CN104569394A - 一种多重miRNA肿瘤标志物检测方法及其应用 - Google Patents

一种多重miRNA肿瘤标志物检测方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种多重miRNA肿瘤标志物检测方法及其应用，通过获取包含有目标miRNA的总RNA样本溶液，将样本溶液与等量DNA-RNA嵌合探针混合后，得到嵌合探针，再用RNase？ONE核糖核酸酶降解互补核酸双链中发生错配或部分互补的单链RNA，最后采用化学发光法测定目标miRNA量。本发明操作简便，特异性高，适用于肿瘤的筛查与早期诊断方面的应用。

Description

一种多重miRNA肿瘤标志物检测方法及其应用
技术领域
本发明属于癌症检测技术领域，尤其涉及一种多重miRNA肿瘤标志物检测方法及其应用。
背景技术
对于癌症的防治来说，早期发现、早期诊断是关键。即在患者出现临床症状前或在癌症发生浸润前实现确诊，从而使患者得到及时治疗，进而改善预后，达到提高治愈率、降低死亡率的目的。
目前临床中肿瘤最常用的检查方法是影像学及血清标志物检验，但这些方法往往只能在肿瘤发展到一定的程度后才能检测出来。寻找新的肿瘤标志物并对其进行准确检测一直都是癌症治疗的关键前提步骤。肿瘤标志物在癌症的早期诊断、个体化治疗、预后判断等诸多方面都具有重要作用，较常见的肿瘤标志物有蛋白酶类、肿瘤特异性抗原、肿瘤代谢产物、激素、癌基因和抑癌基因及甲基化DNA等。尽管越来越多的肿瘤标志物已经被发现并应用于癌症的普查、诊断和疗效的监控，但是它们的临床应用效果还存在着明显不足，而且目前肿瘤标志物的检测大多程序繁杂且灵敏度低，从而限制了其临床应用。
microRNA(miRNA)是一类内源性、长19至24个核苷酸的非编码单链RNA分子。它主要通过碱基互补配对与指导蛋白质合成的信使RNA(messagerRNA，mRNA)相结合，导致其翻译受阻或降解，从而参与调控个体发育、细胞凋亡、增殖及分化等生命活动。然而，除了与人类的许多正常的生理活动相关，miRNA也与癌症的发生、发展存在千丝万缕的联系。由于miRNA的变化早于基因和蛋白质的改变，也早于疾病症状的出现，由此检测miRNA的动态变化，有可能为疾病的发生、发展提供线索，进而指导临床早期干预，有效控制疾病发展。不同肿瘤具有不同的miRNA表达模式，通过miRNA表达谱的分析，将有助于临床上对肿瘤进行诊断、分期及预后的估计。因此，miRNA将成为肿瘤早期诊断及预后评估的新肿瘤标志物。
尽管miRNA作为肿瘤标志物检测在癌症筛查和早期诊断中具有明显的优势，但是在我国广大的肺癌高危人群中却未能得到应用，其根本原因是缺乏一种低成本、高通量的多重miRNA检测技术。miRNA的超小尺寸与超低浓度使许多传统核酸检测技术对之“无可奈何”。例如：对于经典的实时荧光定量核酸扩增反应(Real-Time quantitative Polymerase Chain Reaction，RT-qPCR)来说，目标miRNA的超小尺寸导致要使用过短的寡核苷酸链引物，造成了解链温度(Melting Temperature，Tm)的降低，影响了扩增的效率；其结果还可能会受miRNA前体(miRNA precursor，pre-miRNA)的干扰。并且，目前还难以基于RT-qPCR开发出多重miRNA检测技术，每增加1个目标miRNA的检测即增加1个反应所需样本量，这对珍贵的临床肿瘤样本是不可接受的。miRNA芯片技术因为可以实现快速、多重miRNA检测而得到极大发展。但是miRNA的超小尺寸使得芯片上核酸探针与目标miRNA杂交的严格性降低；且杂交过程中产生的碱基错配或部分互补会引起结果的假阳性率升高。除此之外，以上技术在实际应用时还需要特殊的检测设备、复杂的操作程序和专门的结果读取方法，这无疑将造成使用成本的大幅度上升。
液相芯片，又称悬浮阵列、流式荧光技术，是基于美国Luminex公司的xMAP(flexibleMulti-Analyte Profiling)技术开发的多功能生物芯片平台，是目前唯一得到美国食品和药品监督管理局(FDA)批准用于临床的高通量、多重诊断技术。这种技术通过使用荧光染色编码5.6μm磁性聚苯乙烯微球可以同时对不同目标miRNA进行检测，最多可以在一个微量液态反应体系中同时检测多达100种miRNA。与固相芯片相比，因为核酸杂交反应是在悬浮溶液中进行，更有利于探针与目标miRNA杂交，并能最大程度地避免固态芯片中探针之间的交叉反应。但是由于耗材昂贵与专利技术垄断，极高的使用成本阻碍了这一先进诊断技术在临床上的推广。
综上所述，尽管利用miRNA肿瘤标志物检测进行肺癌筛查与早期诊断已经有了许多重要进展，但是目前这一策略仍只停留在实验室阶段，阻碍其成为临床应用的最大障碍是缺乏一种精确且廉价的多重miRNA检测技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多重miRNA肿瘤标志物检测方法及其应用，旨在解决上述背景技术中的不足。
本发明是这样实现的，一种多重miRNA肿瘤标志物检测方法，包括以下步骤：
(1)对临床血液样本进行前处理，获取包含有目标miRNA的总RNA样本溶液；
(2)将样本溶液与等量DNA-RNA嵌合探针混合后，通过升温和降温退火的方式，使探针的RNA部分与其目标miRNA杂交，得到嵌合探针；
(3)将5’端修饰氨基的DNA捕捉序列与活化后的酶标板孔中的化学基团通过酰胺反应进行连接；
(4)将步骤(2)中得到的嵌合探针加入到步骤(3)中已连接DNA捕捉序列的酶标板孔中进行核酸链之间的杂交作用，形成酶标板-嵌合探针-miRNA复合物；
(5)往酶标板孔中加入核糖核酸酶降解双链RNA中发生错配或部分互补的单链RNA；
(6)通过化学发光法检测目标miRNA量。
优选地，在步骤(1)中，所述前处理具体为：将血浆与血清样本用0.05MpH 7.4的Tris-HCl缓冲液稀释至原体积的20倍，加入5U/mL蛋白酶K(proteinase K)与3％EDTA，在37℃消化2小时，添加5％至10％Tween 20表面活性剂后混合30分钟，去除结合着miRNA的蛋白质，释放miRNA；再加入10U/mL DNA酶I，37℃反应1小时，得到包含有目标miRNA的总RNA。
优选地，在步骤(2)中，所述DNA-RNA嵌合探针的种类数量由要检测的目标miRNA数量决定；其中，所述DNA-RNA嵌合探针的RNA部分与其对应的目标miRNA完全互补且，5’端标记Biotin，所述DNA-RNA嵌合探针的DNA部分与要连接在酶标板上的对应DNA捕捉序列完全互补。
优选地，所述DNA-RNA嵌合探针的DNA部分的序列为：
5’-TACTTCTTTACTACAATTTACAAC-3’。
优选地，在步骤(3)中，所述酶标板为马来酸酐表面改性96/384孔酶标板；
所述DNA捕捉序列为：5’-GTTGTAAATTGTAGTAAAGAAGTA-3’。
优选地，在步骤(6)中，所述化学发光法具体为：加入200μg/mL的SA-HRP，该蛋白与探针上Biotin标记迅速结合；然后用PBS清洗三遍，然后添加Thermo Scientific公司的化学发光试剂，利用该蛋白上连接的HRP与试剂中的Luminol-H2O2发生酶促反应，产生强烈的425nm荧光，荧光酶标仪检测其荧光强度值，做出荧光强度值与miRNA量的标准曲线。
本发明进一步提供了上述检测方法在肿瘤的筛查与早期诊断方面的应用。
优选地，所述肿瘤为肺癌。
本发明克服现有技术的不足，提供一种多重miRNA肿瘤标志物检测方法及其应用，本发明中，依据DirectPCR技术中的前处理方案，对生物细胞或临床肺癌样本(全血、血浆、血清)进行化学和生物学处理，降解掉蛋白质和DNA成分，释放出其中的总RNA，而无需进行RNA的提取，简化了实验流程，缩短检测时间，而且能节省珍贵的临床肿瘤样本；然后，采用表面改性的96/384孔酶标板取代xMAP液相芯片技术中的MagPlex-TAG荧光标记磁珠，这种酶标板表面被有反应活性的基团所修饰，可以化学交联末端存在氨基或巯基的核酸链，使用过的酶标板经过适当处理和清洗后，可以被重复利用；然后，使用末端标记生物素(Biotin)的DNA-RNA嵌合探针，其设计原则来自xMAP液相芯片技术，并全部由国内生物公司合成；RNase ONE核糖核酸酶被用来检查发生错配或部分互补的情况，通过其降解互补核酸双链中发生错配或部分互补的单链RNA，最低可达一个碱基；最后，采用化学发光法测定目标miRNA量。通过使用辣根过氧化物酶标记的链霉素亲和素(Streptavidin-HorseradishPeroxidase，SA-HRP)与嵌合探针上的Biotin标记结合，辣根过氧化物酶(HRP)在增强型化学发光底物环境下发生酶促反应，产生强烈的荧光。通过荧光酶标仪测定每孔中产生的不同荧光强度值，可推算出相对应目标miRNA量。
这种检测手段利用了HRP酶的生物催化特性来快速放大检测信号，无需核酸扩增。根据本发明的设计方案，生物细胞及临床样本仅需一次处理，加入不同嵌合探针后；一块酶标板最多可同时检测384种miRNA肿瘤标志物(384孔板)；达到高通量和多重检测的设计目标。
相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：本发明操作简便，特异性高，适用于临床检测。
附图说明
图1是本发明多重miRNA肿瘤标志物检测方法的技术路线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一种多重miRNA肿瘤标志物检测方法，如图1所示，包括以下步骤：
a、临床血液样本的前处理
临床样本(血浆与血清)用0.05M Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液稀释至原体积的20倍，加入5U/mL蛋白酶K(proteinase K)与3％EDTA，在37℃消化2小时，添加5％至10％Tween 20表面活性剂后混合30分钟，去除结合着miRNA的蛋白质，释放miRNA；再加入10U/mL DNA酶I，37℃反应1小时，降解了基因组中的DNA成分后，溶液中剩余的即为包含有目标miRNA的总RNA。
以上的每个步骤都要注意抑制RNA酶的活性，除所用的缓冲液都需要用DEPC进行预处理外，还需要添加40U/mL RNA酶抑制剂，为下面的检测提供最佳且最多的miRNA。
b、嵌合探针与目标miRNA杂交
将处理好的样本溶液中加入等量的1μM不同DNA-RNA嵌合探针(探针种类数量由要检测的目标miRNA数量决定)，探针的RNA部分与其对应的目标miRNA完全互补且5’端标记Biotin，探针的DNA部分(5’-TACTTCTTTACTACAATTTACAAC-3’)与将要连接在酶标板上的对应DNA捕捉序列(5’-GTTGTAAATTGTAGTAAAGAAGTA-3’)完全互补；充分混合后，将溶液升温至90℃，然后逐渐降至室温，进行退火，使探针的RNA部分与其目标miRNA杂交。
c、连接捕捉序列于表面改性酶标板上
将购买到的Thermo Scientific马来酸酐表面改性96/384孔酶标板(MaleicAnhydride Activated Plates)用PBS-Tween 20溶液冲洗三次，活化其上的化学基团，设计并合成5’端修饰氨基的DNA捕捉序列(5’-GTTGTAAATTGTAGTAAAGAAGTA-3’)，通过酰胺反应将捕捉序列连接在酶标板上(每孔加入1μM)，然后用BSA蛋白溶液(10mg/mL)封闭酶标板上未参与反应的化学基团，PBS清洗三遍后，酶标板用塑料膜覆盖，存储于4℃环境中，等待进行下一个步骤。
d、核酸杂交形成酶标板-嵌合探针-miRNA复合物
将b步骤中已与目标miRNA杂交的嵌合探针加入c步骤中已连接DNA捕捉序列的酶标板孔中，加入含有5％TritonX-100表面活性剂的Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)；根据碱基互补配对的原则，嵌合探针的DNA部分与连接在酶标板上的捕捉序列产生杂交，形成酶标板-嵌合探针-miRNA复合物；通过核酸链之间的杂交作用将嵌合探针与目标miRNA固定在酶标板上。
e、RNase ONE核糖核酸酶进行检查
每孔加入10U/mL的RNase ONE核糖核酸酶至满，37℃反应1小时，然后PBS溶液清洗每孔三遍。RNase ONE核糖核酸酶通过降解双链RNA中发生错配或部分互补的单链RNA机制，检查嵌合探针上杂交的miRNA；即使是仅与目标miRNA相差1个核苷酸的同源miRNA也能被其识别并降解。RNase ONE核糖核酸酶的使用保证了检测结果的高准确度与强特异性，降低了假阳性率的产生。
f、化学发光法检测目标miRNA量
加入200μg/mL的SA-HRP，该蛋白与探针上Biotin标记迅速结合。然后用PBS清洗三遍，然后添加Thermo Scientific公司的化学发光试剂(SuperSignalELISA Femto Substrate)，利用该蛋白上连接的HRP与试剂中的Luminol-H2O2发生酶促反应，产生强烈的425nm荧光，荧光酶标仪检测其荧光强度值，做出荧光强度值与miRNA量的标准曲线。
g、验证灵敏度与特异性，评估临床应用潜力
采用人工合成miRNA let-7家族中的let-7a至let-7h共八种同源miRNA重复以上步骤，发现虽然这些miRNA之间只有少数碱基差异，但是使用这种方法仍能区别出来，可以证明此方法有高特异性，适用于临床检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种多重miRNA肿瘤标志物检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对临床血液样本进行前处理，获取包含有目标miRNA的总RNA样本溶液；
(2)将样本溶液与等量DNA-RNA嵌合探针混合后，通过升温和降温退火的方式，使探针的RNA部分与其目标miRNA杂交，得到嵌合探针；
(3)将5’端修饰氨基的DNA捕捉序列与活化后的酶标板孔中的化学基团通过酰胺反应进行连接；
(4)将步骤(2)中得到的嵌合探针加入到步骤(3)中已连接DNA捕捉序列的酶标板孔中进行核酸链之间的杂交作用，形成酶标板-嵌合探针-miRNA复合物；
(5)往酶标板孔中加入核糖核酸酶降解双链RNA中发生错配或部分互补的单链RNA；
(6)通过化学发光法检测目标miRNA量。
2.如权利要求1所述的多重miRNA肿瘤标志物检测方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述前处理具体为：将血浆与血清样本用0.05M pH 7.4的Tris-HCl缓冲液稀释至原体积的20倍，加入5U/mL蛋白酶K(proteinase K)与3％EDTA，在37℃消化2小时，添加5％至10％Tween 20表面活性剂后混合30分钟，去除结合着miRNA的蛋白质，释放miRNA；再加入10U/mL DNA酶I，37℃反应1小时，得到包含有目标miRNA的总RNA。
3.如权利要求2所述的多重miRNA肿瘤标志物检测方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述DNA-RNA嵌合探针的种类数量由要检测的目标miRNA数量决定；其中，所述DNA-RNA嵌合探针的RNA部分与其对应的目标miRNA完全互补且，5’端标记Biotin，所述DNA-RNA嵌合探针的DNA部分与要连接在酶标板上的对应DNA捕捉序列完全互补。
4.如权利要求3所述的多重miRNA肿瘤标志物检测方法，其特征在于，所述DNA-RNA嵌合探针的DNA部分的序列为：
5’-TACTTCTTTACTACAATTTACAAC-3’。
5.如权利要求4所述的多重miRNA肿瘤标志物检测方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述酶标板为马来酸酐表面改性96/384孔酶标板；
所述DNA捕捉序列为：5’-GTTGTAAATTGTAGTAAAGAAGTA-3’。
6.如权利要求5所述的多重miRNA肿瘤标志物检测方法，其特征在于，在步骤(6)中，所述化学发光法具体为：加入200μg/mL的SA-HRP，该蛋白与探针上Biotin标记迅速结合；然后用PBS清洗三遍，然后添加ThermoScientific公司的化学发光试剂，利用该蛋白上连接的HRP与试剂中的Luminol-H2O2发生酶促反应，产生强烈的425nm荧光，荧光酶标仪检测其荧光强度值，做出荧光强度值与miRNA量的标准曲线。
7.权利要求1～6任一项所述的检测方法在肿瘤的筛查与早期诊断方面的应用。
8.如权利要求7所述的检测方法在肿瘤筛查与早期诊断方面的应用，其特征在于，所述肿瘤为肺癌。
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