曲线的负一次微分曲线表示的图。
当采用实施例7的检测用引物和竞争性引物的组合时，得到与实施例6相同的结果。由此可知，即使在用于检测变异的引物组中，在竞争性引物的3’末端的第5个碱基位置上引入变异的情况下，T等位基因特异性也更优异。
（实施例8）
除了作为竞争性引物使用VK1W8t以外，进行与实施例7相同的反应和相同的分析。将其结果表示在图20中。
图20是将实施例8的结果以熔解曲线的负一次微分曲线表示的图。
当采用实施例8的检测用引物和竞争性引物的组合时，得到与实施例6相同的结果。由此可知，即使在用于检测变异的引物组中，在竞争性引物的3’末端的第8个碱基位置上引入变异时，T等位基因特异性也更优异。
（实施例9~18）
将作为模板的VK1ORC1基因多态的C等位基因或T等位基因、作为引物的表13所示的检测用引物和竞争性引物组，与作为共用引物的VK1R2混合后，将反应液调制成如表11所记载的组成。将上述反应液装入实时聚合酶链反应（PCR）系统（由罗氏（Roche）公司制造的荧光定量PCR仪LightCycler）中，在95℃温度下保持1分钟，使DNA聚合酶的抗体发生改性，然后将包括两个步骤即62℃温度下反应20秒、95℃温度下反应5秒的PCR反应重复55个循环，且进行95℃~40℃的熔解曲线分析。另外，作为阴性对照，在模板中使用了蒸馏水（D、W）。将其结果表示在图21~30中。
表13
  检测用引物   竞争性引物   结果
  实施例9   VK1Wat-pyrene   VK1M4t   图21
  实施例10   VK1Wat-pyrene   VK1M5t   图22
  实施例11   VK1Wat-pyrene   VK1M8t   图23
  实施例12   VK1Wat-pyrene   VK1M10a   图24
  实施例13   VK1Wat-pyrene   VK1M17t   图25
  实施例14   VK1Mtg-pyrene   VK1W4t   图26
  实施例15   VK1Mtg-pyrene   VK1W5t   图27
  实施例16   VK1Mtg-pyrene   VK1W8t   图28
  实施例17   VK1Mtg-pyrene   VK1W10a   图29
  实施例18   VK1Mtg-pyrene   VK1W17t   图30
图21~30是将实施例9~18的结果以熔解曲线的负一次微分曲线表示的图。
采用实施例9~13的检测用引物和竞争性引物的组合时，得到与实施例3相同的结果，采用实施例14~18的检测用引物和竞争性引物的组合时，得到与实施例6相同的结果。
根据实施例9~13确认：当检测用引物所具有的不匹配碱基和竞争性引物所具有的不匹配碱基位于从多态性碱基的互补碱基17个碱基以内时，能够以高精度进行检测。
另外，根据实施例3~8确认：即使在退火温度低的条件下，当位于8个碱基以内时，则能够以高精度进行检测。
在实施例19~27中，与上述相同地，将与华法林最佳用量相关的基因即维生素K环氧化物还原酶复合体1（VKORC1）的内含子1区域1173位的基因多态（1173C>T）设为识别对象，评价了竞争性引物与检测用引物的链长差异对检测精度的影响。
如表14所示，重新制造出用于识别VKORC1基因多态的检测用引物（VK1Wat-P-FAM1）。作为检测用引物，从日本生物服务株式会社（Japan BioServices Co）购买在5’末端的第4个碱基的胞核嘧啶上引入Amino-modifer C6dC（由Glen research公司制造）、且在5’末端的第6个碱基的胸腺嘧啶上引入荧光素dT（由Glen research公司制造）的物质，并使用1-芘丁酸琥珀酰亚胺酯（由Invitrogen公司制造）对氨基进行芘修饰，从而作为检测用引物。
对于表14所示的竞争性引物和共用引物，使用了从葛莱娜日本公司（Greiner Bio-One）购买的通过常规的合成方法合成的引物。关于竞争性引物，制造出多个链长不同的竞争性引物。
表14中，用粗体表示1173位点和多态性碱基的识别部位，用下划线表示不匹配碱基的引入部位。另外，[FAMdT]表示荧光素dT、[PyrendC]表示经过芘标记的Amino-modifer C6dC、右栏的数字表示与序列表中的标记前序列相对应的序列号。其中，所使用的模板与表9所记载的序列相同。
（实施例19~27）
将作为模板的VKORC1基因多态的C等位基因或T等位基因、作为引物的表15所示的检测用引物和竞争性引物的组合，与作为共用引物的VK1R2混合后，将反应液调制成如表10所记载的组成。将上述反应液装入实时聚合酶链反应（PCR）系统（由罗氏（Roche）公司制造的荧光定量PCR仪LightCycler）中，在95℃温度下保持1分钟，使DNA聚合酶的抗体发生改性，然后将包括两个步骤即64℃温度下反应30秒、95℃温度下反应5秒的PCR反应重复60个循环。作为模板采用C等位基因而进行反应，将所得到的结果表示在图31中。
Figure BDA00002172795800441
表15
  检测用引物   竞争性引物   结果
  实施例19   VK1Wat-P-FAM1   VK1Mtg-23   图31
  实施例20   VK1Wat-P-FAM1   VK1Mtg-24   图31
  实施例21   VK1Wat-P-FAM1   VK1Mtg-25   图31
  实施例22   VK1Wat-P-FAM1   VK1Mtg-26   图31
  实施例23   VK1Wat-P-FAM1   VK1Mtg-27   图31
  实施例24   VK1Wat-P-FAM1   VK1Mtg-31   图31
  实施例25   VK1Wat-P-FAM1   VK1Mtg-35   图31
  实施例26   VK1Wat-P-FAM1   VK1Mtg-39   图31
  实施例27   VK1Wat-P-FAM1   VK1Mtg-43   图31
如图31所示，采用实施例19~27的检测用引物和竞争性引物的组合时，确认了能够以高精度检测出基因多态。
确认了采用链长比检测用引物长2~16个碱基的竞争性引物的实施例21~26的反应性，优于采用链长比检测用引物长20个碱基的竞争性引物的实施例27的反应性。
而且，采用链长与检测用引物相同、或比检测用引物长1个碱基的竞争性引物的实施例19和实施例20的反应性，优于采用链长比检测用引物长2~16个碱基的竞争性引物的实施例21~26的反应性。
在实施例28~35中，与上述相同地，将与华法林最佳用量相关的基因即维生素K环氧化物还原酶复合体1（VKORC1）的内含子1区域1173位的基因多态（1173C>T）设为识别对象，并评价引入到竞争性引物和检测用引物中的第2个不匹配碱基对检测精度的影响。
如表16所示，重新制造出用于识别VKORC1基因多态的新型检测用引物（VK1Wat-P-FAM2-8）。作为检测用引物，使用从日本生物服务株式会社（Japan Bio Services Co）购买在5’末端的第4个碱基胞核嘧啶上引入Amino-modifer C6dC（由Glen research公司制造）、且在5’末端的第6个碱基胸腺嘧啶上引入荧光素dT（由Glen research公司制造）的物质，并通过1-芘丁酸琥珀酰亚胺酯（由Invitrogen公司制造）对氨基进行芘修饰的检测用引物。
对于表16所示的竞争性引物和共用引物，使用从葛莱娜日本公司（Greiner Bio-One）购买的通过常规的合成方法合成的引物。对于竞争性引物，制造出多个第2个不匹配碱基的引入位置不同的竞争性引物。
表16中，用粗体表示1173位点和多态性碱基识别部位，用下划线表示不匹配碱基的引入部位。另外，[FAMdT]表示荧光素dT、[Pyrend C]表示经过芘标记的Amino-modifer C6dC、右栏的数字表示与序列表中的标记前序列相对应的序列号。其中，所使用的模板与表9所记载的序列相同。
（实施例28~35）
将作为模板的VKORC1基因多态的C等位基因或T等位基因、作为引物的表17所示的检测用引物和竞争性引物的组合，与作为共用引物的VK1R2混合后，将反应液调制成如表10所记载的组成。将上述反应液装入实时聚合酶链反应（PCR）系统（由罗氏（Roche）公司制造的荧光定量PCR仪LightCycler）中，在95℃温度下保持1分钟，使DNA聚合酶的抗体发生改性，然后将包括两个步骤即在64℃温度下反应30秒、95℃温度下反应5秒的PCR反应重复60循环。作为模板采用C等位基因进行反应，将所得到的结果表示在图32中。
表16
Figure BDA00002172795800471
表17
  检测用引物   竞争性引物   结果
  实施例28   VK1Wat-P-FAM1   VK1Mtg-23-1   图32
  实施例29   VK1Wat-P-FAM2   VK1Mtg-23-2   图32
  实施例30   VK1Wat-P-FAM3   VK1Mtg-23-3   图32
  实施例31   VK1Wat-P-FAM4   VK1Mtg-23-4   图32
  实施例32   VK1Wat-P-FAM5   VK1Mtg-23-5   图32
  实施例33   VK1Wat-P-FAM6   VK1Mtg-23-6   图32
  实施例34   VK1Wat-P-FAM7   VK1Mtg-23-7   图32
  实施例35   VK1Wat-P-FAM8   VK1Mtg-23-8   图32
如图32所示，采用实施例28~35的检测用引物和竞争性引物的组合时，能够以高精度检测出基因多态。
另外，确认了采用第2个不匹配碱基离3’末端7个碱基以上的检测用引物和竞争性引物组合的实施例29~35，其反应性优于没有引入第2个不匹配碱基的实施例28。
其中，确认了采用第2个不匹配碱基离3’末端9个碱基以上的检测用引物和竞争性引物的组合的实施例29~34，其反应性特别优异。
工业实用性
根据本发明的利用竞争性引物的目标碱基序列的检测方法，由于其识别基因型的精度非常优异，因此可应用于临床检查等领域，特别是可应用单碱基多态或体细胞变异领域。
Figure IDA00002172796700011
Figure IDA00002172796700021
Figure IDA00002172796700031
Figure IDA00002172796700041
Figure IDA00002172796700061
Figure IDA00002172796700071

Claims (14)

1.一种目标碱基序列的检测方法，其是检测具有多态性碱基的目标碱基序列的方法，其特征在于，包括：
（a）在具有由包含目标碱基序列的碱基序列组成的目标核酸的核酸试样中，添加本质上与所述目标碱基序列互补的至少一种检测用引物、本质上与所述目标碱基序列互补且通过与所述检测用引物竞争与所述目标核酸进行退火的至少一种竞争性引物、以及至少一种共用引物的步骤；
（b）作为模板采用包含所述核酸试样中的多态性碱基的目标碱基序列，使所述检测用引物与所述竞争性引物通过竞争与所述目标核酸发生退火并进行延伸反应，从而合成延伸产物A的步骤；
（c）使通过所述步骤（b）或后述步骤（d）而得到的所述延伸产物A与所述共用引物进行退火并进行延伸反应，从而合成延伸产物B的步骤；
（d）使通过所述步骤（c）得到的延伸产物B与所述检测用引物或所述竞争性引物进行退火，从而合成延伸产物A的步骤；以及
（e）检测所述延伸产物A或B的步骤，
而且，所述检测用引物包括与多态性碱基互补的匹配碱基、以及与所述目标序列中的除多态性碱基以外的碱基非互补的至少一个不匹配碱基；
所述竞争性引物包括与多态性碱基非互补的不匹配碱基、以及与所述目标序列中的除多态性碱基以外的碱基非互补的至少一个不匹配碱基；
所述检测用引物所具有的至少一个不匹配碱基的位置，不同于所述竞争性引物所具有的与除多态性碱基以外的碱基非互补的至少一个不匹配碱基的位置；
所述共用引物是与所述检测用引物或所述竞争性引物形成引物对，从而能够使所述目标核酸扩增的引物。
2.如权利要求1所述的目标碱基序列的检测方法，其特征在于，所述检测用引物在3’末端或3’末端的第2个碱基上具有与多态性碱基互补的匹配碱基。
3.如权利要求1或2所述的目标碱基序列的检测方法，其特征在于，
在所述检测用引物和所述竞争性引物中，对于与除多态性碱基以外的碱基非互补的不匹配碱基而言，在所述检测用引物中位于与多态性碱基互补的匹配碱基的第17个碱基以内，在所述竞争性引物中位于与多态性碱基非互补的不匹配碱基的第17个碱基以内，在各个引物中不匹配碱基的位置不同。
4.如权利要求1~3中任一项所述的目标碱基序列的检测方法，其特征在于，所述竞争性引物和所述检测用引物的链长之差为16个碱基以内。
5.如权利要求1~3中任一项所述的目标碱基序列的检测方法，其特征在于，
在所述检测用引物和所述竞争性引物中，第1个不匹配碱基位于3’末端第6个碱基以内，第2个不匹配碱基位于3’末端第7个碱基以上且5’末端侧，
所述检测用引物的第1个不匹配碱基的位置与所述竞争性引物的第1个不匹配碱基的位置不相同，
所述检测用引物的第2个不匹配碱基与所述竞争性引物的第2个不匹配碱基互不相同。
6.如权利要求5所述的目标碱基序列的检测方法，其特征在于，所述检测用引物和所述竞争性引物所具有的所述第2个不匹配碱基的位置相同。
7.如权利要求1~6中任一项所述的目标碱基序列的检测方法，其特征在于，
所述步骤（b）~（d）是通过由PCR、LAMP、NASBA、ICAN、TRC、SDA、TMA、SMAP、RPA、HAD所组成的组中选出的一种方法进行的步骤。
8.如权利要求1~7中任一项所述的目标碱基序列的检测方法，其特征在于，对所述检测用引物、所述竞争性引物或所述共用引物中的至少一个进行标记。
9.如权利要求8所述的目标碱基序列的检测方法，其特征在于，用于所述标记的标记物质是由荧光色素和吸能物质所组成的组中选出的至少一种。
10.如权利要求8或9所述的目标碱基序列的检测方法，其特征在于，
用不同种类的标记物质分别标记所述检测用引物和所述竞争性引物，
所述步骤（e）为分别检测出所述检测用引物的延伸产物和所述竞争性引物的延伸产物的步骤。
11.如权利要求8~10中任一项所述的目标碱基序列的检测方法，其特征在于，所述步骤（e）是与所述步骤（a）~（d）同时进行的步骤，是检测被标记引物的延伸产物形成双链的状态的步骤。
12.如权利要求8~10中任一项所述的目标碱基序列的检测方法，其特征在于，所述步骤（e）是在所述步骤（d）之后进行的步骤，是采用所述延伸产物的熔解曲线或扩增曲线进行检测的步骤。
13.如权利要求8~10中任一项所述的目标碱基序列的检测方法，其特征在于，所述步骤（e）是采用QP法进行检测的步骤。
14.一种目标碱基序列检测试剂盒，用于具有多态性碱基的目标碱基序列的检测方法，其特征在于，包括：
本质上与所述目标碱基序列互补的至少一种检测用引物；
本质上与所述目标碱基序列互补且通过与所述检测用引物竞争与所述目标核酸进行退火的至少一种竞争性引物；以及
至少一种共用引物，
而且，所述检测用引物包括与多态性碱基互补的匹配碱基、以及与所述目标序列中的除多态性碱基以外的碱基非互补的至少一个不匹配碱基；
所述竞争性引物包括与多态性碱基非互补的不匹配碱基、以及与所述目标序列中的除多态性碱基以外的碱基非互补的至少一个不匹配碱基；
所述检测用引物所具有的至少一个不匹配碱基的位置，不同于所述竞争性引物所具有的与除多态性碱基以外的碱基非互补的至少一个不匹配碱基的位置；
所述共用引物是与所述检测用引物或所述竞争性引物形成引物对，从而能够使所述目标核酸扩增的引物，
所述方法包括：
（a）在具有所述目标核酸的核酸试样中，添加所述检测用引物和所述竞争性引物的步骤；
（b）作为模板采用包含所述核酸试样中的多态性碱基的目标碱基序列，且使所述检测用引物和所述竞争性引物通过竞争与所述目标核酸发生退火并进行延伸反应，从而合成延伸产物A的步骤；
（c）使通过所述步骤（b）或后述步骤（d）而得到的所述延伸产物A与所述共用引物进行退火并进行延伸反应，从而合成延伸产物B的步骤；
（d）使通过所述步骤（c）得到的延伸产物B与所述检测用引物或所述竞争性引物发生退火，从而合成延伸产物A的步骤；以及
（e）检测所述延伸产物A或B的步骤。
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