CN107849604A

CN107849604A - 用于评估无细胞dna的多重优化错配扩增(moma)实时pcr

Info

Publication number: CN107849604A
Application number: CN201680039018.XA
Authority: CN
Inventors: 青·富田·米切尔; 迈克尔·米切尔; 卡尔·斯塔姆
Original assignee: Wisconsin State University Medical School
Current assignee: Wisconsin State University Medical School; Medical College of Wisconsin
Priority date: 2015-04-30
Filing date: 2016-04-29
Publication date: 2018-03-27
Also published as: EA201792389A1; AU2022203482A1; WO2016176662A1; CA2984352A1; IL255301B; MX2017013878A; IL289404A; JP2018514219A; JP2022002508A; EP3289102A1; IL255301A0; HK1252152A1; AU2016255573A1; US20180142296A1; BR112017023232A2

Abstract

本发明涉及用于评估例如来自对象的样品中非天然核酸的量的方法和组合物。本文中提供的方法和组合物可用于确定对象中例如移植排斥的病症的风险。

Description

用于评估无细胞DNA的多重优化错配扩增(MOMA)实时PCR

相关申请

本申请依据35 U.S.C.119(e)要求于2015年4月30日提交的美国临时申请62/155,453的申请日权益，其内容通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明涉及用于评估来自对象的样品中非天然核酸的量的方法和组合物。本文中提供的方法和组合物可用于确定例如移植排斥的病症的风险。本发明还涉及用于使用多重优化错配扩增(multiplexed optimized mismatch amplification，MOMA)来评估非天然无细胞脱氧核糖核酸(非天然无细胞DNA，例如供体特异性无细胞DNA)的量的方法和组合物。

技术背景

检测并量化样品中非天然核酸的能力可允许早期检测例如移植排斥的病症。然而，当前用于定量分析异质核酸群(例如，天然和非天然核酸的混合物)的方法是受限的。

发明概述

本公开内容至少部分地基于以下令人惊讶的发现：可使用多重优化错配扩增来量化来自对象的样品中的低频率非天然核酸。多重优化错配扩增包括引物的设计，所述引物可包含用于扩增特定序列的3’倒数第二位错配，和相对于另一序列的双错配。用这样的引物进行扩增可允许定量地确定样品中非天然核酸的量，甚至在非天然核酸的量在异质核酸群中为例如1％或甚至0.5％以下的情况下也如此。

本文中提供了与这样的经优化扩增相关的方法、组合物和试剂盒。所述方法、组合物或试剂盒可以是本文中分别提供的任一种方法、组合物或试剂盒，包括实例和附图中的那些中的任一种。

在一个方面，提供了一种评估来自对象的样品中非天然核酸的量的方法。在一个实施方案中，所述方法包括：对于多种单核苷酸变体(single nucleotide variant，SNV)靶标中的每一种，用至少一种引物对对样品或其部分获得来自基于扩增的定量测定(例如聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)定量测定)的结果，其中所述至少一种引物对包含正向引物和反向引物，其中所述至少一种引物对包含具有相对于SNV靶标之一种序列(例如，等位基因)的3’错配(例如，倒数第二位错配)而相对于SNV靶标之另一种序列(例如，等位基因)的3’双错配的引物，并且特异性地扩增SNV靶标的这一种序列(例如，等位基因)。

在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括：对于每种SNV靶标，用至少一种另一引物对获得来自定量测定的结果，其中所述至少一种另一引物对包含正向引物和反向引物，其中所述至少一种另一引物特异性地扩增SNV靶标的另一种序列(例如，等位基因)。

在一个实施方案中，提供了一种评估来自对象的样品中非天然核酸的量的方法：对于多种单核苷酸变体(SNV)靶标中的每一种，用至少两种引物对对样品或其部分进行基于扩增的定量测定(例如PCR定量测定)，其中每种引物对包含正向引物和反向引物，其中所述至少两种引物对中的一种包含相对于SNV靶标之一种序列(例如，等位基因)的3’错配(例如，倒数第二位)而相对于SNV靶标之另一种序列(例如，等位基因)的3’双错配且特异性地扩增SNV靶标的这一种序列(例如，等位基因)，并且所述至少两种引物对中的另一种特异性地扩增SNV靶标的这另一种序列(例如，等位基因)。

在一个实施方案中，提供了一种评估来自对象的样品中非天然核酸的量的方法，其包括：对多种单核苷酸变体(SNV)靶标中的每一种获得来自用至少两种引物对对样品或其部分进行基于扩增的定量测定(例如聚合酶链反应(PCR)定量测定)的结果，其中每种引物对包含正向引物和反向引物，其中所述至少两种引物对中的一种包含相对于SNV靶标之一种序列(例如，等位基因)的3’错配(例如，倒数第二位)而相对于SNV靶标之另一种序列(例如，等位基因)的3’双错配且特异性地扩增SNV靶标的这一种序列(例如，等位基因)，并且所述至少两种引物对中的另一种特异性地扩增SNV靶标的这另一种序列(例如，等位基因)。

在一个实施方案中，提供了一种评估例如来自对象的样品中非天然核酸的量的方法，所述样品包含非天然和天然核酸，所述方法包括：对于多种SNV靶标，对每种这样的SNV靶标用如本文中提供的至少一种引物对(例如至少两种引物对)对样品获得来自基于扩增的定量测定(例如聚合酶链反应(PCR)测定)的结果，其中每种引物对包含正向引物和反向引物；基于天然核酸和/或非天然核酸的基因型来选择信息性结果；以及基于信息性结果来确定样品中非天然核酸的量。在一个实施方案中，所述方法还包括鉴定多种SNV靶标。在一个实施方案中，所述方法还包括推断非天然核酸的基因型。在一个实施方案中，所述方法还包括提供结果。

在一个实施方案中，提供了一种评估来自对象的样品中非天然核酸的量的方法，所述方法包括：获得来自以下的结果：1)对于多种SNV靶标中的每一种用至少一种引物对(例如至少两种引物对)对样品或其部分进行基于扩增的定量测定(例如PCR定量测定)，其中每种引物对包含正向引物和反向引物，其中所述至少一种引物对，例如至少两种引物对中的一种包含相对于SNV靶标之一种序列(例如，等位基因)的3’错配(例如，倒数第二位)而相对于SNV靶标之另一种序列(例如，等位基因)的3’双错配，并且特异性地扩增SNV靶标的这一种序列(例如，等位基因)；以及2)基于天然基因型和/或对可能的非天然基因型的预测来确定信息性结果。在一个实施方案中，当存在至少两种引物对时，另外的引物对特异性地扩增每种SNV靶标的另一种序列(例如，等位基因)，并且对每种SNV靶标用另外的引物对获得量化结果。

在一个实施方案中，一种评估来自对象的样品中非天然核酸的量的方法，所述方法包括获得来自以下的结果：1)对于多种SNV靶标中的每一种，用至少两种引物对对样品或其部分进行基于扩增的定量测定(例如PCR定量测定)，其中每种引物对包含正向引物和反向引物，其中所述至少两种引物对中的一种包含相对于SNV靶标之一种序列(例如，等位基因)的3’错配(例如，倒数第二位)而相对于SNV靶标之另一种序列(例如，等位基因)的3’双错配且特异性地扩增SNV靶标的这一种序列(例如，等位基因)，并且所述至少两种引物对中的另一种特异性地扩增SNV靶标的这另一种序列(例如，等位基因)；以及2)基于天然基因型和/或对可能的非天然基因型的预测来确定信息性结果。

在本文中提供的任一种方法、组合物或试剂盒的一个实施方案中，还包括用于每种SNV靶标的至少一种另一种引物对，和/或用其获得基于扩增的定量测定(例如PCR定量测定)的结果。在本文中提供的任一种方法、组合物或试剂盒的一个实施方案中，所述至少另一种引物对包含相对于SNV靶标之另一种序列(例如，等位基因)的3’错配(例如，倒数第二位)而相对于SNV靶标之一种序列(例如，等位基因)的3’双错配，并且特异性地扩增SNV靶标的这另一种序列(例如，等位基因)。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括基于结果来评估非天然核酸的量。在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述结果是信息性结果。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括选择基于扩增的定量测定(例如PCR定量测定)的信息性结果。在提供的任一种方法的一个实施方案中，对选择的信息性结果求平均。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，基于非天然核酸和/或天然核酸的基因型来选择基于扩增的定量测定(例如PCR定量测定)的信息性结果。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括获得非天然核酸和/或天然核酸的基因型。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括基于天然基因型和/或对可能的非天然基因型的预测来选择信息性结果。在提供的任一种方法的一个实施方案中，当不知道或未获得非天然核酸的基因型时，所述方法还包括基于对可能的非天然基因型的预测来评估结果。在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法包括基于信息性结果和预测的样品中非天然核酸的量。在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述评估或预测用期望-最大化算法进行。在提供的任一种方法的一个实施方案中，使用期望-最大化来预测可能的非天然基因型。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，使用最大似然来计算非天然核酸的量。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括获得多种SNV靶标。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括获得多种SNV靶标中每一种的至少一种，例如至少两种引物对。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括获得或提供结果。在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述结果是信息性结果。在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述结果包含样品中非天然核酸的量。

在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述结果在报告中提供。在一个方面，这样的报告在本文中提供。在提供的任一种方法或报告的一个实施方案中，所述结果是信息性结果。在提供的任一种方法或报告的一个实施方案中，所述结果包含样品中非天然核酸的量。

在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述结果从报告获得。在提供的任一种报告的一个实施方案中，所述报告以电子形式给予。在提供的任一种报告的一个实施方案中，所述报告为硬拷贝。在提供的任一种报告的一个实施方案中，所述报告口头给予。

在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述结果用于或可用于确定样品中非天然核酸的量。在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述结果是信息性结果。

在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括确定，例如基于所述结果来确定样品中非天然核酸的量。在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述结果是信息性结果。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，样品中非天然核酸的量是基于以扩增为基础的定量测定(例如PCR定量测定)的结果。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述结果是基于扩增的定量测定(例如PCR定量测定)的信息性结果。

在本文中提供的任一种方法、组合物、试剂盒或报告的一个实施方案中，所述量是非天然核酸与天然核酸的比例或百分比。

在提供的任一种方法、组合物或试剂盒的一个实施方案中，每种SNV靶标存在至少一种引物对、至少两种引物对、至少三种引物对、至少四种引物对或更多。在提供的任一种方法、组合物或试剂盒的一个实施方案中，多种SNV靶标为至少45、48、50、55、60、65、70、75、80、85或90种或更多种。在提供的任一种方法、组合物或试剂盒的一个实施方案中，多种SNV靶标为至少90、95种或更多种靶标。在提供的任一种方法、组合物或试剂盒的一个实施方案中，多种SNV靶标为少于105或100种靶标。

在提供的任一种方法、组合物或试剂盒的一个实施方案中，错配的引物是正向引物。在提供的任一种方法、组合物或试剂盒的一个实施方案中，用于每种SNV靶标的引物对中的反向引物是相同的。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，样品中非天然核酸的量为至少0.005％。在提供的任一种方法的一个实施方案中，样品中非天然核酸的量为至少0.01％。在提供的任一种方法的一个实施方案中，样品中非天然核酸的量为至少0.03％。在提供的任一种方法的一个实施方案中，样品中非天然核酸的量为至少0.05％。在提供的任一种方法的一个实施方案中，样品中非天然核酸的量为至少0.1％。在提供的任一种方法的一个实施方案中，样品中非天然核酸的量为至少0.3％。在提供的任一种方法的一个实施方案中，样品中非天然核酸的量为少于1.5％。在提供的任一种方法的一个实施方案中，样品中非天然核酸的量为少于1.3％。在提供的任一种方法的一个实施方案中，样品中非天然核酸的量为少于1％。在提供的任一种方法的一个实施方案中，样品中非天然核酸的量为少于0.5％。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述样品包含无细胞DNA样品，并且所述量为非天然无细胞DNA的量。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述对象是移植接受者，并且非天然核酸的量为供体特异性无细胞DNA的量。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述移植接受者是心脏移植接受者。在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述移植接受者是儿科移植接受者。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，多个基于扩增的定量测定(例如PCR定量测定)是实时PCR测定或数字PCR测定。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括基于样品中非天然核酸的量来确定对象中的风险。在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述风险是与移植相关的风险。在提供的任一种方法的一个实施方案中，与移植相关的风险是移植排斥、移植的解剖学问题或移植损伤的风险。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述移植损伤是初始损伤或进行性损伤。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，与移植相关的风险指示损伤的严重程度。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，如果非天然核酸的量大于阈值，风险提高。在提供的任一种方法的一个实施方案中，如果非天然核酸的量小于阈值，风险降低。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，当所述风险是与心脏移植排斥相关的风险时，阈值为1％。在提供的任一种方法的一个实施方案中，当风险是与心脏移植排斥相关的风险时，阈值为1.3％。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括基于非天然核酸的量来选择用于对象的治疗。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括基于非天然核酸的量来治疗对象。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括基于非天然核酸的量来提供关于针对对象的治疗的信息。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括随时间监测或建议随时间监测对象中非天然核酸的量。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括在后续时间点评估对象中非天然核酸的量。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括例如在后续时间点从对象获得另一样品，并对该样品进行测试，例如本文中提供的任一种方法。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括基于非天然核酸的量来评价施用于对象的治疗的效果。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述治疗是抗排斥治疗。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括提供或获得样品或其部分。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括从样品提取核酸。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括扩增步骤。在提供的任一种方法的一个实施方案中，在定量测定之前进行扩增。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述样品包含血液、血浆、血清或尿。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述样品在心脏移植的10天内从对象获得，或者是在心脏移植的10天内从对象获得的样品。

在一个方面，一种确定多种SNV靶标的方法，其包括：a)在个体群中鉴定多种高度杂合的SNV；b)设计横跨每种SNV的一种或更多种引物，c)选择充分特异性引物；d)在例如共同解链温度下和/或在共同溶液中评价引物的多重化能力；以及e)鉴定用引物或其子集均匀扩增的序列。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括计算所选引物的解链温度和/或GC％。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括过滤中等范围的序列。

在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，步骤a)还包括选择Hardy-Weinberg p>0.25的SNV，和/或排除与困难区域相关的那些。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述困难区域是综合征区和/或低复杂性区域。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，步骤b)的一种或更多种引物横跨70bp的窗口和/或一种或更多种引物的长度为16至26bp，例如长度为20至26bp。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，步骤c)的充分特异性引物用BLAST分析鉴定。在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述BLAST分析针对GCRh37。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法包括或还包括进行迭代遗传算法和/或模拟退火。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括获得用于每种鉴定的SNV靶标的至少一种引物对，其中所述至少一种引物对包含相对于SNV靶标之一种序列(例如，等位基因)的3’错配(例如，倒数第二位)而相对于SNV靶标之另一种序列(例如，等位基因)的3’双错配，并且特异性地扩增SNV靶标的这一种序列(例如，等位基因)。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括获得用于每种鉴定的SNV靶标的另一种引物对，其中所述另一种引物对特异性地扩增SNV靶标的这另一种序列(例如，等位基因)。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，其中所述另一种引物对包含相对于SNV靶标之这另一种序列(例如，等位基因)的3’错配(例如，倒数第二位)而相对于SNV靶标之这一种序列(例如，等位基因)的3’双错配。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，其中存在至少45、48、50、55、60、65、70、75、80、85或90种或更多种SNV靶标。在提供的任一种方法的一个实施方案中，存在至少90、95种或更多种SNV靶标。在提供的任一种方法的一个实施方案中，存在少于105或100种SNV靶标。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括提供用于每种SNV靶标的至少一种引物对。

在一个方面，一种推断非天然核酸基因型的方法，其包括：获得多种SNV靶标中每一种的非天然核酸水平，例如信息性非天然核酸水平，并用例如最大化步骤将每个水平分配给至少两个分布中的一个，所述至少两个分布中一个用于完全信息性水平，另一个用于半信息性水平。在提供的任一种方法的一个实施方案中，当尚不知道获得的水平的信息性时，所述至少两个分布为三个分布，其中一个用于完全信息性水平，另一个用于半信息性水平，最后一个用于非信息性水平或背景水平。在一个实施方案中，当对多种SNV靶标中每一种获得信息性非天然核酸水平时，每个水平用例如最大化步骤分配为完全信息性的或半信息性的。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，通过去除被确定为天然核酸和/或代表无调用或错误调用的水平来获得信息性非天然核酸水平。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括去除代表无调用或错误调用的水平。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述水平用例如对来自对象的样品进行测序，例如下一代测序获得。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述水平由基于扩增的定量测定，例如PCR定量测定获得。在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述水平由提供的任一种方法获得。在任一种所述方法的一个实施方案中，所述水平通过对多种SNV靶标中的每一种进行基于扩增的定量测定，例如PCR定量测定而获得。在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述水平通过进行本文中提供的任一种方法获得。在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述水平通过使用本文中提供的任一种引物组合物进行定量测定，例如PCT定量测定而获得。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，对多种SNV靶标中的每一种用至少两种引物对进行基于扩增的定量测定，例如PCR定量测定，其中每种引物对包含正向引物和反向引物，其中所述至少两种引物对中的一种包含相对于SNV靶标之一种序列(例如，等位基因)的3’(例如，倒数第二位)错配而相对于SNV靶标之另一种序列(例如，等位基因)的3’双错配且特异性地扩增SNV靶标的这一种序列(例如，等位基因)，并且所述至少两种引物对中的另一种特异性地扩增SNV靶标的这另一种序列(例如，等位基因)。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述至少两种引物对中的另一种引物对也包含相对于SNV靶标之这另一种序列(例如，等位基因)的3’(例如，倒数第二位)错配而相对于SNV靶标之这一种序列(例如，等位基因)的3’双错配，并且特异性地扩增SNV靶标的这另一种序列(例如，等位基因)。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括提供分配的水平。在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述分配的水平在报告中提供。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括基于水平的分配来获得非天然核酸的量。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括基于水平的分配来提供非天然核酸的量。在提供的任一种方法的一个实施方案中，基于水平分配的非天然核酸的量在报告中提供。

在一个方面，提供了根据本文中提供的任一种方法获得任一组分配水平或其组合或者基于分配的非核酸的量并基于所述水平或量来评估对象中风险的方法。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，基于评估的风险来给予对象治疗或关于治疗的信息。在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述治疗是抗排斥治疗。

在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括随时间监测或建议随时间监测对象中非天然核酸的量。在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括在后续时间点确定对象中非天然核酸的量。在提供的任一种方法的一个实施方案中，所述量用本文中提供的任一种方法确定。

在一个方面，提供了一种组合物或试剂盒，其包含多种SNV靶标中每一种的至少一种引物对，其中每种引物对包含相对于SNV靶标之一种序列(例如，等位基因)的3’错配(例如，倒数第二位)而相对于SNV靶标之另一种序列(例如，等位基因)的3’双错配，并且特异性地扩增SNV靶标的这一种序列(例如，等位基因)。在提供的任一种方法、组合物或试剂盒的一个实施方案中，还包括多种SNV靶标中每一种的至少一种另一引物对，其中所述至少一种另一引物对特异性地扩增SNV靶标的这另一种序列(例如，等位基因)。在提供的任一种方法、组合物或试剂盒的一个实施方案中，所述至少一种另一引物对包含相对于SNV靶标之这另一种序列(例如，等位基因)的3’错配(例如，倒数第二位)而相对于SNV靶标之这另一种序列(例如，等位基因)的3’双错配，并且特异性地扩增SNV靶标的这另一种序列(例如，等位基因)。

在提供的任一种方法、组合物或试剂盒的一个实施方案中，每种引物对包含相对于SNV靶标之一种序列(例如，等位基因)的3’错配(例如，倒数第二位)而相对于SNV靶标之另一种序列(例如，等位基因)的3’双错配，并且特异性地扩增SNV靶标的这一种等位基因。

在提供的任一种方法、组合物或试剂盒的一个实施方案中，每种SNV靶标存在至少一种引物对、至少两种引物对、至少三种引物对、至少四种引物对或更多。在本文中提供的任一种组合物或试剂盒的一个实施方案中，每种SNV靶标存在至少两种引物对。在提供的任一种方法、组合物或试剂盒的一个实施方案中，存在至少45、48、50、55、60、65、70、75、80、85或90种或更多种SNV靶标。在提供的任一种方法、组合物的一个实施方案中，存在至少90、95种或更多种靶标。在提供的任一种方法、组合物或试剂盒的一个实施方案中，存在少于105或100种SNV靶标。

在提供的任一种组合物或试剂盒的一个实施方案中，所述组合物或试剂盒包含缓冲剂。

在提供的任一种组合物或试剂盒的一个实施方案中，所述组合物或试剂盒包含聚合酶。

在提供的任一种组合物或试剂盒的一个实施方案中，所述组合物或试剂盒包含探针。在提供的任一种组合物或试剂盒的一个实施方案中，其中所述探针是荧光探针。

在提供的任一种组合物或试剂盒的一个实施方案中，所述组合物或试剂盒包含使用说明。在提供的任一种组合物或试剂盒的一个实施方案中，其中所述使用说明是用于确定样品中非天然核酸的量的说明。在本文中提供的任一种组合物或试剂盒的一个实施方案中，所述使用说明包含用于进行本文中提供的任一种方法的说明。

在一个实施方案中，用于本文中提供的方法的任一个实施方案可以是用于提供的任一种组合物、试剂盒或报告的实施方案。在一个实施方案中，用于本文中提供的组合物、试剂盒或报告的任一个实施方案可以是用于本文中提供的任一种方法的实施方案。

附图简述

附图并非旨在按比例绘制。这些附图仅是举例说明性的，并且不是实现本公开内容所必需的。

图1提供了MOMA引物的示例性的非限制性图。在聚合酶链反应(PCR)测定中，预期发生包含SNV A的序列的延伸，使得检测SNV A，其可随后进行量化。然而，由于双错配而预期不发生SNV B的延伸。

图2提供了示例性的扩增迹线。

图3示出了来自证明了概念验证(proof of concept)的重建实验的结果。

图4提供了用来自移植接受者患者的血浆样品测量的无细胞DNA百分比。所有数据均来自已接受活检的患者。暗点表示排斥。

图5提供了来自对血浆样品进行本文中提供的方法的进一步数据。在移植外科手术后，供体百分比水平下降。

图6表明了使用期望最大化来预测未知的非天然供体基因型。黑色＝背景，绿色＝半信息性的，红色＝完全信息性的，虚线＝第一次迭代，实线＝第二次迭代，最终调用＝10％。

图7表明了使用期望最大化来预测未知的非天然供体基因型。黑色＝背景，绿色＝半信息性的，红色＝完全信息性的，最终调用＝5％。

图8提供了表明能够在未知时预测非天然供体基因型的重建实验数据。数据用一组95种SNV靶标生成。

图9提供了104种MOMA靶标的平均背景噪声。

图10提供了使用MOMA的方法的背景噪声的另一些实例。

图11至30示出了在一些实施方案中使探针与错配引物在相同链上的益处。

发明详述

本公开内容的一些方面涉及用于灵敏地检测和/或量化样品中的非天然核酸的方法。非天然核酸(例如非天然DNA)可以在多种情况下存在于个体中，所述情况包括器官移植后。本公开内容提供了检测、分析和/或量化从对象获得的样品中的非天然核酸(例如非天然无细胞DNA浓度)的技术。

本文中使用的“非天然核酸”是指来自另一来源或是见于对象中的核酸的突变形式(就特定序列而言)的核酸。因此，“天然核酸”是并非来自另一来源并且不是见于对象中的核酸的突变形式(就特定序列而言)的核酸。在一些实施方案中，非天然核酸是非天然无细胞DNA。“无细胞DNA”(或cf-DNA)是存在于细胞外部，例如在对象的血液、血浆、血清、尿等中的DNA。不希望受任何特定理论或机理的束缚，认为cf-DNA是从细胞释放的，例如通过细胞的凋亡而从细胞释放的。非天然核酸的一个实例是移植接受者对象中来自移植物供体的核酸。如本文中使用的，本文中提供的组合物和方法可用于确定来自非天然来源的无细胞DNA的量，例如供体特异性的DNA或供体特异性无细胞DNA(例如供体特异性cfDNA)的量。

本文中提供了可用于测量在序列身份方面具有差异的核酸的方法和组合物。在一些实施方案中，序列身份的差异是单核苷酸变体(SNV)；然而，无论本文中在何处提及SNV，天然与非天然核酸之间的任何序列身份差异均旨在同样适用。因此，本文中提供的任一种方法或组合物可应用于序列身份不同的天然与非天然核酸。本文中使用的“单核苷酸变体”是指其中在单个核苷酸处存在序列变异的核酸序列。在一些实施方案中，SNV是双等位基因的SNV，意味着SNV具有一种主要等位基因和一种次要等位基因。在一些实施方案中，SNV可具有多于两种等位基因，例如在群体内。在一些实施方案中，SNV是序列的突变体形式，并且非天然核酸是指突变体形式，而天然核酸是指非突变形式(例如野生型形式)。因此，这样的SNV可以是可在对象内发生并且可与疾病或病症相关的突变。一般来说，“次要等位基因”是指对于基因座而言频率较低，例如在群体中频率较低的等位基因，而“主要等位基因”是指频率较高，例如在群体中频率较高的等位基因。在一些实施方案中，本文中提供的方法和组合物可量化核酸混合物中主要和次要等位基因的核酸，甚至在以低水平存在时也如此。

其中存在序列身份变异的核酸序列(例如SNV)通常被称为“靶标”。本文中使用的“SNV靶标”是指例如在个体群中或作为突变的结果，而在单个核苷酸处存在序列变异的核酸序列，所述突变可在对象中发生并且可与疾病或病症相关。SNV靶标具有多于一种等位基因，并且在一些优选实施方案中，SNV靶标是双等位基因的。在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，SNV靶标是SNP靶标。在这些实施方案中的一些中，SNP靶标是双等位基因的。已经发现，通过用对SNV靶标具有特异性的引物进行基于扩增的定量测定(例如PCR测定)可以甚至在极低的水平下量化非天然核酸。在一些实施方案中，非天然核酸的量通过试图对多种SNV靶标用引物进行基于扩增的定量测定(例如定量PCR测定)来确定。“多种SNV靶标”是指多于一种SNV靶标，其中对于每种靶标存在至少两个等位基因。优选地，在一些实施方案中，预期每种SNV靶标是双等位基因的，并且使用对SNV靶标的每个等位基因具有特异性的引物对来特异性地扩增每个等位基因的核酸，其中如果样品中存在特定等位基因的核酸，则发生扩增。在一些实施方案中，多种SNV靶标是对象中的多种序列，其可以突变并且如果如此突变的话可指示对象中的疾病或病症。如本文中使用的，一种等位基因可以是靶序列的突变形式，而另一种等位基因是该序列的非突变形式。

在一些实施方案中，用引物对对至少40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95种或更多种靶标进行基于扩增的定量测定(例如定量PCR)。在一些实施方案中，用引物对对少于105、104、103、102、101、100、99、98或97种靶标进行定量测定。在一些实施方案中，用引物对对40至105、45至105、50至105、55至105、60至105、65至105、70至105、75至105、80至105、85至105、90至105、90至104、90至103、90至102、90至101、90至100、90至99、91至99、92至99、93、99、94至99、95至99或90至95种靶标获得足够的信息性结果。在一些实施方案中，用引物对对40至99、45至99、50至99、55至99、60至99、65至99、70至99、75至99、80至99、85至99、90至99、90至99、90至98、90至97或90至96种靶标获得足够的信息性结果。

本文中提供的“信息性结果”是可用于量化样品中非天然或天然核酸的水平的结果。一般来说，信息性结果排除了天然核酸对于特定SNV靶标为杂合的结果以及“无调用”或错误调用结果。由信息性结果，在提供的任一种方法的一些实施方案中，可使用标准曲线来计算等位基因百分比。在提供的任一种方法的一些实施方案中，非天然和/或天然核酸的量分别代表非天然和/或天然核酸的全部信息性结果的平均值。

非天然核酸的量(例如比例或百分比)可用主要和次要等位基因的量以及天然和/或非天然核酸的基因型来确定。例如，在知晓天然基因型的情况下可排除天然核酸对于特定SNV靶标为杂合的结果。进一步地，还可在知晓非天然基因型下评估结果。在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，当天然核酸的基因型是已知的而非天然核酸的基因型未知时，所述方法可包括预测可能的非天然基因型或通过测序来确定非天然基因型的步骤。这样的方法的更多细节在本文的其他部分，例如在实施例中提供。在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，可基于对对象的天然核酸和/或于对象而言非天然的核酸(例如，分别为接受者和供体的)进行预先基因分型来确定等位基因。用于基因分型的方法在本领域是公知的。这样的方法包括测序，例如下一代、杂交、微阵列、其他分离技术或PCR测定。本文中提供的任一种方法均可包括获得这样的基因型的步骤。

本文中使用的“获得”是指通过其可获取相应信息或材料的任何方法。因此，可通过实验方法来获取相应的信息，例如以确定天然基因型。在一些实施方案中，相应材料可用多种实验或实验室方法来创建、设计等。相应信息或材料还可通过给予或提供信息(例如在报告中)或材料来获取。在一些实施方案中，材料可通过商业手段(即通过购买)来给予或提供。

报告可以是口头、书面(或硬拷贝)或电子形式，例如可被可视化或显示的形式。在一些实施方案中，本文中提供的每个测定的“原始”结果在报告中提供，并且从该报告可采取进一步的步骤来确定样品中非天然核酸的量。这些进一步的步骤可包括以下中的任意一个或更多个：选择信息性结果，获得天然和/或非天然基因型，计算天然和非天然核酸的信息性结果的等位基因百分比，对等位基因百分比求平均，等等。在另一些实施方案中，报告提供了样品中非天然核酸的量。由所述量，在一些实施方案中，临床医生可评估对象的治疗需求或监测非天然核酸的量的需求。因此，在本文中提供的任一种方法中，所述方法可包括在另一时间点评估对象中非核酸的量。这样的评估可用本文中提供的任一种方法或组合物进行。

本文中提供的定量测定利用多重优化错配扩增(MOMA)。可获得用于这样的测定的引物，并且本文中提供的任一种方法均可包括获得用于进行定量测定的一种或更多种引物对的步骤。一般来说，引物具有有利于其用于量化核酸的量的独特特性。例如，引物对的正向引物可在3’核苷酸(例如倒数第二个3’核苷酸)处错配。在提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，这种错配位于3’核苷酸处但与SNV位置相邻。在提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，引物相对于SNV位置的错配定位如图1所示。一般来说，这样的正向引物即使具有3’错配也能在扩增反应中产生扩增产物(与合适的反向引物联合)，从而允许扩增并导致检测到具有相应SNV的核酸。如果特定SNV不存在并且存在相对于SNV靶标的另一种等位基因的双错配，则通常不会产生扩增产物。优选地，在本文中提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，对于每种SNV靶标，获得以下引物对，通过所述引物对，可发生每种等位基因的特异性扩增而不扩增其他等位基因。“特异性扩增”是指扩增靶标的特定等位基因，而基本上不扩增另外的核酸或不扩增在背景或噪声以上的另外核酸序列。在一些实施方案中，特异性扩增仅导致扩增特定等位基因。

在本文中提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，对于双等位基因的每种SNV靶标，存在两种引物对，每种对两种等位基因之一具有特异性，并且因此具有相对于其将要扩增之等位基因的单个错配而相对于其不扩增之等位基因的双错配(同样地如果这些等位基因的核酸存在的话)。在本文中提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，错配引物是正向引物。在本文中提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，用于每个SNV靶标的两种引物对中的反向引物是相同的。

这些概念可用于设计用于本文中提供的任一种组合物和方法的引物对。应理解，正向和反向引物被设计成结合相对链(例如有义链和反义链)以扩增模板的特定基因座的片段。引物对的正向和反向引物可被设计成扩增任意合适大小的核酸片段以检测例如根据本公开内容之SNV靶标的等位基因是否存在。本文中提供的任一种方法均可包括用于获得如本文中所述的一种或更多种引物对的一个或更多个步骤。

应理解，本文中所述的引物对可用于多重PCR测定。因此，在一些实施方案中，引物对被设计成在PCR反应中与其他引物对相容。例如，引物对可被设计成在PCR反应中与至少2种、至少5种、至少10种、至少20种、至少30种、至少40种等其他引物对相容。如本文中使用的，如果引物对能够在同一PCR反应中扩增其靶标，则其在PCR反应中是“相容的”。在一些实施方案中，如果在同一PCR反应中多重化时，引物对扩增其靶DNA被抑制不超过1％、不超过2％、不超过5％、不超过10％、不超过15％、不超过20％、不超过25％、不超过30％、不超过35％、不超过40％、不超过45％、不超过50％或不超过60％，则所述引物对是相容的。引物对可能由于多种原因而不相容，所述原因包括但不限于引物二聚体的形成和与模板上的脱靶位点结合，这可能干扰另外的引物对。因此，本公开内容的引物对可被设计成避免与其他引物对形成二聚体或限制脱靶结合位点的数目。用于设计用于多重PCR测定的引物的示例性方法是本领域已知的并且在本文中另外描述。

在一些实施方案中，本文中所述的引物对用于在多重PCR测定中量化非天然核酸的量。因此，在本文中提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，引物对被设计成检测二倍体的基因组区域，不包括被设计成检测可能是非二倍体的基因组区域的引物对。在本文中提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，根据本公开内容使用的引物对不检测重复掩蔽区、已知拷贝数可变区或可能是非二倍体的其他基因组区。

在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，基于扩增的定量测定是通过其扩增核酸并且可确定核酸的量的任何定量测定。这样的测定包括通过其用本文中所述的MOMA引物扩增核酸并量化的那些。这样的测定包括简单的扩增和检测、杂交技术、分离技术(例如电泳)、下一代测序等。

在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，定量测定是定量PCR测定。定量PCR包括实时PCR、数字PCR、Taqman等。在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，PCR是“实时PCR”。这样的PCR是指其中可在扩增过程仍进行的同时在液相中监测反应动力学的PCR反应。与常规PCR相比，实时PCR提供了在扩增反应中同时实时地检测或量化的能力。基于来自特定染料的荧光强度的提高，甚至可在扩增达到其平台期之前确定靶标的浓度。

使用多个探针可扩大单探针实时PCR的能力。多重实时PCR使用多个基于探针的测定，其中每个测定具有经独特的荧光染料标记的特定探针，使得对每个测定观察到不同的颜色。实时PCR仪器可区分由不同染料产生的荧光。不同的探针可用各自具有独特的发射谱的不同染料标记。谱信号用离散的光学装置收集，通过一系列滤光器组，并由检测器阵列收集。染料之间的谱重叠可通过使用纯染料谱通过矩阵代数对实验数据去卷积进行校正。

探针可用于本公开内容的方法，特别地可用于包括量化步骤的那些方法。本文中提供的任一种方法可包括在进行PCR测定中使用探针，而本文中提供的试剂盒的任一种组合物可包含一种或更多种探针。重要的是，在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，一个或更多个或全部PCR定量测定中的探针与错配引物位于相同链上，而不在相对链上。已发现，将探针这样并入PCR反应中，可提供额外的等位基因特异性区分。这在图11至30中举例说明。

作为一个实例，探针是在5’端具有FAM^TM或染料标记并且在3’端具有小沟结合剂(minor groove binder，MGB)非荧光猝灭剂(non-fluorescentquencher，NFQ)的水解探针。探针原理一般依赖于聚合酶在与互补探针结合区杂交期间切割双重标记的探针的5'-3'核酸外切酶活性和基于荧光团的检测。探针可提高定量PCR反应的指数期期间定量测量中检测的特异性。

PCR系统通常依赖于信号与反应中PCR产物的量成正比地提高的荧光染料或报道子的检测和量化。例如，在最简单和最经济的形式中，所述报道子可以是双链DNA特异性染料 Green(Molecular Probes)。SYBR Green是一种与双链DNA小沟结合的染料。当SYBR Green染料与双链DNA结合时，荧光强度提高。随着产生更多的双链扩增子，SYBRGreen染料信号将提高。

在本文中提供的任一种方法中，PCR可以是数字PCR。数字PCR涉及将经稀释的扩增产物分配到多个离散的测试位点中，使得大多数的离散测试位点包含零个或一个扩增产物。然后，分析扩增产物以提供样品中所选目的基因组区域的频率的表示。每个离散测试位点分析一个扩增产物产生每个离散测试位点的二元“是或否”结果，从而允许对所选目的基因组区域进行量化，并且确定所选目的基因组区域相对于彼此的相对频率。在某些方面，作为补充或替代，可使用对应于来自预定区域的基因组区域的扩增产物进行多次分析。可使用来自对两个或更多个预定区域进行分析的结果来量化和确定扩增产物的相对频率数目。使用两个或更多个预定区域来确定样品中的频率通过例如扩增效率的变异而降低偏差的可能性，这通过单次检测测定可能不容易明显。使用数字PCR量化DNA的方法是本领域已知的，并且先前已经在例如美国专利公开号US20140242582中进行描述。

应理解，可对本文中提供的PCR条件进行改进或优化以根据本文中所述的任一种方法工作。通常来说，PCR条件基于所使用的酶、靶模板和/或引物。在一些实施方案中，对PCR反应的一种或更多种组分进行改进或优化。可优化的PCR反应组分的非限制性实例包括模板DNA、引物(例如正向引物和反向引物)、脱氧核苷酸(dNTP)、聚合酶、镁浓度、缓冲剂、探针(例如，当进行实时PCR时)、缓冲液和反应体积。

在前述任一实施方案中，可使用任何DNA聚合酶(催化DNA核苷酸聚合成DNA链的酶)，包括热稳定性聚合酶。合适的聚合酶是本领域技术人员已知的，并且包括大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段、T7DNA聚合酶、T4DNA聚合酶、T5DNA聚合酶、Klenow类聚合酶、Taq聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Vent聚合酶、噬菌体29、REDTaq^TM基因组DNA聚合酶或测序酶。示例性的聚合酶包括但不限于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)pol I、水生栖热菌(Thermus aquaticus，Taq)pol I、嗜热古细菌(Pyrccoccus furiosus，Pfu)、乌兹炽热球菌(Pyrococcus woesei，Pwo)、黄栖热菌(Thermus flavus，Tfl)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus，Tth)、里氏栖热菌(Thermus litoris，Tli)和海栖热袍菌(Thermotoga maritime，Tma)。这些酶、这些酶的经修饰形式和酶组合可从供应商商购获得，所述供应商包括Roche、Invitrogen、Qiagen，Stratagene和Applied Biosystems。代表性的酶包括(New EnglandBiolabs，Ipswich，MA)、Hot MasterTaq^TM(Eppendorf)、 Mpx(Finnzymes)、(Fermentas)、KOD(EMD Biosciences)、Z-Taq(TAKARA)和CS3AC/LA(KlenTaq，University City，MO)。

盐和缓冲剂包括本领域技术人员熟悉的那些，包括分别包含MgCl2，以及Tris-HCl和KCl的那些。通常来说，1.5至2.0nM的镁对于Taq DNA聚合酶是最佳的，然而，最佳的镁浓度可取决于模板、缓冲剂、DNA和dNTP因为每一种都具有与镁形成螯合物的可能。如果镁[Mg2+]的浓度太低，则不能形成PCR产物。如果镁[Mg2+]的浓度太高，则可能会发现不期望的PCR产物。在一些实施方案中，镁浓度可通过以0.1mM或0.5mM的增量补充镁浓度直至镁浓度为约5mM来优化。

根据本公开内容使用的缓冲液可包含添加剂，例如表面活性剂、二甲基亚砜(DMSO)、甘油、牛血清白蛋白(BSA)和聚乙二醇(PEG)，以及本领域技术人员熟悉的其他添加剂。核苷酸一般是三磷酸脱氧核糖核苷，例如三磷酸脱氧腺苷(dATP)、三磷酸脱氧胞苷(dCTP)、三磷酸脱氧鸟苷(dGTP)和三磷酸脱氧胸苷(dTTP)，其也可以以足够的量添加到反应中用于扩增靶核酸。在一些实施方案中，一种或更多种dNTP(例如，dATP、dCTP、dGTP、dTTP)的浓度为约10μM至约500μM，这可取决于PCR反应中产生的PCR产物的长度和数量。

在一些实施方案中，根据本公开内容使用的引物是经修饰的。引物可被设计成以高特异性仅与其预期靶标(例如特定SNV)结合，并且对其他核苷酸序列差异显示出高度区分。可对引物进行修饰以具有特定的计算出解链温度(Tm)，例如46℃至64℃的解链温度。为了设计具有期望解链温度的引物，可改变引物的长度和/或可改变引物的GC含量。通常来说，增加引物的GC含量和/或长度将提高引物的Tm。相反，降低引物的GC含量和/或长度通常会降低引物的Tm。应理解的是，可通过相对于靶标有意地掺入错配来修饰引物以相对于其他以高灵敏度检测特定SNV(或序列非全同的其他形式)。因此，可通过相对于引物被设计成要结合的特定序列(例如，特定SNV)插入一个或更多个错配来对引物进行修饰。

在一些实施方案中，可改进或优化PCR反应中使用的引物的浓度。在一些实施方案中，PCR反应中引物(例如正向或反向引物)的浓度可为例如约0.05μM至约1μM。在一些具体实施方案中，每种引物的浓度为约1nM至约1μM。应理解，根据本公开内容的引物可在PCR反应中以相同或不同的浓度使用。例如，引物对中的正向引物可以以0.5μM的浓度使用，而引物对中的反向引物可以以0.1μM使用。引物的浓度可以基于以下因素，包括但不限于引物长度、GC含量、纯度、与靶DNA的错配、或形成引物二聚体的可能性。

在一些实施方案中，对PCR反应的热分布进行改进或优化。PCR热分布改进的非限制性实例包括变性温度和持续时间、退火温度和持续时间，以及延伸时间。

PCR反应溶液的温度可在变性状态、退火状态和延伸状态之间顺序第进行预定数目的循环。实际的时间和温度可以是酶、引物和靶标依赖性的。对于任何给定的反应，变性状态在某些实施方案中可以为约70℃至约100℃。另外，退火温度和时间可影响引物与靶核酸内特定基因座结合的特异性和效率，并且对于特定的PCR反应可能是重要的。对于任何给定的反应，退火状态在某些实施方案中可以为约20℃至约75℃。在一些实施例中，退火状态可以为约46℃到64℃。在某些实施方案中，退火状态可在室温(例如，约20℃至约25℃)下进行。

延伸温度和时间也可影响等位基因产物产率。对于给定的酶，延伸状态在某些实施方案中可以为约60℃至约75℃。

如本文中提供的由定量测定来量化等位基因的量可如本文中提供的进行，或者如另外本领域普通技术人员显而易见地进行。作为一个实例，分析扩增迹线的一致性和稳健量化。可使用内标来将循环阈值转化为输入核酸(例如，DNA)的量。等位基因的量可作为性能测定的平均值来计算，并且可针对基因型进行调整。有效扩增的宽范围表明成功检测出低浓度的核酸。供体百分比可计算为所有性能测定(例如，纳克非天然等位基因与纳克天然等位基因的比例)的修剪平均值。量可通过针对基因型进行调整来确定。

已经发现，本文中提供的方法和组合物可用于检测样品中的低水平核酸，例如非天然核酸。因此，本文中提供的方法可用于其中需要检测相对稀少的核酸的样品。在一些实施方案中，可对样品使用本文中提供的任一种方法以检测样品中少于1.5％核酸的非天然核酸。在另一些实施方案中，本文中提供的任一种方法可用于其中样品中少于1.3％、1.2％、1.1％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.05％、0.03％或0.01％的核酸是非天然的样品。在另一些实施方案中，本文中提供的任一种方法可用于其中至少0.005％、0.01％、0.03％或0.05％的核酸是非天然的样品。在本文中提供的任一种方法的另一些实施方案中，样品中至少0.005％但少于1.3％、1.2％、1.1％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.05％、0.03％或0.01％的核酸是非天然的。

由于能够甚至在低水平下确定非天然核酸的量，本文中提供的方法和组合物也可用于评估对象(例如移植接受者)中的风险。如本文中提供的“风险”是指对象(例如移植接受者)中任何不期望病症的存在或不存在，或者这样的病症(例如移植排斥)的存在或不存在的可能性提高。本文中提供的“风险提高”是指对象中存在任何不期望的病症或存在这样的病症的可能性提高。本文中提供的“风险降低”是指对象中不存在任何不期望的病症或这样的病症的存在的可能性降低(或不存在的可能性提高)。

作为一个实例，早期检测植入移植物(例如心脏移植物)后的排斥可促进治疗并改善临床结果。移植排斥仍然是移植失败和晚期死亡的主要原因，并且通常需要终身监视监测。已经显示用免疫抑制治疗来治疗移植排斥改善治疗结果，特别是如果早期检测到排斥的话。通常使用基于导管的心内膜心肌活检(endomyocardial biopsy，EMB)来监测移植排斥。然而，这种侵入性操作与患者的风险和不适相关，并且可能对儿科患者特别不利。因此，本文中提供了用于监测对象例如移植接受者的灵敏的、特异性的、有成本效益的且非侵入性的技术。已经发现这样的技术允许在早期检测移植排斥。这样的技术还可用于监测器官恢复以及选择和监测治疗或疗法，例如抗排斥治疗，由此改善患者的恢复并提高存活率。

因此，在提供的任一种方法的一些实施方案中，所述对象是移植的接受者，并且所述风险是与移植相关的风险。在提供的任一种方法的一些实施方案中，与移植相关的风险是移植排斥、移植的解剖问题或移植损伤的风险。在提供的任一种方法的一些实施方案中，移植损伤是初始或进行性损伤。在提供的任一种方法的一些实施方案中，与移植相关的风险是急性病症或慢性病症。在提供的任一种方法的一些实施方案中，急性病症是移植排斥，包括细胞排斥或抗体介导排斥。在提供的任一种方法的一些实施方案中，慢性病症是移植血管病。在提供的任一种方法的一些实施方案中，与移植相关的风险指示损伤的严重程度。

本文中使用的“移植”是指将来自供体的器官移动到接受者用于替代接受者的受损或缺失器官。移植可以是一个器官或多于一个器官的移植。在一些实施方案中，术语“移植”是指移植的一个或更多个器官，并且这样的含义从术语所使用的上下文将是清楚的。可移植的器官的实例包括但不限于心脏、多个肾、肾、肝、肺、胰、肠等。本文中提供的任一种方法或组合物可用于来自已经历本文中所提供任意一个或更多个器官之移植的对象的样品。在一些实施方案中，移植是心脏移植。

可例如通过评估与移植排斥相关之细胞损伤的生物标志物非天然cf-DNA(例如供体特异性无细胞DNA(DS cf-DNA))的量来确定移植接受者中的风险。DS cf-DNA是指推测从移植的器官脱落的DNA，其序列与捐献移植器官的供体的基因型(全部或部分地)匹配。本文中使用的DS cf-DNA可以指DS cf-DNA群体中的某一或某些序列，其中该序列与接受者cf-DNA可区分(例如，在特定核苷酸位置处具有不同的序列))，或者其可以指整个DS cf-DNA群体。

可例如通过与评估总无细胞DNA的量(例如以ng/ml血浆计)组合使用所提供的任一种方法如本文中所述地评估非天然cf-DNA(例如供体特异性无细胞DNA)的量来确定移植接受者中的风险。因此，本文中提供的任一种方法可包括获得对象中总无细胞DNA水平(例如以ng/ml计)的步骤。在一些实施方案中，这样的方法还包括基于对象中供体特异性无细胞DNA和总无细胞DNA的量的组合来评估对象中与移植相关的风险。用于确定对象中总无细胞DNA的方法是本领域已知的。在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，使用RNA酶P作为靶标用Taqman实时PCR来确定总无细胞DNA。

在一些实施方案中，本文中提供的任一种方法可包括使非天然核酸的增加和/或非天然核酸相对于天然核酸的比例或百分比的增加与病症(例如移植排斥)的风险提高相关联。在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，相关联包括将非天然核酸的水平(例如，浓度、比例或百分比)与阈值进行比较以鉴定病症风险提高或降低的对象。在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，与阈值相比具有非天然核酸的量增加的对象被鉴定为病症的风险提高。在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，与阈值相比非天然核酸的量降低或类似的对象被鉴定为病症的风险降低。

本文中使用的“量”是指用于测量核酸的任何定量值，并且可以以绝对量或相对量给出。此外，该量可以是总量、频率、比例、百分比等。本文中使用的术语“水平”可用于代替“量”，但旨在是指相同类型的值。

本文中使用的“阈值”是指指示病症的存在或不存在或者风险的存在或不存在的任何预定水平或水平范围。阈值可采用多种形式。其可以是单个截止值，例如中值或平均值。其可基于比较组来建立，例如在一个确定组中的风险是另一个确定组中的风险的两倍的情况下。其可以是一个范围，例如在以下情况下：将测试群体平等地(或不平等地)分组，例如低风险组、中等风险组和高风险组；或者分为四个象限，最低象限是风险最低的对象，最高象限是风险最高的对象。阈值可取决于所选的特定群体。例如，表面健康的群体将具有不同的“正常”范围。作为另一个实例，可由在病症或风险存在之前或者在治疗过程之后的基线值确定阈值。这样的基线可指示对象中与所测试风险或病症不相关的正常或其他状态。在一些实施方案中，阈值可以是所测试对象的基线值。因此，所选择的预定值可将对象所属的类别纳入考虑之中。本领域普通技术人员仅用常规实验即可选择合适的范围和类别。

还可随时间监测非天然核酸水平的变化。例如，可使用非天然核酸的量(例如比例或百分比)从阈值(例如基线)的改变作为风险(例如与移植相关的风险)的非侵入性临床指标。这可允许测量临床状态的变异和/或允许计算正常值或基线水平。在器官移植中，这可形成用于排斥或与其相关之病症风险的个体化非侵入性筛选测试的基础。一般来说，如本文中提供的，非天然核酸的量(例如比例或百分比)可指示接受者中与病症相关的风险(例如与移植相关的风险，例如排斥)的存在或不存在，或者可指示进一步测试或监视的需求。在一些实施方案中，对于移植接受者，与无细胞DNA的总量组合的该量对风险具有指示性。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还可包括用于评估病症例如移植排斥、移植损伤等的另外的测试。另外的测试可以是本文中提供的任一种方法。在一些实施方案中，对于移植接受者，另外的测试是确定来自对象的样品中总无细胞DNA的量。

在本文中针对心脏移植接受者提供的任一种方法的一些实施方案中，这样的阈值为1％，其中高于1％的水平指示风险提高，并且其中处于或低于1％的水平指示风险降低。在本文中针对心脏移植接受者提供的任一种方法的一些实施方案中，这样的阈值为1.3％，其中高于1.3％的水平指示风险提高，并且其中处于或低于1.3％的水平指示风险降低。

在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，当确定非天然核酸量(例如比例或百分比)高于阈值时，本文中提供的任一种方法还可包括对对象或来自对象的样品进行另外的测试。这样的其他测试可以是本领域普通技术人员已知可用于确定例如移植接受者中风险的存在或不存在的任何其他测试。在一些实施方案中，另外的测试是本文中提供的任一种方法。在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，所述对象是移植接受者，并且另外的测试是确定移植接受者中BNP和/或肌钙蛋白的水平。在本文中提供的任一种方法的另一些实施方案中，作为BNP和/或肌钙蛋白的水平补充或代替的另一种测试是超声心动图。

在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，如果确定非天然核酸量(例如比例或百分比)小于阈值(例如1％或1.3％)，则不需要或推荐向对象进行进一步测试，和/或不需要或不建议对对象治疗。尽管在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，当从接受者获得的样品中非天然核酸的量(例如，比例或百分比)大于1％或1.3％时，可以确定接受者中的风险提高，但是应理解，可以使用其他阈值，因为本发明的实施方案在这方面不受限制。在一些实施方案中，所述方法还可包括对对象进行进一步测试或推荐对对象进行进一步测试，和/或治疗或建议治疗对象。在这些实施方案的一些中，进一步测试是本文中提供的任一种方法。在这些实施方案的一些中，治疗是抗排斥治疗。在一些实施方案中，以书面形式或电子形式提供信息。在一些实施方案中，信息可作为计算机可读指令提供。

抗排斥治疗包括例如向移植接受者施用免疫抑制剂。免疫抑制剂包括但不限于皮质类固醇(例如，泼尼松龙或氢化可的松)、糖皮质激素、细胞抑制剂、烷化剂(例如，氮芥(环磷酰胺)，亚硝基脲、铂化合物、环磷酰胺(癌得星(Cytoxan)))、抗代谢物(例如，叶酸类似物如甲氨蝶呤，嘌呤类似物如硫唑嘌呤和巯嘌呤，嘧啶类似物，和蛋白质合成抑制剂)、细胞毒性抗生素(例如，更生霉素、蒽环类、丝裂霉素C、博来霉素、光神霉素)、抗体(例如，抗CD20、抗IL-1、抗IL-2Rα、抗T细胞或抗CD-3单克隆抗体和多克隆抗体，例如Atgam和即复宁(Thymoglobuline))、作用于亲免疫因子(immunophilin)的药物、环孢素、他克莫司、西罗莫司、干扰素、阿片样物质(opiod)、TNF结合蛋白、霉酚酸酯、芬戈莫德和多球壳菌素。在一些实施方案中，抗排斥治疗包括输血或骨髓移植。治疗还可包括用于治疗系统性病症如脓毒症的治疗。脓毒症治疗包括静脉内流体、抗生素、外科手术引流、早期目标定向治疗(earlygoal directed therapy，EGDT)、血管加压剂、甾类、激活蛋白C、屈曲可净α(drotrecoginalfa)(活化的)、氧和器官功能障碍的合适载体。这可包括肾衰竭中的血液透析、肺功能障碍中的机械通气、血液产品的输注，以及用于循环衰竭的药物和流体治疗。特别地在长期疾病期间还可包括确保足够的营养，优选地通过肠道营养，但如有需要通过肠胃外营养。其他相关的治疗可包括胰岛素以及预防深静脉血栓和胃溃疡的药物。用于治疗移植接受者的治疗还可包括用于治疗细菌、真菌和/或病毒感染的治疗。这样的治疗是本领域普通技术人员已知的。

本文中提供的任一种方法可包括从获自对象(例如移植接受者)的样品提取核酸(例如无细胞DNA)。这样的提取可使用本领域已知或本文中另外提供的(参见，例如CurrentProtocols in Molecular Biology，最新版本，或QIAamp循环核酸试剂盒或其他合适的可商购获得试剂盒)任何方法来进行。描述了用于从血液分离无细胞DNA的示例性方法。从对象收集包含抗凝剂(例如EDTA或DTA)的血液。使包含cf-DNA的血浆与血液中存在的细胞分离(例如，通过离心或过滤)。可进行任选的第二分离以从血浆中除去任何剩余的细胞(例如，第二离心或过滤步骤)。然后，可使用本领域已知的任何方法，例如使用商用试剂盒(例如由Qiagen生产的那些)来提取cf-DNA。用于提取cf-DNA的其他示例性方法也是本领域已知的(参见，例如Cell-Free Plasma DNA as a Predictor of Outcome in Severe Sepsisand Septic Shock.Clin.Chem.2008，第54卷，第1000-1007页；Prediction of MYCNAmplification in Neuroblastoma Using Serum DNA and Real-Time QuantitativePolymerase Chain Reaction.JCO 2005，第23卷，第5205-5210页；Circulating NucleicAcids in Blood of Healthy Male and Female Donors.Clin.Chem.2005，第51卷第1317-1319页；Use of Magnetic Beads for Plasma Cell-free DNA Extraction:TowardAutomation of Plasma DNA Analysis for Molecular Diagnostics.Clin.Chem.2003，第49卷，第1953-1955页；Chiu RWK，Poon LLM，Lau TK，Leung TN，Wong EMC，Lo YMD.Effectsof blood-processing protocols on fetal and total DNA quantification inmaternal plasma.Clin Chem 2001；47:1607-1613；和Swinkels等Effects of Blood-Processing Protocols on Cell-free DNA Quantification in Plasma.ClinicalChemistry，2003，第49卷，第3期，525-526)。

如本文中使用的，来自对象的样品可以是生物样品。这样的生物样品的实例包括全血、血浆、血清、尿等。在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，可向样品添加另外的核酸，例如标准品。

在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，进行扩增步骤。扩增的示例性方法如下，并且这样的方法可包括在本文中提供的任一种方法中。对于约100种靶标使用Q5DNA聚合酶在PCR中扩增约15ng的无细胞血浆DNA，其中合并的引物总共为6μM。样品进行约35个循环。反应总共为25ul。在扩增后，可使用数种方法清洗样品，包括AMPURE珠清洗、珠纯化、或者简单的Exosap it或Zymo。这样的扩增步骤用于本文中提供的一些方法中。

本公开内容还提供了用于确定在本文中提供的任一种方法中使用的或可由其获得任一种引物组合物的多种SNV靶标的方法。确定多种SNV靶标的方法在一些实施方案中包括：a)在个体群中鉴定多种高度杂合的SNV；b)设计横跨每种SNV的一种或更多种引物；c)选择充分特异性引物；d)在例如共同解链温度下和/或在共同溶液中评价引物的多重化能力；以及e)鉴定用引物或其子集均匀扩增的序列。

本文中使用的“高度杂合的SNV”是次要等位基因在群体中具有足够高百分比的那些。在一些实施方案中，次要等位基因在群体中为至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％或35％或更高。在这些实施方案的任一个中，次要等位基因在群体中为少于50％、49％、45％或40％。这样的SNV增加了在天然与非天然核酸之间提供有差别靶标的可能性。

引物被设计成通常横跨70bp的窗口，但也可选择另一些窗口，例如60bp至80bp的窗口。此外，一般期望SNV大概处于在该窗口的中间。例如，对于70bp的窗口，SNV在第20至50位碱基之间，例如在第30至40位碱基之间。本文中提供的引物被设计成与SNV相邻。

本文中使用的“充分特异性引物”是在期望的等位基因的扩增与不期望的等位基因的扩增之间表现出有所区别的那些。因此，对于PCR，期望在扩增二者之间具有循环间隙。在一个实施方案中，循环间隙为至少5、6、7或8个循环间隙。

此外，基于解链温度来选择序列，通常选择解链温度为45℃至55℃的那些作为“中等范围序列”。可期望另一些温度范围并且其可由本领域普通技术人员确定。“中等范围序列”通常是可在该温度内以多重扩增形式扩增的序列。在一些实施方案中，gc％含量为30％至70％，例如33％至66％。

在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还可包括排除与困难区域相关的序列。“困难区域”是含量或特征使其难以可靠地关于靶序列作出预测或被认为不适于多重扩增的任何区域。这样的区域包括综合征区、低复杂性区域、高GC含量的区域或具有连续串联重复的区域。可确定其他这样的特征或者其对于本领域普通技术人员而言是另外已知的。

本公开内容还提供了可用于评估样品中非天然核酸的量的组合物或试剂盒。在一些实施方案中，组合物或试剂盒包含多种引物对。组合物或试剂盒的每种引物对可包含正向引物和反向引物，其中在本文中提供的任一种方法、组合物或试剂盒的一些实施方案中，在一种引物中存在3’错配(例如，在倒数第二个3’核苷酸)。在本文中提供的任一种方法、组合物或试剂盒的一些实施方案中，这种错配位于3’核苷酸处且于与SNV位置相邻，并且当不存在特定的SNV时，相对于该SNV靶标的另一种等位基因存在双错配。在本文中提供的任一种方法、组合物或试剂盒的一些实施方案中，引物对中的错配引物是正向引物。在本文中提供的任一种方法、组合物或试剂盒的一些实施方案中，SNV靶标的每种等位基因的反向引物是相同的。

在本文中提供的任一种方法、组合物或试剂盒的一些实施方案中，存在至少2种、至少5种、至少10种、至少20种、至少30种、至少40种等这样的引物对。在提供的任一种方法、组合物或试剂盒的一些实施方案中，针对至少40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95种或更多种靶标存在引物对，例如至少两种引物对。在提供的任一种方法、组合物或试剂盒的一些实施方案中，针对少于105、104、103、102、101、100、99、98或97种靶标存在引物对，例如至少两种引物对。在提供的任一种方法、组合物或试剂盒的一些实施方案中，针对40至105、45至105、50至105、55至105、60至105、65至105、70至105、75至105、80至105、85至105、90至105、90至104、90至103、90至102、90至101、90至100、90至99、91至99、92至99、93、99、94至99、95至99或90至95种靶标存在引物对，例如至少两种引物对。在提供的任一种方法、组合物或试剂盒的一些实施方案中，针对40至99、45至99、50至99、55至99、60至99、65至99、70至99、75至99、80至99、85至99、90至99、90至99、90至98、90至97或90至96种靶标存在引物对，例如至少两种引物对。在提供的任一种方法、组合物或试剂盒的一些实施方案中，针对90至105、90至104、90至103、90至102、90至101、90至100、90至99、91至99、92至99、93、99、94至99、95至99、90至95种靶标存在引物对，例如至少两种引物对。在本文中提供的任一种方法、组合物或试剂盒的一些实施方案中，引物对被设计成相容地用于本文中提供的定量测定。例如，引物对被设计成防止引物二聚体和/或限制脱靶结合位点的数目。应理解的是，提供的任一种方法、组合物或试剂盒的多种引物对可根据本文所述的任一种方法进行优化或设计。

在一些实施方案中，提供的任一种组合物或试剂盒还包含缓冲剂。在一些实施方案中，缓冲剂包含添加剂，例如表面活性剂、二甲基亚砜(DMSO)、甘油、牛血清白蛋白(BSA)和聚乙二醇(PEG)或其他PCR反应添加剂。在一些实施方案中，提供的任一种组合物或试剂盒还包含聚合酶，例如组合物或试剂盒可包含大肠杆菌DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段、T7DNA聚合酶、T4DNA聚合酶、T5DNA聚合酶、Klenow类聚合酶、Taq聚合酶、PfuDNA聚合酶、Vent聚合酶、噬菌体29、REDTaq^TM基因组DNA聚合酶或测序酶。在一些实施方案中，提供的任一种组合物或试剂盒还包含一种或更多种dNTP(例如，dATP、dCTP、dGTP、dTTP)。在一些实施方案中，提供的任一种组合物或试剂盒还包含探针(例如，探针)。

本文中使用的“试剂盒”通常限定包含本发明的一种或更多种组合物，和/或与本发明相关的其他组合物的包装或组合件，例如如前所述。本文中提供的任一种试剂盒还可包含至少一个反应管、孔、室等。本文中所述的任一种引物、引物系统(例如用于多种靶标的一组引物)或引物组合物可以以试剂盒的形式提供或包含在试剂盒内。

试剂盒的每种组合物可以以液体形式(例如在溶液中)、固体形式(例如干粉)等提供。试剂盒在一些情况下可包括以使得本领域普通技术人员将认识到说明与本发明组合物相关的方式以任何形式与本发明组合物联合提供的说明。说明可包括用于进行本文中提供的任一种方法的说明。说明书可包括使用、调节、混合、稀释、保存、施用、组装、储存、包装和/或制备所述组合物和/或与试剂盒相关的其他组合物的说明。说明可以以本领域普通技术人员可识别的任何形式提供，如用于包含这样的说明的合适载体，例如以任何方式提供的书写或公开的、口头的、可听的(例如电话的)、数字的、光学的、可视的(例如，录像带、DVD等)或电子的通信(包括因特网或基于网络的通信)。

本发明的不同方面可单独地、组合或以前文所述实施方案中未具体讨论的多种布置使用，并且因此其应用不限于在先描述中所述的或附图中举例说明的组分的细节和布置。例如，一个实施方案中描述的方面可以以任何方式与其他实施方案中描述的方面组合。

此外，本发明的实施方案可作为一种或更多种方法实施，其实例已提供。作为方法的一部分执行的动作可以以任何合适的方式排序。因此，可以构建其中动作以不同于所举例说明的顺序执行的实施方案，其可包括同时进行一些动作，即使在举例说明性实施方案中被示为顺序动作。

在权利要求书中使用例如“第一”、“第二”、“第三”等的序数术语来修饰权利要求要素并非自身暗示一个权利要求要素相对于另一个具有任何优先权、优先性或顺序或者其中执行方法动作的时间顺序。这样的术语仅用作标记以区分具有某一名称的一个权利要求要素与具有相同名称(除序数术语的使用之外)的另一个要素。

本文中使用的用语和术语是为了描述的目的，并且不应被认为是限制性的。“包括”、“包含”、“具有”、“含有”、“涉及”及其变化形式的使用意味着涵盖其后列出的项目和附加项目。

已经详细描述了本发明的数个实施方案，本领域技术人员将容易想到不同的修改和改进。这样的修改和改进旨在落入本发明的精神和范围内。因此，前面的描述仅仅是作为示例，而不是限制性的。以下描述提供了本文中提供的方法的实例。

实施例

实施例1–具有接受者和供体基因型信息

SNV靶标选择

对用于根据本公开内容之多重化的合适的相容性靶标的鉴定可包括下文示例的一个或更多个以下步骤：

·以高度杂合的SNP开始

–对数个种族对照群体进行筛选

–Hardy-Weinberg p>0.25

–排除已知的困难区域

·在患者中可能异常的综合征区

·低复杂性区域，包括染色体的着丝粒和端粒

·在计算机上设计期望长度的靶片段

–横跨每个SNP的70bp窗口的两个20至26bp引物

–用BLAST针对GCRh37查询所有的候选引物

–保留充分特异性的引物

·监测脱靶命中，特别是在片段的3’端

·分析脱靶候选命中用于可能在尺寸选择中存留下来的成对片段产生

·在计算机上进行多重化评价

–计算解链温度和GC％，并过滤中等范围序列

–迭代遗传算法/模拟退火选择400个候选的相容性靶标

·产生最佳的400种靶标(800种引物)并在共同溶液中在共同解链温度下物理上测试多重化能力

·在测序的400种靶标中：

–过滤到均匀地多重扩增的序列

–中等阅读深度窗口

·为来自表现最好的多重化SNP的MOMA而设的48个测定

–每种SNP具有在WT/MUT中以四个错配选择设计的探针(每个测定8种探针)

–在70bp富集片段内设计新巢式引物

–对已知杂合个体实验扩增以评价扩增效率(8×48TAQMAN，一式三份)

每个测定的先验(Apriori)基因分型信息量

·对于每个测定的SNP具有已知接受者和供体基因型，选择信息性测定的子集。

–在供体是任何其他基因型时，可使用接受者纯合位点

·不具有供体基因型，但可在移植之前获得明确的接受者基因型；供体基因型可由血浆数据差异推断。

·可通过测序或SNP微阵列或对已知0％(明确接受者)样品应用MOMA测定来获知基因型。

多重测定性能的处理后分析

在整个实验群组，评估患者特异性MOMA探针偏差。迭代地细化选择使得最终供体％调用仅使用可靠的探针。自动化异常值检测提供患者特异性的异常基因组区域。

重建实验

·用已知的混合比对重建血浆样品评价灵敏度和精确度。

·评价比为1:10、1:20、1:100、1:200、1:1000。

重建实验的结果证明了概念验证(图3)。一种靶标是完全信息性的，其中相对于纯合接受者存在纯合供体(有阴影的数据点)。另一种靶标是半信息性的，其中相对于纯合接受者存在杂合供体(空心数据点)。另外，用MOMA方法分析来自移植接受者患者的血浆样品(图4)。所有数据均来自已接受活检的患者。深色点指示排斥。图5中所示的另外数据表明本文中提供的MOMA方法对真正血浆样品起作用。在移植外科手术之后，供体百分比水平下降。一般来说，使用如本文中所述95种SNV靶标的引物。

实施例2-具有接受者基因型信息但不具有供体基因型信息

为了在不具有供体基因型信息情况下工作，可进行以下操作以推断信息性测定并允许量化血浆样品中的供体特异性无细胞DNA。在完全信息背景下评价所有测定的性能。这一操作由此假设每个测定的明确AA/AB/BB基因型和每个量化的无偏行为。对于接受者基因型，选择已知在接受者中纯合的测定。任何污染均归因于供体核酸，并且测定集合产生具有对应于非信息性、半信息性和完全信息性测定的三个测定簇的三模态分布。用足够数量的接受者纯合测定，可假设供体完全信息性测定的存在。

如果接受者基因型是纯合的且已知的，则如果观察到了并非接受者基因型的测量，真正是供体纯合的探针将具有最高的簇并且等于猜测，而为供体杂合的那些的将是半猜测。可绘制概率分布，并且可使用期望最大化算法(EM)来推断供体基因型。这可用于在本文中提供的任一种方法中推断供体基因型频率。因此，使用EM算法来推断在所有测定SNV靶标的最可能供体基因型。在推断的供体基因型下，可如在完全信息背景下进行量化。EM可以以下假设开始：在测定中发现的次要等位基因比例遵循三模态分布，用于接受者和供体的每种组合的三模态分布，给定所有测定在接受者中是“AA”(或反过来为“BB”而不失一般性)。在所有供体基因型未知的情况下，根据显示出几乎为零的次要等位基因的任何测定均为供体AA，而最高为供体BB这一知识，则可能自我启动(bootstrap)。记录对所有供体基因型的初始猜测，并计算每个簇的平均值。用供体BB测定的平均值是供体AB的平均值两倍这一强制执行来约束该检索。然后，基于簇和内置假设，算法重新分配猜测的供体基因型。这个过程是迭代的，直到不再发生变化。在给定其与背景的测量偏差下，最终的结果是最可能供体基因型集合。一般来说，每种靶标都落入模型中；如果在最大化之后在组之间，可抛出结果。

图6示出了以这种方式操作的来自血浆样品的示例性结果。x轴为发现接受者为纯合的任何测定的供体％。各行的点表示各个PCR测定结果。最下行的圆圈表示供体基因型的初始猜测：一些为AA，一些为A/B，一些为BB。然后，绘制实曲线，其表示集中于初始测定的β分布，红色用于纯合的(完全信息性的)，绿色用于杂合的(半信息性的)，其中黑色曲线表示非信息性测定或背景噪声的分布。在第二行中将测定重新分配为更新的猜测。第二行的曲线使用虚线。最上面一行为最终估计，因为没有变化发生。绿色虚线的峰的二倍对应于最大似然的供体％调用，约为10％，或等于红色曲线的平均值。

使用来自两个个体的DNA，以10％、5％、1％、0.5％和0.1％构建重建实验(Recon1)。用多重靶标文库扩增所有混合物、清洗，然后使用MOMA方法定量地进行基因分型。对每个个体进行基因分型来进行分析，以获知其真正的基因型。使用主要个体基因型的先前知识来确定信息性靶标(查询纯合位点)，并且在第二个体不同的情况下，使用信息性靶标来计算分数(百分比)。然后，计算所述分数(以黑色示出以表示“具有基因型”信息)。

以两个个体(主要和次要)开始，同样以10％、5％、1％、0.5％和0.1％构建第二重建实验(Recon2)。用多重靶标文库扩增所有混合物、清洗，然后使用MOMA方法定量地基因分型。对每个个体进行基因分型来进行分析以获知其真正基因型。如上所述使用第二个体的基因型的先前知识来确定信息性靶标。然后，计算分数(以黑色示出以表示“具有基因型”信息)。

次日再次运行这些重建(Recon3)。

然后，不使用来自第二个体(次要DNA贡献者)的基因分型信息而仅使用第一个体(主要DNA贡献者)可用的基因分型信息来再次分析相同的重建样品(Recon 1、2、3)。使用约38至40种靶标来计算分数，不具有基因分型(模拟没有供体)用阴影表示(图8)。发现，为接受者纯合的每种靶标都可能是有用的。圆圈为首次猜测，刚好阈值化，在右侧的那些被认为是完全信息性的，而在左侧的那些则不是。沿着顶部的三角形是相同的靶标，但由于最终的信息性决策，其被重新着色。发现，期望最大化优于简单阈值化。

Claims

1.评估来自对象的样品中非天然核酸的量的方法，所述样品包含非天然和天然核酸，所述方法包括：

对于多种单核苷酸变体(SNV)靶标中的每一种，用至少两种引物对对所述样品或其部分进行基于扩增的定量测定，其中每种引物对包含正向引物和反向引物，其中所述至少两种引物对中的一种在引物中包含相对于所述SNV靶标之一种等位基因的3’倒数第二位错配而相对于所述SNV靶标之另一种等位基因的3’双错配且特异性地扩增所述SNV靶标的所述一种等位基因，并且所述至少两种引物对中的另一种特异性地扩增所述SNV靶标的所述另一种等位基因，

以及获得或提供来自所述基于扩增的定量测定的结果以确定所述样品中非天然核酸的量。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述结果在报告中提供。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法还包括基于所述结果来确定所述样品中所述非天然核酸的量。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述结果包含所述样品中所述非天然核酸的量。

5.评估来自对象的样品中非天然核酸的量的方法，所述样品包含非天然和天然核酸，所述方法包括：

获得来自对于多种单核苷酸变体(SNV)靶标中的每一种用至少两种引物对对所述样品或其部分进行基于扩增的定量测定的结果，其中每种引物对包含正向引物和反向引物，其中所述至少两种引物对中的一种在引物中包含相对于所述SNV靶标之一种等位基因的3’倒数第二位错配而相对于所述SNV靶标之另一种等位基因的3’双错配且特异性地扩增所述SNV靶标的所述一种等位基因，并且所述至少两种引物对中的另一种特异性地扩增所述SNV靶标的所述另一种等位基因；以及

基于所述结果来评估非天然核酸的量。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述样品中所述非天然核酸的量基于所述基于扩增的定量测定的所述结果。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述结果从报告获得。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少两种引物对中的另一种引物对也在引物中包含相对于所述SNV靶标之所述另一种等位基因的3’倒数第二位错配而相对于所述SNV靶标之所述一种等位基因的3’双错配，并且特异性地扩增所述SNV靶标的所述另一种等位基因。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述量是非天然核酸与天然核酸的比例或百分比。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述结果是所述基于扩增的定量测定的信息性结果。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述量基于所述基于扩增的定量测定的信息性结果。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括选择所述基于扩增的定量测定的信息性结果。

13.根据权利要求12所述的方法，其中对所选的信息性结果求平均。

14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述基于扩增的定量测定的所述信息性结果基于所述非天然核酸和/或天然核酸的基因型来选择。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括获得所述非天然核酸和/或天然核酸的基因型。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括获得所述多种SNV靶标。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括获得所述多种SNV靶标中每一种的所述至少两种引物对。

18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多种SNV靶标为至少90种SNV靶标。

19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多种SNV靶标为至少95种SNV靶标。

20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多种SNV靶标为少于105种SNV靶标。

21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多种SNV靶标为少于100种SNV靶标。

22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品中非天然核酸的量为至少0.005％。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述样品中非天然核酸的量为至少0.01％。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述样品中非天然核酸的量为至少0.03％。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述样品中非天然核酸的量为至少0.05％。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述样品中非天然核酸的量为至少0.1％。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述样品中非天然核酸的量为至少0.3％。

28.根据权利要求22至27中任一项所述的方法，其中所述样品中非天然核酸的量为少于1.5％。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述样品中非天然核酸的量为少于1.3％。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述样品中非天然核酸的量为少于1％。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述样品中非天然核酸的量为少于0.5％。

32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中当不知道或未获得所述非天然核酸的基因型时，所述方法还包括：

基于对可能的非天然基因型的预测来评估结果。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述评估用期望-最大化算法进行。

34.评估来自对象的样品中非天然核酸的量的方法，所述样品包含非天然和天然核酸，所述方法包括：

获得来自以下的结果：1)对于多种SNV靶标中的每一种，用至少两种引物对对样品或其部分进行基于扩增的定量测定，其中每种引物对包含正向引物和反向引物，其中所述至少两种引物对中的一种在引物中包含相对于所述SNV靶标之一种等位基因的3’倒数第二位错配而相对于所述SNV靶标之另一种等位基因的3’双错配且特异性地扩增所述SNV靶标的所述一种等位基因，并且所述至少两种引物对中的另一种特异性地扩增所述SNV靶标的所述另一种等位基因，和2)基于天然基因型和对可能的非天然基因型的预测来确定信息性结果；以及

提供所述结果以确定所述样品中非天然核酸的量。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述结果在报告中提供。

36.根据权利要求34或35所述的方法，其中所述方法还包括基于所述结果来确定所述样品中非天然核酸的量。

37.根据权利要求34至36中任一项所述的方法，其中所述结果包含所述样品中所述非天然核酸的量。

38.评估来自对象的样品中非天然核酸的量的方法，所述样品包含非天然和天然核酸，所述方法包括：

基于所述结果来评估非天然核酸的量。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述样品中所述非天然核酸的量基于所述基于扩增的定量测定的所述结果。

40.根据权利要求38或39所述的方法，其中所述结果从报告获得。

41.根据权利要求34至40中任一项所述的方法，其中所述方法还包括基于天然基因型和对可能的非天然基因型的预测来选择信息性结果。

42.根据权利要求34至41中任一项所述的方法，其中使用期望-最大化来预测可能的非天然基因型。

43.根据权利要求34至42中任一项所述的方法，其中所述至少两种引物对中的另一种引物对也在引物中包含相对于所述SNV靶标之所述另一种等位基因的3’倒数第二位错配而相对于所述SNV靶标之所述一种等位基因的3’双错配，并且特异性地扩增所述SNV靶标的所述另一种等位基因。

44.根据权利要求34至43中任一项所述的方法，其中所述量是非天然核酸与天然核酸的比例或百分比。

45.根据权利要求34至44中任一项所述的方法，其中所述方法还包括获得所述天然核酸的基因型。

46.根据权利要求34至45中任一项所述的方法，其中所述方法还包括获得所述多种SNV靶标。

47.根据权利要求34至46中任一项所述的方法，其中所述方法还包括获得所述多种SNV靶标中每一种的所述至少两种引物对。

48.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用最大似然来计算非天然核酸的量。

49.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品包含无细胞DNA样品，并且所述量是非天然无细胞DNA的量。

50.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述对象是移植接受者，并且非天然核酸的量是供体特异性无细胞DNA的量。

51.根据权利要求50所述的方法，其中所述移植接受者是心脏移植接受者。

52.根据权利要求50或51所述的方法，其中所述移植接受者是儿科移植接受者。

53.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多个的基于扩增的定量测定是定量PCR测定，例如实时PCR测定或数字PCR测定。

54.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括基于所述样品中非天然核酸的量来确定所述对象中的风险。

55.根据权利要求54所述的方法，其中所述风险是与移植相关的风险。

56.根据权利要求55所述的方法，其中所述移植是心脏移植。

57.根据权利要求56所述的方法，其中所述与移植相关的风险是移植排斥的风险。

58.根据权利要求54至57中任一项所述的方法，其中如果非天然核酸的量大于阈值，所述风险升高。

59.根据权利要求54至57中任一项所述的方法，其中如果非天然核酸的量小于阈值，所述风险降低。

60.根据权利要求58或59所述的方法，在其中所述风险是与心脏移植排斥相关的风险的情况下，所述阈值为1％。

61.根据权利要求58或59所述的方法，在其中所述风险是与心脏移植排斥相关的风险的情况下，所述阈值为1.3％。

62.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括基于非天然核酸的量来选择用于所述对象的治疗。

63.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括基于非天然核酸的量来治疗所述对象。

64.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括基于非天然核酸的量来提供关于针对所述对象的治疗的信息。

65.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括随时间监测或建议随时间监测所述对象中非天然核酸的量。

66.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在后续时间点评估所述对象中非天然核酸的量。

67.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括基于非天然核酸的量来评价施用于所述对象的治疗的效果。

68.根据权利要求62至67中任一项所述的方法，其中所述治疗是抗排斥治疗。

69.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括提供或获得所述样品或其部分。

70.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括从所述样品提取核酸。

71.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品包含血液、血浆或血清。

72.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品在心脏移植的10天内从所述对象获得。

73.确定多种SNV靶标的方法，其包括：

a)在个体群中鉴定多种高度杂合的SNV，

b)设计横跨每种SNV的一种或更多种引物，

c)选择充分特异性引物，

d)计算所选引物的解链温度和/或GC％并过滤中等范围序列，

e)在共同溶液中在共同解链温度下评价引物的多重化能力，以及

f)鉴定均匀扩增、例如用PCR均匀扩增的序列。

74.根据权利要求73所述的方法，其中步骤a)还包括选择Hardy-Weinberg p>0.25的SNV和/或排除与困难区域相关的那些。

75.根据权利要求74所述的方法，其中所述困难区域是综合征区域和/或低复杂性区域。

76.根据权利要求73至75中任一项所述的方法，其中步骤b)的所述一种或更多种引物横跨70bp的窗口和/或所述一种或更多种引物的长度为16至26bp。

77.根据权利要求73至76中任一项所述的方法，其中步骤c)的所述充分特异性引物用BLAST分析鉴定。

78.根据权利要求77所述的方法，其中所述BLAST分析针对GCRh37。

79.根据权利要求73至78中任一项所述的方法，其中步骤d)还包括迭代遗传算法和/或模拟退火。

80.根据权利要求73至79中任一项所述的方法，其还包括获得用于每种鉴定的SNV靶标的引物对，其中所述引物对在引物中包含相对于所述SNV之一种等位基因的3’倒数第二位错配而相对于所述SNV靶标之另一种等位基因的3’双错配，并且特异性地扩增所述SNV靶标的所述一种等位基因。

81.根据权利要求80所述的方法，其中所述方法还包括获得用于每种鉴定的SNV的另一种引物对，其中所述另一种引物对特异性地扩增所述SNV靶标的所述另一种等位基因。

82.根据权利要求81所述的方法，其中所述另一种引物对在引物中包含相对于所述SNV之所述另一种等位基因的3’倒数第二位错配而相对于所述SNV之所述一种等位基因的3’双错配。

83.根据权利要求73至82中任一项所述的方法，其中鉴定的所述多种SNV靶标为至少90种SNV靶标。

84.根据权利要求83所述的方法，其中所述多种SNV靶标为至少95种SNV靶标。

85.根据权利要求73至84中任一项所述的方法，其中鉴定的所述多种SNV靶标为少于105种SNV靶标。

86.根据权利要求85所述的方法，其中所述多种SNV靶标为少于100种SNV靶标。

87.组合物或试剂盒，其包含：

多种SNV靶标中每一种的引物对，其中每种引物对在引物中包含相对于SNV靶标之一种等位基因的3’倒数第二位错配而相对于所述SNV靶标之另一种等位基因的3’双错配，并且特异性地扩增所述SNV靶标的所述一种等位基因。

88.根据权利要求87所述的组合物或试剂盒，其还包含所述多种SNV靶标中每一种的另一种引物对，其中所述另一种引物对特异性地扩增所述SNV靶标的所述另一种等位基因。

89.根据权利要求87或88所述的组合物或试剂盒，其中所述多种SNV靶标为至少90种SNV靶标。

90.根据权利要求89所述的组合物或试剂盒，其中所述多种SNV靶标为至少95种SNV靶标。

91.根据权利要求87至90中任一项所述的组合物或试剂盒，其中所述多种SNV靶标为少于105种SNV靶标。

92.根据权利要求91所述的组合物或试剂盒，其中所述多种SNV靶标为少于100种SNV靶标。

93.根据权利要求87至92中任一项所述的组合物或试剂盒，其还包含缓冲剂。

94.根据权利要求87至93中任一项所述的组合物或试剂盒，其还包含聚合酶。

95.根据权利要求87至94中任一项所述的组合物或试剂盒，其还包含探针。

96.根据权利要求95所述的组合物或试剂盒，其中所述探针是荧光探针。

97.根据权利要求87至96中任一项所述的组合物或试剂盒，其还包含使用说明。

98.根据权利要求97所述的组合物或试剂盒，其中所述使用说明是用于确定样品中非天然核酸的量的说明。

99.根据权利要求98所述的组合物或试剂盒，其中所述样品来自心脏移植接受者。

100.根据权利要求99所述的组合物或试剂盒，其中所述样品来自儿科心脏移植接受者。

101.推断非天然核酸基因型的方法：

获得多种单核苷酸变体(SNV)靶标中每一种的信息性非天然核酸水平，

用最大似然或期望最大化步骤将所述水平分配给两个分布中的一个，所述两个分布中一个用于完全信息性水平，另一个用于半信息性水平。

102.根据权利要求101所述的方法，其中所述信息性非天然核酸水平通过去除被确定为天然核酸的水平而获得。

103.根据权利要求101或102所述的方法，其中所述方法还包括去除代表无调用或错误调用的水平。

104.根据权利要求101至103中任一项所述的方法，其中所述水平用测序、例如用下一代测序来确定。

105.根据权利要求101至104中任一项所述的方法，其中所述水平由对所述多种SNV靶标中每一种进行的基于扩增的定量测定获得。

106.根据权利要求105所述的方法，其中所述基于扩增的定量测定对所述多种SNV靶标中的每一种用至少两种引物对进行，其中每种引物对包含正向引物和反向引物，其中所述至少两种引物对中的一种在引物中包含相对于所述SNV靶标之一种等位基因的3’倒数第二位错配而相对于所述SNV靶标之另一种等位基因的3’双错配且特异性地扩增所述SNV靶标的所述一种等位基因，并且所述至少两种引物对中的另一种特异性地扩增所述SNV靶标的所述另一种等位基因。

107.根据权利要求106所述的方法，其中所述至少两种引物对中的另一种引物对也在引物中包含相对于所述SNV靶标之所述另一种等位基因的3’倒数第二位错配而相对于所述SNV靶标之所述一种等位基因的3’双错配，并且特异性地扩增所述SNV靶标的所述另一种等位基因。

108.根据权利要求101至107中任一项所述的方法，其中所述方法还包括提供分配的水平。

109.根据权利要求101至108中任一项所述的方法，其中所述方法还包括基于所述水平的分配来获得非天然核酸的量。

110.根据权利要求101至109中任一项所述的方法，其中所述方法还包括基于所述水平的分配来提供非天然核酸的量。

111.包括以下的方法：

根据权利要求101至110中任一项所述的方法来获得被分配为完全信息性或半信息性的水平或者基于所述分配的非核酸的量，和

基于所述水平或量来评估所述对象中的风险。

112.根据权利要求111所述的方法，其中所述对象是移植的接受者。

113.根据权利要求111或112所述的方法，其中基于评估的风险来给予所述对象治疗或关于治疗的信息。

114.根据权利要求113所述的方法，其中所述治疗是抗排斥治疗。

115.根据权利要求111至113中任一项所述的方法，其中所述方法还包括随时间监测或建议随时间监测所述对象中非天然核酸的量。