CN110177874A - 用于使用错配扩增和统计方法来评估风险的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于评估样品(例如来自对象)中非天然核酸的量的方法和组合物。本文中提供的方法和组合物可用于在对象中确定病症(例如移植物排斥)的风险。
Description
相关申请
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2016年11月2日提交的美国临时申请62/416,696和于2017年8月17日提交的美国临时申请62/546,789的申请日的权益，其中的每一个的内容通过引用整体并入本文。
发明领域
本发明涉及用于评估来自对象的样品中非天然核酸的量的方法和组合物。本文中提供的方法和组合物可用于确定病症(例如移植物排斥(transplant rejection))的风险。本发明还涉及使用多路复用优化的错配扩增(multiplexed optimized mismatchamplification，MOMA)来评估非天然无细胞脱氧核糖核酸(非天然无细胞DNA，例如供体特异性无细胞DNA)的量的方法和组合物。
发明背景
检测和量化样品中非天然核酸的能力可允许早期检测病症，例如移植物排斥。然而，当前用于定量分析异质核酸群(例如，天然和非天然核酸的混合物)的方法是有限的。
发明概述
本公开内容至少部分基于以下出乎意料的发现：多路复用优化的错配扩增可用于量化来自对象的样品中的低频非天然核酸。多路复用优化的错配扩增包括引物的设计，所述引物可包含针对特定序列扩增的3’倒数第二位错配(penultimate mismatch)，但包含相对于替代序列的双错配。用这样的引物扩增可允许定量确定样品中非天然核酸的量，即使在异质核酸群中非天然核酸的量例如低于1％，或甚至0.5％。
本文中提供了与这种经优化的扩增相关的方法、组合物、试剂盒和报告。所述方法、组合物、试剂盒和报告可分别是本文中提供的方法、组合物、试剂盒和报告中的任一种，包括实施例和附图的那些中的任一种。
在一个方面，提供了评估来自对象的样品中非天然核酸的量的方法，所述样品包含非天然和天然核酸。该方法可包括从基于错配扩增的定量测定获得结果，并基于结果确定样品中非天然核酸的量，其中确定包括对结果进行平均(averaging)以确定该量，并且进行平均是取中位数(taking the median)。
在另一个方面，提供了评估来自对象的样品中非天然核酸的量的方法，所述样品包含非天然和天然核酸，所述方法包括从基于错配扩增的定量测定获得结果，以及基于该结果确定样品中非天然核酸的量，其中所述确定包括使用稳健标准偏差(robust standarddeviation)和/或稳健变异系数(robust coefficient of variation)来分析结果。
在另一个方面，提供了评估来自对象的样品中非天然核酸的量的方法，所述样品包含非天然和天然核酸，所述方法包括从基于错配扩增的定量测定获得结果，以及基于该结果确定样品中非天然核酸的量，其中所述确定包括使用不一致值(discordance value)来分析结果。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述确定包括或者所述方法还包括使用稳健标准偏差和/或稳健变异系数来分析结果。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述确定包括或者所述方法还包括使用不一致值来分析结果。
在另一个方面，基于来自对象的一个或更多个样品中的一种或更多种非天然核酸的量来评估对象中风险的方法，所述样品包含非天然和天然核酸，所述方法包括获得来自对象的一个或更多个样品中的一种或更多种非天然核酸的量，该量是从一种或更多种基于错配扩增的定量测定中确定的，每种测定均如本文中提供的这样的测定中的任一种所限定，以及基于非天然核酸的量来评估风险。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述量是从报告中获得的或在报告中提供的。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述量是非天然核酸与天然核酸或总核酸的比例或百分比。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，还确定了天然核酸或总核酸的量。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，基于错配扩增的定量测定包括，针对多种单核苷酸变体(single nucleotide variant，SNV)靶标中的每一种，用至少一种引物对(primer pair)对样品或其一部分进行核酸扩增(例如聚合酶链式反应(PCR))，其中所述至少一种引物对包含正向引物和反向引物，其中所述至少一种引物对包含这样的引物，其具有相对于SNV靶标的一种序列(例如，等位基因)的3’错配(例如，倒数第二位错配)，然而具有相对于SNV靶标的另一种序列(例如，等位基因)的3’双错配，并且特异性地扩增SNV靶标的一种序列(例如，等位基因)。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，基于错配扩增的定量测定还包括，针对每种SNV靶标，用至少一个另一种引物对进行核酸扩增，其中所述至少一个另一种引物对包含正向引物和反向引物，其中所述至少一个另一种引物对特异性地扩增SNV靶标的另一种序列(例如，等位基因)。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，基于错配扩增的定量测定包括，针对多种单核苷酸变体(SNV)靶标中的每一种，用至少两种引物对对样品或其一部分进行核酸扩增(例如PCR)，其中每种引物对包含正向引物和反向引物，其中所述至少两种引物对中的一种包含相对于SNV靶标的一种序列(例如，等位基因)的3’错配(例如，倒数第二位)，但包含相对于SNV靶标的另一种序列(例如，等位基因)的3’双错配，并且特异性地扩增SNV靶标的一种序列(例如，等位基因)，并且至少两种引物对中的另一种特异性地扩增SNV靶标的另一种序列(例如，等位基因)。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，基于错配扩增的定量测定包括，针对多种SNV靶标，针对每个这样的SNV靶标，用如本文所提供的至少一种引物对(例如至少两种引物对)进行样品的核酸扩增(例如PCR)，其中每种引物对包含正向引物和反向引物，基于天然核酸和/或非天然核酸的基因型选择信息性结果(informative result)。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，该方法可包括基于信息性结果确定样品中非天然核酸的量。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，基于错配扩增的定量测定还包括鉴定多种SNV靶标。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，基于错配扩增的定量测定还包括推断非天然核酸的基因型。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述确定该量包括对其进行平均，例如取中位数。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，该量基于结果(例如信息性结果)的平均，例如中位数。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述确定包括或者所述方法还包括使用稳健统计学(Robust Statistics)来分析结果。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，可用以下方式来分析结果：标准偏差，例如稳健标准偏差；和/或变异系数，例如稳健变异系数；或％变异系数，例如％稳健变异系数。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述量至少部分地基于或者所述方法还包括使用稳健统计学来分析结果。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，分析包括使用：标准偏差，例如稳健标准偏差；和/或变异系数，例如稳健变异系数；或％变异系数，例如％稳健变异系数。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述确定包括或者所述方法还包括使用不一致值来分析结果。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，可用不一致值来分析结果。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述量至少部分地基于或者所述方法还包括使用不一致值来分析结果。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，分析包括使用不一致值。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，基于错配扩增的定量测定包括，针对多种SNV靶标中的每一种，用至少一种引物对(例如至少两种引物对)对样品或其一部分进行核酸扩增(例如PCR)，其中每种引物对包含正向引物和反向引物，其中所述至少一种引物对中的一种(例如至少两种引物对)包含相对于SNV靶标的一种序列(例如，等位基因)的3’错配(例如，倒数第二位)，但包含相对于SNV靶标的另一种序列(例如，等位基因)的3’双错配，并且特异性地扩增SNV靶标的一种序列(例如，等位基因)和基于天然基因型和/或可能的非天然基因型的预测确定信息性结果。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，基于错配扩增的定量测定还包括，针对每个SNV靶标用至少一个另一种引物对进行核酸扩增(例如PCR)。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述至少一个另一种引物对包含相对于SNV靶标的另一种序列(例如，等位基因)的3’错配(例如，倒数第二位)，然而相对于SNV靶标的一种序列(例如，等位基因)的3’双错配，并且特异性地扩增SNV靶标的另一种序列(例如，等位基因)。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，该方法还包括基于扩增结果评估非天然核酸的量。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，结果是信息性结果。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，基于错配扩增的定量测定还包括选择扩增(例如PCR扩增)的信息性结果。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，对所选择的信息性结果进行平均，例如中位数平均。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，该方法还包括用稳健统计学进一步分析结果。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，可用以下进一步分析结果：标准偏差，例如稳健标准偏差；和/或变异系数，例如稳健变异系数；或％变异系数，例如％稳健变异系数。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，该方法还包括用不一致值来分析结果。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，可用不一致值进一步分析结果。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，基于非天然核酸和/或天然核酸的基因型选择核酸扩增(例如PCR)的信息性结果。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，该方法还包括获得非天然核酸和/或天然核酸的基因型。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，基于错配扩增的定量测定还包括基于天然基因型和/或可能的非天然基因型的预测来选择信息性结果。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，当非天然核酸的基因型未知或未获得时，基于错配扩增的定量测定还包括基于对可能的非天然基因型的预测来评估结果。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，用最大期望值法(expectation-maximization)算法来执行评估或预测。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，使用最大期望值法来预测可能的非天然基因型。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，使用最大似然法(maximumlikelihood)来计算非天然核酸的量。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，基于错配扩增的定量测定还包括获得多种SNV靶标。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，基于错配扩增的定量测定还包括获得针对多种SNV靶标中的每一种的至少一种，例如至少两种引物对。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，基于错配扩增的定量测定还包括获得或提供结果。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，结果是信息性结果。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，该方法还包括获得或提供量。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，结果或量在报告中提供。
在一个方面，提供了包含本文中提供的任一种方法的结果和/或量的报告。在所提供的任一种方法或任一个报告的一个实施方案中，结果是信息性结果。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，结果从报告中获得。在所提供的任一个报告的一个实施方案中，报告以电子形式给出。在所提供的任一个报告的一个实施方案中，报告是硬拷贝。在所提供的任一个报告的一个实施方案中，报告是口头给出的。
在任一种方法的一个实施方案中，每种SNV靶标存在至少一种引物对、至少两种引物对、至少三种引物对、至少四种引物对或更多。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，所述多种SNV靶标为至少45种、48种、50种、55种、60种、65种、70种、75种、80种、85种或90种或更多种。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，所述多种SNV靶标是至少90种、95种或更多种靶标。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，所述多种SNV靶标是少于90种、95种或更多种靶标。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，多种SNV靶标是少于105种或100种靶标。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，错配引物是正向引物。在任一种方法的一个实施方案中，针对每种SNV靶标的引物对的反向引物是相同的。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，样品中非天然核酸的量为至少0.005％。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，样品中非天然核酸的量为至少0.01％。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，样品中非天然核酸的量为至少0.03％。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，样品中非天然核酸的量为至少0.05％。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，样品中非天然核酸的量为至少0.1％。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，样品中非天然核酸的量为至少0.3％。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，样品中非天然核酸的量小于1.5％。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，样品中非天然核酸的量小于1.3％。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，样品中非天然核酸的量小于1％。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，样品中非天然核酸的量小于0.5％。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，样品包含无细胞DNA样品，并且量是非天然无细胞DNA的量。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，对象是移植物接受者，并且非天然核酸的量是供体特异性无细胞DNA的量。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，移植物接受者是心脏移植物接受者。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，移植物接受者是儿科移植物接受者，例如儿科心脏移植物接受者。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，扩增(例如PCR)，是实时PCR或数字PCR扩增。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，该方法还包括基于样品中非天然核酸的量确定对象中的风险。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，风险是与移植物相关的风险。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，与移植物相关的风险是是移植物排斥的风险、移植物的解剖学问题或移植物的损伤。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，移植物的损伤是初始或持续性损伤。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，与移植物相关的风险指示损伤的严重程度。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，如果非天然核酸的量大于阈值，则风险提高。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，如果非天然核酸的量小于阈值，则风险降低。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，其中风险是与心脏移植物排斥相关的风险，阈值是1％。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，其中风险是与心脏移植物排斥相关的风险，阈值为1.3％。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，该方法还包括基于非天然核酸的量来选择用于对象的治疗。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，该方法还包括基于非天然核酸的量来治疗对象。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，该方法还包括基于非天然核酸的量向对象提供关于治疗的信息。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，方法还包括随时间监测或建议监测对象中非天然核酸的量。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，该方法还包括在随后的时间点评估对象中非天然核酸的量。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，该方法还包括从对象获得另一个样品，例如在随后的时间点，并对样品进行测试，例如本文中提供的任一种方法。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，该方法还包括基于非天然核酸的量来评价向对象施用的治疗的效果。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，治疗是抗排斥治疗。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，治疗是抗感染治疗。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，该方法还包括提供或获得样品或其一部分。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，该方法还包括从样品中提取核酸。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，样品包含血液、血浆或血清。
在所提供的任一种方法或报告的一个实施方案中，样品获自心脏移植的10天内的对象或者是从心脏移植的10天内的对象获得的样品。在本文中提供的任一种方法或任一个报告的一个实施方案中，样品获自手术的14小时内的对象或者是从手术的14小时内的对象获得的样品。在本文中提供的任一种方法或任一个报告的一个实施方案中，样品获自手术的24小时内的对象或者是从手术的24小时内的对象获得的样品。在本文中提供的任一种方法或任一个报告的一个实施方案中，手术是移植手术。在本文中提供的任一种方法或任一个报告的一个实施方案中，样品获自横断钳闭移除(cross-clamp removal)的14小时内的对象或者是从横断钳闭移除的14小时内的对象获得的样品。在本文中提供的任一种方法或任一个报告的一个实施方案中，样品获自横断钳闭移除的24小时内的对象或者是从横断钳闭移除的24小时内的对象获得的样品。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述量随时间每周确定或获得。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述量随时间每两周确定或获得。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述量随时间每月确定或获得。
在一个实施方案中，本文中提供的方法的任一个实施方案可以是针对所提供的任一个报告的实施方案。在一个实施方案中，针对本文中提供的报告的任一个实施方案可以是针对本文中提供的任一种方法的实施方案。
附图简述
附图并非旨在按比例绘制。所述附图仅是举例说明性的，并且不是使得能够实现本公开内容所需要的。
图1提供了MOMA引物的示例性的非限制性图。在聚合酶链反应(PCR)测定中，预期发生包含SNV A的序列的延伸，导致检出SNV A，其可随后被量化。然而，由于双错配而预期不发生SNV B的延伸。
图2提供了示例性的扩增迹线。
图3示出了显示概念验证的来自重建实验的结果。
图4提供了用来自移植物接受者患者的血浆样品测量的无细胞DNA百分比。所有数据均来自进行了活检的患者。暗点表示排斥。
图5提供了来自本文中提供的关于血浆样品的方法的另外的数据。移植手术之后，供体百分比水平下降。
图6显示了当未知时使用最大期望值法来预测非天然供体基因型。黑色＝背景，绿色＝半信息性，红色＝完全信息性，虚线＝第一次迭代(iteration)，实线＝第二次迭代，最终调用(final call)＝10％。
图7显示了当未知时使用最大期望值法来预测非天然供体基因型。黑色＝背景，绿色＝半信息性，红色＝完全信息性，最终调用＝5％。
图8提供了重建实验数据，其示出了当未知时预测非天然供体基因型的能力。已用一组95种SNV靶标生成数据。
图9提供了104种MOMA靶标的平均背景噪声。
图10提供了使用MOMA的方法的背景噪声的另外的实例。
图11至30举例说明了在一些实施方案中使探针与错配引物在同一链上的益处。
图31示出了可用其操作一些实施方案的计算机系统的一个实例。
发明详述
公开内容的一些方面涉及用于灵敏地检测和/或量化样品中的非天然核酸的方法。非天然核酸(例如非天然DNA)可在包括器官移植后的多种情况下存在于个体中。本公开内容提供了检测、分析和/或量化从对象获得的样品中的非天然核酸(例如非天然无细胞DNA浓度)的技术。
本文中使用的“非天然核酸”是指来自另一来源或是见于对象中的核酸的突变形式(就特定序列而言)的核酸。因此，“天然核酸”是并非来自另一来源并且不是见于对象中的核酸的突变形式(就特定序列而言)的核酸。在一些实施方案中，非天然核酸是非天然无细胞DNA。“无细胞DNA”(或cf-DNA)是存在于细胞外部(例如在对象的血液、血浆、血清等中)的DNA。不希望受任何特定理论或机理的束缚，认为cf-DNA是从细胞释放的，例如通过细胞的凋亡而从细胞释放的。非天然核酸的一个实例是来自移植物接受者对象中移植物供体的核酸。如本文中使用的，本文中提供的组合物和方法可用于确定来自非天然来源的无细胞DNA的量，例如供体或供体特异性无细胞DNA(例如供体特异性cfDNA)的量。
本文中提供了可用于测量在序列同一性方面具有差异的核酸的方法和组合物。在一些实施方案中，序列同一性的差异是单核苷酸变体(SNV)；然而，无论本文中在何处提及SNV，天然与非天然核酸之间的任何序列同一性差异均旨在同样适用。因此，本文中提供的任一种方法可应用于序列同一性不同的天然与非天然核酸。本文中使用的“单核苷酸变体”是指其中在单个核苷酸处存在序列变异的核酸序列。在一些实施方案中，SNV是双等位基因SNV，意指对于SNV存在一个主要等位基因和一个次要等位基因。在一些实施方案中，SNV可具有多于两种等位基因，例如在群体内。在一些实施方案中，SNV是序列的突变体形式，且非天然核酸是指突变体形式，而天然核酸是指非突变形式(例如野生型形式)。因此，这样的SNV可以是可在对象体内发生并且可与疾病或病症相关的突变。通常来说，“次要等位基因”是指对于基因座而言频率较低的等位基因，例如在群体中，而“主要等位基因”是指频率较高的等位基因，例如在群体中。在一些实施方案中，本文中提供的方法和组合物可量化核酸混合物中主要和次要等位基因的核酸，甚至在低水平存在时也是如此。
其中存在序列同一性变异的核酸序列(例如SNV)通常称为“靶标”。本文中使用的“SNV靶标”是指其中存在序列变异的核酸序列，在单个核苷酸处，例如在个体的群体中，或可在对象中发生的突变以及与疾病或病症相关的突变的结果。SNV靶标具有多于一种等位基因，并且在一些优选的实施方案中，SNV靶标是双等位基因的。在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，SNV靶标是SNP靶标。在这些实施方案的一些中，SNP靶标是双等位基因。已经发现，通过用对如本文所提供的SNV靶标具有特异性的引物进行基于扩增的定量测定(例如PCR测定)可甚至在极低水平下量化非天然核酸。在一些实施方案中，通过尝试用多种SNV靶标的引物进行基于扩增的定量测定(例如定量PCR测定)来确定非天然核酸的量。
“多种SNV靶标”是指多于一种SNV靶标，其中对于每种靶标存在至少两种等位基因。优选地，在一些实施方案中，预期每种SNV靶标是双等位基因的，并且对SNV靶标的每种等位基因具有特异性的引物对用于特异性地扩增每种等位基因的核酸，其中如果样品中存在特定等位基因的核酸，则发生扩增。在一些实施方案中，多种SNV靶标是对象内可突变且如果这样突变则可指示对象中的疾病或病症的多种序列。如本文中使用的一种等位基因可以是靶序列的突变形式，而另一种等位基因是该序列的非突变形式。
在一些实施方案中，用针对至少40种、45种、50种、55种、60种、65种、70种、75种、80种、85种、90种、91种、92种、93种、94种、95种或更多种靶标的引物对进行基于扩增的定量测定(例如定量PCR)。在一些实施方案中，用针对少于105种、104种、103种、102种、101种、100种、99种、98种或97种靶标的引物对进行定量测定。在一些实施方案中，用针对以下数量的靶标的引物对获得足够的信息性结果：40至105种、45至105种、50至105种、55至105种、60至105种、65至105种、70至105种、75至105种、80至105种、85至105种、90至105种、90至104种、90至103种、90至102种、90至101种、90至100种、90至99种、91至99种、92至99种、93至99种、94至99种、95至99种、或90至95种靶标。在一些实施方案中，用针对以下数量的靶标的引物对获得足够的信息性结果：40至99种、45至99种、50至99种、55至99种、60至99种、65至99种、70至99种、75至99种、80至99种、85至99种、90至99种、90至99种、90至98种、90至97种、或90至96种靶标。在另一些实施方案中，用针对以下数量的靶标的引物对获得足够的信息性结果：40至95种、45至95种、50至95种、55至95种、60至95种、65至95种、70至95种、75至95种、80至95种、85至95种、或90至95种靶标。在另一些实施方案中，用针对以下数量的靶标的引物对获得足够的信息性结果：40至90种、45至90种、50至90种、55至90种、60至90种、65至90种、70至90种、75至90种、80至90种、或85至90种靶标。在另一些实施方案中，用针对以下数量的靶标的引物对获得足够的信息性结果：40至85种、45至85种、50至85种、55至85种、60至85种、65至85种、70至85种、75至85种、或80至85种靶标。在另一些实施方案中，用针对以下数量的靶标的引物对获得足够的信息性结果：40至80种、45至80种、50至80种、55至80种、60至80种、65至80种、70至80种、或75至80种靶标。在另一些实施方案中，用针对以下数量的靶标的引物对获得足够的信息性结果：40至75种、45至75种、50至75种、55至75种、60至75种、65至75种、或70至75种靶标。
本文中提供的“信息性结果”是可用于量化样品中非天然或天然核酸的水平的结果。一般来说，信息性结果排除了其中天然核酸对特定SNV靶标是杂合以及“无调用(nocall)”或错误调用结果的结果。由信息性结果，在所提供的任一种方法的一些实施方案中，可使用标准曲线来计算等位基因百分比。在所提供的任一种方法的一些实施方案中，非天然和/或天然核酸的量分别代表非天然和/或天然核酸的信息性结果的平均。在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，该平均以绝对量或百分比给出。优选地，在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，该平均是中位数。在本文中提供的任一种方法的另一些实施方案中，平均是截尾均值(trimmed mean)。如本文所用，“截尾均值”是指去除最低报告靶标(例如两个最低)联合最高报告靶标(例如两个最高)。在本文中提供的任一种方法的另一些实施方案中，平均是均值(mean)。
在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，该方法还可包括使用稳健统计学(例如，BD FACSDivaTM软件)来分析结果。在一些这样的实施方案中，可在结束时使用这种统计作为结果的质量检查。在一些这样的实施方案中，统计可指示可需要重新运行样本或者应该丢弃一些结果。在一些实施方案中，本文中提供的任一种方法可包括这样的步骤，通过该步骤可计算标准偏差，例如稳健标准偏差(Robust Standard Deviation，rSD)；和/或变异系数，例如稳健变异系数(Robust Coefficient of Variation，rCV)；或％变异系数，例如％稳健变异系数。
如本文中所用，稳健SD基于各个数据点相对于总体的中位数的偏差。它可如下计算：
rSD＝({|Xi-中位数x|}的中位数)×1.4826
值1.4826是一个常数因子，它将所得的稳健值调整为等同于正态总体分布。因此，对于正态分布的群体，SD和rSD是相等的。
类似地，稳健CV和稳健CV百分比可分别如下计算：
rCV＝rSD/中位数x，且％rCV＝rSD/中位数x×100％
因此，在本文中提供的任一种方法中，最终量可至少部分地通过使用标准偏差(例如rSD)和/或变异系数(例如rCV)或％变异系数(例如％rCV)对结果进行分析来确定。
在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，该方法还可包括使用不一致值(dQC)。例如，可评价接受者纯合和非信息性靶标的平均次要等位基因比例，以针对样品混淆(mixup)和污染提供保护。根据非特异性等位基因噪声，这些应理论上理解为几乎为零。如果在收集或处理过程中发生样品交换，则使用错误的接受者基因型，dQC可在假定的非信息性靶标上立即标记高达50％或100％的读数。dQC还可捕获样品污染和可能的基因组不稳定性。通常来说，健康样品的dQC将低于0.5％。
非天然核酸的量(例如比例或百分比)可用主要和次要等位基因的量以及天然和/或非天然核酸的基因型来确定。例如，可根据天然基因型的知识排除其中天然核酸对特定SNV靶标是杂合的结果。此外，还可根据非天然基因型的知识来评估结果。在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，其中天然核酸的基因型是已知的而非天然核酸的基因型是未知的，所述方法可包括预测可能的非天然基因型或通过测序确定非天然基因型的步骤。这些方法的进一步细节在本文中别处提供，例如在实施例中。在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，可基于对象的天然核酸和/或对所述对象(例如分别为接受者和供体)非天然的核酸进行预先基因型分型来确定等位基因。用于基因型分型的方法是本领域中公知的。这样的方法包括测序，例如下一代、杂交、微阵列、其他分离技术或PCR测定。本文中提供的任一种方法均可包括获得这样基因型的步骤。
本文中使用的“获得”是指通过其可获取相应信息或材料的任何方法。因此，在一些实施方案中，可通过实验方法来获取相应的信息，例如以确定天然基因型。相应材料可用多种实验或实验室方法来创建、设计等。相应信息或材料还可通过给予或提供信息(例如在报告中)或材料来获取。在一些实施方案中，材料可通过商业手段(即通过购买)来给予或提供。
报告可以是口头、书面(或硬拷贝)或电子形式，例如可被可视化或显示的形式。在一些实施方案中，本文中提供的每个测定的“原始”结果在报告中提供，并且从该报告可采取进一步的步骤来确定样品中非天然核酸的量。这些进一步的步骤可包括以下中的任意一个或更多个：选择信息性结果，获得天然和/或非天然基因型，计算天然和非天然核酸的信息性结果的等位基因百分比，对等位基因百分比求平均，等。在另一些实施方案中，报告提供了样品中非天然核酸的量。由所述量，在一些实施方案中，临床医生可在稍后的时间评估对象的治疗需求或监测对象(例如非天然核酸的量)的需求。因此，在本文中提供的任一种方法中，所述方法可包括在另外的时间点评估对象中非核酸的量。这样的评估可用本文中提供的任一种方法进行。
本文中提供的基于扩增的定量测定利用多路复用优化的错配扩增(MOMA)。可获得用于这样的测定的引物，并且本文中提供的任一种方法均可包括获得用于进行定量测定的一种或更多种引物对的步骤。一般来说，引物具有有利于其用于量化核酸的量的独特特性。例如，引物对的正向引物可在3’核苷酸(例如，倒数第二位3’核苷酸)处错配。在所提供的任一种方法的一些实施方案中，这种错配位于3’核苷酸处但与SNV位置相邻。在所提供的任一种方法一些实施方案中，引物相对于SNV位置的错配定位如图1中所示。一般来说，这样的正向引物即使具有3’错配也在扩增反应中产生扩增产物(与合适的反向引物联合)，因此允许扩增并导致检测到具有相应SNV的核酸。如果特定SNV不存在并且存在相对于SNV靶标的另一种等位基因的双错配，则通常不会产生扩增产物。优选地，在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，对于每种SNV靶标，获得以下引物对，通过所述引物对，可发生每种等位基因的特异性扩增而不扩增其他等位基因。“特异性扩增”是指扩增靶标的特定等位基因，而基本上不扩增另外的核酸或不扩增超过背景或噪声的另外核酸序列。在一些实施方案中，特异性扩增仅导致扩增特定等位基因。
在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，对于双等位基因的每种SNV靶标，存在两种引物对，每种对两种等位基因之一具有特异性，并且因此具有相对于其将要扩增之等位基因的单个错配，并且具有相对于其不扩增之等位基因的双错配(如果这些等位基因的核酸存在的话则是同样)。在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，错配引物是正向引物。在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，用于每种SNV靶标的两种引物对中的反向引物是相同的。
这些概念可用于设计用于本文中提供的任一种方法的引物对。应理解，正向和反向引物被设计成结合相对链(例如，有义链和反义链)以扩增模板的特定基因座的片段。引物对的正向和反向引物可被设计成扩增任意合适大小的核酸片段以检测例如根据本公开内容之SNV靶标的等位基因是否存在。本文中提供的任一种方法均可包括用于获得如本文中所述的一种或更多种引物对的一个或更多个步骤。
应理解，本文中所述的引物对可用于多路复用PCR测定。因此，在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，引物对被设计成在PCR反应中与其他引物对相容。例如，引物对可被设计成在PCR反应中与至少2种、至少5种、至少10种、至少20种、至少30种、至少40种等其他引物对相容。如本文中使用的，如果引物对能够在同一PCR反应中扩增其靶标，则其在PCR反应中是“相容的”。在一些实施方案中，如果在同一PCR反应中多路复用进行时，引物对扩增其靶DNA被抑制不超过1％、不超过2％、不超过5％、不超过10％、不超过15％、不超过20％、不超过25％、不超过30％、不超过35％、不超过40％、不超过45％、不超过50％或不超过60％，则所述引物对是相容的。引物对可由于多种原因而不相容，所述原因包括但不限于引物二聚体的形成和与模板上的脱靶位点结合，这可能干扰另外的引物对。因此，本公开内容的引物对可被设计成避免与其他引物对形成二聚体或限制脱靶结合位点的数目。用于设计用于多路复用PCR测定的引物的示例性方法是本领域中已知的或在本文中别处描述。
在一些实施方案中，本文中所述的引物对用于多路复用PCR测定以量化非天然核酸的量。因此，在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，引物对被设计成检测二倍体的基因组区域，不包括被设计成检测可能是非二倍体的基因组区域的引物对。在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，根据本公开内容使用的引物对不检测重复掩蔽区、已知拷贝数可变区或可以是非二倍体的其他基因组区。
如上所述，在一些实施方案中，本文中提供的任一种方法可包括“错配扩增方法”或“基于错配扩增的定量测定”等的步骤，以确定特定无细胞核酸(例如DNA)的量的值。在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，“基于错配扩增的定量测定”是任何定量测定，其中用本文中所述的MOMA引物扩增核酸，并且可确定核酸的量。此类方法包括多种SNV靶标的多重扩增。这样的方法包括PCT申请No.PCT/US2016/030313的方法，并且本文中提供的任一种方法可包括PCT申请No.PCT/US2016/030313中描述的任一种方法的步骤，这些方法和步骤通过引用并入本文。在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，多重扩增的这种结果可用于通过使用一种或更多种统计学方法(包括中位数、稳健标准偏差、稳健变异系数和不一致值)确定样品中非天然核酸的量。在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，定量测定是定量PCR测定。定量PCR包括实时PCR、数字PCR、TAQMANTM等。在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，PCR是“实时PCR”。这样的PCR是指其中可在扩增过程仍在进行的同时在液相中监测反应动力学的PCR反应。与常规PCR相比，实时PCR提供了在扩增反应中同时实时地检测或量化的能力。基于来自特定染料的荧光强度的提高，甚至可在扩增达到其平台期之前确定靶标的浓度。
使用多种探针可扩展单探针实时PCR的能力。多路复用实时PCR使用多个基于探针的测定，其中每个测定可具有用独特的荧光染料标记的特定探针，使得对于每个测定观察到不同的颜色。实时PCR仪器可区分由不同染料产生的荧光。不同的探针可用各自具有独特的发射谱的不同染料进行标记。谱信号可用离散的光学装置收集，通过一系列滤光器组，并由检测器阵列收集。染料之间的谱重叠可通过使用纯染料谱通过矩阵代数对实验数据去卷积来进行校正。
探针可用于本公开内容的方法，特别地可用于包括量化步骤的那些方法。本文中提供的任一种方法可包括在进行PCR测定中使用探针，同时本文中提供的试剂盒的任一种组合物可包含一种或更多种探针。重要的是，在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，一个或更多个或全部PCR定量测定中的探针与错配引物位于同一链上，而不在相对链上。已发现，将探针这样并入PCR反应中，可提供另外的等位基因特异性区分。如图11-30中所示。
作为一个实例，探针是在5’端具有FAMTM或染料标记并且在3’端具有小沟结合剂(minor groove binder，MGB)非荧光猝灭剂(non-fluorescentquencher，NFQ)的水解探针。探针原理一般依赖于聚合酶在与互补探针结合区杂交期间切割双重标记的探针的5’-3’核酸外切酶活性和基于荧光团的检测。探针可提高定量PCR反应的指数期期间定量测量中检测的特异性。
PCR系统通常依赖于荧光染料或报道子(其中信号与反应中PCR产物的量成正比地提高)的检测和量化。例如，在最简单和最经济的形式中，所述报道子可以是双链DNA特异性染料Green(Molecular Probes)。SYBR Green是与双链DNA小沟结合的染料。当SYBR Green染料与双链DNA结合时，荧光强度提高。随着产生更多的双链扩增子，SYBRGreen染料信号将提高。
在本文中提供的任一种方法中，PCR可以是数字PCR。数字PCR涉及将经稀释的扩增产物分配到多个离散的测试位点中，使得大多数的离散测试位点包含零个或一个扩增产物。然后，分析扩增产物以提供样品中所选目的基因组区域的频率的表示。每个离散测试位点分析一个扩增产物产生每个离散测试位点的二元“是或否”结果，从而允许对所选目的基因组区域进行量化，并且确定所选目的基因组区域相对于彼此的相对频率。在某些方面，作为补充或替代，可使用对应于来自预定区域的基因组区域的扩增产物进行多重分析。可使用来自对两个或更多个预定区域进行分析的结果来量化和确定扩增产物的相对频率数目。使用两个或更多个预定区域来确定样品中的频率通过例如扩增效率的变异而降低偏差的可能性，这通过单次检测测定可以不那么明显。使用数字PCR量化DNA的方法是本领域中已知的，并且先前已经在例如美国专利公开号US20140242582中进行描述。
应理解，可对本文中提供的PCR条件进行改进或优化以根据本文中所述的任一种方法来工作。通常来说，PCR条件基于所使用的酶、靶模板和/或引物。在一些实施方案中，对PCR反应的一种或更多种组分进行改进或优化。可优化的PCR反应组分的一些非限制性实例包括模板DNA、引物(例如，正向引物和反向引物)、脱氧核苷酸(dNTP)、聚合酶、镁浓度、缓冲剂、探针(例如，当进行实时PCR时)、缓冲剂和反应体积。
在前述任一实施方案中，可使用任何DNA聚合酶(催化DNA核苷酸聚合成DNA链的酶)，包括热稳定性聚合酶。合适的聚合酶将是本领域技术人员已知的，并且包括大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段、T7 DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶、T5DNA聚合酶、Klenow类聚合酶、Taq聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Vent聚合酶、噬菌体29、REDTaqTM基因组DNA聚合酶或测序酶。示例性的聚合酶包括但不限于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)pol I、水生栖热菌(Thermus aquaticus，Taq)pol I、嗜热古细菌(Pyrccoccus furiosus，Pfu)、乌兹炽热球菌(Pyrococcus woesei，Pwo)、黄栖热菌(Thermus flavus，Tfl)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus，Tth)、里氏栖热菌(Thermuslitoris，Tli)和海栖热袍菌(Thermotoga maritime，Tma)。这些酶、这些酶的经修饰形式和酶组合可从供应商商购获得，所述供应商包括Roche、Invitrogen、Qiagen，Stratagene和Applied Biosystems。代表性的酶包括(New England Biolabs，Ipswich，MA)、Hot MasterTaqTM(Eppendorf)、Mpx(Finnzymes)、(Fermentas)、KOD(EMD Biosciences)、Z-Taq(TAKARA)和CS3AC/LA(KlenTaq，UniversityCity，MO)。
盐和缓冲剂包括本领域技术人员熟悉的那些，包括分别包含MgCl2，以及Tris-HCl和KCl的那些。通常来说，1.5至2.0nM的镁对于Taq DNA聚合酶是最佳的，然而，最佳的镁浓度可取决于模板、缓冲剂、DNA和dNTP因为每一种都具有与镁形成螯合物的潜力。如果镁[Mg2+]的浓度太低，则不能形成PCR产物。如果镁[Mg2+]的浓度太高，则可见到不期望的PCR产物。在一些实施方案中，镁浓度可通过以0.1mM或0.5mM的增量补充镁浓度直至镁浓度为约5mM来优化。
根据本公开内容使用的缓冲剂可包含添加剂，例如表面活性剂、二甲基亚砜(DMSO)、甘油、牛血清白蛋白(BSA)和聚乙二醇(PEG)，以及本领域技术人员熟悉的其他添加剂。核苷酸一般是三磷酸脱氧核糖核苷，例如三磷酸脱氧腺苷(dATP)、三磷酸脱氧胞苷(dCTP)、三磷酸脱氧鸟苷(dGTP)和三磷酸脱氧胸苷(dTTP)，其也可以以足够的量添加至反应用于扩增靶核酸。在一些实施方案中，一种或更多种dNTP(例如，dATP、dCTP、dGTP、dTTP)的浓度为约10μM至约500μM，这可取决于PCR反应中产生的PCR产物的长度和数量。
在一些实施方案中，根据本公开内容使用的引物是经修饰的。引物可被设计成以高特异性仅与其预期靶标(例如，特定SNV)结合，并且对其他核苷酸序列差异显示出高度区分。可对引物进行修饰以具有特定的计算解链温度(Tm)，例如46℃至64℃的解链温度。为了设计具有期望解链温度的引物，可改变引物的长度和/或可改变引物的GC含量。通常来说，提高引物的GC含量和/或长度将提高引物的Tm。相反，降低引物的GC含量和/或长度通常会降低引物的Tm。应理解的是，可通过相对于靶标有意地并入错配来修饰引物以相对于其他以高灵敏度检测特定SNV(或序列非同一的其他形式)。因此，可通过相对于引物被设计成要结合的特定序列(例如，特定SNV)并入一个或更多个错配来对引物进行修饰。
在一些实施方案中，可改进或优化PCR反应中使用的引物的浓度。在一些实施方案中，PCR反应中引物(例如正向或反向引物)的浓度可以是例如约0.05μM至约1μM。在一些具体实施方案中，每种引物的浓度为约1nM至约1μM。应理解，根据本公开内容的引物可在PCR反应中以相同或不同的浓度使用。例如，引物对中的正向引物可以以0.5μM的浓度使用，而引物对中的反向引物可以以0.1μM使用。引物的浓度可基于包括但不限于以下的因素：引物长度、GC含量、纯度、与靶DNA的错配、或形成引物二聚体的可能性。
在一些实施方案中，对PCR反应的热分布(thermal profile)进行改进或优化。PCR热分布改进的一些非限制性实例包括变性温度和持续时间、退火温度和持续时间，以及延伸时间。
PCR反应溶液的温度可在变性状态、退火状态和延伸状态之间依次地进行预定数目的循环。实际的时间和温度可以是酶、引物和靶标依赖性的。对于任何给定的反应，变性状态在某些实施方案中可以是约70℃至约100℃。另外，退火温度和时间可影响引物与靶核酸内特定基因座结合的特异性和效率，并且对于特定的PCR反应可以是重要的。对于任何给定的反应，退火状态在某些实施方案中可以是约20℃至约75℃。在一些实施例中，退火状态可以是约46℃到64℃。在某些实施方案中，退火状态可在室温(例如，约20℃至约25℃)下进行。
延伸温度和时间还可影响等位基因产物产率。对于给定的酶，延伸状态在某些实施方案中可以是约60℃至约75℃。
由本文中提供的定量测定来量化等位基因的量可如本文中提供的进行，或者如另外本领域普通技术人员显而易见地进行。作为一个实例，分析扩增迹线的一致性和稳健量化。可使用内标(internal standard)来将循环阈值转化为输入核酸(例如，DNA)的量。等位基因的量可作为性能测定的均值来计算，并且可针对基因型进行调整。高效扩增的宽范围表明成功检测出低浓度的核酸。在所提供的任何一种方法中，本文中提供的量(例如的供体百分比)可作为所有性能测定的截尾均值(例如，纳克非天然等位基因相对于纳克天然等位基因的比例)来计算。在一些实施方案中，在所提供的任何一种方法中，本文中提供的量(例如供体百分比)可作为所有性能测定的中位数来计算。量可通过调整基因型来确定。
已经发现，本文中提供的方法和组合物可用于检测样品中的低水平核酸，例如非天然核酸。因此，本文中提供的方法可用于需要检测相对稀有核酸的样品。在一些实施方案中，本文中提供的任一种方法可用于样品以检测样品中少于核酸的1.5％的非天然核酸。在另一些实施方案中，本文中提供的任一种方法可用于这样的样品，其中样品中少于1.3％、1.2％、1.1％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.05％、0.03％或0.01％的核酸是非天然的。在另一些实施方案中，本文中提供的任一种方法可用于这样的样品，其中至少0.005％、0.01％、0.03％或0.05％的核酸是非天然的。在本文中提供的任一种方法的另一些实施方案中，样品中至少0.005％但少于1.3％、1.2％、1.1％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.05％、0.03％或0.01％的核酸是非天然的。
由于能够甚至在低水平下确定非天然核酸的量，本文中提供的方法和组合物可用于评估对象(例如移植物接受者)中的风险。如本文中提供的“风险”是指对象中(例如移植物接受者)任何不期望病症(例如移植物排斥)的存在或不存在，或者这样的病症(例如移植物排斥)的存在或不存在的可能性提高。本文中提供的“风险升高”是指对象中任何不期望的病症的存在，或者这样的病症的存在的可能性升高。本文中提供的“风险降低”是指对象中不存在任何不期望的病症，或者这样的病症的存在的可能性降低(或不存在的可能性升高)。
例如，植入移植物(例如，心脏移植物)之后早期检测排斥可有利于治疗并改善临床结局。移植物排斥仍然是移植物失败和晚期死亡的主要原因，并且通常需要终身监视监测。已示出用免疫抑制治疗来治疗移植物排斥改善治疗结果，特别是如果排斥是早期检测到的。通常使用基于导管的心内膜心肌活检(endomyocardial biopsy，EMB)监测移植物排斥。然而，这种侵入性操作与患者的风险和不适相关，并且对于儿科患者可以是特别不利。因此，本文中提供了用于监视对象(例如移植物接受者)的灵敏性、特异性、成本有效和非侵入性技术。已发现这样的技术允许在早期阶段检测移植物排斥。这样的技术还可用于监测器官恢复以及治疗或治疗的选择和监测，例如抗排斥治疗或抗感染治疗，因此改善患者的恢复并提高存活率。在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，该方法可早在手术(例如移植手术)的14或24小时内对来自对象的一个或更多个样品进行。在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，该方法可早在横断钳闭移除(例如在心脏移植中)的14或24小时内对来自对象的一个或更多个样品进行。在本文中提供的任一种方法中，对于在手术(例如移植手术)的14或24小时内取得的一个或更多个样品，可获得对象中非天然核酸的量。在本文中提供的任一种方法中，对于在横断钳闭移除(例如在心脏移植中)的14或24小时内采集的一个或更多个样品，可获得对象中非天然核酸的量。然后，临床医生可用该量对对象进行评估。
因此，在所提供的任一种方法的一些实施方案中，对象是移植物接受者，并且风险是与移植物相关的风险。在所提供的任一种方法的一些实施方案中，与移植物相关的风险是移植物排斥的风险、移植物的解剖学问题或移植物的损伤。在所提供的任一种方法的一些实施方案中，对移植物的损伤是初始或持续性损伤。在所提供的任一种方法的一些实施方案中，与移植物相关的风险是急性病症或慢性病症。在所提供的任一种方法的一些实施方案中，急性病症是移植物排斥，包括细胞排斥或抗体介导的排斥。在所提供的任一种方法的一些实施方案中，慢性病症是移植物血管病变。在所提供的任一种方法的一些实施方案中，与移植物相关的风险指示损伤的严重程度。在所提供的任一种方法的一些实施方案中，与移植物相关的风险是感染的风险或状态。
本文中使用的“移植物”是指出于替换接受者的受损或缺失的器官的目的而将器官从供体移至接受者。移植物可以是一个器官或多于一个器官。在一些实施方案中，术语“移植物”是指移植物的器官，并且这样的含义从使用该术语的上下文中将是清楚的。可移植的器官的实例包括但不限于心脏、肾、肾、肝、肺、胰腺、肠等。本文中提供的任一种方法可用于来自经历了本文中提供的任一种或更多种器官的移植物的对象的样品。在一些实施方案中，移植物是心脏移植物。
例如，通过评估非天然cf-DNA的量，例如供体特异性无细胞DNA(DS cf-DNA)，一种与移植物排斥相关的细胞损伤的生物标志物，可确定移植物接受者中的风险。DS cf-DNA是指可能从移植物器官脱落的DNA，其序列与捐献所移植器官的供体的基因型相匹配(全部或部分)。
移植物在接受者中的风险可例如通过评估非天然cf-DNA(例如供体特异性无细胞DNA)的量来确定，如本文中所述，使用所提供的任一种方法。
在一些实施方案中，本文中提供的任一种方法可包括使非天然核酸的提高和/或非天然核酸相对于天然核酸或总核酸的比例或百分比的提高与病症(例如移植物排斥)的风险升高相关联。在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，相关联包括将非天然核酸的水平(例如，浓度、比例或百分比)与阈值进行比较以鉴定病症风险升高或降低的对象。在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，与阈值相比具有非天然核酸的量提高的对象被鉴定为病症的风险升高。在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，与阈值相比非天然核酸的量降低或类似的对象被鉴定为病症的风险降低。
本文中使用的“量”是指用于测量核酸的任何定量值，并且可以以绝对量或相对量给出。此外，该量可以是总量、频率、比例、百分比等。本文中使用的术语“水平”可用于代替“量”，但旨在是指相同类型的值。
本文中使用的“阈值”是指指示病症的存在或不存在或者风险的存在或不存在的任何预定水平或水平范围。阈值可采用多种形式。其可以是单个截止值，例如中位数或均值。其可基于比较组来建立，例如在一个确定组中的风险是另一个确定组中的风险的两倍的情况下。其可以是一个范围，例如在以下情况下：将测试群体平等地(或不平等地)分组，例如低风险组、中等风险组和高风险组；或者分为四个象限，最低象限是风险最低的对象，最高象限是风险最高的对象。阈值可取决于所选的特定群体。例如，表面健康的群体将具有不同的“正常”范围。作为另一个实例，可由在病症或风险存在之前或者在治疗过程之后的基线值确定阈值。这样的基线可指示对象中与所测试风险或病症不相关的正常或其他状态。在一些实施方案中，阈值可以是所测试对象的基线值或来自另一时间点(例如在前的时间点)的值。因此，所选择的预定值可将对象所属的类别纳入考虑之中。本领域普通技术人员仅用常规实验即可选择合适的范围和类别。
还可随时间监测非天然核酸水平的变化。例如，可使用非天然核酸的量(例如比例或百分比)相对于阈值的改变作为风险(例如与移植物相关的风险)的非侵入性临床指标。这可允许测量临床状态的变异和/或允许计算正常值或基线水平。在器官移植中，这可形成针对排斥或与其相关的病症的风险的个体化非侵入性筛选测试的基础。一般来说，如本文中提供的，非天然核酸的量(例如比例或百分比)可指示与病症相关的风险(例如与接受者中移植物相关的风险，例如排斥)的存在或不存在，或者可指示进一步测试或监视的需求。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还可包括用于评估病症(例如移植物排斥、移植物损伤等)的另外的测试。另外的测试可以是本文中提供的任一种方法。
在本文中提供的关于心脏移植物接受者的任一种方法的一些实施方案中，这样的阈值等于或大于0.8％、0.9％或1％，其中，分别地，水平在此之上指示风险升高，并且其中水平在此处或水平低于此指示风险降低。在本文中提供的关于心脏移植物接受者的任一种方法的一些实施方案中，这样的阈值等于或大于1.1％、1.2％或1.3％，其中水平高于此指示风险升高，并且其中水平在此处或水平低于此指示风险降低。
在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，当确定非天然核酸量(例如比例或百分比)高于阈值时，本文中提供的任一种方法还可包括对对象或来自对象的样品进行另外的测试。这样的其他测试可以是本领域普通技术人员已知可用于确定例如在移植物接受者的对象中存在或不存在风险的任何其他测试。在一些实施方案中，其他测试是本文中提供的任一种方法。在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，对象是移植物接受者，且另一种测试是确定移植物接受者中BNP和/或肌钙蛋白的水平。在本文中提供的任一种方法的另一些实施方案中，除了BNP和/或肌钙蛋白水平或其代替之外的其他测试是超声心动图。
在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，其中确定非天然核酸量(例如比例或百分比)小于阈值，则可以不需要另外的测试或向对象推荐另外的测试和/或不需要治疗或向对象建议治疗。虽然在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，可确定这样的对象可仍需要随时间进行监测。应理解，可使用其他阈值作为本发明的一些实施方案。在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，所述方法还可包括对对象进行另外的测试或推荐进行另外的测试和/或对对象进行治疗或建议治疗。在这些实施方案的一些中，另外的测试是本文中提供的任一种方法。
在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，该方法还可包括基于所述量确定治疗方案。如本文所用，“确定治疗方案”是指确定用于治疗对象的行动过程。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，确定治疗方案包括确定向对象提供的适当的治疗或关于适当治疗的信息。在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，所述确定包括向对象提供适当治疗或关于适当治疗的信息。如本文所用，可以以书面形式或电子形式提供关于治疗或治疗或监测的信息。在一些实施方案中，可将信息作为计算机可读指令来提供。在一些实施方案中，可口头提供信息。
在这些实施方案中的一些中，治疗是抗排斥治疗或抗感染。在一些实施方案中，信息以书面形式或电子形式提供。在一些实施方案中，可将信息作为计算机可读指令来提供。
抗排斥治疗包括例如向移植物接受者施用免疫抑制剂。“施用”意指以在药理学上可用的方式向对象直接或间接地提供物质。因此，该术语包括指导对象或另一方施用物质(例如向其开处方)。可通过本领域中已知的任何方法完成治疗或治疗的施用(参见例如Harrison’s Principle of Internal Medicine，McGraw Hill Inc.)。优选地，治疗或治疗的施用以治疗有效量发生。用于不同施用途径的组合物是本领域中已知的(参见例如E.W.Martin的Remington’s Pharmaceutical Sciences)。
免疫抑制剂包括但不限于皮质类固醇(例如，泼尼松龙或氢化可的松)、糖皮质激素、细胞抑制剂、烷化剂(例如，氮芥类(环磷酰胺)、亚硝基脲类、铂化合物、环磷酰胺(Cytoxan))、抗代谢物类(例如叶酸类似物(例如甲氨蝶呤)、嘌呤类似物(例如硫唑嘌呤和巯嘌呤)、嘧啶类似物和蛋白质合成抑制剂)、细胞毒性抗生素(例如，放线菌素D、蒽环类、丝裂霉素C、博来霉素、光辉霉素)、抗体(例如，抗CD20，抗-IL-1、抗IL-2Rα、抗T细胞或抗CD-3单克隆抗体和多克隆抗体，例如Atgam和即复宁(Thymoglobuline)、作用于免疫嗜素(immunophilin)的药物、环孢素、他克莫司、西罗莫司、干扰素、阿片样物质(opiod)、TNF-结合蛋白、霉酚酸酯、芬洛莫德和多里菌素(myriocin)。在一些实施方案中，抗排斥治疗包括血液转移或骨髓移植物。治疗还可包括用于治疗全身病症(例如脓毒症)的治疗。脓毒症的治疗可包括静脉内输液(intravenous fluid)、抗生素、外科引流、早期目标定向治疗(early goal directed therapy，EGDT)，血管加压剂、类固醇、活化蛋白C、屈曲可净α(drotrecogin alfa(活化的)、氧气和器官功能障碍的适当支持物。这可包括肾衰竭的血液透析、肺功能障碍的机械通气、血液制品的输注以及循环衰竭的药物和流体治疗。确保足够的营养(优选通过肠内营养，但如果有必要，通过肠外营养)也可包括特别是在长期疾病期间。其他相关治疗可包括胰岛素和药物以预防深静脉血栓形成和胃溃疡。
在其中指示感染的一些实施方案中，用于治疗移植物的接受者的治疗还可包括用于治疗细菌、真菌和/或病毒感染的治疗。这样的治疗包括抗生素。其他实例包括但不限于杀阿米巴剂、氨基糖苷类、驱虫剂、抗真菌剂、唑类抗真菌剂、棘白菌素类、多烯类、二芳基喹啉类、酰肼衍生物、烟酸衍生物、利福霉素衍生物、链霉菌属衍生物、抗病毒剂、趋化因子接受者拮抗剂、整合酶链转移抑制剂、神经氨酸酶抑制剂、NNRTI、NS5A抑制剂、核苷逆转录酶抑制剂(NRTI)、蛋白酶抑制剂、嘌呤核苷、碳青霉烯类、头孢菌素、甘氨酰环素类(glycylcyclines)、抗麻风剂(leprostatics)、林可霉素衍生物、大环内酯衍生物、酮内酯类、大环内酯类、唑烷酮类抗生素、青霉素类、β-内酰胺酶类抑制剂、喹诺酮类、磺胺类和四环素类。其他这样的治疗是本领域普通技术人员已知的。本文中提供的任一种方法可包括向对象施用或建议抗感染治疗(在一些实施方案中，包括向对象提供关于治疗的信息)。在一些实施方案中，抗感染治疗可以是免疫抑制治疗中的量或频率的降低或施用于对象的免疫抑制治疗的改变。其他治疗是本领域普通技术人员已知的。
已经发现，对临床医生特别可用的是包含本文中提供的量、结果或其他值的报告。因此，在一个方面，提供了这样的报告。报告可以是口头、书面(或硬拷贝)或电子形式，例如可被可视化或显示的形式。在一些实施方案中，本文中提供的每个测定的“原始”结果在报告中提供，并且从该报告中可采取进一步的步骤来分析非天然核酸(如供体特异性无细胞DNA)的量。在另一些实施方案中，该报告提供了针对对象的非天然核酸(例如供体特异性无细胞DNA)的量的多个值。根据这些量，在一些实施方案中，临床医生可随时间评估对对象的治疗需求或监测对象的需求。
本文中提供的任一种方法可包括从获自对象(例如移植物的接受者)的样品提取核酸(例如无细胞DNA)。这样的提取可使用本领域中已知或本文中另外提供的任何方法(参见例如Current Protocols in Molecular Biology，最新版本，或QIAamp循环核酸试剂盒或其他合适的可商购获得试剂盒)来进行。描述了用于从血液分离无细胞DNA的示例性方法。从对象收集包含抗凝剂(例如EDTA或DTA)的血液。使包含cf-DNA的血浆与血液中存在的细胞分离(例如，通过离心或过滤)。可进行任选的第二分离以从血浆中除去任何剩余的细胞(例如，第二离心或过滤步骤)。然后，可使用本领域中已知的任何方法，例如使用商用试剂盒(例如由Qiagen生产的那些)来提取cf-DNA。用于提取cf-DNA的其他示例性方法也是本领域中已知的(参见例如Cell-Free Plasma DNA as a Predictor of Outcome in SevereSepsis and Septic Shock.Clin.Chem.2008，第54卷，第1000-1007页；Prediction ofMYCN Amplification in Neuroblastoma UsingSerum DNA and Real-Time QuantitativePolymerase Chain Reaction.JCO2005，第23卷，第5205-5210页；Circulating NucleicAcids in Blood of Healthy Male and Female Donors.Clin.Chem.2005，第51卷第1317-1319页；Use of Magnetic Beads for Plasma Cell-free DNA Extraction：TowardAutomation of Plasma DNA Analysis for Molecular Diagnostics.Clin.Chem.2003，第49卷，第1953-1955页；Chiu RWK，Poon LLM，Lau TK，Leung TN，Wong EMC，Lo YMD.Effectsof blood-processing protocols on fetal and total DNA quantification inmaternal plasma.Clin Chem 2001；47：1607-1613；和Swinkels等Effects of Blood-Processing Protocols on Cell-free DNA Quantification in Plasma.ClinicalChemistry，2003，第49卷，第3期，525-526)。
如本文中使用的，来自对象的样品可以是生物样品。这样的生物样品的实例包括全血、血浆、血清等。在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，可向样品添加另外的核酸，例如标准品。
在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，进行早期的另外扩增步骤。扩增的示例性方法如下，并且这样的方法可包括在本文中提供的任一种方法中。对于约100种靶标使用Q5DNA聚合酶在PCR中扩增约15ng的无细胞血浆DNA，其中合并的引物总共为6uM。样品进行约35个循环。反应总共为25ul。在扩增后，可使用数种方法清洗样品，包括AMPURE珠净化、珠纯化、或者简单的Exosap it或Zymo。这样的扩增步骤用于如本文中提供的一些方法中。
本公开内容还提供了用于确定多种SNV靶标的方法，所述SNV靶标用于本文中提供的任一种方法中或者可从其来源的引物的任一种组合物中。在一些实施方案中，确定多种SNV靶标的方法包括a)鉴定个体群体中的多种高度杂合的SNV，b)设计跨越每种SNV的一种或更多种引物，c)选择足够特异性的引物，d)评估引物的多路复用能力，例如在共同的解链温度和/或共同的溶液中，以及e)鉴定用引物或其子集均匀扩增的序列。
如本文中使用的，“高度杂合的SNV”是在群体中具有足够高百分比的次要等位基因的那些。在一些实施方案中，次要等位基因在群体中为至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％或35％或更多。在任一个这些实施方案中，次要等位基因在群体中为小于50％、49％、45％、或40％。这样的SNV提高了提供天然与非天然核酸之间不同的靶标的可能性。
引物被设计成通常跨越70bp窗口，但也可选择一些其他窗口，例如60bp与80bp之间的窗口。而且，通常来说，期望SNV在该窗口的中间下降。例如，对于70bp的窗口，SNV在20至50的碱基之间，例如在30至40的碱基之间。本文中提供的引物被设计为与SNV相邻。
如本文中使用的“足够特异性的引物”是那些示出在预期的等位基因的扩增与非预期的等位基因的扩增之间存在区别的引物。因此，在PCR的情况下，在两者的扩增之间期望循环间隙。在一个实施方案中，循环间隙是至少5、6、7或8个循环间隙。
此外，基于解链温度选择序列，通常选择解链温度为45℃至55℃的序列作为“中等范围序列”。可能期望其他温度范围并且可由本领域普通技术人员确定。“中等范围序列”通常是可在温度内以多路复用扩增形式扩增的序列。在一些实施方案中，gc％含量是30％至70％，例如33％至66％。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还可包括排除与困难区域相关的序列。“困难区域”是具有使得难以可靠地预测靶序列或被认为不适合多路复用扩增的含量或特征的任何区域。这样的区域包括综合征区域、低复杂性区域、具有高GC含量的区域或具有连续串联重复的区域。其他这样的特征可被确定或者为本领域普通技术人员另外所知。
在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，所述引物对被设计为相容地用于本文中提供的定量测定。例如，可设计引物对以防止引物二聚体和/或限制脱靶结合位点的数目。应理解的是，所提供的任一种方法、组合物或试剂盒的多种引物对可根据本文中所述的任一种方法进行优化或设计。
本发明的不同方面可单独地、组合或以前文中所述实施方案中未具体讨论的多种布置使用，并且因此其应用不限于在先描述中所述的或附图中举例说明的组分的细节和布置。例如，一个实施方案中描述的方面可以以任何方式与其他实施方案中描述的方面组合。
此外，本发明的一些实施方案可作为一种或更多种方法实施，其实例已提供。作为方法的一部分执行的动作可以以任何合适的方式排序。因此，可构建其中动作以不同于所举例说明的顺序执行的实施方案，其可包括同时进行一些动作，即使在举例说明性实施方案中被示为顺序动作。
在权利要求书中使用例如“第一”、“第二”、“第三”等的序数术语来修饰权利要求要素并非自身暗示一个权利要求要素相对于另一个具有任何优先权、优先性或顺序或者其中执行方法动作的时间顺序。这样的术语仅用作标记以区分具有某一名称的一个权利要求要素与具有相同名称(除序数术语的使用之外)的另一个要素。
本文中使用的用语和术语是出于描述的目的，并且不应被认为是限制性的。“包括”、“包含”、“具有”、“含有”、“涉及”及其变化形式的使用意味着涵盖其后列出的项目和附加项目。
已经详细描述了本发明的数个实施方案，本领域技术人员将容易想到不同的修改和改进。这样的修改和改进旨在落入本发明的精神和范围内。因此，前面的描述仅是作为示例，而不是旨在是限制性的。以下描述提供了本文中提供的方法的一些实例。
实施例
实施例1-具有接受者和供体基因型信息
SNV靶标选择
如目前所述，根据本公开内容的用于多路复用的靶标的鉴定可包括一个或更多个以下步骤。首先，可在数个种族对照群体(Hardy-Weinberg p＞0.25)上(不包括已知的困难区域)筛选高度杂合的SNP。困难区域包括患者中可能异常的综合征区和低复杂性的区域，包括染色体的着丝粒和端粒。然后可在计算机中(in silico)设计期望长度的靶标片段。具体地，可设计跨越每个SNP的70bp窗口的两个20至26bp引物。然后可使用BLAST将所有候选引物查询到GCRh37。可保留那些被发现具有足够特异性的引物，并监测脱靶的命中，特别是在片段的3’末端。可分析脱靶候选物命中之将在尺寸选择后还存在的成对片段生成。然后可对选择的引物进行计算机多路复用评价。引物的计算解链温度和鸟嘌呤-胞嘧啶百分比(GC％)可用于过滤中等范围序列。迭代遗传算法和模拟退火可用于选择与400种靶标相容的候选引物，最终导致选择800种引物。可产生800种引物并在常见溶液中在共同的解链温度下物理地测试多路复用能力。具体地，可基于多路复用筛选中的均匀扩增和中等读取深度窗口来过滤引物。可使用表现最佳的多路复用SNP为MOMA设计了48种测定。每种SNP可具有在四种错配选择处以WT/MUT中设计的探针；每次测定8种探针。可在70bp富集的片段内设计新的嵌套引物。最后，可实验性地扩增引物以评价扩增效率(使用TAQMANTM，一式三份，8种探针×48个测定)。
每种测定的先验基因型分型信息
例如，使用每种所测定的SNP处已知或可能的天然或非天然基因型，选择信息性测定的子集。注意，可在非天然是任何其他基因型的情况下使用对象纯合位点。另外，如果非天然的基因型未知，则可被推断。还可通过测序、SNP微阵列或在已知的0％(纯净接受者)样品上应用MOMA测定来了解基因型。
多路复用测定性能的后处理分析
可在整个实验组中评估患者特异性MOMA探针偏倚。可细化迭代选择以进行最终的非天然百分比调用。
重建实验
可使用具有已知混合比例的重建血浆样品评价测定的灵敏度和精密度。具体地，可评价1∶10、1∶20、1∶100、1∶200和1∶1000的比例。通常来说，在一些实施方案中，可如本文中所述使用针对95种SNV靶标的引物。
为了在没有非天然基因型信息的情况下工作，可执行以下程序以推断血浆样品中的非天然特异性无细胞DNA的信息性测定并允许对其进行定量。可在完整信息情境中评价所有测定的性能。因此，该程序假定在每次测定时有干净的AA/AB/BB基因型和每种定量的无偏倚行为。在天然基因型的情况下，可选择已知在对象中纯合的测定。污染可归因于非天然核酸，并且测定收集产生三模态分布(tri-modal distribution)，其中三簇测定对应于非信息性、半信息性和完全信息性测定。通过足够数目的接受者纯合测定，可假设存在供体完全信息性测定。
如果天然基因型是纯合的并且是已知的，则如果观察到不是非天然基因型的测量，那么真正非天然纯合的探针将具有最高的簇并且等于猜测，而非天然杂合的那些将是猜测的一半。可绘制概率分布，并且可以使用最大期望值法算法(EM)来推断非天然基因型。这可用于推断本文中提供的任一种方法中的非天然基因型频率。
因此，EM算法用于在所有所测定的SNV靶标处推断最可能的非天然基因型。利用推断的非本地基因型，量化可如完整信息情境中那样进行。EM可开始于假设在测定中发现的次要等位基因比例遵循三态分布，对于对象和非天然的每种组合一种，假设所有测定在对象中是“AA”(或从“BB”翻转而大部分没有损失)。在所有非天然基因型都是未知的情况下，可从知识引导得到(bootstrap)任何表现出几乎为零的次要等位基因的测定都是非天然AA，并且最高的是非天然BB。记录所有非天然基因型的初始猜测，并计算每个簇的均值。强制使非天然BB测定的均值是非天然AB的两倍限制了搜索。然后，该算法基于聚类和内置假设重新分配猜测的非天然基因型。该过程是迭代的，直至不再进行任何更改。最终结果是一组给出其与背景的测量差异最可能的非天然基因型。通常来说，每种靶标都落入模型中；如果在最大化之后结果在组之间可能会被抛到一边。
重建实验的结果表明概念验证(图3)。其中针对纯合子接受者存在纯合供体的一个靶标是完全信息性的(阴影数据点)。其中针对纯合子接受者存在杂合供体的另一个靶标是半信息性的(空心数据点)。此外，用错配方法分析来自移植物接受者患者的血浆样品(图4)。所有数据均来自已进行活检的患者。暗点表示排斥。图5中示出的另外的数据表明，本文中提供的错配方法与实际血浆样品一起使用。移植手术后，供体百分比水平下降。通常来说，使用如本文中所述的95种SNV靶标的引物。
实施例2-具有接受者但不具有供体基因型信息
为了在没有供体基因型信息的情况下工作，可进行以下操作以推断信息性测定并允许定量血浆样品中供体特异性无细胞DNA。在完整信息情境中评价所有测定的性能。因此，该操作假定每次测定时有干净的AA/AB/BB基因型和每种定量的无偏倚行为。对于接受者基因型，选择已知在接受者中纯合的测定。任何污染都归因于供体核酸，并且测定收集产生三模态分布，其中三簇测定对应于非信息性、半信息性和完全信息性测定。通过足够数目的接受者纯合测定，可推测存在供体完全信息性测定。
如果接受者基因型是纯合的并且是已知的，则如果观察到不是接受者基因型的测量，那么真正供体-纯合的探针将具有最高的簇并且等于猜测，而供体杂合的那些探针将是猜测的一半。可绘制概率分布并且可使用最大期望值法算法(EM)来推断供体基因型。这可用于在本文中提供的任一种方法中推断供体基因型频率。因此，EM算法用于在所有所测定的SNV靶标处推断最可能的供体基因型。利用推断的供体基因型，可在完全信息情境中进行量化。EM可开始于假设在测定中存在的次要等位基因比例遵循三态分布，对于接受者和供体的每种组合一种，假定所有测定在接受者中是“AA”(或从“BB”翻转而大部分没有损失)。由于所有供体基因型都未知，因此可从知识引导得到显示几乎为零次要等位基因的任何测定都是供体AA，并且最高的是供体BB。记录对所有供体基因型的初始猜测，并计算每个簇的均值。强制使BB测定的均值是供体AB的两倍限制了搜索。然后，该算法基于聚类和内置假设重新分配猜测的供体基因型。该过程是迭代的，直到不再进行任何更改。最终结果是一组给出其与背景的测量差异最可能的供体基因型。通常来说，每个靶标都落入模型中；如果在最大化之后结果在组之间可能会被抛到一边。
图6示出了以这种方式处理的血浆样品的示例性结果。对于任何存在接受者纯合子的测定，x轴是供体％。点行表示单独的PCR测定结果。圆圈最底部行表示供体基因型的初始猜测，一些AA、一些A/B和一些BB。然后绘制实体曲线，表示了以初始测定为中心的β分布，红色为纯合(完全信息性)，且绿色表示杂合(半信息性)，黑色曲线表示非信息性测定或背景噪声的分布。在第二行中对于测定重新分配了更新的猜测。第二行的曲线使用虚线。最上面的行是最终评估，因为没有发生变化。绿色虚线曲线的双倍峰对应于最大似然法供体％调用，在约10％，或等于红色曲线的均值。
以10％、5％、1％、0.5％和0.1％产生使用来自两个个体的DNA的重建实验(重组子1)。用靶标的多路复用文库扩增所有混合物、清洗，然后使用MOMA方法定量基因型分型。对每个个体进行基因型分型进行分析以便了解其真实的基因型。使用主要个体基因型的先验知识(寻找纯合位点)确定信息性靶标并且其中第二个个体不同，并使用信息性靶标计算分数(百分比)。然后计算分数(以黑色表示以指示“具有基因型”信息)。
还以10％、5％、1％、0.5％和0.1％从两个个体(主要和次要)开始创建第二次重建实验(重组子2)。用靶标的多路复用文库扩增所有混合物、清洁，然后使用MOMA方法定量地进行基因型分型。通过对每个个体进行基因型分型进行分析以便了解其真实的基因型。使用如上所述的第二个体的基因型的先验知识确定信息性靶标。然后计算分数(以黑色表示以指示“具有基因型”信息)。
在第二天再次允许这些重建(重组子3)。
然后仅使用可用于第一个体(主要DNA贡献者)的基因型分型信息而不用来自第二个体(次要DNA贡献者)的基因型分型信息再次分析相同的重建样品(重组子1、2、3)。约38至40种靶标用于计算没有进行基因型分型(没有供体模拟)的分数，阴影(图8)。发现接受者纯合的每个靶标可能是可用的。圆圈为第一个猜测，仅阈值；在右边的那些被认为是完全信息性的，而在左边那些并不是。顶部的三角形是相同的靶标，但对于最终的信息性确定，他们被重新着色。发现最大期望值法优于简单阈值。
实施例3-具有截尾均值、中位数和未截尾均值的重建实验
进行重建实验，其中以不同比例混合两个DNA样品以测试MOMA测定的准确度和精密度。在下面给出了具有三种类型的输出量度(截尾均值、中位数和未截尾均值)的结果。
管8没有DNA，阴性对照样品准确地反映了缺乏可用的靶标，且“NA”为供体％。截尾均值降低两个最低报告靶标和两个最高报告靶标，从而降低离群值的影响。中位数报告最中心的值。原始均值是标准地定义的均值。最后一列是分析中使用的靶标数量，从94种候选靶标降低到仅具有该特定接受者/供体对的那些信息性基因型，并且还过滤会产生不可靠值的行为不当的靶标或不良扩增的靶标。
结果发现原始均值受个别离群值靶标值的强烈偏倚。在十三个样本中的七个样本中，与其他两个候选量度相比，中位数的绝对值与“预期百分比”更接近。原始均值最接近5，且截尾中位数最接近3。总的来说，中位数更经常更准确。
如上所述进行另一个重建实验。
管3是意外的样品失败，据信是由于文库扩增不良。同样，原始均值受个别离群值靶标值的强烈偏倚。在十三个样本中的五个样本中，与其他两个候选量度相比，中位数的绝对值再次更接近“预期百分比”。原始均值最接近5，且截尾最接近4。
如上所述进行另一个重建实验。
同样，原始均值受个别离群值靶标值的强烈偏倚。在十四个样本中的九个样本中，与其他两个候选量度相比，中位数的绝对值再次更接近“预期百分比”。原始均值最接近7，且截尾最接近0。总的来说，中位数更经常更准确。
实施例4-计算机实现的实施方案的实施例
在一些实施方案中，上述诊断技术可通过执行一种或更多种软件设施的一种或更多种计算装置来实现以随时间分析对象的样品、测量样品中的无细胞核酸(例如DNA)并基于一种或更多种样品产生诊断结果。图31示出了可用其操作一些实施方案的计算机系统的一个实例，但应理解，实施方案不限于使用图31中所示类型的系统来操作。
图31的计算机系统包括对象802和可从对象806获得样品806的临床医生804。如从前述应理解的，样品806可以是用于对象802的任何合适的生物材料样品，其可用于测量对象802(包括血液样品)中无细胞核酸(例如DNA)的存在。可将样品806提供给分析装置808，普通技术人员将从前述内容中理解其将分析样品808以确定(包括评估)样品806和/或对象802中非天然无细胞核酸(例如DNA)的量。为了便于举例说明，将分析装置808描绘为单个装置，但应理解，分析装置808可采用任何合适的形式，并且在一些实施方案中，可作为多个装置实现。为了确定样品806和/或对象802中的无细胞核酸(例如DNA)的量，分析装置808可执行上述任何技术，并且不限于进行任何特定的分析。分析装置808可包含一个或更多个处理器以执行在软件中实现的分析设施，其可驱动处理器以操作其他硬件并接收由其他硬件执行的任务的结果以确定分析的总结果(其可以是样品806和/或对象802中的无细胞核酸(例如DNA)的量)。分析设施可存储在装置808的一个或更多个计算机可读存储介质(例如存储器)中。在另一些实施方案中，本文中描述的用于分析样品的技术可部分地或完全地在一个或更多个专用计算机组件(例如专用集成电路(Application Specific IntegratedCircuits，ASIC))中实现，或者通过可代替软件实施的任何其他合适形式的计算机组件来实现。
在一些实施方案中，临床医生804可直接将样品806提供给分析装置808，并且除了从对象802获得样品806之外还可操作装置808，而在另一些实施方案中，装置808可在地理上位于远离临床医生804的位置，并且对象802和样品806可需要被运送或以其他方式转移至分析装置808的位置。在一些实施方案中，样品806可(例如，经由任何合适的界面输入)与样品806和/或对象802、获得样品806的日期和/或时间、或者描述或识别样品806之其他信息的标识符一起提供给分析装置808。
在一些实施方案中，分析装置808可配置成将对样品806执行的分析的结果提供给计算装置810，所述计算装置810可包括可作为数据库或其他合适的数据存储的数据存储810A来实现。在一些实施方案中，计算装置810可作为一种或更多种服务器实现，包括作为例如云服务提供商的分布式计算平台的一种或更多种物理和/或虚拟机。在另一些实施方案中，装置810可作为台式或膝上型个人计算机、智能移动电话、平板计算机、专用硬件装置或其他计算装置实现。
在一些实施方案中，分析装置808可经由一种或更多种有线和/或无线、本地和/或广域计算机通信网络(包括因特网)将其分析结果传送至装置810。可使用任何合适的协议传达分析的结果，并且可与描述或识别样品806的信息，例如样品806和/或对象802的标识符或获得样品806的日期和/或时间一起传送。
计算装置810可包括一种或更多种处理器以执行在软件中实现的诊断设施，其可驱动处理器来执行本文中描述的诊断技术。诊断设施可存储在装置810的一种或更多种计算机可读存储介质(例如存储器)中。在另一些实施方案中，本文中描述的用于分析样品的技术可部分地或全部地在一种或更多种专用计算机组件(例如专用集成电路(ASIC))中，或通过可代替软件实现的任何其他合适形式的计算机组件来实现。
诊断设施可接收分析的结果以及描述或识别样品806的信息，并且可将该信息存储在数据存储810A中。该信息可与对于对象802的其他信息相关联地存储在数据存储810A中，例如在关于对象802的先前样品的信息先前由诊断设施接收和存储的情况下。关于多个样品的信息可使用通用标识符(common identifier)(例如对象802的标识符)来关联。在一些情况下，数据存储810A可包括用于多个不同对象的信息。
还可操作诊断设施以分析由用户输入识别的特定对象802的一种或更多种样品806的分析结果，以便确定对象802的诊断。诊断可以是对象802患有、可患有或可在将来发生特定病症的风险的结论。诊断设施可使用上述任何多种实例来确定诊断，包括通过将针对特定样品806确定的无细胞核酸(例如DNA)的量与一种或更多种阈值进行比较，或者通过比较对样品806确定的无细胞核酸(例如DNA)的量相对于一种或更多种阈值随时间的变化。例如，诊断设施可通过将同一样品806的非天然无细胞核酸(例如DNA)的量与另一个阈值进行比较来确定对象802的病症的风险。基于与阈值的比较，诊断设施可产生指示对象802的病症的风险的输出。
如从前述应理解的，在一些实施方案中，诊断设施可配置有不同的阈值，可将无细胞核酸(例如DNA)的量与其进行比较。例如，不同的阈值可对应于不同的人口统计组(年龄、性别、种族、经济类别、病史中特定操作/病症/其他的存在或不存在，或其他人口统计类别)、不同的病症和/或其他参数或参数的组合。在这样的一些实施方案中，诊断设施可配置成选择与其比较无细胞核酸(例如DNA)的量的阈值，其中不同的阈值存储在计算装置810的存储器中。因此，在基于人口统计组阈值不同的一些实施方案中，可基于对象802的人口统计信息进行选择，并且在这些情况下，可将对象802的人口统计信息提供给诊断设施或使用对象802的标识符通过诊断设施检索(来自另一个计算装置，或可以是与数据存储810A相同或不同的数据储存或来自任何其他合适的来源)。作为替代或补充，可基于待确定风险的条件来进行选择，并且诊断设施可在确定风险之前接收作为输入的条件并使用该条件来选择确定风险的基础的阈值。应理解，在支持多个阈值的一些实施方案中，诊断设施不限于以任何特定方式选择阈值。
在一些实施方案中，诊断设施可配置成输出以向用户呈现用户界面，该用户界面包括对象802的诊断的风险和/或诊断的基础。诊断的基础可包括例如对于对象802在一种或更多种样品806中检测的无细胞核酸(例如DNA)的量。在一些实施方案中，用户界面可包括上面讨论的结果、值、量、图等的任何实例。它们可包括随时间推移的结果、值、量等。在一些情况下，可对图进行注释以向用户指示图的不同区域如何可对应于可以从图中显示的数据的分析产生的不同诊断。例如，可将图数据所针对的阈值进行比较以确定分析可施加在图上。这可包括向图添加线条、将图分成部分等。在一些实施方案中，所述部分可附加地或作为替代地被加阴影，例如用不同透明度和/或颜色的阴影。在诊断设施评价多于两个阈值的一些实施方案中，可通过线和/或阴影指示更多的区域。
与可通过其他用户界面提供的相比，特别是具有线条和/或阴影的用户界面可向用户提供更直观且更快速评阅的界面，以基于无细胞核酸(例如DNA)的量确定对象802的风险。这样，对于如本文中提供的用户界面可存在特定且实质性的益处。与可通过其他用户界面提供的相比，特别是具有线条和/或阴影的用户界面还可为用户提供更直观且更快速的评阅界面，以基于无细胞核酸(例如DNA)的量确定对象802的风险。然而，应理解，实施方案不限于用任何特定用户界面来实现。
在一些实施方案中，诊断设施可将诊断或用户界面输出至可由对象802和/或临床医生(可以是临床医生804或其他临床医生)操作的一种或更多种其他计算装置814(包括装置814A、814B)。诊断设施可经由网络812将诊断和/或用户界面传送至装置814。
根据本文中描述的原理操作的技术可以以任何合适的方式实现。上面讨论中包括一系列流程图，示出了基于无细胞核酸(例如DNA)的量的分析来确定病症风险之多种方法的步骤和动作。上面讨论的处理和决策块(decision block)表示可包括在执行这些多种过程的算法中的步骤和动作。从这些过程导出的算法可作为与一种或更多种单用途或多用途处理器的操作集成并指导其操作的软件来实现，可作为功能等效电路(例如数字信号处理(Digital Signal Processing，DSP)电路或应用型专用集成电路(Application-SpecificIntegrated Circuit，ASIC))来实现，或者可以以任何其他合适的方式实现。应理解，实施方案不限于任何特定电路或任何特定编程语言或编程语言类型的任何特定语法(syntax)或操作。相反，本领域技术人员可使用上面的描述来制造电路或实现计算机软件算法以执行实施本文中描述的技术类型的特定装置的处理。还应理解的是，除非本文中另有指示，否则上述步骤和/或动作的特定顺序仅是举例说明可被实现的算法，并且可在本文中描述的原理的实现和实施方案中变化。
因此，在一些实施方案中，本文中描述的技术可体现为作为软件(包括作为应用软件、系统软件、固件、中间件、嵌入代码或任何其他合适类型的计算机代码)的计算机可执行指令来实现。这样的计算机可执行指令可使用许多合适的编程语言和/或编程或脚本工具中的任一种来编写，并且还可被编译为在框架或虚拟机上执行的可执行机器语言代码或中间代码。
当本文中描述的技术体现为计算机可执行指令时，这些计算机可执行指令可以以任何合适的方式实现，包括作为多种功能设施，每种功能设施提供一种或更多种操作以完成根据这些技术操作的算法的执行。然而，实例化的“功能设施”是计算机系统的结构组件，当用一种或更多种计算机集成并由其执行时，使得一种或更多种计算机执行特定的操作角色。功能设施可以是软件元素的一部分或全部。例如，功能设施可根据过程、或作为离散过程，或作为任何其他合适的处理单元来实现。如果本文中描述的技术作为多种功能设施来实现，则每种功能设施可以以其自已的方式实现；所有这些都不需要以同样的方式实现。另外，这些功能设施可并行和/或串行地执行(如果适当的话)，并且可使用正在执行它们的计算机上的共享存储器，使用消息传递协议，或者以任何其他合适的方式在彼此之间传递信息。
一般来说，功能设施包括执行特定任务或实现特定抽象数据类型的例程、程序、对象、组件、数据结构等。通常来说，功能设施的功能可根据期望在它们运行的系统中组合或分布。在一些实现中，执行本文中技术的一个或更多个功能设施可一起形成完整的软件包。在一些作为替代的实施方案中，这些功能设施可适于与其他不相关的功能设施和/或过程交互以实现软件程序应用。
本文中已经描述了用于执行一个或更多个任务的一些示例性功能设施。然而，应理解，所描述的功能设施和任务划分仅是举例说明可实现本文中描述的示例性技术的功能设施的类型，并且实施方案不限于以任何特定数目、划分或功能设施的类型来实现。在一些实现中，所有功能可在单个功能设施中实现。还应理解，在一些实现中，本文中描述的一些功能设施可与其他功能设施一起实现或与其他功能设施分开实现(即，作为单个单元或单独的单元)，或者可以不实现这些功能设施中的一些。
在一些实施方案中，实现本文中描述的技术的计算机可执行指令(当作为一个或更多个功能设施或以任何其他方式实现时)可在一个或更多个计算机可读介质上编码以向介质提供功能。计算机可读介质包括磁介质例如硬盘驱动器，光学介质例如光盘(CompactDisk，CD)或数字通用盘(Digital Versatile Disk，DVD)，持久或非持久性固态存储器(例如，闪存、磁性RAM等)或任何其他合适的存储介质。这样的计算机可读介质可以以任何合适的方式实现，包括作为计算装置的一部分或作为独立的单独存储介质。如本文中使用的，“计算机可读介质”(也称为“计算机可读存储介质”)是指有形存储介质。有形存储介质为非暂时性的并且具有至少一个物理结构组件。在如本文中使用的“计算机可读介质”中，至少一个物理结构组件具有至少一个物理特性，该特性可在创建具有嵌入信息的介质的过程、在其上记录信息的过程、或用信息编码介质的任何其他过程期间以某种方式改变。例如，可在记录过程期间改变计算机可读介质的物理结构的一部分的磁化状态。
在其中技术可体现为计算机可执行指令的一些但非全部实现中，这些指令可在任何合适的计算机系统中操作的一个或更多个合适的计算装置上执行，包括图31的示例性计算机系统，或者可对一个或更多个计算装置(或一个或更多个计算装置的一个或更多个处理器)进行编程以执行计算机可执行指令。计算装置或处理器可被编程为当指令以可访问计算装置或处理器的方式，例如在数据存储器(例如，片上高速缓存或指令寄存器、通过总线访问的计算机可读存储介质等)中存储时，执行指令。包括这些计算机可执行指令的功能设施可与以下集成并指导其操作：单个多用途可编程数字计算装置、共享处理能力并且联合执行本文中描述的技术的两个或更多个多用途计算装置的协调系统、专用于执行本文中所述技术的单个计算装置或计算装置的协调系统(共址或地理上分布式)、用于执行本文中所述技术的一个或更多个现场可编程门阵列(Field-Programmable Gate Array，FPGA)或任何其他合适的系统。
已经描述了以电路和/或计算机可执行指令实现这些技术的实施方案。应理解，一些实施方案可以是其中已经提供了至少一个实例的方法的形式。作为方法的一部分执行的动作可以以任何合适的方式排序。因此，可构造一些实施方案，其中各动作以不同于所示的顺序执行，这可包括同时执行某些动作，即使所述动作在举例说明性实施方案中作为顺序动作示出。在另一些方面，本文中提供了前述任一个，包括前述装置、系统、实施方案、方法、技术、算法、介质、硬件、软件、接口、处理器、显示器、网络、输入、输出或其任何组合。
实施例5-示例性测定
基因型分型
基于多路复用的等位基因特异性定量PCR的测定可用于计算供体分数(donorfraction，DF)作为cf-DNA的百分比。针对可靠地区分等位基因选择一组高频SNP。简而言之，将15ng总cf-DNA添加至多路复用文库主混合物中，其中将外源标准品掺入到每个样品中(4.5E+03个拷贝)，并在含有0.005U Q5(NEB)DNA聚合酶、0.2mM dNTP、3uM 96种靶标的正向引物库、3uM 96种靶标的反向引物库、终浓度为2mM MgCl2的25u1反应中通过PCR扩增35个循环。
循环条件可以是98℃持续30秒，然后是35个循环的98℃持续10秒，55℃持续40秒，以及72℃持续30秒。然后可用在72℃下孵育2分钟来终止，并随后在4℃保存。用ExoSAP-IT(Thermo Fisher Scientific)通过在37℃下孵育15分钟然后在80℃下持续15分钟来净化10微升的最终反应。然后用保存缓冲液稀释文库，并进行基因型分型来处理或储存在-80℃。定量基因型分型(quantitative genotyping，qGT)从38ul以1∶100稀释的保存文库的1∶100稀释液开始进行，并在Roche LightCycler 480平台(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)上与适当的对照和校准物一起一式两份地运行3ul反应。使用一种操作以向接受者或供体的基因组DNA(gDNA)分配每个靶基因座上的三种可能基因型之一(即纯合AA、杂合AB和纯合BB)。
供体分数(特异性)分析
杂合DNA来源的标准曲线用于定量每种靶标处的等位基因。质量控制操作可用于评价每个标准曲线和样品扩增。可量化的靶标可进行解释。可接受性标准可包括历史扩增形状、等位基因特异性PCR测定相对于第二等位基因的特异性、信噪比、标准曲线组的斜率和r平方、对照的扩增、以及阴性对照的污染。
利用每种靶标处的接受者和/或供体可能的基因型标记(例如纯合AA、杂合AB和纯合BB，信息性靶标可定义为接受者已知为纯合并且供体具有不同基因型的那些。在供体为纯合并且不同于接受者的情况下，靶标被称为完全信息性的，这是由于观察到的B等位基因比例是大约整体DF水平。在供体为杂合的情况下，靶标被称为半信息性的，这是由于对A和B等位基因二者都有贡献，而且经测量的贡献加倍。计算信息性和质量控制通过的等位基因比例的中位数并报告为总cf-DNA的DF(％)。
每个定量基因型分型过程可产生两种质量控制量度，即rCV和dQC。使用信息性和可量化靶标的分布来计算正则化(regularized)的稳健变异系数(rCV)。首先，稳健标准偏差(rSD)作为相对于中位次要种类比例的中位数绝对差异来计算。rSD在经过正则化后除以中位数后转换为变异系数。rCV量度围绕其中位数的测定靶标的扩散，并可用作精密度或样品质量的度量。dQC是一种不一致性质量检查，例如评价接受者纯合和非信息性靶标的平均次要等位基因比例(可作为防止污染的保护措施)。
Claims (54)
1.评估来自对象的样品中非天然核酸的量的方法，所述样品包含非天然和天然核酸，所述方法包括：
从基于错配扩增的定量测定获得结果，以及
基于所述结果确定所述样品中所述非天然核酸的量，其中所述确定包括对所述结果进行平均以确定所述量，并且所述进行平均是取中位数。
2.权利要求1所述的方法，其中所述确定包括或者所述方法还包括使用稳健标准偏差和/或稳健变异系数来分析所述结果。
3.权利要求1或2所述的方法，其中所述确定包括或者所述方法还包括使用不一致值来分析所述结果。
4.评估来自对象的样品中非天然核酸的量的方法，所述样品包含非天然和天然核酸，所述方法包括：
从基于错配扩增的定量测定获得结果，以及
基于所述结果确定所述样品中所述非天然核酸的量，其中所述确定包括使用稳健标准偏差和/或稳健变异系数来分析所述结果。
5.权利要求4所述的方法，其中所述确定包括或者所述方法还包括使用不一致值来分析所述结果。
6.评估来自对象的样品中非天然核酸的量的方法，所述样品包含非天然和天然核酸，所述方法包括：
从基于错配扩增的定量测定获得结果，以及
基于所述结果确定所述样品中所述非天然核酸的量，其中所述确定包括使用不一致值来分析所述结果。
7.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述量在报告中提供。
8.基于来自对象的一个或更多个样品中的一种或更多种非天然核酸的量来评估对象中风险的方法，所述样品包含非天然和天然核酸，所述方法包括：
获得在来自对象的一个或更多个样品中的一种或更多种非天然核酸的量，该量是从一种或更多种基于错配扩增的定量测定的结果确定的，以及
基于所述非天然核酸的量来评估风险。
9.权利要求8所述的方法，其中所述量从报告中获得。
10.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述量是非天然核酸与天然核酸或总核酸的比例或百分比。
11.权利要求10所述的方法，其中还确定了所述天然核酸或总核酸的量。
12.前述权利要求中任一项所述的方法，其中每种基于错配扩增的定量测定包括：
针对多种单核苷酸变体(SNV)靶标中的每一种，用至少两种引物对对所述样品或其一部分的核酸进行扩增，其中每种引物对包含正向引物和反向引物，其中所述至少两种引物对中的一种在引物中包含相对于所述SNV靶标之一种等位基因的3’倒数第二位错配，但包含相对于所述SNV靶标之另一种等位基因的3’双错配，并且特异性地扩增所述SNV靶标之所述一种等位基因，并且所述至少两种引物对中的另一种特异性地扩增SNV靶标之所述另一种等位基因，以及
从所述扩增中获得或提供结果。
13.权利要求12所述的方法，其中所述至少两种引物对中的所述另一种引物对在引物中还包含相对于所述SNV靶标之所述另一种等位基因的3’倒数第二位错配，但包含相对于所述SNV靶标之所述一种等位基因的3’双错配，并且特异性地扩增所述SNV靶标之所述另一种等位基因。
14.权利要求12或13所述的方法，其中所述结果是所述扩增的信息性结果。
15.权利要求12至14中任一项所述的方法，其中所述基于错配扩增的定量测定还包括选择所述扩增测定的信息性结果。
16.权利要求12至15中任一项所述的方法，其中基于所述非天然核酸和/或天然核酸的基因型选择所述扩增的信息性结果。
17.权利要求12至16中任一项所述的方法，其中所述基于错配扩增的定量测定还包括获得所述非天然核酸和/或天然核酸的基因型。
18.权利要求12至17中任一项所述的方法，其中所述基于错配扩增的定量测定还包括获得多种SNV靶标。
19.权利要求12至18中任一项所述的方法，其中所述基于错配扩增的定量测定还包括获得针对所述多种SNV靶标中的每一种的所述至少两种引物对。
20.权利要求12至19中任一项所述的方法，其中所述多种SNV靶标是至少90种SNV靶标。
21.权利要求20所述的方法，其中所述多种SNV靶标是至少95种SNV靶标。
22.权利要求20或21所述的方法，其中所述多种SNV靶标是少于105种SNV靶标。
23.权利要求22所述的方法，其中所述多种SNV靶标是少于100种SNV靶标。
24.权利要求12至23中任一项所述的方法，其中当所述非天然核酸的基因型未知或未获得时，所述基于错配扩增的定量测定还包括：
基于对可能的非天然基因型的预测来评估结果。
25.权利要求24所述的方法，其中用最大期望值法算法来执行所述评估。
26.权利要求12至25中任一项所述的方法，其中所述基于错配扩增的定量测定还包括基于天然基因型和对所述可能的非天然基因型的预测来选择信息性结果。
27.权利要求26所述的方法，其中使用最大期望值法来预测所述可能的非天然基因型。
28.权利要求12至27中任一项所述的方法，其中所述基于错配扩增的定量测定还包括获得所述天然核酸的基因型。
29.权利要求12至28中任一项所述的方法，其中所述基于错配扩增的定量测定还包括获得所述多种SNV靶标。
30.权利要求12至29中任一项所述的方法，其中所述基于错配扩增的定量测定还包括获得针对所述多种SNV靶标中的每一种的所述至少两种引物对。
31.权利要求12至30中任一项所述的方法，其中使用最大似然法来确定非天然核酸的所述量。
32.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品包含无细胞DNA样品，并且所述量是非天然无细胞DNA的量。
33.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述对象是移植物接受者，并且非天然核酸的所述量是供体特异性无细胞DNA的量。
34.权利要求33所述的方法，其中所述移植物接受者是心脏移植物接受者。
35.权利要求33或34所述的方法，其中所述移植物接受者是儿科移植物接受者。
36.权利要求12至35中任一项所述的方法，其中所述扩增通过定量PCR例如实时PCR或数字PCR来进行。
37.权利要求1至7和9至36中任一项所述的方法，其中所述方法还包括基于所述量来确定风险。
38.权利要求8或37所述的方法，其中所述风险是与移植物相关的风险。
39.权利要求38所述的方法，其中所述移植物是心脏移植物。
40.权利要求38或39所述的方法，其中所述移植物是儿科移植物。
41.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括或者所述评估包括基于非天然核酸的量来选择用于所述对象的治疗。
42.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括或者所述评估包括基于非天然核酸的量来治疗所述对象。
43.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括或者所述评估包括基于非天然核酸的量向所述对象提供关于治疗的信息。
44.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括或者所述评估包括随时间监测或建议监测所述对象中非天然核酸的量。
45.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括或者所述评估包括在随后的时间点获得所述对象中非天然核酸的量。
46.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括或者所述评估包括基于非天然核酸的量来评价向所述对象施用的治疗的效果。
47.权利要求41至43和46中任一项所述的方法，其中所述治疗是抗排斥治疗。
48.权利要求41至43和46中任一项所述的方法，其中所述治疗是抗感染治疗。
49.前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括提供或获得所述样品或其一部分。
50.前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括从所述样品中提取核酸。
51.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品包含血液、血浆或血清。
52.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品来自移植、例如心脏移植的10天内的对象。
53.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品来自移植、例如心脏移植的24小时内的对象。
54.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品来自交叉请求移除、例如心脏移植中的交叉请求移除的24小时内的对象。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201662416696P | 2016-11-02 | 2016-11-02 | |
| US62/416,696 | 2016-11-02 | ||
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