JP2022002508A - 無細胞ｄｎａを評価するための多重／最適化ミスマッチ増幅（ｍｏｍａ）−リアルタイムｐｃｒ - Google Patents

Abstract

【課題】試料中の非天然核酸の量を評価する方法を提供する。【解決手段】対象からの試料中の非天然核酸の量を評価する方法であって、試料が非天然核酸及び天然核酸を含み、方法が：複数の一塩基バリアント（ＳＮＶ）標的のそれぞれについて、試料又はその一部に対して、少なくとも２つのプライマー対を用いた増幅に基づく定量アッセイを実施する、ここで各プライマー対はフォワードプライマー及びリバースプライマーを含み、少なくとも２つのプライマー対の１つは、ＳＮＶ標的の１つのアレルに対して３’末端から２番目のミスマッチを、ＳＮＶ標的の別のアレルに対しては３’二重ミスマッチを含み、かつ、ＳＮＶ標的の１つのアレルを特異的に増幅し、少なくとも２つのプライマー対のもう１つは、ＳＮＶ標的の別のアレルを特異的に増幅する、及び、増幅に基づく定量アッセイの結果から、試料中の非天然核酸の量を決定すること、を含む、前記方法である。【選択図】なし

Description

関連出願
本出願は、35 U.S.C. 119(e)の元で、２０１５年４月３０日に出願された米国仮出願第62/155,453号の出願日の利益を主張し、この仮出願の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

発明の分野
本発明は、対象からの試料中の非天然核酸の量を評価するための、方法および組成物に関する。本明細書で提供される方法および組成物は、移植拒絶反応などの状態のリスクを決定するために使用することができる。本発明はさらに、非天然無細胞デオキシリボ核酸（ドナー特異的無細胞ＤＮＡなどの非天然無細胞ＤＮＡ）の量を評価するための、多重／最適化ミスマッチ増幅（ＭＯＭＡ）を使用した、方法および組成物に関する。

発明の背景
試料中の非天然核酸を検出および定量する能力は、移植拒絶反応などの状態の早期検出を可能にし得る。しかし、異種核酸集団（例えば、天然および非天然核酸の混合物）の定量分析のための現在の方法は限られている。

本開示は少なくとも部分的に、多重／最適化ミスマッチ増幅を用いて対象からの試料中の低頻度の非天然核酸を定量することができるという、驚くべき発見に基づく。多重／最適化ミスマッチ増幅は、特定配列の増幅のために３’末端から２番目のミスマッチを、しかし代替配列に対しては２重ミスマッチを含み得るプライマーの設計を包含する。かかるプライマーでの増幅は、核酸異種集団において、非天然核酸の量が例えば１％未満、または０．５％である場合でさえ、試料中の非天然核酸の量の定量的決定を可能にする。

本明細書に提供されるのは、かかる最適化された増幅に関連する方法、組成物およびキットである。本方法、組成物またはキットはそれぞれ、実施例および図面にあるもののいずれか１つを含む、本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つであることができる。
一側面において、対象からの試料中の非天然核酸の量を評価する方法が提供される。一態様において、方法は、複数の一塩基バリアント（ＳＮＶ）標的のそれぞれについて、試料またはその一部に対して、少なくとも１つのプライマー対を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）定量アッセイなどの増幅に基づく定量アッセイからの結果を得ること、ここで少なくとも１つのプライマー対はフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、少なくとも１つのプライマー対は、ＳＮＶ標的の１つの配列（例えはアレル）に対して３’ミスマッチ（例えば末端から２番目のミスマッチ）を、しかしＳＮＶ標的の別の配列（例えばアレル）に対しては３’二重ミスマッチを有するプライマーを含み、かつＳＮＶ標的の１つの配列（例えばアレル）を特異的に増幅する。

本明細書に提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、各ＳＮＶ標的について、少なくとも１つの別のプライマー対を用いた定量アッセイからの結果を得ることを含み、ここで少なくとも１つの別のプライマー対はフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、少なくとも１つの別のプライマー対は、ＳＮＶ標的の別の配列（例えばアレル）を特異的に増幅する。
一態様において、対象からの試料中の非天然核酸の量を評価する方法であって、複数の一塩基バリアント（ＳＮＶ）標的のそれぞれについて、試料またはその一部に対して、少なくとも２つのプライマー対を用いて、ＰＣＲ定量アッセイなどの増幅に基づく定量アッセイを実施すること、ここで各プライマー対はフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、少なくとも２つのプライマー対の１つは、ＳＮＶ標的の１つの配列（例えはアレル）に対して３’ミスマッチ（例えば末端から２番目）を、しかしＳＮＶ標的の別の配列（例えばアレル）に対しては３’二重ミスマッチを含み、かつＳＮＶ標的の１つの配列（例えばアレル）を特異的に増幅し、少なくとも２つのプライマー対のもう１つは、ＳＮＶ標的の別の配列（例えばアレル）を特異的に増幅する、前記方法が提供される。

一態様において、対象からの試料中の非天然核酸の量を評価する方法であって、複数の一塩基バリアント（ＳＮＶ）標的のそれぞれについて、試料またはその一部に対して、少なくとも２つのプライマー対を用いて実施される、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）定量アッセイなどの増幅に基づく定量アッセイからの結果を得ることを含み、ここで各プライマー対はフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、少なくとも２つのプライマー対の１つは、ＳＮＶ標的の１つの配列（例えはアレル）に対して３’ミスマッチ（例えば末端から２番目）を、しかしＳＮＶ標的の別の配列（例えばアレル）に対しては３’二重ミスマッチを含み、かつＳＮＶ標的の１つの配列（例えばアレル）を特異的に増幅し、および少なくとも２つのプライマー対のもう１つは、ＳＮＶ標的の別の配列（例えばアレル）を特異的に増幅する、前記方法が提供される。

一態様において、例えば対象からなどの試料中の非天然核酸の量を評価する方法であって、試料が非天然および天然核酸を含み、方法が、複数のＳＮＶ標的に対して、かかるＳＮＶ標的の各々について、本明細書に記載の少なくとも１つのプライマー対、例えば少なくとも２つのプライマー対を用いた、試料へのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）定量アッセイなどの増幅に基づく定量アッセイからの結果を得ること、ここで各プライマー対はフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、および、天然核酸および／または非天然核酸の遺伝子型に基づいて情報提供的な結果を選択すること、および、該情報提供的な結果に基づき、試料中の非天然核酸の量を決定すること、を含む、前記方法が提供される。一態様において、方法はさらに、複数のＳＮＶ標的を同定することを含む。一態様において、本方法はさらに、非天然核酸の遺伝子型を推定することを含む。一態様において、方法はさらに、結果を提供することを含む。

一態様において、対象からの試料中の非天然核酸の量を評価する方法であって、方法が、次の１）および２）からの結果を得ることを含む、前記方法が提供される：１）複数の一塩基バリアント（ＳＮＶ）標的のそれぞれについて、試料またはその一部に対して少なくとも１つのプライマー対、例えば少なくとも２つのプライマー対を用いて実施された、ＰＣＲ定量アッセイなどの増幅に基づく定量アッセイ；ここで各プライマー対はフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、少なくとも１つ、例えば少なくとも２つのプライマー対の１つは、ＳＮＶ標的の１つの配列（例えはアレル）に対して３’ミスマッチ（例えば末端から２番目）を、しかしＳＮＶ標的の別の配列（例えばアレル）に対しては３’二重ミスマッチを含み、かつＳＮＶ標的の１つの配列（例えばアレル）を特異的に増幅する、および２）天然の遺伝子型、および／または可能性のある非天然の遺伝子型の予測、に基づく情報提供的結果の決定。一態様において、少なくとも２つのプライマー対が存在する場合、別のプライマー対は、各ＳＮＶ標的の別の配列（例えばアレル）を特異的に増幅し、定量結果は、別のプライマー対を用いて、ＳＮＶ標的のそれぞれについて得られる。

一態様において、対象からの試料中の非天然核酸の量を評価する方法であって、方法が、次の１）および２）からの結果を得ることを含む、前記方法が提供される：１）複数のＳＮＶ標的のそれぞれについて、試料またはその一部に対して少なくとも２つのプライマー対を用いて実施された、ＰＣＲ定量アッセイなどの増幅に基づく定量アッセイ；ここで各プライマー対はフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、少なくとも２つのプライマー対の１つは、ＳＮＶ標的の１つの配列（例えはアレル）に対して３’ミスマッチ（例えば末端から２番目）を、しかしＳＮＶ標的の別の配列（例えばアレル）に対しては３’二重ミスマッチを含み、かつＳＮＶ標的の１つの配列（例えばアレル）を特異的に増幅し、少なくとも２つのプライマー対のもう１つは、ＳＮＶ標的の別の配列（例えばアレル）を特異的に増幅する、および２）天然の遺伝子型、および／または可能性のある非天然の遺伝子型の予測、に基づく情報提供的結果の決定。

本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様においては、各ＳＮＶ標的についての少なくとも１つの別のプライマー対、および／または、それを用いたＰＣＲ定量アッセイなどの増幅に基づく定量アッセイを用いて結果を得ることを、さらに含む。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、少なくとも１つの別のプライマー対は、ＳＮＶ標的の別の配列（例えばアレル）に対して３’ミスマッチ（例えば、末端から２番目）を、しかしＳＮＶ標的の１つの配列（例えばアレル）に対しては３’二重ミスマッチを含み、かつＳＮＶ標的の別の配列（例えばアレル）を特異的に増幅する。
提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、非天然核酸の量を結果に基づいて評価することを含む。本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、結果は、情報提供的な結果である。

提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、ＰＣＲ定量アッセイなどの増幅に基づく定量アッセイの、情報提供的な結果を選択することを含む。提供される方法のいずれか１つの一態様において、選択された情報提供的な結果は、平均化される。
提供される方法のいずれか１つの一態様において、ＰＣＲ定量アッセイなどの増幅に基づく定量アッセイの情報提供的な結果は、非天然核酸および／または天然核酸の遺伝子型に基づいて選択される。
提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、非天然核酸および／または天然核酸の遺伝子型を得ることを含む。

提供される方法のいずれか１つの一態様において、本方法はさらに、天然の遺伝子型、および／または可能性のある非天然の遺伝子型の予測、に基づく情報提供的な結果を選択することを含む。提供される方法のいずれか１つの一態様において、非天然核酸の遺伝子型が知られていないかまたは得られていない場合、方法はさらに、可能性のある非天然の遺伝子型の予測に基づいて結果を評価することを含む。提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法は、情報提供的な結果および予測に基づく、試料中の非天然核酸の量を含む。提供される方法のいずれか１つの一態様において、評価することまたは予測は、期待値最大化アルゴリズムを用いて実施される。提供される方法のいずれか１つの一態様において、期待値最大化を用いて、可能性のある非天然の遺伝子型を予測する。

提供される方法のいずれか１つの一態様において、最大尤度を用いて、非天然核酸の量を算出する。
提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、複数のＳＮＶ標的を得ることを含む。
提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、複数のＳＮＶ標的のそれぞれについて、少なくとも１つ、例えば少なくとも２つのプライマー対を得ることを含む。
提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、結果を得ることまたは提供することを含む。提供される方法のいずれか１つの一態様において、結果は、情報提供的な結果である。提供される方法のいずれか１つの一態様において、結果は、試料中の非天然核酸の量を含む。

本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、結果はレポートで提供される。一側面において、かかるレポートが本明細書に提供される。提供される方法またはレポートのいずれか１つの一態様において、結果は、情報提供的な結果である。提供される方法またはレポートのいずれか１つの一態様において、結果は、試料中の非天然核酸の量を含む。
本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、結果は、レポートから得られる。提供されるレポートのいずれか１つの一態様において、レポートは、電子形式で与えられる。提供されるレポートのいずれか１つの一態様において、レポートは、ハードコピーである。提供されるレポートのいずれか１つの一態様において、レポートは、口頭で与えられる。

本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、結果は、試料中の非天然核酸の量であるか、またはこれを決定するために使用することができる。提供される方法のいずれか１つの一態様において、結果は、情報提供的な結果である。
本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、試料中の非天然核酸の量を、例えば結果に基づいて決定することを含む。提供される方法のいずれか１つの一態様において、結果は、情報提供的な結果である。本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、試料中の非天然核酸の量は、ＰＣＲ定量アッセイなどの増幅に基づく定量アッセイの結果に基づく。本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、結果は、ＰＣＲ定量アッセイなどの増幅に基づく定量アッセイの、情報提供的な結果である。

本明細書で提供される方法、組成物、キットまたはレポートのいずれか１つの一態様において、量は、非天然核酸の天然核酸に対する比率またはパーセンテージである。
提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、ＳＮＶ標的当たり、少なくとも１つのプライマー対、少なくとも２つのプライマー対、少なくとも３つのプライマー対、少なくとも４つのプライマー対、またはそれ以上が存在する。提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、複数のＳＮＶ標的は、少なくとも４５、４８、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５または９０個またはそれ以上である。提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、複数のＳＮＶ標的は、少なくとも９０、９５個またはそれ以上の標的である。提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、複数のＳＮＶ標的は、１０５または１００個未満の標的である。

提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、ミスマッチプライマーは、フォワードプライマーである。提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、各ＳＮＶ標的についてのプライマー対のリバースプライマーは、同一である。
提供される方法のいずれか１つの一態様において、試料中の非天然核酸の量は、少なくとも０．００５％である。提供される方法のいずれか１つの一態様において、試料中の非天然核酸の量は、少なくとも０．０１％である。提供される方法のいずれか１つの一態様において、試料中の非天然核酸の量は、少なくとも０．０３％である。提供される方法のいずれか１つの一態様において、試料中の非天然核酸の量は、少なくとも０．０５％である。提供される方法のいずれか１つの一態様において、試料中の非天然核酸の量は、少なくとも０．１％である。提供される方法のいずれか１つの一態様において、試料中の非天然核酸の量は、少なくとも０．３％である。提供される方法のいずれか１つの一態様において、試料中の非天然核酸の量は、１．５％未満である。提供される方法のいずれか１つの一態様において、試料中の非天然核酸の量は、１．３％未満である。提供される方法のいずれか１つの一態様において、試料中の非天然核酸の量は、１％未満である。提供される方法のいずれか１つの一態様において、試料中の非天然核酸の量は、０．５％未満である。

提供される方法のいずれか１つの一態様において、試料は無細胞ＤＮＡ試料を含み、量は非天然無細胞ＤＮＡの量である。
提供される方法のいずれか１つの一態様において、対象は移植レシピエントであり、非天然核酸の量はドナー特異的無細胞ＤＮＡの量である。
提供される方法のいずれか１つの一態様において、移植レシピエントは、心臓移植レシピエントである。提供される方法のいずれか１つの一態様において、移植レシピエントは、小児の移植レシピエントである。
提供される方法のいずれか１つの一態様において、ＰＣＲ定量アッセイなどの、複数の増幅に基づく定量アッセイは、リアルタイムＰＣＲアッセイまたはデジタルＰＣＲアッセイである。

提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、対象におけるリスクを、試料中の非天然核酸の量に基づいて決定することを含む。提供される方法のいずれか１つの一態様において、リスクは、移植に関連するリスクである。提供される方法のいずれか１つの一態様において、移植に関連するリスクは、移植拒絶反応のリスク、移植片の解剖学的問題、または移植片の損傷である。本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、移植片の損傷は、初期または進行中の損傷である。本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、移植に関連するリスクは、損傷の重篤度を示す。
提供される方法のいずれか１つの一態様において、リスクは、非天然核酸の量が閾値よりも大きい場合に増大する。提供される方法のいずれか１つの一態様において、リスクは、非天然核酸の量が閾値未満である場合に低下する。

提供される方法のいずれか１つの一態様において、リスクが心臓移植拒絶反応に関連するリスクである場合、閾値は１％である。提供される方法のいずれか１つの一態様において、リスクが心臓移植拒絶反応に関連するリスクである場合、閾値は１．３％である。
提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、対象への処置を、非天然核酸の量に基づいて選択することを含む。
提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、対象を、非天然核酸の量に基づいて処置することを含む。
提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、処置についての情報を、非天然核酸の量に基づき、対象に提供することを含む。

提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、対象における非天然核酸の量を経時的にモニタリングすること、またはモニタリングを示唆すること、を含む。
提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、対象における非天然核酸の量を、その後の時点で評価することを含む。
提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、対象から別の試料を、例えばその後の時点で得ること、および、試料に対して試験を、例えば本明細書で提供される方法のいずれか１つを行うこと、を含む。
提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、対象に投与される処置の効果を、非天然核酸の量に基づいて評価することを含む。

提供される方法のいずれか１つの一態様において、処置は、抗拒絶反応療法である。
提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、試料またはその一部を提供することまたは得ることを含む。
提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、核酸を試料から抽出することを含む。
提供される方法のいずれか１つの一態様において、本方法はさらに、増幅ステップを含む。提供される方法のいずれか１つの一態様において、増幅は、１つ以上の定量アッセイの前に実施される。
提供される方法のいずれか１つの一態様において、試料は、血液、血漿、血清または尿を含む。

提供される方法のいずれか１つの一態様において、試料は、対象から心臓移植の１０日以内に得るか、または得たものである。
一側面において、複数のＳＮＶ標的を決定する方法であって、ａ）個体の集団における複数の高度にヘテロ接合性のＳＮＶを同定すること、ｂ）各ＳＮＶにわたる１つ以上のプライマーを設計すること、ｃ）十分に特異的なプライマーを選択すること、ｄ）プライマーの多重化能力を、例えば共通の融解温度で、および／または共通の溶液中で評価すること、およびｅ）プライマーまたはそのサブセットで均一に増幅された配列を同定すること、を含む、前記方法が提供される。本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、選択されたプライマーの融解温度および／またはＧＣ％を算出することを含む。本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、中程度範囲の配列についてフィルタリングすることを含む。

本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、ステップａ）はさらに、Hardy-Weinbergのｐ＞０．２５のＳＮＶを選択すること、および／または困難領域に関連するＳＮＶを除外すること、を含む。本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、困難領域は、症候性領域および／または低複雑性領域である。
提供される方法のいずれか１つの一態様において、ステップｂ）の１つ以上のプライマーは、７０ｂｐウィンドウにわたり、および／または１つ以上のプライマーは、１６〜２６ｂｐの長さ、例えば２０〜２６ｂｐの長さである。
提供される方法のいずれか１つの一態様において、ステップｃ）の十分に特異的なプライマーは、ＢＬＡＳＴ分析によって同定される。提供される方法のいずれか１つの一態様において、ＢＬＡＳＴ分析は、ＧＣＲｈ３７に対する。

提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法は、反復遺伝アルゴリズムおよび／または模擬アニーリングを行うことを含むか、またはこれをさらに含む。
提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、同定された各ＳＮＶ標的について少なくとも１つのプライマー対を得ることを含み、ここで、少なくとも１つのプライマー対は、ＳＮＶ標的の１つの配列（例えばアレル）に対して３’ミスマッチ（例えば、末端から２番目）を、しかしＳＮＶ標的の別の配列（例えばアレル）に対しては３’二重ミスマッチを含み、かつＳＮＶ標的の１つの配列（例えばアレル）を特異的に増幅する。
提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、同定された各ＳＮＶ標的についての別のプライマー対を得ることを含み、ここで別のプライマー対は、ＳＮＶ標的の別の配列（例えばアレル）を特異的に増幅する。

提供される方法のいずれか１つの一態様において、ここで別のプライマー対は、ＳＮＶ標的の別の配列（例えばアレル）に対して３’ミスマッチ（例えば、末端から２番目）を、しかしＳＮＶ標的の１つの配列（例えばアレル）に対しては３’二重ミスマッチを含む。
提供される方法のいずれか１つの一態様において、少なくとも４５、４８、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５または９０個またはそれ以上の、ＳＮＶ標的が存在する。提供される方法のいずれか１つの一態様において、少なくとも９０、９５個またはそれ以上のＳＮＶ標的が存在する。提供される方法のいずれか１つの一態様において、１０５または１００個未満のＳＮＶ標的が存在する。
提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、少なくとも１つのプライマー対を、各ＳＮＶ標的に対して提供することを含む。

一側面において、非天然核酸の遺伝子型を推定する方法であって、複数のＳＮＶ標的のそれぞれについて、非天然核酸レベル、例えば情報提供的な非天然核酸レベルを得ること、および、各レベルを、例えば最大化ステップを用いて、少なくとも２つの分布の１つに割り当てること、そのうちの１つは完全情報提供的レベル用であり、もう１つは半情報提供的レベル用である、を含む前記方法が提供される。提供される方法のいずれか１つの一態様において、得られたレベルの情報提供性（informativity）がまだ知られていない場合、少なくとも２つの分布は３つの分布であり、そのうちの１つは完全情報提供的レベル用であり、別のものは半情報提供的レベル用であり、最後のものは非情報提供的またはバックグラウンドのレベル用である。一態様において、情報提供的な非天然核酸レベルが複数のＳＮＶ標的のそれぞれについて得られる場合、各レベルは、最大化ステップなどを用いて、完全情報提供的または半情報提供的のいずれかとして割り当てられる。
提供される方法のいずれか１つの一態様において、情報提供的な非天然核酸レベルは、天然核酸であると決定されたレベルおよび／またはコールなしもしくは誤ったコールを表すレベルを除去することにより、得られる。

提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、コールなしまたは誤ったコールを表すレベルを除去することを含む。
提供される方法のいずれか１つの一態様において、レベルは、次世代シーケンシングなどのシーケンシングによって、例えば対象からの試料について得られる。
提供される方法のいずれか１つの一態様において、レベルは、ＰＣＲ定量アッセイなどの、増幅に基づく定量アッセイから得られる。提供される方法のいずれか１つの一態様において、レベルは、提供される方法のいずれか１つから得られる。本方法のいずれか１つの一態様において、レベルは、複数のＳＮＶ標的のそれぞれについて、ＰＣＲ定量アッセイなどの増幅に基づく定量アッセイを行うことにより得られる。提供される方法のいずれか１つの一態様において、レベルは、本明細書で提供される方法のいずれか１つを行うことにより得られる。提供される方法のいずれか１つの一態様において、レベルは、本明細書で提供されるプライマーの組成物のいずれか１つを用いて、例えばＰＣＴ定量アッセイなどの定量アッセイを行うことにより、得られる。

提供される方法のいずれか１つの一態様において、ＰＣＲ定量アッセイなどの増幅に基づく定量アッセイは、複数のＳＮＶ標的のそれぞれについて少なくとも２つのプライマー対を用いて実施され、ここで各プライマー対はフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、少なくとも２つのプライマー対の１つは、ＳＮＶ標的の１つの配列（例えばアレル）に対して３’（末端から２番目）ミスマッチを、しかしＳＮＶ標的の別の配列（例えばアレル）に対しては３’二重ミスマッチを含み、かつＳＮＶ標的の１つの配列（例えばアレル）を特異的に増幅し、および、少なくとも２つのプライマー対のもう１つは、ＳＮＶ標的の別の配列（例えばアレル）を特異的に増幅する。
提供される方法のいずれか１つの一態様において、少なくとも２つのプライマー対のもう１つプライマー対もまた、ＳＮＶ標的の別の配列（例えばアレル）に対して３’（例えば、末端から２番目）ミスマッチを、しかしＳＮＶ標的の１つの配列（例えばアレル）に対しては３’二重ミスマッチを含み、かつＳＮＶ標的の別の配列（例えばアレル）を特異的に増幅する。

提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、割り当てられたレベルを提供することを含む。提供される方法のいずれか１つの一態様において、割り当てられたレベルは、レポートで提供される。
提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、非天然核酸の量を、レベルの割り当てに基づいて得ることを含む。
提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、非天然核酸の量を、レベルの割り当てに基づき提供することを含む。提供される方法のいずれか１つの一態様において、レベルの割り当てに基づく非天然核酸の量は、レポートで提供される。

一側面において、本明細書で提供される方法のいずれか１つに従った割り当てに基づいて、割り当てられたレベルのセットまたはその組み合わせまたは非核酸の量のいずれか１つを得るための、および、対象におけるリスクを、レベルまたは量に基づき評価するための方法が提供される。
提供される方法のいずれか１つの一態様において、処置または処置に関する情報が、評価されたリスクに基づいて対象に与えられる。提供される方法のいずれか１つの一態様において、処置は、抗拒絶療法である。
提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、対象における非天然核酸の量を、経時的にモニタリングすること、またはモニタリングを示唆すること、を含む。提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、対象における非天然核酸の量を、その後の時点で決定することを含む。提供される方法のいずれか１つの一態様において、量は、本明細書で提供される方法のいずれか１つを用いて決定される。

一側面において、少なくとも１つのプライマー対を複数のＳＮＶ標的のそれぞれについて含む組成物またはキットであって、ここで各プライマー対は、ＳＮＶ標的の１つの配列（例えばアレル）に対して３’ミスマッチ（例えば、末端から２番目）を、しかしＳＮＶ標的の別の配列（例えばアレル）に対しては３’二重ミスマッチを含み、かつＳＮＶ標的の１つの配列（例えばアレル）を特異的に増幅する、前記組成物またはキットが提供される。提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、少なくとも１つの別のプライマー対を複数のＳＮＶ標的のそれぞれについてさらに含み、ここで少なくとも１つの別のプライマー対は、ＳＮＶ標的の別の配列（例えばアレル）を特異的に増幅する。提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、少なくとも１つの別のプライマー対は、ＳＮＶ標的の別の配列（例えばアレル）に対して３’ミスマッチ（例えば、末端から２番目）を、しかしＳＮＶ標的の別の配列（例えばアレル）に対しては３’二重ミスマッチを含み、かつＳＮＶ標的の別の配列（例えばアレル）を特異的に増幅する。

提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、各プライマー対は、ＳＮＶ標的の１つの配列（例えばアレル）に対して３’ミスマッチ（例えば、末端から２番目のもの）を、しかしＳＮＶ標的の別の配列（例えばアレル）に対しては３’二重ミスマッチを含み、ＳＮＶ標的の１つのアレルを特異的に増幅する。
提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、ＳＮＶ標的あたり、少なくとも１つのプライマー対、少なくとも２つのプライマー対、少なくとも３つのプライマー対、少なくとも４つのプライマー対、またはそれ以上が存在する。本明細書で提供される組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、少なくとも２つのプライマー対が、各ＳＮＶ標的に対して存在する。提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、少なくとも４５、４８、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５または９０個またはそれ以上の、ＳＮＶ標的が存在する。提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、少なくとも９０、９５個またはそれ以上の標的が存在する。提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、１０５または１００個未満のＳＮＶ標的が存在する。

提供される組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、組成物またはキットは、緩衝液を含む。
提供される組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、組成物またはキットは、ポリメラーゼを含む。
提供される組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、組成物またはキットは、プローブを含む。提供される組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、プローブは、蛍光プローブである。

提供される組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、組成物またはキットは、使用説明書を含む。提供される組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、使用説明書は、試料中の非天然核酸の量を決定するための説明書である。本明細書で提供される組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、使用説明書は、本明細書で提供される方法のいずれか１つを実施するための説明書を含む。
一態様において、本明細書で提供される方法の態様のいずれか１つは、提供される組成物、キットまたはレポートのいずれか１つの態様であることができる。一態様において、本明細書で提供される組成物、キットまたはレポートの態様のいずれか１つは、本明細書で提供される方法のいずれか１つの態様であることができる。

添付の図面は、一定の縮尺で描くことを意図していない。これらの図は例示的なものに過ぎず、開示を可能にするためには必要とされない。
図１は、ＭＯＭＡプライマーの例示的で非限定的な図を提供する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイにおいて、ＳＮＶ Ａを含有する配列の伸長が起こることが予想され、これによりＳＮＶ Ａの検出が行われ、これは続いて定量され得る。しかしＳＮＶ Ｂの伸長は、二重ミスマッチのために起こることは予想されない。 図２は、例示的な増幅トレースを提供する。 図３は、概念の証明を実証する再構成実験からの結果を示す。

図４は、移植レシピエント患者からの血漿試料で測定した無細胞ＤＮＡのパーセントを提供する。すべてのデータは、生検を受けた患者からのものである。濃い点は拒絶反応を意味する。 図５は、血漿試料についての本明細書に提供される方法からのさらなるデータを提供する。移植手術後、ドナーのパーセントレベルは低下する。 図６は、期待値最大化を用いた、未知の場合の非天然ドナー遺伝子型の予測を示す。黒＝バックグラウンド、緑＝半情報提供的、赤＝完全情報提供的、破線＝最初の反復、実線＝２回目の反復、最終コール＝１０％。 図７は、期待値最大化を用いた、未知の場合の非天然ドナー遺伝子型の予測を示す。黒＝バックグラウンド、緑＝半情報提供的、赤＝完全情報提供的、最終コール＝５％。

図８は、未知の場合の非天然ドナー遺伝子型を予測する能力を実証する、再構成実験データを提供する。データは、９５個のＳＮＶ標的のセットを用いて生成されている。 図９は、１０４個のＭＯＭＡ標的の平均バックグラウンドノイズを提供する。 図１０は、ＭＯＭＡを使用する方法のバックグラウンドノイズのさらなる例を提供する。 図１１〜３０は、いくつかの態様における、ミスマッチプライマーと同じ鎖上にプローブを有する利点を示す。

発明の詳細な説明
本開示の側面は、試料中の非天然核酸の高感度の検出および／または定量化のための方法に関する。非天然核酸、例えば非天然ＤＮＡは、臓器移植後を含む様々な状況において個体に存在し得る。本開示は、対象から得た試料中の、非天然無細胞ＤＮＡ濃度などの非天然核酸を検出、分析、および／または定量するための技術を提供する。

本明細書で使用する場合、「非天然核酸」は、別の供給源に由来するか、または対象において見出される核酸の突然変異型である（特定の配列に関して）、核酸を指す。したがって「天然核酸」は、別の供給源からではなく、対象において見出される核酸の突然変異型ではない（特定の配列に関して）核酸である。いくつかの態様において、非天然核酸は、非天然無細胞ＤＮＡである。「無細胞ＤＮＡ」（またはｃｆ−ＤＮＡ）は、細胞の外、例えば対象の血液、血漿、血清、尿などに存在するＤＮＡである。いかなる特定の理論またはメカニズムにも束縛されることを望まないが、ｃｆ−ＤＮＡは、例えば細胞のアポトーシスを介して、細胞から放出されると考えられている。非天然核酸の例は、移植レシピエント対象における、移植片のドナーからの核酸である。本明細書で使用する場合、本明細書で提供される組成物および方法は、非天然供給源からの無細胞ＤＮＡ、例えば、ドナー特異的ＤＮＡまたはドナー特異的無細胞ＤＮＡ（例えば、ドナー特異的ｃｆＤＮＡ）の量を決定するために、使用することができる。

本明細書において提供されるのは、配列同一性の違いを有する核酸を測定するために使用することができる、方法および組成物である。いくつかの態様において、配列同一性の違いは、一塩基バリアント（ＳＮＶ）である；しかしながら、ＳＮＶが本明細書で言及される場合はいつでも、天然核酸と非天然核酸の間の配列同一性のいかなる違いも、適用可能であることが意図される。したがって、本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つは、配列同一性に違いがある場合に、天然核酸ｖｓ非天然核酸に適用することができる。本明細書で使用する場合、「一塩基バリアント」は、単一ヌクレオチド（single nucleotide）において配列可変性がその中に存在する、核酸配列を指す。いくつかの態様において、ＳＮＶは両アレル（biallelic）ＳＮＶであり、ＳＮＶについて１つのメジャーなアレルおよび１つのマイナーなアレルが存在することを意味する。いくつかの態様において、ＳＮＶは、集団内などに２つより多くのアレルを有し得る。いくつかの態様において、ＳＮＶは配列の突然変異バージョンであり、非天然核酸は突然変異バージョンを指し、一方天然核酸は非突然変異バージョン（野生型など）を指す。かかるＳＮＶはこのように対象内で起こりうる突然変異であることができ、これは疾患または状態に関連し得る。一般に「マイナーなアレル」は、遺伝子座について、集団などにおいて頻度が少ないアレルを指し、一方「メジャーなアレル」は、集団などにおいてより頻度が高いアレルを指す。本明細書で提供される方法および組成物は、核酸の混合物内のメジャーおよびマイナーなアレルの核酸を、いくつかの態様において低レベルで存在する場合であっても、定量することができる。

ＳＮＶなどの、配列同一性に可変性が存在する核酸配列は、一般に「標的」と呼ばれる。本明細書で使用する場合、「ＳＮＶ標的」は、個体の集団などにおける、または対象において起こり得て疾患または状態に関連し得る突然変異の結果として生じる、単一ヌクレオチドにおいて配列可変性が存在するところの核酸配列を指す。ＳＮＶ標的は１つより多くのアレルを有し、好ましい態様において、ＳＮＶ標的は両アレルである。本明細書で提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、ＳＮＶ標的は、ＳＮＰ標的である。これらの態様のいくつかにおいて、ＳＮＰ標的は両アレルである。非天然核酸は、極めて低いレベルであっても、ＰＣＲアッセイなどの増幅に基づく定量アッセイをＳＮＶ標的に特異的なプライマーを用いて実施することにより、定量可能であることが発見されている。いくつかの態様において、非天然核酸の量は、定量的ＰＣＲアッセイなどの増幅に基づく定量アッセイを、複数のＳＮＶ標的についてのプライマーを用いて試みることにより、決定される。「複数のＳＮＶ標的」は、各標的に対して少なくとも２つのアレルが存在する、１より多くのＳＮＶ標的を指す。好ましくは、いくつかの態様において、各ＳＮＶ標的は両アレルであると予想され、ＳＮＶ標的の各アレルに特異的なプライマー対を使用して、各アレルの核酸を特異的に増幅し、ここで増幅は、特異的アレルの核酸が試料中に存在する場合に起こる。いくつかの態様において、複数のＳＮＶ標的は、対象内の複数の配列であって、突然変異することができ、そのように突然変異した場合に、対象の疾患または状態を示すことができるものである。本明細書で使用する場合、１つのアレルは標的配列の突然変異型であってよく、別のアレルは配列の非突然変異型である。

いくつかの態様において、定量的ＰＣＲなどの増幅に基づく定量アッセイは、プライマー対を用いて、少なくとも４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５個またはそれ以上の標的に対して、実施される。いくつかの態様において、定量アッセイは、プライマー対を用いて、１０５、１０４、１０３、１０２、１０１、１００、９９、９８、または９７個未満の標的に対して、実施される。いくつかの態様において、十分に情報提供的な結果が、プライマー対を用いて、４０〜１０５、４５〜１０５、５０〜１０５、５５〜１０５、６０〜１０５、６５〜１０５、７０〜１０５、７５〜１０５、８０〜１０５、８５〜１０５、９０〜１０５、９０〜１０４、９０〜１０３、９０〜１０２、９０〜１０１、９０〜１００、９０〜９９、９１〜９９、９２〜９９、９３、９９、９４〜９９、９５〜９９、または９０〜９５個の間の標的に対して、実施される。いくつかの態様において、十分に情報提供的な結果が、プライマー対を用いて、４０〜９９、４５〜９９、５０〜９９、５５〜９９、６０〜９９、６５〜９９、７０〜９９、７５〜９９、８０〜９９、８５〜９９、９０〜９９、９０〜９９、９０〜９８、９０〜９７または９０〜９６個の間の標的に対して、実施される。

本明細書で提供される「情報提供的な結果」とは、試料中の非天然核酸または天然核酸のレベルを定量するために使用することができる結果である。一般に情報提供的な結果は、天然核酸が特定のＳＮＶ標的についてヘテロ接合性である場合の結果および、「コールなし」または誤ったコール結果を除外する。情報提供的な結果からアレルのパーセントを、標準曲線を使用し、提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において算出することができる。提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、非天然核酸および／または天然核酸の量は、それぞれ、非天然核酸および／または天然核酸の情報提供的な結果にわたる平均値を表す。

非天然核酸の量（例えば、比率またはパーセンテージ）は、天然および／または非天然核酸のメジャーおよびマイナーなアレルの量ならびに遺伝子型を用いて、決定することができる。例えば、天然核酸が特定のＳＮＶ標的についてヘテロ接合性である場合の結果は、天然の遺伝子型の知識を用いて除外することができる。さらに、結果を、非天然の遺伝子型の知識を用いて評価することもできる。本明細書で提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、天然核酸の遺伝子型は既知であるが非天然核酸の遺伝子型は知られていない場合、方法は、可能性のある非天然の遺伝子型を予測すること、または非天然の遺伝子型をシーケンシングによって決定すること、のステップを含む。かかる方法のさらなる詳細は、本明細書の他の箇所、例えば実施例などに提供される。本明細書に提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、アレルは、対象の天然核酸および／または対象に天然にはない核酸（例えば、それぞれレシピエントおよびドナーのもの）の以前の遺伝子型決定に基づき、決定することができる。遺伝子型決定のための方法は、当技術分野において知られている。かかる方法には、次世代、ハイブリダイゼーション、マイクロアレイなどのシーケンシング、他の分離技術またはＰＣＲアッセイを含む。本明細書で提供される方法のいずれか１つは、かかる遺伝子型を得るステップを含むことができる。

本明細書で使用する「得ること」とは、それによってそれぞれの情報または材料を獲得できる任意の方法を指す。したがってそれぞれの情報は、天然の遺伝子型を決定することなどの、実験方法によって獲得することができる。いくつかの態様において、それぞれの材料を、様々な実験的または実験室的方法で作成し、設計することができる。それぞれの情報または材料は、レポートまたは資料などにおいて情報を与えられまたは提供されることによっても、獲得することができる。材料は、いくつかの態様において、商業的手段によって（すなわち、購入によって）与えられるかまたは提供されてもよい。

レポートは、口頭、書面（またはハードコピー）または電子形式において、例えば視覚化または表示することができる形式であってよい。いくつかの態様において、本明細書で提供される各アッセイについての「生の」結果がレポートで提供され、このレポートから、試料中の非天然核酸の量を決定するためのさらなるステップを実施することができる。これらのさらなるステップは、以下のうちのいずれか１つ以上を含むことができる：情報提供的な結果を選択すること、天然および／または非天然の遺伝子型を得ること、天然および非天然核酸に関する情報提供的な結果についてのアレルパーセントを算出すること、アレルパーセントを平均化すること、など。他の態様において、レポートは、試料中の非天然核酸の量を提供する。その量から、いくつかの態様において臨床医は、対象に対する処置の必要性または非天然核酸の量をモニターする必要性を、評価することができる。したがって、本明細書で提供される方法のいずれか１つにおいて、方法は、対象中の非核酸の量を別の時点で評価することを含むことができる。かかる評価は、本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つを用いて実施することができる。

本明細書で提供される定量アッセイは、多重／最適化ミスマッチ増幅（ＭＯＭＡ）を利用する。かかるアッセイで使用するためのプライマーを得ることができ、本明細書で提供される方法のいずれか１つは、定量アッセイを実施するための１つ以上のプライマー対を得るステップを含むことができる。一般にプライマーは、核酸の量を定量する際にそれらの使用を容易にする、ユニークな特性を有する。例えば、プライマー対のフォワードプライマーは、３’ヌクレオチド（例えば、末端から２番目の３’ヌクレオチド）でミスマッチであり得る。提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、このミスマッチは３’ヌクレオチドにおいてであるが、ＳＮＶ位置に隣接している。提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、ＳＮＶ位置に対するプライマーのミスマッチ位置は、図１に示される通りである。一般に、かかるフォワードプライマーは３’ミスマッチを有していても、増幅反応において増幅生成物（適切なリバースプライマーと併せて）を生成し、こうしてそれぞれのＳＮＶを有する核酸の増幅およびその結果としての検出を可能にする。特定のＳＮＶが存在せず、ＳＮＶ標的の別のアレルに対して二重ミスマッチがある場合、増幅産物は一般に産生されない。好ましくは、本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、各ＳＮＶ標的について、各アレルの特異的増幅が、他のアレルの増幅なしで起こり得るプライマー対が得られる。「特異的増幅」とは、別の核酸の実質的な増幅なしの、またはバックグラウンドもしくはノイズを超える別の核酸配列の増幅なしの、標的の特異的アレルの増幅をいう。いくつかの態様において、特異的な増幅は、特異的なアレルの増幅のみをもたらす。

本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、両アレルである各ＳＮＶ標的について、２つのプライマー対があり、それぞれが２個のアレルのうちの１つに特異的であり、したがって、それが増幅するアレルに関しては１つのミスマッチを有し、増幅しないアレルに関して二重ミスマッチを有する（ただしこれらのアレルの核酸が存在する場合に限る）。本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、ミスマッチプライマーはフォワードプライマーである。本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、各ＳＮＶ標的についての２つのプライマー対のリバースプライマーは、同一である。

これらの概念は、本明細書で提供される組成物および方法のいずれか１つでのプライマー対の設計において使用することができる。フォワードおよびリバースプライマーは、鋳型の特定の遺伝子座の断片を増幅するために、反対の鎖（例えば、センス鎖およびアンチセンス鎖）に結合するように設計されることが理解されるべきである。プライマー対のフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、任意の適切なサイズの核酸断片を増幅するように設計され得て、例えば本開示によるＳＮＶ標的のアレルの存在を検出する。本明細書で提供される方法のいずれか１つは、本明細書に記載の１つ以上のプライマー対を得るための１つ以上のステップを含むことができる。

本明細書に記載のプライマー対は、多重ＰＣＲアッセイに使用され得ることが理解されるべきである。したがって、いくつかの態様において、プライマー対は、ＰＣＲ反応において他のプライマー対と適合するように設計される。例えばプライマー対は、ＰＣＲ反応における他のプライマー対の少なくとも２個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個等と適合するように設計されてもよい。本明細書で使用する場合、ＰＣＲ反応におけるプライマー対は、それらの標的を同じＰＣＲ反応において増幅することができる場合に、「適合的」である。いくつかの態様においてプライマー対が適合的であるのは、同じＰＣＲ反応に多重化されている場合に、それらの標的ＤＮＡの増幅が、１％以下、２％以下、５％以下、１０％以下、１５％以下、２０％以下、２５％以下、３０％以下、３５％以下、４０％以下、４５％以下、５０％以下、または６０％以下阻害されている場合である。プライマー対は多くの理由で適合的でない可能性があり、その理由としては、限定はされないが、プライマー二量体の形成、および他のプライマー対と干渉し得る、鋳型上の標的外部位への結合を含む。したがって、本開示のプライマー対は、他のプライマー対との二量体の形成を妨げるか、または標的外結合部位の数を制限するように、設計され得る。多重ＰＣＲアッセイにおいて使用するためのプライマーを設計するための例示的な方法は、当技術分野で知られており、本明細書に別途記載される。

いくつかの態様において、本明細書に記載のプライマー対は、非天然核酸の量を定量するために多重ＰＣＲアッセイにおいて使用される。したがって、本明細書に提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、プライマー対は、潜在的に非二倍体であるゲノム領域を検出するように設計されたプライマー対を除いて、二倍体であるゲノム領域を検出するように設計される。本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、本開示に従って使用されるプライマー対は、反復マスク領域、既知コピー数可変領域、または非二倍体であり得る他のゲノム領域を検出しない。

本明細書で提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、増幅に基づく定量アッセイは、それによって核酸が増幅されて、核酸の量を決定することができる、任意の定量アッセイである。かかるアッセイには、核酸を本明細書に記載のＭＯＭＡプライマーで増幅して定量するものが含まれる。かかるアッセイには、単純な増幅および検出、ハイブリダイゼーション技術、電気泳動などの分離技術、次世代シーケンシングなどが含まれる。
本明細書で提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、定量アッセイは定量的ＰＣＲアッセイである。定量的ＰＣＲには、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、Taqmanなどが含まれる。本明細書で提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、ＰＣＲは「リアルタイムＰＣＲ」である。かかるＰＣＲは、増幅プロセスがまだ進行している間に反応動態を液相でモニタリングすることができる、ＰＣＲ反応を指す。従来のＰＣＲとは対照的に、リアルタイムＰＣＲは、増幅反応においてリアルタイムで同時に検出または定量する能力を提供する。特定の色素からの蛍光強度の増加に基づき、標的の濃度を、増幅がそのプラトーに達する前であっても決定することができる。

複数プローブの使用は、単一プローブリアルタイムＰＣＲの能力を拡大することができる。多重リアルタイムＰＣＲは、各アッセイが固有の蛍光色素で標識された特異的プローブを有し、各アッセイについて異なる観察色をもたらす、複数のプローブに基づくアッセイを使用する。リアルタイムＰＣＲ装置は、異なる色素から生成される蛍光を区別することができる。異なるプローブは、それぞれ固有の発光スペクトルを有する異なる色素で標識することができる。スペクトル信号は、離散光学系で収集され、一連のフィルタセットを通過し、検出器のアレイによって収集される。色素間のスペクトルの重なりの補正は、純粋な色素スペクトルを用いて行列代数により実験データをデコンボリューションすることにより、実施することができる。

プローブは、本開示の方法、特に定量化ステップを含む方法のために有用であり得る。本明細書で提供される方法のいずれか１つは、ＰＣＲアッセイの実施におけるプローブの使用を含むことができ、一方で本明細書で提供されるキットの組成物のいずれか１つは、１つ以上のプローブを含むことができる。重要なことに、本明細書に提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、ＰＣＲ定量アッセイの１つ以上または全てにおけるプローブは、ミスマッチプライマーと同じ鎖上にあり、反対鎖上ではない。このようにプローブをＰＣＲ反応に組み込む際に、さらなるアレル特異的識別が提供できることが見出されている。これは、図１１〜３０に示されている。

一例として、TaqMan（登録商標）プローブは、５’末端にＦＡＭ（商標）またはＶＩＣ（登録商標）色素標識を有し、３’末端にマイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ）非蛍光クエンチャー（ＮＦＱ）を有する、加水分解プローブである。TaqMan（登録商標）プローブの原理は、一般に、相補的なプローブ結合領域へのハイブリダイゼーション中に二重標識TaqMan（登録商標）プローブを切断するための、Taq（登録商標）ポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性、およびフルオロフォアに基づく検出に依存する。TaqMan（登録商標）プローブは、定量的ＰＣＲ反応の指数関数的段階の間に、定量的測定における検出の特異性を高めることができる。
ＰＣＲシステムは一般に、蛍光色素またはレポーターの検出および定量に依存し、そのシグナルは反応におけるＰＣＲ産物の量に正比例して増加する。例えば、最も簡単で最も経済的な形式においては、そのレポーターは、二本鎖ＤＮＡ特異的色素SYBR（登録商標）Green（Molecular Probes）であることができる。SYBR Greenは、二本鎖ＤＮＡのマイナーグルーブに結合する色素である。SYBR Green色素が二本鎖ＤＮＡに結合すると、蛍光強度が増加する。より多くの二本鎖アンプリコンが産生されると、SYBR Green色素シグナルが増加する。

本明細書で提供される方法のいずれか１つにおいて、ＰＣＲはデジタルＰＣＲであってもよい。デジタルＰＣＲは、希釈された増幅産物を複数の個別試験部位に分割して、ほとんどの個別試験部位が、ゼロまたは１つの増幅産物を含むようにすることを含む。次いで増幅産物を分析して、試料中の選択された関心対象のゲノム領域の頻度の表示を提供する。個別試験部位ごとに１つの増幅産物を分析すると、各個別試験部位について２値の「イエスまたはノー」の結果が得られ、選択された関心のあるゲノム領域が定量化され、選択された関心のあるゲノム領域の相互の頻度が決定される。ある側面において、これに加えて、または代替として、複数の分析を、所定の領域からのゲノム領域に対応する増幅産物を使用して行うことができる。２つ以上の所定の領域の分析結果を用いて、増幅産物の数の相対的な頻度を定量し、決定することができる。２つ以上の所定の領域を使用して試料中の頻度を決定することにより、単一の検出アッセイによっては容易には明らかにされない、増幅効率の変動などを介したバイアスの可能性が低減される。デジタルＰＣＲを使用してＤＮＡを定量する方法は、当技術分野で知られており、例えば米国特許公開番号US20140242582に記載されている。

本明細書で提供されるＰＣＲ条件は、本明細書に記載の方法のいずれか１つに従って機能するように、改変または最適化できることが、理解されるべきである。典型的には、ＰＣＲ条件は、使用する酵素、標的鋳型、および／またはプライマーに基づく。いくつかの態様において、ＰＣＲ反応の１つ以上の成分が改変または最適化される。最適化され得るＰＣＲ反応の成分の非限定的な例としては、鋳型ＤＮＡ、プライマー（例えば、フォワードプライマーおよびリバースプライマー）、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、ポリメラーゼ、マグネシウム濃度、緩衝液、プローブ（例えば、リアルタイムＰＣＲを実施する場合）、緩衝液、および反応容積を含む。

前述の態様のいずれにおいても、任意のＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡヌクレオチドをＤＮＡ鎖に重合させる酵素）を利用することができ、これには熱安定性ポリメラーゼを含む。適切なポリメラーゼ酵素は当業者に知られており、以下を含む：大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウクラスのポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ventポリメラーゼ、バクテリオファージ２９、REDTaq（商標）ゲノムＤＮＡポリメラーゼ、またはシークエナーゼ。例示的なポリメラーゼとしては、限定はされないが、以下を含む：Bacillus stearothermophilus ｐｏｌ Ｉ、Thermus aquaticus（Ｔａｑ）ｐｏｌ Ｉ、Pyrccoccus furiosus（Ｐｆｕ）、Pyrococcus woesei（Ｐｗｏ）、Thermus flavus（Ｔｆｌ）、Thermus thermophilus（Ｔｔｈ）、Thermus litoris(Ｔｌｉ）およびThermotoga maritime（Ｔｍａ）。これらの酵素、これらの酵素の改変型、および酵素の組み合わせは、Roche、Invitrogen、Qiagen、StratageneおよびApplied Biosystemsを含む販売元から市販されている。代表的な酵素としては、以下を含む：PHUSION（登録商標）（New England Biolabs, Ipswich, MA）、Hot MasterTaq（登録商標）（Eppendorf）、PHUSION（登録商標）Mpx（Finnzymes）、PyroStart（登録商標）（Fermentas）、KOD（EMD Biosciences）、Z-Taq（TAKARA）、およびCS3AC/LA（KlenTaq, University City, MO）。

塩および緩衝液としては、当業者によく知られているものが挙げられ、これには、それぞれＭｇＣｌ_２およびＴｒｉｓ−ＨＣｌおよびＫＣｌを含むものが含まれる。典型的には、１．５〜２．０ｎＭのマグネシウムがＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼに最適であるが、しかし最適なマグネシウム濃度は、鋳型、緩衝液、ＤＮＡおよびｄＮＴＰに依存し得、これはそれぞれがマグネシウムをキレート化する可能性があるからである。マグネシウム［Ｍｇ２＋］の濃度が低すぎると、ＰＣＲ産物が形成されない場合がある。マグネシウム［Ｍｇ２＋］の濃度が高すぎると、望ましくないＰＣＲ産物が見られる場合がある。いくつかの態様において、マグネシウム濃度は、０．１ｍＭまたは０．５ｍＭ増分で約５ｍＭまでのマグネシウム濃度を補充することにより、最適化することができる。

本開示に従って使用される緩衝液は、添加剤、例えば界面活性剤、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など、ならびに当業者によく知られた他のものを含んでもよい。ヌクレオチドは一般に、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、例えばデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）およびデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）などであり、これらは、標的核酸の増幅についての反応適切量に添加される。いくつかの態様において、１つ以上のｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）の濃度は、約１０μＭ〜約５００μＭであり、これはＰＣＲ反応で生成されるＰＣＲ産物の長さおよび数に依存し得る。

いくつかの態様において、本開示に従って使用されるプライマーは、改変される。プライマーは、それらの意図された標的（例えば、特定のＳＮＶ）のみに、高い特異性で結合するように設計されてよく、さらなるヌクレオチド配列の差異に対して高い識別を示す。プライマーは、特定の算出融解温度（Ｔｍ）、例えば、４６℃〜６４℃の範囲の融解温度を有するように、改変することができる。所望の融解温度を有するプライマーを設計するために、プライマーの長さを変えることができ、および／またはプライマーのＧＣ含量を変えることができる。典型的には、ＧＣ含量および／またはプライマーの長さを増加させることにより、プライマーのＴｍが増加する。逆に、ＧＣ含量および／またはプライマーの長さを減少させると、プライマーのＴｍが典型的に低下する。特定のＳＮＶ（または配列非同一性の他の形態）を高感度で別のものよりも検出するために、標的に対して意図的にミスマッチ（単数または複数）を組み込むことにより、プライマーを改変できることが理解されるべきである。したがってプライマーは、それらが結合するように設計された特定の配列（例えば、特定のＳＮＶ）に関して、１つ以上のミスマッチを組み込むことにより、改変され得る。

いくつかの態様において、ＰＣＲ反応において使用されるプライマーの濃度は、改変または最適化されてよい。いくつかの態様において、ＰＣＲ反応におけるプライマー（例えば、フォワードまたはリバースプライマー）の濃度は、例えば、約０．０５μＭ〜約１μＭであり得る。特定の態様において、各プライマーの濃度は、約１ｎＭ〜約１μＭである。本開示に従ったプライマーは、ＰＣＲ反応において同一または異なる濃度で使用され得ることが理解されるべきである。例えば、プライマー対のフォワードプライマーを０．５μＭの濃度で使用し、プライマー対のリバースプライマーを０．１μＭで使用することができる。プライマーの濃度は、限定はされないが、プライマー長、ＧＣ含量、純度、標的ＤＮＡとのミスマッチ、またはプライマー二量体を形成する可能性を含む因子に基づき得る。
いくつかの態様において、ＰＣＲ反応の熱プロファイルは、改変または最適化される。ＰＣＲ熱プロファイル改変の非限定的な例には、変性温度および持続時間、アニーリング温度および持続時間および伸長時間が含まれる。

ＰＣＲ反応溶液の温度は、所定のサイクル数の間、変性状態、アニーリング状態、および伸長状態の間で順次循環させることができる。実際の時間および温度は、酵素、プライマーおよび標的に依存性であり得る。任意の所与の反応について、変性状態は、ある態様において約７０℃〜約１００℃の範囲であり得る。さらに、アニーリング温度および時間は、標的核酸内の特定の座位に結合するプライマーの特異性および効率に影響を及ぼし得、特定のＰＣＲ反応にとって重要であり得る。任意の所与の反応について、アニーリング状態は、ある態様において約２０℃〜約７５℃の範囲であり得る。いくつかの態様において、アニーリング状態は、約４６℃〜６４℃であり得る。ある態様において、アニーリング状態は、室温（例えば、約２０℃〜約２５℃）で行うことができる。

伸長温度および時間もまた、アレル産物の収量に影響し得る。所与の酵素に対して、伸長状態は、ある態様において約６０℃〜約７５℃の範囲であることができる。
本明細書で提供される定量アッセイからのアレルの量の定量化は、本明細書で提供されるように、または当業者に明らかな他のようにして、実施することができる。一例として、増幅トレースを、一貫性および堅牢な定量化のために分析する。内部標準を使用して、Cycle閾値を入力核酸（例えば、ＤＮＡ）の量に翻訳することができる。アレルの量は、性能（performant）アッセイの平均として算出することができ、遺伝子型について調整することができる。広範囲の効果的な増幅は、低濃度核酸の成功した検出を示す。ドナーパーセントは、全ての性能アッセイのトリミングされた平均として算出することができる（例えば、ナノグラム非天然アレル対ナノグラム天然アレルの比）。量は、遺伝子型についての調整によって決定することができる。

本明細書で提供される方法および組成物は、試料中の、非天然核酸などの低レベルの核酸を検出するために使用できることが見出されている。したがって、本明細書で提供される方法は、比較的まれな核酸の検出が必要とされる試料で使用することができる。いくつかの態様において、本明細書で提供される方法のいずれか１つを試料に用いて、試料中の核酸の１．５％未満である非天然核酸を検出することができる。他の態様において、本明細書に提供される方法のいずれか１つは、試料中の核酸の１．３％、１．２％、１．１％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０５％、０．０３％、または０．０１％未満が非天然であるところの試料に、用いることができる。他の態様において、本明細書に提供される方法のいずれか１つは、試料中の核酸の少なくとも０．００５％、０．０１％、０．０３％または０．０５％が非天然であるところの試料に、用いることができる。本明細書で提供される方法のいずれか１つのさらに他の態様においては、試料中の核酸の少なくとも０．００５％が、ただし１．３％、１．２％、１．１％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０５％、０．０３％、または０．０１％未満が、非天然である。

非天然核酸の量を、低レベルにおいても決定する能力により、本明細書で提供される方法および組成物は、対象、例えば移植レシピエントにおける、リスクを評価するために使用することができる。本明細書で提供される「リスク」とは、対象（移植レシピエントなど）における任意の望ましくない状態の存在または不在、または、例えば移植拒絶反応等のかかる状態の存在または不在の可能性の増加を指す。本明細書で提供される「増加したリスク」とは、対象における任意の望ましくない状態の存在、または、かかる状態の存在の可能性の増加を指す。本明細書で提供される「リスクの減少」とは、対象における任意の望ましくない状態の不在、または、かかる状態の存在の可能性の低下（または不在の可能性の増加）を指す。

一例として、移植片（例えば、心臓移植片）の移植後の拒絶反応の早期検出は、処置を容易にし、臨床転帰を改善することができる。移植拒絶反応は、移植の失敗および死亡率の主な原因であり続け、一般的には、生涯にわたる監視モニタリングを必要とする。免疫抑制療法による移植拒絶反応の処置は、特に拒絶反応が早期に検出された場合に、処置の成果を改善することが示されている。移植拒絶反応は典型的には、カテーテルベースの心内膜生検（ＥＭＢ）を用いてモニタリングされる。しかしこの侵襲的処置は、患者のリスクおよび不快感を伴い、小児患者にとって特に不利になり得る。したがって、本明細書において、移植レシピエントなどの対象の監視のための、感度が高く、特異的で、費用効果が高く、非侵襲的な技術が提供される。かかる技術は、初期段階での移植拒絶反応の検出を可能にすることが見出されている。かかる技術はまた、臓器回復のモニタリングおよび、抗拒絶反応処置などの処置または療法の選択をモニタリングして、患者の回復を改善し、生存率を高めるために使用することもできる。

したがって、提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、対象は移植のレシピエントであり、リスクは移植に関連するリスクである。提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、移植に関連するリスクは、移植拒絶反応のリスク、移植片の解剖学的問題または移植片の損傷である。提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、移植片に対する損傷は、初期または進行中の損傷である。提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、移植に関連するリスクは、急性状態または慢性状態である。提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、急性状態は、細胞拒絶反応または抗体媒介性拒絶反応を含む、移植拒絶反応である。提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、慢性状態は、移植脈管症である。提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、移植に関連するリスクは、損傷の重篤度を示す。

本明細書で使用する場合、「移植（transplant）」とは、レシピエントの損傷または欠損した臓器を交換する目的での、ドナーからレシピエントへの臓器の移動を指す。移植は、１つの臓器または複数の臓器であってもよい。いくつかの態様において、用語「移植片（transplant）」は、移植された１以上の臓器を指し、かかる意味は、この用語が使用される文脈から明らかであろう。移植可能な臓器の例としては、限定はされないが、心臓、腎臓（単数または複数）、腎臓、肝臓、肺（単数または複数）、膵臓、腸などが含まれる。本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つは、本明細書で提供されるいずれか１つ以上の臓器の移植を受けた対象からの試料に、使用されてよい。いくつかの態様において、移植は心臓移植である。

移植のレシピエントにおけるリスクは例えば、非天然ｃｆ−ＤＮＡの量、例えば移植拒絶反応に関連する細胞損傷のバイオマーカーであるドナー特異的無細胞ＤＮＡ（ＤＳ ｃｆ−ＤＮＡ）の量を評価することによって、決定することができる。ＤＳ ｃｆ−ＤＮＡは、移植された臓器からおそらくは剥がれ落ちたＤＮＡを指し、その配列は、移植された臓器を寄付したドナーの遺伝子型に（全体または一部が）適合するものである。本明細書で使用する場合、ＤＳ ｃｆ−ＤＮＡはＤＳ ｃｆ−ＤＮＡ集団における特定の配列を指してもよく、ここでこの配列はレシピエントのｃｆ−ＤＮＡ（例えば、異なる配列を特定のヌクレオチド位置に有している）から区別され、または、ＤＳ ｃｆ−ＤＮＡはＤＳ ｃｆ−ＤＮＡ集団全体を指してもよい。

移植のレシピエントにおけるリスクは、例えば、本明細書に記載されているように、ドナー特異的無細胞ＤＮＡなどの非天然ｃｆ−ＤＮＡの量を、提供される方法のいずれか１つを全無細胞ＤＮＡ量の評価と組み合わせて用いて、例えば血漿中のｎｇ／ｍｌで評価することにより、決定することができる。したがって、本明細書で提供される方法のいずれか１つは、全無細胞ＤＮＡのレベルを、対象においてｎｇ／ｍｌなどで得るステップを含むことができる。かかる方法はさらに、いくつかの態様において、対象における移植に関連するリスクを、対象におけるドナー特異的無細胞ＤＮＡおよび全無細胞ＤＮＡの量の組合せに基づいて、評価することを含む。対象における全無細胞ＤＮＡを決定するための方法は、当技術分野で知られている。本明細書で提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、全無細胞ＤＮＡは、ＲＮａｓｅＰを標的として使用する、TaqmanリアルタイムＰＣＲを用いて決定される。

いくつかの態様において、本明細書で提供される方法のいずれか１つは、非天然核酸の増加および／または天然核酸と比較した非天然核酸の比率またはパーセンテージの増加を、移植拒絶反応などの状態のリスクの増加と相関させることを含むことができる。本明細書で提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、相関させることは、非天然核酸のレベル（例えば、濃度、比率またはパーセンテージ）を閾値と比較して、状態のリスクが増加または低下している対象を同定することを含む。本明細書で提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、閾値と比較して増加した量の非天然核酸を有する対象は、状態のリスクが高いと同定される。本明細書に提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、閾値と比較して非天然核酸の量が減少または同程度の対象は、状態のリスクが低下していると同定される。

本明細書で使用する場合、「量」とは、核酸の測定のための任意の定量値を指し、絶対量または相対量で与えることができる。さらに、量は、総量、頻度、比率、パーセンテージなどであることができる。本明細書で使用する「レベル」という用語は、「量」の代わりに使用することができるが、同じ種類の値を指すことを意図する。

本明細書で使用する場合、「閾値（threshold）」または「閾値（threshold value）」は、状態の有無またはリスクの有無を示す、任意の所定のレベルまたはレベルの範囲を指す。閾値は、様々な形態をとることができる。これは、中央値または平均値などの単一カットオフ値であることができる。これは、１つの定義群のリスクが別の定義群のリスクの２倍の場合などの、比較群に基づいて設定することができる。これは範囲であることができ、例えば、試験される集団を複数の群に等しく（または不等に）分割するか（低リスク群、中リスク群および高リスク群など）、またはクォードラント（quadrant）に分割して、最も低い象限はリスクが最も低い対象で、最も高い象限はリスクが最も高い対象である、などである。閾値は、選択された特定の集団に依存し得る。例えば、明らかに健康な集団は、異なる「正常」範囲を有するであろう。別の例として、閾値は、状態またはリスクの存在前または処置経過後のベースライン値から、決定することができる。かかるベースラインは、試験されているリスクまたは状態と相関していない、対象における正常状態または他の状態を示すことができる。いくつかの態様において、閾値は、試験される対象のベースライン値であることができる。したがって、選択された所定の値は、対象が属するカテゴリーを考慮に入れてよい。適切な範囲およびカテゴリーは、当業者の通常の実験を用いて選択することができる。

非天然核酸レベルの変化も、経時的にモニターすることができる。例えば、非天然核酸の量、例えば比率またはパーセンテージなどの、閾値（ベースラインなど）からの変化は、リスク、例えば移植に関連するリスクの非侵襲的臨床指標として使用することができる。これは、臨床状態における変動の測定を可能にし、および／または正常値またはベースラインレベルの算出を可能にする。臓器移植において、これは、拒絶反応またはそれに関連する状態のリスクについての、個別の非侵襲的スクリーニング検査の基礎を形成することができる。一般に、本明細書で提供されるように、非天然核酸の量、例えば比率またはパーセンテージは、状態に関連するリスク、例えばレシピエントにおける拒絶反応等の移植に関連するリスクなどの、有無を示すことができ、またはさらなる検査または監視の必要性を示すことができる。いくつかの態様において、移植レシピエントの場合、この量は、無細胞ＤＮＡの総量と組み合わせて、リスクを示す。本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、移植拒絶反応、移植片損傷などの状態を評価するための、さらなる試験を含み得る。追加の１以上の試験は、本明細書に提供される方法のいずれか１つであってよい。いくつかの態様において、移植レシピエントの場合、追加の試験は、対象からの試料中の全無細胞ＤＮＡ量の決定である。

本明細書で提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、心臓移植レシピエントに関して、かかる閾値は１％であり、ここで１％を超えるレベルはリスクの増加を示し、１％以下のレベルはリスクの減少を示す。本明細書で提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、心臓移植レシピエントに関して、かかる閾値は１．３％であり、ここで１．３％を超えるレベルはリスクの増加を示し、１．３％以下のレベルはリスクの減少を示す。

本明細書で提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、非天然核酸の量、例えば比率またはパーセンテージなどが閾値を上回ると決定された場合、本明細書で提供される方法のいずれか１つはさらに、対象または対象からの試料に、別の試験を実施することを含む。かかる別の試験は、例えば移植レシピエントにおいてリスクの有無を決定するのに有用であることが当業者に知られている、任意の別の試験であることができる。いくつかの態様において、別の試験は、本明細書で提供される方法のいずれか１つである。本明細書で提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、対象は移植レシピエントであり、別の試験は、移植レシピエントにおけるＢＮＰおよび／またはトロポニンのレベルの決定である。本明細書で提供される方法のいずれか１つの別の態様において、ＢＮＰおよび／またはトロポニンのレベルに追加された、またはその代わりの別の試験は、心エコー検査である

本明細書で提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、非天然核酸の量、例えば比率またはパーセンテージなどが、１％または１．３％などの閾値未満であると決定された場合、さらなる試験は、対象に必要でないかまたは推奨されず、および／または、処置は、対象に必要でないかまたは推奨されない。本明細書で提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、レシピエントから得られた試料中の非天然核酸の量（例えば、比率またはパーセンテージ）が１％または１．３％より大きい場合、レシピエントにはリスクの増加があると決定され得るが、しかし本発明の態様はこの点に限定されないので、他の閾値を利用できることが理解されるべきである。いくつかの態様において、方法はさらに、対象に対してさらなる試験、またはさらなる試験を推奨すること、および／または対象を処置すること、または処置を示唆すること、を含み得る。これらの態様のいくつかにおいて、さらなる試験は、本明細書で提供される方法のいずれか１つである。これらの態様のいくつかにおいて、処置は抗拒絶反応処置である。いくつかの態様において、情報は書面または電子形式で提供される。いくつかの態様において、情報は、コンピュータで読むことができる使用説明書として提供されてもよい。

抗拒絶反応療法には、例えば、免疫抑制剤の移植レシピエントへの投与が含まれる。免疫抑制剤としては、限定はされないが、以下を含む：コルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはヒドロコルチゾン）、グルココルチコイド、細胞分裂停止剤（cytostatics）、アルキル化剤（ナイトロジェンマスタード（シクロホスファミド）、ニトロソ尿素、白金化合物、シクロホスファミド（Cytoxan））、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキセートなどの葉酸類似体、アザチオプリンおよびメルカプトプリンなどのプリン類似体、ピリミジン類似体、およびタンパク質合成阻害剤）、細胞傷害性抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトラマイシン）、抗体（例えば、抗ＣＤ２０、抗ＩＬ−１、抗ＩＬ−２Ｒアルファ、抗Ｔ細胞または抗ＣＤ−３モノクローナルおよびポリクローナル、例えばAtgamおよびThymoglobuline）、イムノフィリンに作用する薬物、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、インターフェロン、オピオイド、ＴＮＦ結合タンパク質、ミコフェノラート、フィンゴリモドおよびミリオシン。いくつかの態様において、抗拒絶反応療法は、血液輸送（blood transfer）または骨髄移植を含む。療法はまた、敗血症などの全身状態を処置するための療法を含むこともできる。敗血症の治療には、静脈内液剤、抗生物質、外科的排液、早期目標指向療法（ＥＧＤＴ）、昇圧剤、ステロイド、活性化プロテインＣ、ドロトレコギンα（活性化）、酸素および臓器機能不全に対する適切な支援が含まれる。これには、腎不全の血液透析、肺機能障害の機械的換気、血液製剤の輸血、および循環不全のための薬物および体液治療が含まれ得る。適切な栄養の確保、好ましくは経腸栄養によるが、必要に応じて非経口栄養による確保は、特に長期の病気の際に含めることができる。他の関連する療法には、深部静脈血栓症および胃潰瘍を予防するためのインスリンおよび薬物療法を含むことができる。移植のレシピエントを処置するための療法はまた、細菌感染、真菌感染および／またはウイルス感染を処置するための療法も含むことができる。かかる療法は、当業者に知られている。

本明細書で提供される方法のいずれか１つは、例えば移植のレシピエントなどの対象から得られた試料から、例えば無細胞ＤＮＡなどの核酸を抽出することを含み得る。かかる抽出は、当技術分野で知られている任意の方法または本明細書に提供される他の方法を用いて行うことができる（例えば、Current Protocols in Molecular Biology、最新版またはQIAamp循環核酸キットまたは他の適切な市販キットを参照）。無細胞ＤＮＡを血液から単離するための例示的な方法は、記載されている。ＥＤＴＡまたはＤＴＡなどの抗凝固剤を含有する血液を、対象から採取する。ｃｆ−ＤＮＡを含む血漿を、血液中に存在する細胞から分離する（例えば、遠心分離または濾過によって）。所望の二次分離を行って、任意の残存する細胞を血漿から除去することができる（例えば、第２の遠心分離または濾過ステップ）。その後ｃｆ−ＤＮＡを、当分野で知られている任意の方法、例えばQiagenにより製造されたものなどの市販のキットを用いて、抽出することができる。ｃｆ−ＤＮＡを抽出するための他の例示的な方法も、当技術分野で知られている（例えば、Cell-Free Plasma DNA as a Predictor of Outcome in Severe Sepsis and Septic Shock. Clin. Chem. 2008, v. 54, p. 1000-1007；Prediction of MYCN Amplification in Neuroblastoma Using Serum DNA and Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction. JCO 2005, v. 23, p.5205-5210；Circulating Nucleic Acids in Blood of Healthy Male and Female Donors. Clin. Chem. 2005, v. 51, p.1317-1319；Use of Magnetic Beads for Plasma Cell-free DNA Extraction: Toward Automation of Plasma DNA Analysis for Molecular Diagnostics. Clin. Chem. 2003, v. 49, p. 1953-1955；Chiu RWK, Poon LLM, Lau TK, Leung TN, Wong EMC, Lo YMD. Effects of blood-processing protocols on fetal and total DNA quantification in maternal plasma. Clin Chem 2001;47:1607-1613；およびSwinkels et al. Effects of Blood-Processing Protocols on Cell-free DNA Quantification in Plasma. Clinical Chemistry, 2003, vol. 49, no. 3, 525-526を参照）。

本明細書で使用する場合、対象からの試料は、生物学的試料であり得る。かかる生物学的試料の例には、全血、血漿、血清、尿などが含まれる。本明細書で提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、さらなる核酸、例えば標準の、試料への添加が行われ得る。
本明細書で提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、増幅ステップが実施される。例示的な増幅方法は以下の通りであり、かかる方法は、本明細書で提供される方法のいずれか１つに含めることができる。約１５ｎｇの無細胞血漿ＤＮＡを、約１００個の標的とＱ５ ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲで増幅する；ここでプールされたプライマーは合計で６μＭであった。試料を、約３５サイクルに供する。反応は合計で２５μｌである。増幅後、試料は、AMPUREビーズクリーンアップ、ビーズ精製、または簡単にExosap itもしくはZymoを含む、いくつかのアプローチを用いて洗浄することができる。かかる増幅ステップは、本明細書で提供されるいくつかの方法で用いられた。

本開示はまた、本明細書で提供される方法のいずれか１つにおいて使用するための複数のＳＮＶ標的を決定する方法、またはプライマーの組成物のいずれか１つを誘導できる方法を提供する。複数のＳＮＶ標的を決定する方法は、いくつかの態様において、ａ）複数の高度にヘテロ接合性のＳＮＶを個体の集団において同定すること、ｂ）各ＳＮＶにわたる１以上のプライマーを設計すること、ｃ）十分に特異的なプライマーを選択すること、ｄ）プライマーの多重化能力を、共通の融解温度および／または共通の溶液中において評価すること、およびｅ）プライマーまたはそのサブセットで均一に増幅された配列を同定すること、を含む。
本明細書で使用する場合、「高度にヘテロ接合性のＳＮＶ」とは、集団において十分に高いパーセンテージのマイナーなアレルを有するものである。いくつかの態様において、マイナーなアレルは、集団において少なくとも２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％または３５％またはそれ以上である。これらの態様のいずれか１つにおいて、マイナーなアレルは、集団において５０％、４９％、４５％または４０％未満である。かかるＳＮＶは、天然核酸と非天然核酸との間で異なる標的を提供する可能性を増加させる。

プライマーは、一般に７０ｂｐのウィンドウにまたがるように設計されていたが、他のウィンドウ、例えば６０ｂｐｓと８０ｂｐｓの間なども、選択することができる。また一般に、ＳＮＶはこのウィンドウの中央付近にあることが望まれた。例えば、７０ｂｐのウィンドウの場合、ＳＮＶは塩基２０〜５０の間、例えば塩基３０〜４０の間であった。本明細書で提供されるプライマーは、ＳＮＶに隣接するように設計された。
本明細書で使用する場合、「十分に特異的なプライマー」とは、意図されたアレルの増幅の、意図されていないアレルの増幅に対する識別を実証したものであった。したがってＰＣＲでは、２つの増幅の間にサイクルギャップが必要であった。一態様において、サイクルギャップは、少なくとも５、６、７または８サイクルのギャップであった。

さらに、配列は融解温度に基づいて選択され、一般に４５〜５５℃の間の融解温度を有する配列が「中程度範囲の配列」として選択された。他の温度範囲が所望されてもよく、当業者によって決定することができる。「中程度範囲の配列」とは一般に、温度内の多重増幅形式で増幅され得るものである。いくつかの態様において、ｇｃ％含量は３０〜７０％、例えば３３〜６６％であった。
本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、困難領域に関連する配列を除外することを含むことができる。「困難領域」とは、標的配列に関する予測を確実に行うことが困難な、または多重増幅に適さないと考えられる、容量または特徴を有する任意の領域である。かかる領域は、症候性領域、低複雑性領域、高ＧＣ含量の領域、または連続タンデム反復を有する領域を含む。他のかかる特徴は、当業者に決定されるか、または他の方法で当業者に知られている。

本開示はまた、試料中の非天然核酸の量を評価するために有用であり得る、組成物またはキットを提供する。いくつかの態様において、組成物またはキットは、複数のプライマー対を含む。組成物またはキットのプライマー対のそれぞれは、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含むことができ、ここで、本明細書に提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、プライマーの１つには３’ミスマッチがある（例えば、末端から２番目の３’ヌクレオチドにおいて）。本明細書に提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、このミスマッチは３’ヌクレオチドにおいて、ＳＮＶ位置に隣接しており、ここで特定のＳＮＶが存在しない場合、ＳＮＶ標的の別のアレルに対して二重ミスマッチがある。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、プライマー対のミスマッチプライマーは、フォワードプライマーである。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、ＳＮＶ標的の各アレルのリバースプライマーは、同一である

本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、少なくとも２個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個などの、かかるプライマー対が存在する。提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、プライマー対が、例えば少なくとも２つのプライマー対が、少なくとも４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５個、またはそれ以上の標的に対して存在する。提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、プライマー対、例えば少なくとも２つのプライマー対が、１０５、１０４、１０３、１０２、１０１、１００、９９、９８、または９７個未満の標的に対して存在する。提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、プライマー対、例えば少なくとも２つのプライマー対が４０〜１０５、４５〜１０５、５０〜１０５、５５〜１０５、６０〜１０５、６５〜１０５、７０〜１０５、７５〜１０５、８０〜１０５、８５〜１０５、９０〜１０５、９０〜１０４、９０〜１０３、９０〜１０２、９０〜１０１、９０〜１００、９０〜９９、９１〜９９、９２〜９９、９３、９９、９４〜９９、９５〜９９または９０〜９５個の間の標的に対して、存在する。提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、プライマー対、例えば少なくとも２つのプライマー対が、４０〜９９、４５〜９９、５０〜９９、５５〜９９、６０〜９９、６５〜９９、７０〜９９、７５〜９９、８０〜９９、８５〜９９、９０〜９９、９０〜９９、９０〜９８、９０〜９７または９０〜９６個の間の標的に対して、存在する。提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、プライマー対、例えば少なくとも２つのプライマー対が、９０〜１０５、９０〜１０４、９０〜１０３、９０〜１０２、９０〜１０１、９０〜１００、９０〜９９、９１〜９９、９２〜９９、９３、９９、９４〜９９、９５〜９９、９０〜９５個の間の標的に対して、存在する。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、プライマー対は、本明細書で提供される定量アッセイでの使用に適合するように設計される。例えば、プライマー対は、プライマー二量体を防止し、および／またはオフターゲット結合部位の数を制限するように設計される。提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの複数のプライマー対は、本明細書に記載の方法のいずれか１つに従って最適化または設計され得ることが、理解されるべきである。

いくつかの態様において、提供される組成物またはキットのいずれか１つは、緩衝液をさらに含む。いくつかの態様において、緩衝液は、界面活性剤、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または他のＰＣＲ反応添加剤などの添加剤を含む。いくつかの態様において、提供される組成物またはキットのいずれか１つが、例えばポリメラーゼをさらに含む場合、組成物またはキットは、以下を含んでよい：大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウクラスのポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ventポリメラーゼ、バクテリオファージ２９、REDTaq（商標）ゲノムＤＮＡポリメラーゼ、またはシークエナーゼ。いくつかの態様において、提供される組成物またはキットのいずれか１つはさらに、１つ以上のｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を含む。いくつかの態様において、提供される組成物またはキットのいずれか１つはさらに、プローブ（例えば、TaqMan（登録商標）プローブ）を含む。

本明細書で使用される「キット」とは、典型的には、例えば、前述のように、１つ以上の本発明の組成物、および／または本発明に関連する他の組成物を含む、パッケージまたはアセンブリを定義する。本明細書で提供されるキットのいずれか１つはさらに、少なくとも１つの反応チューブ、ウェル、チャンバーなどを含んでよい。本明細書に記載のプライマー、プライマーシステム（複数の標的のためのプライマーのセットなど）またはプライマー組成物のいずれか１つは、キットの形態で提供され得るか、またはキット内に含まれ得る。

キットの各組成物は、液体形態（例えば、溶液）、固体形態（例えば、乾燥粉末）などで提供され得る。キットはいくつかの場合において、任意の形態における使用説明書を含んでよく、これは本発明の組成物と関連して提供され、使用説明書が本発明の組成物と関連していることを当業者が認識するような様式のものである。使用説明書は、本明細書で提供される方法のいずれか１つを実施するための使用説明書を含み得る。使用説明書は、組成物および／またはキットに付随する他の組成物の、使用、改変、混合、希釈、保存、投与、組み立て、保管、包装および／または調製のための使用説明書を含み得る。使用説明書は、かかる使用説明書を含むのに好適な媒体として当業者により認識され得る任意の形態で提供されてよく、例えば、任意の様式での書面または発表、口頭、聴覚的（例えば、電話による）、デジタル、光学的、視覚的（例えば、ビデオテープ、ＤＶＤなど）、または電子通信（インターネットまたはウェブベースの通信を含む）を含む。

本発明の様々な側面は、単独で、組み合わせて、または前述の態様で具体的に論じられていない様々な構成で使用されてもよく、したがって、それらの用途においては、前述の説明または図面に示された構成要素の詳細および配置に限定されない。例えば、一態様に記載された側面は、他の態様に記載された側面と任意の様式で組み合わせてもよい。
また、本発明の態様は、その一例が提供されている、１つ以上の方法として実装されてもよい。方法の一部として実行される行為は、任意の適切な手段で順序付けられる。したがって、図示されていない順序で行為が実施される態様が構成されてもよく、これは、例示的な態様において連続的な行為として示されている場合でも、いくつかの行為を同時に実行することを含んでよい。

特許請求の範囲における順序を示す用語、例えば「第１」、「第２」、「第３」などの、クレーム要素を修飾するための使用は、それ自体、任意の優先順位、序列、または１つのクレーム要素の他の要素に対する順序、または方法の行為が実施される時間的順序を示さない。かかる用語は、特定の名称を有する１つのクレーム要素を、同じ名称を有する別の要素（但し、順序を示す用語の使用は除く）から区別するための、ラベルとしてのみ使用される。
本明細書で使用される語法および専門用語は、説明目的のものであり、限定的であると見なされるべきではない。「含む（including）」、「含む（comprising）」、「有する」、「含有する（containing）」、「伴う（involving）」、およびそれらの変形の使用は、その後に列挙される項目および追加の項目を包含することを意味する。

本発明のいくつかの態様を詳細に説明したので、当業者には様々な改変および改良が容易に思い浮かぶであろう。かかる改変および改良は、本発明の精神および範囲内にあることが意図される。したがって、前述の説明は単なる例示に過ぎず、限定を意図するものではない。以下の説明は、本明細書で提供される方法の例を提供する。

例１−レシピエントおよびドナーの遺伝子型情報を用いて
ＳＮＶ標的選択
本開示による多重化のための適切かつ適合する標的の同定は、以下に例示された１つ以上の次のステップを含み得る：
・高度にヘテロ接合性のＳＮＰで開始
−いくつかの民族的（ethnic）対照集団をスクリーニング
−Hardy-Weinberg ｐ＞０．２５
−既知の困難地域を除外
・症候性領域は患者においても異常である可能性が高い
・染色体のセントロメアおよびテロメアを含む、低複雑性領域

・コンピューターで設計された所望の長さの標的断片
−各ＳＮＰの７０ｂｐウィンドウにわたる、２つの２０〜２６ｂｐプライマー
−すべての候補プライマーをＢＬＡＳＴでＧＣＲｈ３７について検索
−十分に特異的なプライマーを保持
・特に断片の３’末端にて、オフターゲットヒットのモニタリング
・サイズ選択に耐えられるペアワイズ断片生成のためのオフターゲット候補ヒットの分析
・コンピューターでの多重評価
−融解温度およびＧＣ％を算出し、中程度範囲の配列についてフィルタリング
−反復遺伝アルゴリズム／模擬アニーリングは、候補に適合性の４００個の標的を選択
・最適な４００個の標的（８００個のプライマー）を生成し、共通溶液中の共通融解温度での多重化能力について物理的に試験。

・シーケンシングした４００個の標的のうち：
−多重で均一に増幅された配列をフィルタリング
−適度な読み取り深さのウィンドウ
・最高性能の多重化ＳＮＰからＭＯＭＡに指定された４８のアッセイ
各ＳＮＰは、４つのミスマッチの選択においてＷＴ／ＭＵＴで設計されたプローブを有する（アッセイごとに８つのプローブ）
−新しく入れ子になったプライマーを、７０ｂｐの豊富な断片内で設計
−増幅効率を評価するために、既知のヘテロ接合性個体で実験的に増幅（８×４８TAQMANでトリプリケート）

各アッセイの推測的遺伝子型決定の情報性（informativeness）
・アッセイされた各ＳＮＰの既知のレシピエントおよびドナーの遺伝子型を用いて、情報提供的アッセイのサブセットを選択。
−レシピエントホモ接合部位は、ドナーが任意の他の遺伝子型である場合に使用可能
・ドナーの遺伝子型はないが、移植前に利用可能なクリーンなレシピエントの遺伝子型はある；ドナー遺伝子型は、血漿データの相違から推測可能。
・遺伝子型は、シーケンシングまたはＳＮＰマイクロアレイ、またはＭＯＭＡアッセイを既知の０％（クリーンレシピエント）試料に適用することにより、学習し得る。

多重アッセイ性能の後処理分析
実験コホート全体で、患者特異的なＭＯＭＡプローブバイアスが推定される。最終ドナー％コールが信頼性の高いプローブのみを使用するように、選択を反復的に洗練する。自動異常値検出は、患者特異的な異常ゲノム領域を提供する。

再構成実験
・感度と精度を、既知の混合比で再構成された血漿試料で評価した。
・評価比率１：１０、１：２０、１：１００、１：２００、１：１０００
再構成実験の結果は、概念の証明を示す（図３）。１つの標的は完全情報提供的であり、ここではホモ接合性ドナーがホモ接合性レシピエント対して存在する（陰影付けしたデータ点）。他の標的は半情報提供的であり、ここではヘテロ接合性ドナーがホモ接合性レシピエントに対して存在する（白抜きのデータ点）。さらに、移植レシピエント患者からの血漿試料をＭＯＭＡ法で分析した（図４）。すべてのデータは、生検を受けた患者からのものである。濃い点は拒絶反応を意味する。図５に示すさらなるデータは、本明細書で提供されるＭＯＭＡ方法が、実際の血漿試料で機能したことを実証する。移植手術後、ドナーのパーセントレベルは低下した。一般に、本明細書に記載の９５個のＳＮＶ標的に対するプライマーが使用された。

例２−レシピエントの遺伝子型情報はあるがドナーの遺伝子型情報はない
ドナーの遺伝子型情報なしで作業するために、以下の手順を行って情報提供的アッセイを推測し、血漿試料中のドナー特異的無細胞ＤＮＡの定量化を可能にすることができる。すべてのアッセイは、完全情報提供シナリオでの性能について評価した。したがってこの手順は、各アッセイでクリーンなＡＡ／ＡＢ／ＢＢ遺伝子型および各定量化のバイアスなしの挙動を仮定した。レシピエントの遺伝子型を用いて、レシピエントにホモ接合性であることが知られているアッセイを選択した。いかなる汚染もドナー核酸に起因し、アッセイの集合は、非、半、および完全に情報提供的アッセイに対応する３つのクラスターのアッセイを持つ３モード分布を作成した。十分な数のレシピエントホモ接合性アッセイを用いて、ドナーの完全情報提供的アッセイの存在を仮定することができる。

レシピエントの遺伝子型がホモ接合性で既知の場合であって、レシピエントの遺伝子型ではない測定値が観察された場合、真にドナーホモ接合性であるプローブは最も高いクラスターを有し、推測と等しいであろうが、一方ドナーにヘテロ接合性であるプローブは、推測と半分等しいであろう。確率分布をプロットすることができ、期待値最大化アルゴリズム（ＥＭ）を用いてドナー遺伝子型を推定することができる。これらを用いて、本明細書で提供される方法のいずれか１つにおいてドナー遺伝子型頻度を推測することができる。したがって、ＥＭアルゴリズムを使用して、アッセイされたすべてのＳＮＶ標的において最も有望なドナー遺伝子型を推測した。推測されたドナー遺伝子型を用いて、定量化を全情報シナリオのように進めることができる。ＥＭは、全てのアッセイがレシピエントにおいて「ＡＡ」である（または一般性を失うことなく、「ＢＢ」からはじかれる）ことを前提とすると、アッセイで見いだされたマイナーなアレル比率が、レシピエントとドナーの各組み合わせについて１つずつの３つのモードの分布をとるという仮定から、始めることができる。全てのドナー遺伝子型が未知である場合、マイナーアレルがほぼゼロを示すアッセイはドナーＡＡであり、最高はドナーＢＢである、という知識から、ブートストラップすることが可能である。すべてのドナー遺伝子型についての最初の推測を記録し、各クラスターの平均を算出した。ドナーＢＢアッセイの平均がドナーＡＢの２倍であることを強制すると、検索が制限される。次にアルゴリズムは、クラスターおよび組み込みの仮定に基づいて推測されたドナー遺伝子型を、再割り当てする。このプロセスは、これ以上変更が加えられなくなるまで反復的であった。最終結果は、バックグラウンドから測定された発散を考慮した、最も有望なドナー遺伝子型のセットである。一般に、すべての標的がモデルに入る；結果は、最大化後にグループ間でトスされ得る。

図６は、このようにして処理された血漿試料からの例示的な結果を示す。ｘ軸は、レシピエントがホモ接合性であると見出された任意のアッセイのドナー％である。点の列は、個々のＰＣＲアッセイ結果を表す。一番下の円の列は、ドナー遺伝子型の最初の推定値、いくつかのＡＡ、いくつかのＡ／ＢおよびいくつかのＢＢを表す。次いで、最初のアッセイを中心とするベータ分布を示す実曲線を描いた；赤はホモ接合性（完全情報提供的）、および緑はヘテロ接合性（半情報提供的）で、黒色の曲線は非情報提供的アッセイまたはバックグラウンドノイズの分布を表す。アッセイは、２番目の列において、再割り当てされ更新された推定であった。２番目の列の曲線は破線を使用する。一番上の列は、変化が起きなかったので最終的な推定である。緑色破線の曲線のピークの２倍は最大尤度ドナー％コールに対応して、約１０％、または赤色曲線の平均に等しい。

２つの個体のＤＮＡを用いた再構成実験（Recon1）を、１０％、５％、１％、０．５％、０．１％で作成した。全てのミックスを、標的の多重ライブラリーで増幅し、洗浄し、次いでＭＯＭＡ法を用いて定量的に遺伝子型決定した。分析は、真の遺伝子型を知るために各個体の遺伝子型を特定して行った。情報提供的標的は、メジャーな個体の遺伝子型の事前知識を用いて決定され（ホモ接合部位を探す）、第２の個体が異なる場合、情報提供的標的を用いて画分（パーセンテージ）を算出するために使用された。次いで、画分を算出した（黒で示し、遺伝子型情報ありを示す）。

２つの個体で開始した第２の再構成実験（Recon2）も、メジャーおよびマイナーを１０％、５％、１％、０．５％および０．１％で作成した。全てのミックスを、標的の多重ライブラリーで増幅し、洗浄し、次いでＭＯＭＡ法を用いて定量的に遺伝子型決定した。分析は、真の遺伝子型を知るために各個体の遺伝子型を特定して行った。上記の第２の個体の遺伝子型の事前知識を用いて、情報提供的標的を決定した。次いで、画分を算出した（黒で示し、遺伝子型情報ありを示す）。

これらの再構成は、次の日にも再実行した（Recon3）。
第２の個体からの遺伝子型情報（マイナーＤＮＡ寄与者）を用いることなく、第１の個体（メジャーＤＮＡ寄与者）について利用可能な遺伝子型情報のみを用いて、同じ再構成試料（Recon 1、2、3）を再度分析した。約３８〜４０個の標的を用いて、遺伝子型解析なしの画分（ドナーなしでシミュレート）を陰影付けした（図８）。レシピエントホモ接合性である各標的が、おそらくは有用であることが見出された。円は最初の推測であり、ちょうど閾値化（thresholding）され、右側のものは完全に情報提供的であると考えられ、左側のものはそうではないと考えられた。トップに沿った三角形は同じ標的であったが、最終的な情報提供性の決定のために再着色された。期待値最大化が単純な閾値化より優れていることが見出された。

Claims (115)

1. 対象からの試料中の非天然核酸の量を評価する方法であって、試料が非天然核酸および天然核酸を含み、方法が：
   複数の一塩基バリアント（ＳＮＶ）標的のそれぞれについて、試料またはその一部に対して、少なくとも２つのプライマー対を用いた増幅に基づく定量アッセイを実施すること、ここで各プライマー対はフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、少なくとも２つのプライマー対の１つは、プライマーにおいてＳＮＶ標的の１つのアレルに対して３’末端から２番目のミスマッチを、しかしＳＮＶ標的の別のアレルに対しては３’二重ミスマッチを含み、かつＳＮＶ標的の１つのアレルを特異的に増幅し、少なくとも２つのプライマー対のもう１つは、ＳＮＶ標的の別のアレルを特異的に増幅する、および、
   増幅に基づく定量アッセイからの結果を得るかまたは提供して、試料中の非天然核酸の量を決定すること、
   を含む、前記方法。
2. 結果がレポートで提供される、請求項１に記載の方法。
3. 方法がさらに、試料中の非天然核酸の量を、結果に基づいて決定することを含む、請求項１または２に記載の方法。
4. 結果が、試料中の非天然核酸の量を含む、請求項１または２に記載の方法。
5. 対象からの試料中の非天然核酸の量を評価する方法であって、試料が非天然核酸および天然核酸を含み、方法が：
   複数の一塩基バリアント（ＳＮＶ）標的のそれぞれについて、試料またはその一部に対して少なくとも２つのプライマー対を用いて実施した、増幅に基づく定量アッセイからの結果を得ること、ここで各プライマー対はフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、少なくとも２つのプライマー対の１つは、プライマーにおいてＳＮＶ標的の１つのアレルに対して３’末端から２番目のミスマッチを、しかしＳＮＶ標的の別のアレルに対しては３’二重ミスマッチを含み、かつＳＮＶ標的の１つのアレルを特異的に増幅し、少なくとも２つのプライマー対のもう１つは、ＳＮＶ標的の別のアレルを特異的に増幅する、および、
   非天然核酸の量を、結果に基づいて評価すること、
   を含む、前記方法。
6. 試料中の非天然核酸の量が、増幅に基づく定量アッセイの結果に基づく、請求項５に記載の方法。
7. 結果がレポートから得られる、請求項５または６に記載の方法。
8. 少なくとも２つのプライマー対のもう１つのプライマー対もまた、プライマーにおいてＳＮＶ標的の別のアレルに対して３’末端から２番目のミスマッチを、しかしＳＮＶ標的の１つのアレルに対しては３’二重ミスマッチを含み、かつＳＮＶ標的の別のアレルを特異的に増幅する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 量が、非天然核酸の天然核酸に対する比率またはパーセンテージである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 結果が、増幅に基づく定量アッセイの情報提供的な結果である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 量が、増幅に基づく定量アッセイの情報提供的な結果に基づく、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 方法がさらに、増幅に基づく定量アッセイの情報提供的な結果を選択することを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 選択された情報提供的な結果が平均化される、請求項１２に記載の方法。
14. 増幅に基づく定量アッセイの情報提供的な結果が、非天然核酸および／または天然核酸の遺伝子型に基づいて選択される、請求項１２または１３に記載の方法。
15. 方法がさらに、非天然核酸および／または天然核酸の遺伝子型を得ることを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 方法がさらに、複数のＳＮＶ標的を得ることを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 方法がさらに、複数のＳＮＶ標的のそれぞれについて少なくとも２つのプライマー対を得ることを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 複数のＳＮＶ標的が、少なくとも９０個のＳＮＶ標的である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 複数のＳＮＶ標的が、少なくとも９５個のＳＮＶ標的である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 複数のＳＮＶ標的が、１０５個未満のＳＮＶ標的である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法
21. 複数のＳＮＶ標的が、１００個未満のＳＮＶ標的である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 試料中の非天然核酸の量が、少なくとも０．００５％である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 試料中の非天然核酸の量が、少なくとも０．０１％である、請求項２２に記載の方法。
24. 試料中の非天然核酸の量が、少なくとも０．０３％である、請求項２３に記載の方法。
25. 試料中の非天然核酸の量が、少なくとも０．０５％である、請求項２４に記載の方法
26. 試料中の非天然核酸の量が、少なくとも０．１％である、請求項２５に記載の方法。
27. 試料中の非天然核酸の量が、少なくとも０．３％である、請求項２６に記載の方法。
28. 試料中の非天然核酸の量が、１．５％未満である、請求項２２〜２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 試料中の非天然核酸の量が、１．３％未満である、請求項２８に記載の方法。
30. 試料中の非天然核酸の量が、１％未満である、請求項２９に記載の方法。
31. 試料中の非天然核酸の量が、０．５％未満である、請求項３０に記載の方法。
32. 非天然核酸の遺伝子型が知られていないかまたは得られていない場合、方法がさらに：
    可能性のある非天然の遺伝子型の予測に基づいて、結果を評価すること、
    を含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
33. 評価することが、期待値最大化アルゴリズムを用いて実施される、請求項３２に記載の方法。
34. 対象からの試料中の非天然核酸の量を評価する方法であって、試料が非天然核酸および天然核酸を含み、方法が：
    次の１）および２）からの結果を得ること：１）複数のＳＮＶ標的のそれぞれについて、試料またはその一部に対して少なくとも２つのプライマー対を用いて実施された、増幅に基づく定量アッセイ、ここで各プライマー対はフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、少なくとも２つのプライマー対の１つは、プライマーにおいてＳＮＶ標的の１つのアレルに対して３’末端から２番目のミスマッチを、しかしＳＮＶ標的の別のアレルに対しては３’二重ミスマッチを含み、かつＳＮＶ標的の１つのアレルを特異的に増幅し、少なくとも２つのプライマー対のもう１つは、ＳＮＶ標的の別のアレルを特異的に増幅する、および２）天然の遺伝子型および、可能性のある非天然の遺伝子型の予測、に基づく、情報提供的結果の決定、ならびに
    結果を提供して、試料中の非天然核酸の量を決定すること、
    を含む、前記方法。
35. 結果がレポートで提供される、請求項３４に記載の方法。
36. 方法がさらに、試料中の非天然核酸の量を、結果に基づいて決定することを含む、請求項３４または３５に記載の方法。
37. 結果が、試料中の非天然核酸の量を含む、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
38. 対象からの試料中の非天然核酸の量を評価する方法であって、試料が非天然核酸および天然核酸を含み、方法が：
    次の１）および２）からの結果を得ること：１）複数のＳＮＶ標的のそれぞれについて、試料またはその一部に対して少なくとも２つのプライマー対を用いて実施された、増幅に基づく定量アッセイ、ここで各プライマー対はフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、少なくとも２つのプライマー対の１つは、プライマーにおいてＳＮＶ標的の１つのアレルに対して３’末端から２番目のミスマッチを、しかしＳＮＶ標的の別のアレルに対しては３’二重ミスマッチを含み、かつＳＮＶ標的の１つのアレルを特異的に増幅し、少なくとも２つのプライマー対のもう１つは、ＳＮＶ標的の別のアレルを特異的に増幅する、および２）天然の遺伝子型および、可能性のある非天然の遺伝子型の予測、に基づく、情報提供的結果の決定、ならびに
    非天然核酸の量を、結果に基づいて評価すること、
    を含む、前記方法。
39. 試料中の非天然核酸の量が、増幅に基づく定量アッセイの結果に基づく、請求項３８に記載の方法。
40. 結果がレポートから得られる、請求項３８または３９に記載の方法。
41. 方法がさらに、天然の遺伝子型および、可能性のある非天然の遺伝子型の予測、に基づいて情報提供的な結果を選択することを含む、請求項３４〜４０のいずれか一項に記載の方法。
42. 期待値最大化を用いて、可能性のある非天然の遺伝子型を予測する、請求項３４〜４１のいずれか一項に記載の方法。
43. 少なくとも２つのプライマー対のもう１つのプライマー対もまた、プライマーにおいてＳＮＶ標的の別のアレルに対して３’末端から２番目のミスマッチを、しかしＳＮＶ標的の１つのアレルに対しては３’二重ミスマッチを含み、かつＳＮＶ標的の別のアレルを特異的に増幅する、請求項３４〜４２のいずれか一項に記載の方法。
44. 量が、非天然核酸の天然核酸に対する比率またはパーセンテージである、請求項３４〜４３のいずれか一項に記載の方法。
45. 方法がさらに、天然核酸の遺伝子型を得ることを含む、請求項３４〜４４のいずれか一項に記載の方法。
46. 方法がさらに、複数のＳＮＶ標的を得ることを含む、請求項３４〜４５のいずれか一項に記載の方法。
47. 方法がさらに、複数のＳＮＶ標的のそれぞれについて少なくとも２つのプライマー対を得ることを含む、請求項３４〜４６のいずれか一項に記載の方法
48. 最大尤度を用いて非天然核酸の量を算出する、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の方法。
49. 試料が無細胞ＤＮＡ試料を含み、量が非天然無細胞ＤＮＡの量である、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の方法。
50. 対象が移植レシピエントであり、非天然核酸の量がドナー特異的無細胞ＤＮＡの量である、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の方法。
51. 移植レシピエントが、心臓移植レシピエントである、請求項５０に記載の方法。
52. 移植レシピエントが、小児の移植レシピエントである、請求項５０または５１に記載の方法
53. 複数の増幅に基づく定量アッセイが、リアルタイムＰＣＲアッセイまたはデジタルＰＣＲアッセイなどの定量的ＰＣＲアッセイである、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の方法。
54. 方法がさらに、対象におけるリスクを、試料中の非天然核酸の量に基づいて決定することを含む、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
55. リスクが、移植に関連するリスクである、請求項５４に記載の方法。
56. 移植が心臓移植である、請求項５５に記載の方法。
57. 移植に関連するリスクが、移植拒絶反応のリスクである、請求項５６に記載の方法
58. リスクが、非天然核酸の量が閾値よりも大きい場合に増大する、請求項５４〜５７のいずれか一項に記載の方法。
59. リスクが、非天然核酸の量が閾値未満である場合に減少する、請求項５４〜５７のいずれか一項に記載の方法。
60. リスクが心臓移植拒絶反応に関連するリスクの場合に、閾値が１％である、請求項５８または５９に記載の方法。
61. リスクが心臓移植拒絶反応に関連するリスクの場合に、閾値が１．３％である、請求項５８または５９に記載の方法。
62. 方法がさらに、対象に対する処置を、非天然核酸の量に基づき選択することを含む、請求項１〜６１のいずれか一項に記載の方法．
63. 方法がさらに、非天然核酸の量に基づき対象を処置することを含む、請求項１〜６２のいずれか一項に記１２載の方法。
64. 方法がさらに、対象への処置に関する情報を、非天然核酸の量に基づき提供することを含む、請求項１〜６３のいずれか一項に記載の方法。
65. 方法がさらに、対象における非天然核酸の量を、経時的にモニタリングすることまたはモニタリングを示唆することを含む、請求項１〜６４のいずれか一項に記載の方法。
66. 方法がさらに、対象における非天然核酸の量を、その後の時点で評価することを含む、請求項１〜６５のいずれか一項に記載の方法。
67. 方法がさらに、対象に投与する処置の効果を、非天然核酸の量に基づき評価することを含む、請求項１〜６６のいずれか一項に記載の方法。
68. 処置が抗拒絶反応療法である、請求項６２〜６７のいずれか一項に記載の方法。
69. 試料またはその一部を提供するまたは取得することをさらに含む、請求項１〜６８のいずれか一項に記載の方法。
70. 核酸を試料から抽出することをさらに含む、請求項１〜６９のいずれか一項に記載の方法。
71. 試料が、血液、血漿または血清を含む、請求項１〜７０のいずれか一項に記載の方法。
72. 試料を、対象から心臓移植の１０日以内に得る、請求項１〜７１のいずれか一項に記載の方法。
73. 複数のＳＮＶ標的を決定する方法であって、
    ａ）個体の集団において複数の高度にヘテロ接合性のＳＮＶを同定すること、
    ｂ）各ＳＮＶにわたる１つ以上のプライマーを設計すること、
    ｃ）十分に特異的なプライマーを選択すること、
    ｄ）選択されたプライマーの融解温度および／またはＧＣ％を算出し、中程度範囲の配列についてフィルタリングすること、
    ｅ）プライマーの多重化能力を、共通の溶液中の共通の融解温度で評価すること、および
    ｆ）均一に増幅された配列を、ＰＣＲなどで同定すること、
    を含む、前記方法。
74. ステップａ）がさらに、Hardy-Weinbergのｐ＞０．２５のＳＮＶを選択すること、および／または困難領域に関連するＳＮＶを除くこと、を含む、請求項７３に記載の方法。
75. 困難領域が、症候性領域および／または低複雑度領域である、請求項７４に記載の方法。
76. ステップｂ）の１つ以上のプライマーが７０ｂｐウィンドウにわたり、および／または、１つ以上のプライマーが１６〜２６ｂｐの長さである、請求項７３〜７５のいずれか一項に記載の方法。
77. ステップｃ）の十分に特異的なプライマーが、ＢＬＡＳＴ分析によって同定される、請求項７３〜７６のいずれか一項に記載の方法。
78. ＢＬＡＳＴ分析が、ＧＣＲｈ３７に対するものである、請求項７７に記載の方法。
79. ステップｄ）がさらに、反復遺伝アルゴリズムおよび／または模擬アニーリングを含む、請求項７３〜７８のいずれか一項に記載の方法。
80. 同定された各ＳＮＶ標的についてのプライマー対を得ることをさらに含み、ここで、プライマー対が、プライマーにおいてＳＮＶの１つのアレルに対して３’末端から２番目のミスマッチを、しかしＳＮＶ標的の別のアレルに対しては３’二重ミスマッチを含み、かつＳＮＶ標的の１つのアレルを特異的に増幅する、請求項７３〜７９のいずれか一項に記載の方法。
81. 方法がさらに、同定された各ＳＮＶ標的についての別のプライマー対を得ることを含み、ここで別のプライマー対は、ＳＮＶ標的の別のアレルを特異的に増幅する、請求項８０に記載の方法。
82. 別のプライマー対が、プライマーにおいてＳＮＶの別のアレルに対して３’末端から２番目のミスマッチを、しかしＳＮＶの１つのアレルに対しては３’二重ミスマッチを含む、請求項８１に記載の方法。
83. 同定された複数のＳＮＶ標的が、少なくとも９０個のＳＮＶ標的である、請求項７３〜８２のいずれか一項に記載の方法。
84. 複数のＳＮＶ標的が、少なくとも９５個のＳＮＶ標的である、請求項８３に記載の方法。
85. 同定された複数のＳＮＶ標的が、１０５個未満のＳＮＶ標的である、請求項７３〜８４のいずれか一項に記載の方法。
86. 複数のＳＮＶ標的が、１００個未満のＳＮＶ標的である、請求項８５に記載の方法。
87. 組成物またはキットであって、
    複数のＳＮＶ標的のそれぞれについてプライマー対を含み、ここで各プライマー対は、プライマーにおいてＳＮＶ標的の１つのアレルに対して３’末端から２番目のミスマッチを、しかしＳＮＶ標的の別のアレルに対しては３’二重ミスマッチを含み、かつＳＮＶ標的の１つのアレルを特異的に増幅する、
    前記組成物またはキット。
88. 複数のＳＮＶ標的のそれぞれについて別のプライマー対をさらに含み、ここで別のプライマー対が、ＳＮＶ標的の別のアレルを特異的に増幅する、請求項８７に記載の組成物またはキット。
89. 複数のＳＮＶ標的が、少なくとも９０個のＳＮＶ標的である、請求項８７または８８に記載の組成物またはキット。
90. 複数のＳＮＶ標的が、少なくとも９５個のＳＮＶ標的である、請求項８９に記載の組成物またはキット。
91. 複数のＳＮＶ標的が、１０５個未満のＳＮＶ標的である、請求項８７〜９０のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
92. 複数のＳＮＶ標的が、１００個未満のＳＮＶ標的である、請求項９１に記載の組成物またはキット。
93. 緩衝剤をさらに含む、請求項８７〜９２のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
94. ポリメラーゼをさらに含む、請求項８７〜９３のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
95. プローブをさらに含む、請求項８７〜９４のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
96. プローブが蛍光プローブである、請求項９５に記載の組成物またはキット。
97. 使用説明書をさらに含む、請求項８７〜９６のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
98. 使用説明書が、試料中の非天然核酸の量を決定するための使用説明書である、請求項９７に記載の組成物またはキット。
99. 試料が、心臓移植レシピエント由来である、請求項９８に記載の組成物またはキット。
100. 試料が、小児の心臓移植レシピエント由来である、請求項９９に記載の組成物またはキット。
101. 非天然核酸の遺伝子型を推定する方法であって：
     複数の一塩基バリアント（ＳＮＶ）標的のそれぞれについて、情報提供的な非天然核酸レベルを得ること、
     レベルを、最大尤度または期待値最大化ステップを用いて、２つの分布の１つに割り当てること、そのうちの１つは完全情報提供的レベル用であり、もう１つは半情報提供的レベル用である、
     前記方法。
102. 情報提供的な非天然核酸レベルが、天然核酸であると決定されるレベルを除去することによって得られる、請求項１０１に記載の方法。
103. 方法がさらに、コールなしまたは誤ったコールを表すレベルを除去することを含む、請求項１０１または１０２に記載の方法。
104. レベルが、次世代シーケンシングなどのシーケンシングによって決定される、請求項１０１〜１０３のいずれか一項に記載の方法。
105. レベルが、複数のＳＮＶ標的のそれぞれについて実施される増幅に基づく定量アッセイから得られる、請求項１０１〜１０４のいずれか一項に記載の方法。
106. 増幅に基づく定量アッセイが、複数のＳＮＶ標的のそれぞれについて少なくとも２つのプライマー対を用いて実施され、ここで各プライマー対はフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、少なくとも２つのプライマー対の１つは、プライマーにおいてＳＮＶ標的の１つのアレルに対して３’末端から２番目のミスマッチを、しかしＳＮＶ標的の別のアレルに対しては３’二重ミスマッチを含み、かつＳＮＶ標的の１つのアレルを特異的に増幅し、少なくとも２つのプライマー対のもう１つは、ＳＮＶ標的の別のアレルを特異的に増幅する、請求項１０５に記載の方法。
107. 少なくとも２つのプライマー対のもう１つのプライマー対もまた、プライマーにおいてＳＮＶ標的の別のアレルに対して３’末端から２番目のミスマッチを、しかしＳＮＶ標的の１つのアレルに対しては３’二重ミスマッチを含み、かつＳＮＶ標的の別のアレルを特異的に増幅する、請求項１０６に記載の方法。
108. 方法がさらに、割り当てられたレベルを提供することを含む、請求項１０１〜１０７のいずれか一項に記載の方法。
109. 方法がさらに、非天然核酸の量を、レベルの割り当てに基づいて得ることを含む、請求項１０１〜１０８のいずれか一項に記載の方法。
110. 方法がさらに、非天然核酸の量を、レベルの割り当てに基づいて提供することを含む、請求項１０１〜１０９のいずれか一項に記載の方法。
111. 方法であって、
     完全情報提供的または半情報提供的として割り当てられたレベルまたは非核酸の量を、請求項１０１〜１１０のいずれか一項に記載の方法に従った割り当てに基づいて得ること、および
     対象におけるリスクを、前記レベルまたは量に基づいて評価すること、
     を含む、前記方法。
112. 対象が、移植のレシピエントである、請求項１１１に記載の方法。
113. 処置または処置に関する情報が、評価されたリスクに基づいて対象に与えられる、請求項１１１または１１２に記載の方法。
114. 処置が、抗拒絶反応療法である、請求項１１３に記載の方法。
115. 方法がさらに、対象における非天然核酸の量を経時的にモニタリングすること、またはモニタリングを示唆することを含む、請求項１１１〜１１３のいずれか一項に記載の方法。

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