CN109239182A - 一种用纤维素酶原位修饰金芯片的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及纤维素酶原位修饰金芯片的方法。石英晶体微天平(QCM)和表面等离子体共振仪(SPR)技术是实时、原位研究生物大分子在固体界面的吸附是重要工具，前者同时检测石英晶体频率的变化(对应感应器上的重量)和吸附层的能量耗散值(对应感应器上薄膜的结构)的变化，后者只研究“干物质”的变化。传统的研究纤维素酶与底物的方法是把底物固定在QCM或SPR芯片上，然后把纤维素酶作为流动相通过，以研究二者的相互作用。本发明运用原位修饰的方法，把纤维素酶结合到金芯片上，构筑了表面均匀的纤维素酶薄膜，拓宽QCM或SPR的应用范围来研究纤维素酶与体系中其他高分子的相互作用。

Description

一种用纤维素酶原位修饰金芯片的方法
技术领域
本发明涉及纤维素酶原位修饰金芯片的方法，属于仪器分析领域。
背景技术
根据国际能源机构(IEA)的定义，生物质(biomass)是指通过光合作用而形成的各种有机体，包括所有的动植物和微生物。生物质能则是太阳能以化学能形式储存在生物质中的能量形式，它一直是人类赖以生存的重要能源之一，是仅次于煤炭、石油、天然气之后第四大能源，在整个能源系统中占有重要的地位。
当今社会，全球经济高速发展，对各种能源需求也日趋增加，而这些能源大多是由煤矿和石油提供的。一方面，化石燃料的炼制过程中会带来一些环境污染问题。另一方面，化石、煤炭、天然气等能源储量有限而且不可再生。在资源能源匮乏的今天，生物质转化已经成为了目前研究的热点。科学家力图寻找一种新型可再生的，可持续发展的生物材料来代替石油材料和塑料材料。于是人们把目光转向了可再生的木质纤维素。纤维素是木质纤维素的重要成分，是生物圈中的最丰富的生物聚合物，它来源广泛、种类众多。它可以在纤维素酶的作用下降解产生低聚糖和单糖，然后进一步发酵成乙醇燃料和其它化学品。目前的工业化生产燃料乙醇技术绝大多数是以粮食作物为原料的第一代生物乙醇技术，从长远来看具有规模限制性和不可持续性，另外还可能造成国际粮价大涨。以木质纤维素为原料的第二代生物燃料乙醇技术是决定未来能否大规模替代石油的关键，不仅可以达到节粮代粮的目的，而且可以实现资源的永续利用，符合可持续发展和循环经济的要求。
纤维素酶是指可以用来分解晶体纤维素的酶，因为纤维素的结构是很复杂的，由多种多糖分子结合而成，因此纤维素酶也并不是单一的酶类，而是由可以分解这几种多糖的酶复合而成的，一般纤维素酶都是内切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶这几种酶组成的一个酶系，晶体纤维素在这几种酶的协调作用下才能被分解掉。而植物细胞壁的主要成分就是纤维素，因此纤维素酶可以分解大多数植物的细胞壁。
木质纤维原料生物法制取乙醇主要包括原料预处理、纤维素酶制备、纤维素水解、糖液发酵四个关键技术，其难点在纤维素水解和糖液发酵。这是由技术和经济两方面原因决定的，我们可以从纤维素的预处理和提高酶解工艺两方面解决这一难题。因此更好的理解酶在纤维素表面的吸附和解吸规律将有助于提高酶的效率、减少酶的用量、以及提高酶的回收效率。
纤维素的酶解是一个非常复杂的过程，它与纤维种类、纤维素酶种类和用量、以及相互作用环境有关。对底物而言，木质素、半纤维素的含量、底物颗粒的大小、表面积、聚合度、以及纤维素的结晶度对酶解效率和速率都有极大的影响。对纤维素酶来说，纤维素酶的种类、组分、以及用量都会影响到吸附酶解作用。对环境而言还牵涉到pH、离子强度、以及酶解时间等。正是由于整个体系的复杂性，更需要我们进一步研究二者作用的过程。
石英晶体微天平(QCM)和表面等离子体共振仪(SPR)技术是研究生物大分子在固体界面的吸附是非常有利的工具，前者同时检测石英晶体频率的变化(对应感应器上的重量)和吸附层的能量耗散值(对应感应器上薄膜的结构)的变化，后者只研究“干物质”的变化。传统的研究纤维素酶与底物的方法是把底物固定在QCM或SPR芯片上，然后把纤维素酶左右流动相通过以研究二者的相互作用。
本发明涉及一种纤维素酶原位修饰金芯片的方法，把纤维素酶先固定在QCM或SPR芯片上，然后研究其他物质与纤维素酶的相互作用。
发明内容
1.一种纤维素酶原位修饰金芯片的方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤(1)：所用芯片为金表面的QCM或SPR芯片，实验前将金芯片清洗后用氮气吹干，然后放入紫外-臭氧清洗机照射10-30min；
步骤(2)：用75％乙醇为溶剂配制40mM的11-巯基十一烷酸(MUA)与3-巯基丙酸(MPA)；
步骤(3)：用pH为7.4的0.05mM的磷酸盐缓冲溶液配制2mM的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和5mM的N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐(NHSS)的溶液，和50μg/ml的纤维素酶液体；
步骤(4)：将步骤(1)清洗并照射后的芯片放置在QCM或SPR流动池内；
步骤(5)：首先以0.1ml/min的流速通入75％的乙醇溶液把基线走平；
步骤(6)：待平稳后，把步骤(2)中配制的MPA和MUA溶液按体积比10∶1的比例混合后，以0.1ml/min的流速通入QCM或SPR流动池，待检测信号平衡后通入75％乙醇冲洗；
步骤(7)：接下来把步骤(3)中配制的EDC和NHSS溶液以体积比1∶1混合，然后以0.1ml/min的流速通入系统，15min后停止通液体；
步骤(8)：一小时后重新启动泵，以0.1ml/min的流速通入pH为7.4的0.05mM的磷酸盐缓冲溶液；
步骤(9)：待信号平稳后以0.1ml/min的流速通入步骤(3)配制的纤维素酶液体，纤维素酶吸附到芯片上，待吸附平衡后通入磷酸盐缓冲溶液冲洗去未牢固结合的纤维素酶，最后得到原位纤维素酶修饰的金芯片。
具体实施方式
实验温度设置为25℃，流速均设置为0.1ml/min。
所用芯片为金表面的QCM或SPR芯片，实验前将金芯片清洗后用氮气吹干，然后放入紫外-臭氧清洗机照射10-30min。
溶液配制：用75％乙醇为溶剂配制40mM的11-巯基十一烷酸(MUA)与3-巯基丙酸(MPA)；用pH7.4的0.05mM的磷酸盐缓冲溶液配制2mM的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和5mM的N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐(NHSS)的溶液，和50μg/ml的纤维素酶液体。
修饰程序：将清洗并照射后的芯片放置在QCM或SPR流动池内；首先通入75％的乙醇溶液把基线走平；待平稳后，通入MPA/MUA混合溶液对芯片就行修饰，待检测信号平衡后通入75％乙醇冲洗；接下来通入EDC和NHSS对MPA/MUA进行活化，活化后通入磷酸盐缓冲济液；最后通入纤维素酶液体，纤维素酶与活化的MPA/MUA相互作用，吸附到芯片上，特吸附平衡后通入磷酸盐缓冲溶液冲洗去未牢固结合的纤维素酶，最后得到原位纤维素酶修饰的金芯片。
下面结合实施实例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
所用芯片为金表面的QCM芯片。
首先是金芯片的准备：将金芯片清洗后用氮气吹干，放入紫外-臭氧清洗机照射10-30min，然后将芯片放置在QCM流动池内。
然后开始原位修饰程序：
首先以0.1ml/min的速率通入75％的乙醇溶液，直到基线走稳。然后以0.1ml/min的速率通入按10∶1(V∶V)的比例混合的40mM的11-巯基十一烷酸(MPA)与40mM的3-巯基丙酸(MUA)的混合溶液。QCM频率下降到大约-6Hz，。平衡后，通入75％乙醇冲洗，频率恢复到-4Hz左右。整个过程能量耗散值(D)几乎不便。按照Sauerbrey方程计算，MPA/MUA在金芯片上的吸附量大约1.1mg/m2，膜的厚度大约为0.6nm。
接下来通入以体积比为1∶1混合的2mM的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和5mM的N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐(NHSS)的混合溶液15min。然后停止通液体，静止1h使活化充分；QCM监测频率上升到大约150Hz，而相对应的能量耗散值降低到-55×10-6。这个QCM的频率和能量耗散变化主要是由于溶剂体系从乙醇体系转化到了磷酸缓冲液体系导致的。活化一小时后通入磷酸盐缓冲溶液进行冲洗。
最后是纤维素酶的修饰：待平衡后通入浓度为50μg/ml的纤维素酶，平衡后再通入磷酸盐缓冲溶液冲洗去未牢固结合的纤维素酶，最后得到原位纤维素酶修饰的金芯片。由于纤维素酶的吸附，QCM监测的频率相应的从约150Hz下降到100Hz左右，按照Sauerbrey方程计算，纤维素酶在金芯片上的吸附量大约8mg/m2，膜的厚度大约为5nm。整个纤维素酶原位修饰QCM金芯片的QCM监测信号如附图1，其膜的AFM图见附图2。
实施例2
所用芯片为金表面的SPR芯片。
首先是金芯片的准备：将金芯片清洗后用氮气吹干，放入紫外-臭氧清洗机照射10-30min，然后将芯片放置在SPR流动池内。
然后开始原位修饰程序：
首先以0.1ml/min的速率通入75％的乙醇溶液，直到基线走稳，SPR角度大约在72.68°。然后以0.1ml/min的速率通入按10∶1(V∶V)的比例混合的40mM的11-巯基十一烷酸(MUA)与40mM的3-巯基丙酸(MPA)的混合溶液。SPR角度上升到大约72.89°。平衡后，通入75％乙醇冲洗，角度几乎不便。按照方程估算，MPA/MUA在金芯片上的吸附厚度大约为3.8nm。
接下来通入以体积比为1∶1混合的2mM的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(NHSS)和5mM的N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐(EDC)的混合溶液，15min后停止通液体，静止1h使活化充分；SPR监测角度下降到68.5°左右。这个变化主要是溶剂体系从乙醇体系转化到了磷酸缓冲液体系其折射率的改变引起的。活化一小时后通入磷酸盐缓冲溶液冲洗。
最后是纤维素酶的修饰：待平衡后通入浓度为50μg/ml的纤维素酶，SPR角度缓慢上升到约69.5°。平衡后再通入磷酸盐缓冲溶液冲洗去未牢固结合的纤维素酶最后得到原位纤维素酶修饰的金芯片。SPR角度迅速回复到69.03°。也就是说，整个纤维素酶牢固吸附的量导致的SPR角度变化大约0.53°，按照方程估算，该层纤维素酶的厚度大约为9.8nm。整个纤维素酶原位修饰SPR芯片的SPR监测信号变化如附图3，其最后纤维素酶膜的AFM图见附图4。
附图说明
附图1：石英晶体微天平(QCM)监测纤维素酶的原位修饰金芯片的情况
附图2：纤维素酶修饰的石英晶体微天平(QCM)芯片的AFM图
附图3：表面等离子共振仪(SPR)监测纤维素酶的原位修饰金芯片的情况
附图4：纤维素酶修饰的表面等离子体(SPR)芯片的AFM图
技术效果
实施例中吸附量或者膜的厚度都是依据相关方程估算得到，由于纤维素酶膜是粘弹性膜，不是刚性的膜，因此相比于SPR方法，QCM方法中用Sauerbrey方程均严重低估了其膜的厚度约50％。
另外申明，具体实施方式中仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上的实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (1)

1.一种纤维素酶原位修饰金芯片的方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤(1)：所用芯片为金表面的QCM或SPR芯片，实验前将金芯片清洗后用氮气吹干，然后放入紫外-臭氧清洗机照射10-30min；
步骤(2)：用75％乙醇为溶剂配制40mM的11-巯基十一烷酸(MUA)与3-巯基丙酸(MPA)；
步骤(3)：用pH为7.4的0.05mM的磷酸盐缓冲溶液配制2mM的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和5mM的N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐(NHSS)的溶液，和50μg/ml的纤维素酶液体；
步骤(4)：将步骤(1)清洗并照射后的芯片放置在QCM或SPR流动池内；
步骤(5)：首先以0.1ml/min的流速通入75％的乙醇溶液把基线走平；
步骤(6)：待平稳后，把步骤(2)中配制的MPA和MUA溶液按体积比10∶1的比例混合后，以0.1ml/min的流速通入QCM或SPR流动池，待检测信号平衡后通入75％乙醇冲洗；
步骤(7)：接下来把步骤(3)中配制的EDC和NHSS溶液以体积比1∶1混合，然后以0.1ml/min的流速通入系统，15min后停止通液体；
步骤(8)：一小时后重新启动泵，以0.1ml/min的流速通入pH为7.4的0.05mM的磷酸盐缓冲溶液；
步骤(9)：待信号平稳后以0.1ml/min的流速通入步骤(3)配制的纤维素酶液体，纤维素酶吸附到芯片上，待吸附平衡后通入磷酸盐缓冲溶液冲洗去未牢固结合的纤维素酶，最后得到原位纤维素酶修饰的金芯片。
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