RU2631615C2 - Способ и набор реагентов для выявления полиморфизмов в генах LINGO1, LINGO2 и SLC1A2, определяющих генетическую ассоциацию с эссенциальным тремором - Google Patents

Способ и набор реагентов для выявления полиморфизмов в генах LINGO1, LINGO2 и SLC1A2, определяющих генетическую ассоциацию с эссенциальным тремором Download PDF

Info

Publication number
RU2631615C2
RU2631615C2 RU2015152037A RU2015152037A RU2631615C2 RU 2631615 C2 RU2631615 C2 RU 2631615C2 RU 2015152037 A RU2015152037 A RU 2015152037A RU 2015152037 A RU2015152037 A RU 2015152037A RU 2631615 C2 RU2631615 C2 RU 2631615C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
gene
lingo2
seq
lingo1
polymorphism
Prior art date
Application number
RU2015152037A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2015152037A (ru
Inventor
Сергей Николаевич Иллариошкин
Наталья Юрьевна Абрамычева
Яков Игоревич Алексеев
Нина Валерьевна Коновалова
Константин Александрович Благодатских
Мария Сергеевна Степанова
Екатерина Олеговна Иванова
Екатерина Юрьевна Федотова
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научный центр неврологии" (ФГБНУ НЦН)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научный центр неврологии" (ФГБНУ НЦН) filed Critical Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научный центр неврологии" (ФГБНУ НЦН)
Priority to RU2015152037A priority Critical patent/RU2631615C2/ru
Publication of RU2015152037A publication Critical patent/RU2015152037A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2631615C2 publication Critical patent/RU2631615C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
    • C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
    • C12Q2531/113—PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2561/00—Nucleic acid detection characterised by assay method
    • C12Q2561/113—Real time assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Предложенная группа изобретений относится к области медицины, в частности к неврологии и молекулярной биологии. Предложены способ и набор реагентов для выявления генетического полиморфизма в полиморфных точках rs9652490 LINGO1 (A>G), rs11856808 LINGO1 (C>Т), rs10968280 LINGO2 (А>Т), rs7033345 LINGO2 (C>Т), rs1412229 LINGO2 (А>Т), rs10812774 LINGO2 (C>Т) и rs3794087 SLC1A2 (А>С), определяющих генетическую ассоциацию с эссенциальным тремором. Предложенная группа изобретений обеспечивает высокую специфичность и сокращение сроков идентификации олигонуклеотидных полиморфизмов за счет возможности в мультиплексном формате в одной постановке оценивать семь однонуклеотидных полиморфных маркеров. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 21 ил., 19 табл., 1 пр.

Description

Изобретение относится к области медицины, в частности к неврологии и молекулярной биологии, и может быть использовано для выявления полиморфизмов в генах LINGO1, LINGO2 и SLC1A2, ассоциациированных с мультифакториальным заболеванием - эссенциальным тремором посредством проведения медико-генетического анализа одновременно нескольких однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) в этих генах.
Эссенциальный тремор является наиболее распространенным двигательным заболеванием нервной системы, нейродегенеративная природа которого доказывается рядом последних работ. Распространенность заболевания по некоторым данным может достигать 13%. Эссенциальный тремор представляет собой неуклонно прогрессирующее заболевание, приводящее к значительным трудностям в профессиональной деятельности, а затем и в самообслуживании. На молекулярно-генетическом уровне показана высокая гетерогенность этого заболевания, однако до настоящего времени, несмотря на бурное развитие молекулярно-генетических технологий, генетическая структура эссенциального тремора комплексно не определена и непосредственная ДНК-диагностика болезни пока не проводится.
Для эссенциального тремора характерна длительная доклиническая стадия, на которой возможно проведение профилактических мероприятий, предотвращающих их развитие. В свете вышеперечисленного диагностика предрасположенности к развитию такого нейродегенеративного заболевания имеет социальную значимость.
На сегодняшний день не выявлено патогенных мутаций приводящих к эссенциальному тремору, считается что комплекс генетических факторов риска приводит к развитию заболевания. При отборе генетических факторов риска развития эссенциального тремора, мы основывались на анализе результатов работ по выявлению ассоциаций между генетическими вариантами полиморфизмов и развитием заболевания. Так мета-анализ двух исследований полногеномного скрининга ассоциаций (genome-wide association study, GWAS), позволяющих осуществлять тотальный скрининг вариабельных однонуклеотидных участков генома, выявил высокую ассоциацию полиморфизмов в генах SLC1A2 (rs3794087) и LINGO1 (rs9652490), а также в меньшей мере полиморфизма rs11856808 в гене LINGO1 с эссенциальным тремором (Kuhlenbaumer G., Hopflner F. et al. Genetics of essential tremor // Neurology 2014; 18: 1000-1007). В целом ряде работ по изучению ассоциации полиморфизма rs9652490 в гене LINGO1 с эссенциальным тремором в различных европейских популяциях было показано статистически значимое увеличение риска развития заболевания связанное с наличием этого поиморфизма (Thier S, Lorenz D, Nothnagel M, et al. LINGO1 polymorphisms are associated with essential tremor in Europeans. Mov Disord 2010; 25: 709-715; Vilarino-Guell C, Ross OA, Wider C, et al. LINGO1 rs9652490 is associated with essential tremor and Parkinson disease. Parkinsonism Relat Disord2010; 16: 109-111; Clark LN, Park N, Kisselev S, Rios E, Lee JH, Louis ED. Replication of the LINGO1 gene association with essential tremor in a North American population. Eur J Hum Genet 2010; 18: 838-843). Надо отметить, что в китайской популяции не было вывлено достоверной ассоциации полиморфизма rs9652490 в гене LINGO1 с эссенциальным тремором (Zuo X, Jiang Н, Guo JF, et al. Screening for two SNPs of LINGO1 gene in patients with essential tremor or sporadic Parkinson's disease in Chinese population. Neurosci Lett 2010; 481: 69-72), что подтверждает гипотезу существования популяционно-специфичных различий и усиливает значимость расширенных популяционных исследований.
Мультицентровое исследование популяций Северной Америки помимо ассоциации выше перечисленных полиморфизмов с риском развития эссенциального тремора, выявило еще ряд полиморфизмов в гене LINGO2, влияющих в той или иной степени на развитие заболевания (Vilarino-Guell С, Wider С, Ross OA, et al. LINGO1 and LINGO2 variants are associated with essential tremor and Parkinson disease. Neurogenetics 2010; 11: 401-408).
Анализ результатов полногеномных исследований и собственные исследования, позволили отобрать семь однонуклеотидных полиморфизмов: rs9652490, rs11856808 в гене LINGO1 (15q24); rs1412229, rs10968280, rs10812774, rs7033345 в гене LINGO2 (9p21) и rs3794087 в гене SLC1A2 (11p13) (см. таблицу 1), проявивших наибольшую генетическую ассоциацию с эссенциальным тремором и разработать набор реагентов для выявления полиморфизмов в генах LINGO1, LINGO2 и SLC1A2 (гены-кандидаты), который в дальнейшем позволит провести мутационный скрининг эссенциального тремора, а так же ляжет в основу ДНК-диагностики этого заболевания.
Figure 00000001
Наиболее экономичным, быстрым и доступным методом анализа полиморфизмов (SNP) в настоящее время является ПЦР в «режиме реального времени», однако в обычном формате, на современных амплификаторах (термоциклерах) можно проанализировать в мультиплексе только два полиморфизма, так как имеется только четыре оптических канала детекции флуоресцентного сигнала и следовательно можно использовать только четыре флуоресцентно-меченных зонда, соответственно два для дикого аллеля и два для мутантного (для двух полиморфизмов). Примененная нами модификация позволяет анализировать до восьми полиморфизмов в мультиплексном формате, за счет разных температур плавления ампликонов с зондами, меченными одной и той же флуоресцентной меткой, а именно на одном оптическом канале, без потери специфичности и чувствительности можно детектировать сразу четыре ампликона. В разработанном нами наборе анализируется семь полиморфизмов.
Технический результат заявленного изобретения заключается в высокой специфичности набора и способа выявления полиморфизмов в генах LINGO1, LINGO2 и SLC1A2 за счет использования оригинальных олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов, а также оригинальных условий и протокола проведения полимеразной цепной реакции и последующего плавления продуктов реакции с флуоресцентно-меченными зондами. И в ускорении и удешевлении идентификации олигонуклеотидных полиморфизмов за счет возможности в мультиплексном формате в одной постановке сразу оценивать до восьми однонуклеотидных полиморфных маркеров (SNP).
Технический результат достигается тем, что создан набор реагентов для выявления генетического полиморфизма в полиморфных точках генов LINGO1 (rs9652490, rs11856808), LINGO2 (rs10968280, rs7033345, rs1412229, rs10812774) и SLC1A2 (rs3794087), определяющих генетическую ассоциацию с эссенциальным тремором, который включает следующие компоненты: 50 мМ KCl, 15 мМ Tris-HCl с рН 8,8, 0,5% глицерол, 0,1% Tween 20, 6,25 мМ MgCl2, 250 мкМ дезоксинуклеотиды (dNTP) и 0,2 ед/мкл термостабильной ДНК-полимеразы с вытесняющей активностью, при этом все компоненты для проведения мультиплексной полимеразной цепной реакции за исключением ДНК-полимеразы смешаны в одном объеме вместе с 7 парами олигонуклеотидных праймеров, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в полимеразной цепной реакции - SEQ ID №: 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21 в концентрациях, обеспечивающих ассиметричное накопление цепей ДНК, и 7 олигонуклеотидными зондами, меченными флуоресцентными метками на 5'-конце и гасителями на 3'-конце: зонд SEQ ID №1 с меткой FAM и гасителем RTQ1; зонды SEQ ID №4 и 19 с меткой Су5 и гасителем BHQ2; зонд SEQ ID №7 с меткой R6G и гасителем BHQ2; зонды SEQ ID №10 и 16 с меткой ROX и гасителем BHQ2; зонд SEQ ID №13 с меткой R6G и гасителем BHQ1.
Технический результат достигается также за счет способа выявления генетического полиморфизма в полиморфных точках генов LINGO1 (rs9652490, rs11856808), LINGO2 (rs10968280, rs7033345, rs1412229, rs 10812774) и SLC1A2 (rs3794087), определяющих генетическую ассоциацию с эссенциальным тремором, включающий выделение ДНК, проведение полимеразной цепной реакции, путем начального плавления и ряда циклов амплификации, состоящих из денатурации ДНК, отжига и синтеза, при этом проводят мультиплексную полимеразную цепную реакцию с использованием 7-ми пар олигопраймеров и 7-ми олигонуклеотидных флуоресцентно-меченных зондов, охарактеризованных в п. 1, при этом концентрации прямых и обратных праймеров подобраны так, чтобы происходило ассиметричное накопление одной из цепей ДНК комплементарной соответствующему детектирующему флуоресцентно-меченному зонду, при следующих условиях: начальное плавление ДНК проводят в течение 3 минут при температуре 92°C, далее проводят 40 циклов амплификации, включающие денатурацию при 92°C в течение 15 секунд, отжиг и синтез при температуре 63°C в течение 40 секунд, причем амплификацию проводят с термостабильной полимеразой с вытесняющей активностью, затем осуществляют плавление продуктов полимеразной цепной реакции с олигонуклеотидными флуоресцентно-меченными зондами в температурном диапазоне от 20 до 95°C с шагом 0,5°C и временем задержки на каждом шаге в 1 секунду, при этом на каждом шаге проводят измерение флуоресцентного сигнала по каналам детекции всех меток FAM, R6G, ROX, Су5 для построения кривых плавления продукта и идентификации олигонуклеотидных полиморфизмов, основанную на изменении температуры плавления продукта ПЦР в зависимости от того какой аллельный вариант полиморфизма присутствует в образце ДНК.
При создании набора особое значение придавали выбору праймеров. Так как для создания высокоспецифичных мультиплексных систем требуется сочетание праймеров с определенными характеристиками (отсутствие внутренних вторичных структур).
Олигонуклеотидные праймеры и зонды выбраны с помощью программы «Primer3» и проверены на специфичность с помощью программы «Primer-BLAST».
При подборе праймеров, для повышения специфичности ПНР были соблюдены следующие критерии:
- размер праймера соответствовал 16-25 нуклеотидам;
- температура отжига всех праймеров была одинакова (58-62°C)
- разница в температуре плавления праймеров составляла не более 2 градусов;
- область отжига праймеров находилась вне зон полиморфизмов;
- суммарное количество GC-оснований соответствовало 50-60%;
- для улучшения качества отжига последние несколько нуклеотидов 3'-конца
праймера содержали GC-основания;
- отсутствовала внутренняя вторичная структура (праймеры не должны быть само- и взаимнокомплиментарными);
- отсутствовали комплементарности между 3'-концами (чтобы не образовывались праймер-димеры).
Для идентификации каждого однонуклеотидного полиморфизма были выбраны два праймера (прямой и обратный) и один флуоресцентно-меченный зонд (см. таблица 2).
Figure 00000002
Кроме того набор содержал следующие реагенты: 50 мМ КСl, 15 мМ Tris-HCl с рН 8,8, 0,5% глицерол, 0,1% Tween 20, 6,25 мМ MgCl2, 250 мкМ дезоксинуклеотиды (dNTP) и 0,2 ед/мкл термостабильной ДНК-полимеразы с вытесняющей активностью.
Причем все реагенты для проведения мультиплексной полимеразной цепной реакции за исключением ДНК-полимеразы были смешаны в одном объеме вместе с 7-ю парами олигонуклеотидных праймеров - SEQ ID №: 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21 в концентрациях, обеспечивающих ассиметричное накопление цепей ДНК, и 7-ю олигонуклеотидными зондами, меченными флуоресцентными метками на 5'-конце и гасителями на 3'-конце: зонд SEQ ID №1 с меткой FAM и гасителем RTQ1; зонды SEQ ID №4 и 19 с меткой Су5 и гасителем BHQ2; зонд SEQ ID №7 с меткой R6G и гасителем BHQ2; зонды SEQ ID №10 и 16 с меткой ROX и гасителем BHQ2; зонд SEQ ID №13 с меткой R6G и гасителем BHQ1.
Способ выявления полиморфизмов в генах LINGO1, LINGO2 и SLC1A2, определяющих генетическую ассоциацию с эссенциальным тремором состоит из 4 этапов и осуществляется следующим образом.
Этап I. Выделение ДНК по стандартному протоколу.
Этап II. Проведение мультиплексной полимеразной цепной реакции с использованием 7-ми пар олигонуклеотидных праймеров и 7-ю олигонуклеотидными флуоресцентно-меченными зондами в 25 мкл смеси для ПЦР (см. таблица 3).
Figure 00000003
Концентрации олигонуклеотидных праймеров (см. таблица 2) подобраны так, чтобы происходило ассиметричное накопление одной из цепей ДНК (комплементарной детектирующим флуоресцентно-меченным зондам). При этом начальную денатурацию (плавление) ДНК проводят в течение 3 минут при температуре 92°C. Далее проводят 40 циклов амплификации, включающие денатурацию при 92°C в течение 15 секунд, отжиг и синтез при температуре 63°C в течение 40 секунд. Для этапа амплификации используется термостабильная полимераза с вытесняющей активностью, что позволяет избежать разрушения олигонуклеотидных зондов.
Этап III. Плавление продукта полимеразной цепной реакции, полученного на этапе II, с олигонуклеотидными зондами, которые мечены флуорофорами и гасителями флуоресценции. Проводится плавление в температурном диапазоне от 20 до 95°C с шагом 0,5°C и временем задержки на каждом шаге 1 секунда. При этом на каждом шаге проводят измерение флуоресцентного сигнала по каналам детекции красителей FAM, R6G, ROX, Су5 для построения кривых плавления продукта. Этапы II и III могут быть совмещены в одной программе (см. таблица 4).
Figure 00000004
Этап VI. Анализ полученных кривых плавления по заданному протоколу (см. фиг. 1-7).
Идентификация полиморфизма для каждого SNP основана на изменении температуры плавления продукта ПЦР в зависимости от того какой аллельный вариант полиморфизма присутствует в образце ДНК. При анализе кривых плавления нужно руководствоваться величинами температур плавления трех положительных контролей (ПКО): ПКО1 - гомозигота дикого аллеля; ПКО2 - гетерозигота; ПКО3-гомозигота минорного аллеля, для каждого полиморфизма, на соответствующем из четырех каналов (FAM, HEX, ROX, Су5):
Канал FAM: rs9652490 (LINGO1) (см. фиг. 1)
(FAM)-cttcctcccCgcctagcttcactct-(RTQ 1)
Figure 00000005
Канал HEX: rs10968280 (LINGO2) (см. фиг. 2)
(R6G)-aaaagtgatggaattgTatttgata-(BHQ2)
Figure 00000006
Канал ROX: rs7033345 (LINGO2) (см. фиг. 3)
(ROX)-agcaaaCgtacacag-(BHQ2)
Figure 00000007
Figure 00000008
Канал Су5: rs11856808 (LINGO1) (см. фиг. 4)
(Cy5)-ttgttagaacaCgttt-(BHQ2)
Figure 00000009
Канал Су5: rs3794087 (SLC1A2) (см. фиг. 5)
(Cy5)-taggttgaCagttggctttggttcc-(BHQ2)
Figure 00000010
Канал ROX: rs10812774 (LINGO2) (см. фиг. 6)
(ROX)-ataatTtactgactgagttccgttt-(BHQ2)
Figure 00000011
Канал HEX: rs1412229 (LINGO2) (см. фиг. 7)
(R6G)-tgcaAatattttagt-(BHQ1)
Figure 00000012
В результате проведенного исследования установлено, что выбранные праймеры и зонды для выявления генетического полиморфизма в полиморфных точках генов LINGO1 (rs9652490, rs11856808), LINGO2 (rs10968280, rs7033345, rs1412229, rs10812774) и SLC1A2 (rs3794087), определяющих генетическую ассоциацию с эссенциальным тремором методом мультиплексной полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов обладают высокой специфичностью и обеспечивают ускорение и удешевление идентификации олигонуклеотидных полиморфизмов за счет возможности в мультиплексном формате в одной постановке сразу оценивать до восьми однонуклеотидных полиморфных маркеров (SNP).
Пример.
Из 56 образцов цельной крови от пациентов с диагнозом эссенциальный тремор и из 36 образцов цельной крови от пациентов с диагнозом болезнь Паркинсона (группа сравнения) была выделена геномная ДНК с помощью набора для выделения Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega USA). С помощью разработанного набора реагентов проведена ПЦР-наработка ампликонов в мультиплексном формате с последующим плавлением продукта реакции на амплификаторе CFX-96 "REAL TIME" (Bio-Rad США), с помощью объединенной программы. Анализ полученных кривых проведен с помощью программного обеспечения Bio-Rad CFX Manager 3.0 и представлен на фигурах 8-14 и в таблицах 5-11.
На фигуре 8А и Б и таблице 5 представлен анализ кривых плавления для rs9652490 LINGO1 (канал FAM). На фигуре А показаны кривые плавления (по вертикальной оси - интенсивность флуоресценции, по горизонтальной оси температура), на фигуре Б-дифференциальный анализ кривых плавления (по вертикальной оси - производная кривой интенсивности флуоресценции, по горизонтальной оси температура).
В таблице 5 представлены результаты анализа кривых плавления для rs9652490 LINGO1.
Figure 00000013
Figure 00000014
Figure 00000015
На фигуре 9А, Б и таблице 6 представлен анализ кривых плавления для rs10968280 LINGO2 (канал HEX). На фигуре А - показаны кривые плавления (по вертикальной оси - интенсивность флуоресценции, по горизонтальной оси температура), на фигуре Б - дифференциальный анализ кривых плавления.
В таблице 6 представлены результаты анализа кривых плавления для rs10968280 LINGO2.
Figure 00000016
Figure 00000017
Figure 00000018
На фигуре 10 А, Б ив таблице 7 представлен анализ кривых плавления для rs7033345 LINGO2 (канал ROX). На фигуре А показаны кривые плавления (по вертикальной оси - интенсивность флуоресценции, по горизонтальной оси температура), на фигуре Б-дифференциальный анализ кривых плавления.
В таблице 7 представлены результаты анализа кривых плавления для rs7033345 LINGO2.
Figure 00000019
Figure 00000020
Figure 00000021
Figure 00000022
На фигуре 11А, Б и таблице 8 представлен анализ кривых плавления для rs11856808 LINGO1 (канал Су5). На фигуре А показаны кривые плавления (по вертикальной оси - интенсивность флуоресценции, по горизонтальной оси температура), на фигуре Б - дифференциальный анализ кривых плавления.
В таблице 8 представлены результаты анализа кривых плавления для rs1 1856808 LINGO1.
Figure 00000023
Figure 00000024
Figure 00000025
На фигуре 12А, Б и таблице 9 представлен анализ кривых плавления для rs1412229 LINGO2 (канал HEX). На фигуре А показаны кривые плавления (по вертикальной оси - интенсивность флуоресценции, по горизонтальной оси температура), на фигуре Б-дифференциальный анализ кривых плавления.
В таблице 9 представлены результаты анализа кривых плавления для rs1412229 LINGO2.
Figure 00000026
Figure 00000027
Figure 00000028
Figure 00000029
На фигуре 13А, Б и в таблице 10 представлен анализ кривых плавления для rs10812774 LINGO2 (канал ROX). На фигуре А показаны кривые плавления (по вертикальной оси - интенсивность флуоресценции, по горизонтальной оси температура), на фигуре Б - дифференциальный анализ кривых плавления.
В таблице 10 представлены результаты анализа кривых плавления для rs10812774 LINGO2.
Figure 00000030
Figure 00000031
Figure 00000032
На фигуре 14А, Б и в таблице 11 представлен анализ кривых плавления для rs3794087 SLC1A2 (канал Су5). На фигуре А показаны кривые плавления (по вертикальной оси - интенсивность флуоресценции, по горизонтальной оси температура), на фигуре Б - дифференциальный анализ кривых плавления.
В таблице 11 представлены результаты анализа кривых плавления для rs3794087 SLC1A2.
Figure 00000033
Figure 00000034
Figure 00000035
В таблице 12 приведены суммированные результаты анализа 92 образцов ДНК по 7 полиморфизмам (белый фон - гомозиготы дикого типа; светло серый фон - гетерозиготы; темно серый фон - гомозиготы мутантного типа)
Figure 00000036
Figure 00000037
Figure 00000038
Figure 00000039

Claims (3)

1. Набор реагентов для выявления генетического полиморфизма в полиморфных точках: rs9652490 в гене LINGO1 (A>G), rs11856808 в гене LINGO1 (C>Т), rs10968280 в гене LINGO2 (А>Т), rs7033345 в гене LINGO2 (C>Т), rs1412229 в гене LINGO2 (А>Т), rs10812774 в гене LINGO2 (C>Т) и rs3794087 в гене SLC1A2 (А>С), определяющих генетическую ассоциацию с эссенциальным тремором, включающий компоненты: 50 мМ KCl, 15 мМ Tris-HCl с рН 8,8, 0,5% глицерол, 0,1% Tween 20, 6,25 мМ MgCl2, 250 мкМ дезоксинуклеотиды (dNTP) и 0,2 ед/мкл термостабильную ДНК-полимеразу с вытесняющей активностью, при этом все компоненты для проведения мультиплексной полимеразной цепной реакции за исключением ДНК-полимеразы смешаны в одном объеме вместе с 7 парами олигонуклеотидных праймеров, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в полимеразной цепной реакции - SEQ ID №: 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21 в концентрациях, обеспечивающих ассиметричное накопление цепей ДНК, и 7 олигонуклеотидными зондами, меченными флуоресцентными метками на 5'-конце и гасителями на 3'-конце: зонд SEQ ID №1 с меткой FAM и гасителем RTQ1; зонды SEQ ID №4 и 19 с меткой Су5 и гасителем BHQ2; зонд SEQ ID №7 с меткой R6G и гасителем BHQ2; зонды SEQ ID №10 и 16 с меткой ROX и гасителем BHQ2; зонд SEQ ID №13 с меткой R6G и гасителем BHQ1.
2. Набор по п. 1, отличающийся тем, что олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд, прямой и обратный праймеры используют на одну реакцию в следующих количественных соотношениях в pmol: зонд SEQ ID №1, прямой праймер SEQ ID №:2, обратный праймер SEQ ID №:3 - 5:5:1 соответственно, зонд SEQ ID №13, прямой праймер SEQ ID №:14, обратный праймер SEQ ID №:15 - 5:5:1 соответственно; зонд SEQ ID №4, прямой праймер SEQ ID №:5, обратный праймер SEQ ID №:6 - 5:1:5 соответственно, зонд SEQ ID №7, прямой праймер SEQ ID №:8, обратный праймер SEQ ID №:9 - 5:1:5 соответственно, зонд SEQ ID №10, прямой праймер SEQ ID №:11, обратный праймер SEQ ID №:12 - 5:1:5 соответственно, зонд SEQ ID №16, прямой праймер SEQ ID №:17, обратный праймер SEQ ID №:18 - 5:1:5 соответственно и зонд SEQ ID №19, прямой праймер SEQ ID №:20, обратный праймер SEQ ID №:21 - 5:1:5 соответственно.
3. Способ выявления генетического полиморфизма в полиморфных точках: rs9652490 в гене LINGO1 (A>G), rs11856808 в гене LINGO1 (C>Т), rs10968280 в гене LINGO2 (А>Т), rs7033345 в гене LINGO2 (C>Т), rs1412229 в гене LINGO2 (А>Т), rs10812774 в гене LINGO2 (C>Т) и rs3794087 в гене SLC1A2 (А>С), определяющих генетическую ассоциацию с эссенциальным тремором, включающий выделение ДНК, проведение полимеразной цепной реакции путем начального плавления и ряда циклов амплификации, состоящих из денатурации ДНК, отжига и синтеза, отличающийся тем, что проводят мультиплексную полимеразную цепную реакцию с использованием набора реагентов по п. 1, при этом концентрации прямых и обратных праймеров подобраны так, чтобы происходило ассиметричное накопление одной из цепей ДНК комплементарной соответствующему детектирующему флуоресцентно-меченному зонду, при следующих условиях: начальное плавление ДНК проводят в течение 3 минут при температуре 92°С, далее проводят 40 циклов амплификации, включающих денатурацию при 92°С в течение 15 секунд, отжиг и синтез при температуре 63°С в течение 40 секунд, причем амплификацию проводят с термостабильной полимеразой с вытесняющей активностью, затем осуществляют плавление продуктов полимеразной цепной реакции, с соответствующими олигонуклеотидными флуоресцентно-меченными зондами, в температурном диапазоне от 20 до 95°С с шагом 0,5°С и временем задержки на каждом шаге в 1 секунду, при этом на каждом шаге проводят измерение флуоресцентного сигнала по каналам детекции всех меток FAM, R6G, ROX, Су5 для построения кривых плавления продукта и идентификации олигонуклеотидных полиморфизмов, основанную на изменении температуры плавления продукта ПЦР в зависимости от того, какой аллельный вариант полиморфизма присутствует в образце ДНК, а именно для полиморфизма rs9652490 в гене LINGO1: АА, AG или CG; для полиморфизма rs11856808 в гене LINGO1: СС, СТ или ТТ; для полиморфизма rs10968280 в гене LINGO2: ТТ, ТА или АА, для полиморфизма rs7033345 в гене LINGO2: ТТ, ТС или СС; для полиморфизма rs1412229 в гене LINGO2: АА, ТА или ТТ, для полиморфизма rs10812774 в гене LINGO2: ТТ, ТС или СС, для полиморфизма rs3794087 в гене SLC1A2: СС, АС или АА, где в случае выявления аллеля G rs9652490 в гене LINGO1 (A>G), A rs10968280 в гене LINGO2 (А>Т), С rs7033345 в гене LINGO2 (C>Т), Т rs11856808 в гене LINGO1 (C>Т), А rs3794087 в гене SLC1A2 (А>С), С rs10812774 в гене LINGO2 (C>Т) и Т rs1412229 в гене LINGO2 (А>Т) определяют генетическую ассоциацию с эссенциальным тремором.
RU2015152037A 2015-12-04 2015-12-04 Способ и набор реагентов для выявления полиморфизмов в генах LINGO1, LINGO2 и SLC1A2, определяющих генетическую ассоциацию с эссенциальным тремором RU2631615C2 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015152037A RU2631615C2 (ru) 2015-12-04 2015-12-04 Способ и набор реагентов для выявления полиморфизмов в генах LINGO1, LINGO2 и SLC1A2, определяющих генетическую ассоциацию с эссенциальным тремором

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015152037A RU2631615C2 (ru) 2015-12-04 2015-12-04 Способ и набор реагентов для выявления полиморфизмов в генах LINGO1, LINGO2 и SLC1A2, определяющих генетическую ассоциацию с эссенциальным тремором

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2015152037A RU2015152037A (ru) 2017-06-08
RU2631615C2 true RU2631615C2 (ru) 2017-09-25

Family

ID=59031417

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2015152037A RU2631615C2 (ru) 2015-12-04 2015-12-04 Способ и набор реагентов для выявления полиморфизмов в генах LINGO1, LINGO2 и SLC1A2, определяющих генетическую ассоциацию с эссенциальным тремором

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2631615C2 (ru)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005105839A2 (en) * 2004-04-29 2005-11-10 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Essential tremor diagnostic and treatment
RU2467697C1 (ru) * 2011-07-28 2012-11-27 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр неврологии" Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НЦН" РАМН) Способ дифференциальной диагностики болезни паркинсона и эссенциального тремора

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005105839A2 (en) * 2004-04-29 2005-11-10 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Essential tremor diagnostic and treatment
RU2467697C1 (ru) * 2011-07-28 2012-11-27 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр неврологии" Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НЦН" РАМН) Способ дифференциальной диагностики болезни паркинсона и эссенциального тремора

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
VILARINO-GUELL C. et al. LINGO1 and LINGO2 variants are associated with essential tremor and Parkinson disease. Neurogenetics. 2010 Oct; 11(4): 401-408. Epub 2010 Apr 6 [Найдено 17.01.2017] [он-лайн]. Найдено из Интернет: URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20369371KUHLENBAUMER G. et al. Genetics of essential tremor: meta-analysis and review. Neurology. 2014 Mar 18; 82(11): 1000-1007. Epub 2014 Feb 14RU 2467697 C1, 27.11.2012. *
WO 2005105839 A2, 10.11.2005VILARINO-GUELL C. et al. LINGO1 and LINGO2 variants are associated with essential tremor and Parkinson disease. Neurogenetics. 2010 Oct; 11(4): 401-408. Epub 2010 Apr 6 [Найдено 17.01.2017] [он-лайн]. Найдено из Интернет: URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20369371KUHLENBAUMER G. et al. Genetics of essential tremor: meta-analysis and review. Neurology. 2014 Mar 18; 82(11): 1000-1007. Epub 2014 Feb 14 *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2015152037A (ru) 2017-06-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20200255892A1 (en) Multiplex y-str analysis
US11041191B2 (en) Genetic markers for discrimination and detection of gray SPH region on Koi herprsvirus causing infectious aquatic organism diseases, and method of discriminating and detecting the virus using the same
EP3394287B1 (en) A method of fluorescent detection of isothermal loop-mediated amplification (lamp) of a target nucleic acid
US20120122093A1 (en) Methods and kits for multiplex amplification of short tandem repeat loci
US20130071844A1 (en) Method for detecting target base sequence using competitive primer
US20140031248A1 (en) Detection of Amplification Products
CA2849020C (en) Multiplexed kras mutation detection assay
JP5940874B2 (ja) ＮＰＭ１遺伝子のｅｘｏｎ１２変異の検出用プローブおよびその用途
JP2018108054A (ja) ノロウイルスｇ１型を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブ
RU2016136727A (ru) Набор олигонуклеотидных праймеров, зондов и способ выявления мутации 35delg гена gjb2 методом аллель-специфическая пцр амплификации при наследственной несиндромальной глухоте
CN105755134A (zh) 一种内切酶介导的实时多交叉置换核酸扩增技术及应用
US20120129174A1 (en) Target Sequence Amplification Method, Polymorphism Detection Method, and Reagents for Use in the Methods
US20240002923A1 (en) Methods and kits for determining the efficiency of plasma separation from whole blood
US11414698B2 (en) Method of quantifying mutant allele burden of target gene
JP2018108055A (ja) ノロウイルスｇ２型を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブ
RU2631615C2 (ru) Способ и набор реагентов для выявления полиморфизмов в генах LINGO1, LINGO2 и SLC1A2, определяющих генетическую ассоциацию с эссенциальным тремором
WO2019106149A1 (en) Pcr controls
US11530455B2 (en) Penta E polymorphisms for human identification
JPWO2011077990A1 (ja) ｃ−ｋｉｔ遺伝子の多型検出用プローブおよびその用途
KR102420325B1 (ko) 등온증폭 반응을 이용한 표적 유전자의 단일염기다형성 및 돌연변이 검출방법
RU2652895C2 (ru) Набор синтетических олигонуклеотидных проб для определения генотипа митохондриальной днк человека
JP5635496B2 (ja) Ｅｇｆｒ遺伝子多型検出用プローブおよびその用途
US20210180115A1 (en) Multiple analysis method for amplicon by using fluorescence-based multiple melting analysis
US20160273031A1 (en) Method, kit and premix for quantitative and discriminative determination of nucleic acids, qdpcr; in vitro method for the quantitative and discriminative diagnosis of biological entities
Raza et al. REAL TIME PCR;: APPLICATIONS IN DIAGNOSTICS AND RESEARCH

Legal Events

Date Code Title Description
QB4A Licence on use of patent

Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20180424

Effective date: 20180424