CN106119371A - 一种利用单链特异性核酸酶检测microRNA含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用SSSN酶检测microRNA的方法。本发明提供了一种利用SSSN酶检测待测样本中是否含有目标microRNA的方法，包括如下步骤：1)制备目标microRNA探针；所述目标microRNA探针为：NH2‑A‑B‑生物素；所述A为(CH2)n，其中，n为6‑12的整数；所述B为与所述目标microRNA反向互补的单链DNA分子；2)将所述目标microRNA探针、待测样本、SSSN酶依次加入酶标板各孔中，得到反应后酶标板；3)通过化学发光法检测所述反应后酶标板，确定待测样本中是否含有目标microRNA。本发明的实验证明，本发明的方法可以提高整个检测体系的灵敏度和特异性，保证检测结果的准确性和可靠性。

Description

一种利用单链特异性核酸酶检测microRNA含量的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种利用单链特异性核酸酶(Single-StrandSpecific Nuclease，SSSN)检测microRNA含量的方法。
背景技术
microRNA的超小尺寸与体液中的超低浓度使许多优秀的检测技术对其也“无可奈何”。近期，基于核酸杂交的microRNA芯片技术因为其可以实现快速、高通量microRNA检测而得到极大发展。但是microRNA的超小尺寸使得芯片上探针与目标microRNA杂交的严格性降低；且杂交过程中产生的碱基错配或部分互补会引起诊断结果的假阳性率升高。
SSSN酶是一类高度选择性切除单链核酸或双链核酸中单链区域的单链特异性核酸酶。SSSN酶具有特异性识别并切割异源双链杂交或点突变导致的碱基错配以及不能配对的碱基插入/缺失造成的部分互补的能力。这种能力使其被广泛应用于分子生物学的研究中，例如：测定核酸结构，绘制突变图谱，研究核酸与其他化学试剂相互作用的机制等；而细胞内的一些SSSN酶则参与了基因的复制、重组、修复以及突变。由于用途广泛，科研人员已经从不同来源分离出了30多种SSSN酶；但是，目前仅有S1核酸酶(S1Nuclease)、绿豆芽核酸酶(Mung Bean Nuclease)、P1核酸酶(P1Nuclease)、BAL 31核酸酶(BAL 31Nuclease)、核糖核酸酶A(Ribonuclease A)等核酸酶得到了广泛研究和商品化应用。
基于SSSN酶的独特能力，应用这种核酸酶进行核酸分析检测已成为目前科研的一个热点。因此，应用一种常用的SSSN酶，在其特殊能力的辅助下，开发出一套灵敏且可靠的microRNA标志物检测新技术是切实可行的。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种利用SSSN酶检测待测样本中是否含有目标microRNA的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1)制备目标microRNA探针；
所述目标microRNA探针为：NH2-A-B-生物素；
所述A为(CH2)n，其中，n为6-12的整数；
所述B为与所述目标microRNA反向互补的单链DNA分子；
单链DNA分子的5’端与(CH2)n连接，单链DNA分子的3’端与生物素连接。
2)将所述目标microRNA探针、待测样本、SSSN酶依次加入酶标板各孔中，得到反应后酶标板；
3)通过化学发光法检测所述反应后酶标板，确定待测样本中是否含有目标microRNA。
上述方法中，所述目标microRNA探针、待测样本、SSSN酶依次加入酶标板各孔中包括如下步骤：
A)将所述目标microRNA探针固定到酶标板各孔中，得到连接探针的酶标板；
B)将所述待测样本的RNA加入所述连接探针的酶标板，进行杂交反应，得到含有杂交产物的酶标板；
C)将SSSN酶加入所述含有杂交产物的酶标板各孔中，酶切反应，得到反应后酶标板。
上述方法中，在步骤A和步骤C之间，还包括封闭所述连接探针的酶标板的步骤。
上述方法中，步骤A中，所述酶标板为马来酸酐基团修饰的酶标板；
所述目标microRNA探针通过酰胺反应固定到酶标板。
所述将所述目标microRNA探针固定到酶标板各孔中包括如下步骤：先活化所述酶标板上的马来酸酐基团，再将所述目标microRNA探针加入活化后酶标板各孔中，进行酰胺反应，得到连接探针的酶标板。
所述酰胺反应条件为：在温度为25-28℃震荡反应1小时；
步骤B中，所述杂交反应条件为：在温度为45℃反应2小时；
步骤C中，所述酶切反应条件为：在温度为37℃反应1小时；
上述方法中，所述目标microRNA探针的加入浓度为1μM，加入量为每孔200ul；
所述待测样本的RNA的加入量为每孔200ul；
所述SSSN酶的加入浓度为10U/mL，加入量为每孔200ul。
上述方法中，所述确定待测样本中是否含有目标microRNA的方法为：若所述待测样本所在孔有荧光信号或荧光强度值，则所述待测样本中或候选含有所述目标microRNA；若所述待测样本所在孔没有荧光信号或荧光强度值，则所述待测样本不含有或候选不含有所述目标microRNA。
上述方法中，所述通过化学发光法检测所述反应后酶标板包括如下步骤：先将辣根过氧化物酶标记链霉亲和素和化学发光试剂依次加入所述反应后酶标板中，得到酶促反应后孔板，再用荧光酶标仪检测所述酶促反应后孔板各孔的荧光信号或荧光强度值。
本发明另一个目的是提供一种利用SSSN酶检测待测样本中目标microRNA含量的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1)制备目标microRNA探针；
所述目标microRNA探针为：NH2-A-B-生物素；
所述A为(CH2)n，其中，n为6-12的整数；
所述B为与所述目标microRNA反向互补的单链DNA分子；
2)将所述目标microRNA探针、不同浓度的目标microRNA溶液、SSSN酶依次加入酶标板各孔中，得到反应后酶标板；
3)通过化学发光法检测所述反应后酶标板，得到不同浓度的目标microRNA溶液的荧光强度，根据所述不同浓度的目标microRNA溶液的浓度及各自对应的荧光强度做标准曲线；
4)将所述待测样本的RNA替换步骤2)中不同浓度的目标microRNA溶液，重复步骤2)和3)，得到待测样本的RNA对应的荧光强度，将该荧光强度值代入所述标准曲线中，计算得到待测样本中目标microRNA的含量。
上述方法中，所述SSSN酶为S1核酸酶。
上述方法中，所述(CH2)n为(CH2)6、(CH2)9、(CH2)12、(CH2)18或(CH2)24；
和/或，所述目标microRNA具体为microRNA let-7a；
和/或，所述microRNA let-7a探针为NH2-(CH2)12-B-生物素，其中所述B为序列1所示的单链DNA分子；
和/或，所述microRNA let-7a的核苷酸序列具体为序列2。
上述方法中，所述待测样本为离体血浆或离体血清或RNA溶液。
上述SSSN酶或S1核酸酶在检测或辅助检测microRNA中的应用也是本发明保护的范围。
上述方法中的核苷酸探针也是本发明保护的范围。
本发明的实验证明，本发明使用DNA探针比RNA探针稳定，不容易在未使用(保存期)降解，且合成费用也比RNA便宜；另外，本发明使用的S1核酸酶而非昂贵的RNase ONE核酸酶，S1核酸酶价格较为便宜且反应所需条件没有RNase ONE核酸酶所需条件苛刻。总之，本发明用常用SSSN酶检查探针(酰胺反应连接至96孔酶标板)与目标microRNA(提取自血清)杂交中发生的错配和部分互补，提高整个检测体系的灵敏度和特异性，保证检测结果的准确性和可靠性；然后，利用结合到探针上的辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)与化学发光底物(Luminol-H2O2)产生的酶促反应发出强烈荧光，快速放大检测信号(最低检测浓度可达到atto-mol/L级)，而无需进行核酸扩增，减少了实验步骤，降低了检测难度。检测过程仅使用荧光酶标仪；根据每孔中不同的荧光强度，计算出不同孔所对应的目标microRNA量即可。本发明的方法准确可靠，操作简便易行，能大幅度降低microRNA检测成本，进一步增加其应用优势。
附图说明
图1为利用SSSN酶检测microRNA的流程图。
图2为microRNA let-7a的标准曲线。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、利用SSSN酶检测待测样本是否含有microRNA let-7a的方法
图1为利用SSSN酶检测microRNA的流程图。
下面实施例采用microRNA let-7a为待检测microRNA，microRNA let-7a的核苷酸序列为UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU(序列2)。
一、待测样本
本发明的实施例采用的是浓度为0.5fM至1000fM的microRNA let-7a溶液作为待测样本；
上述溶液中的溶质为microRNA let-7a，溶剂为pH值为7.2、浓度为0.01M的PBS缓冲液(8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于1000ml水中)。
本发明的待测样本也可以来源于血浆或血清，需要提取血浆或血清的RNA，具体方法如下：将血浆或血清样本用0.05M pH 7.4的Tris-HCl缓冲液稀释至原体积的20倍，加入5U/mL蛋白酶K(proteinase K)与3％(质量百分含量)EDTA，在37℃消化2小时，添加10％质量百分含量Tween 20表面活性剂后混合30分钟，去除结合着microRNA的蛋白质，释放microRNA；再加入10U/mL DNA酶I，37℃反应1小时，得到包含有microRNA let-7a的总RNA，即为待测样本。
二、利用SSSN酶高通量检测microRNA let-7a的方法
1、microRNA let-7a探针制备
探针种类数量由要检测的待检测microRNA的数量决定；其中，探针的序列与其对应的待检测microRNA的核酸序列完全反向互补，且5’端氨基修饰并连接C12，3’端生物素修饰。
microRNA let-7a的探针如下：NH2-A-B-生物素；
A为(CH2)n，其中，n为6-12的整数；
B为序列1所示的单链DNA分子；
单链DNA分子的5’端与(CH2)n连接，单链DNA分子的3’端与生物素连接。
其中，5’NH2修饰和3’Biotin(生物素)修饰不可缺少；中间(CH2)12间隔可以是(CH2)6、(CH2)9、(CH2)12、(CH2)18、(CH2)24；但是考虑成本和效率，选用了(CH2)12。
microRNA let-7a的探针为：
5’NH2—CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2—AACTATACAACCTACTACCTCA(序列1)—Biotin(生物素)3’
合成上述microRNA let-7a的探针，溶解到pH值为7.2、浓度为0.01M的PBS缓冲液(8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于1000ml水中)中，得到浓度为1μM的microRNA let-7a探针溶液。
2、反应后酶标板的获得
1)连接探针的酶标板
先将马来酸酐化96孔酶标板(Thermo Scientific公司15108)用PBS-Tween 20溶液(0.1M磷酸钠、0.15M氯化钠、0.05％质量百分含量Tween-20和水混匀，pH 7.2)冲洗三次，活化其上的马来酸酐基团；
再将上述1制备的浓度为1μM microRNA let-7a的探针溶液加入96孔酶标板各孔中，每孔加入200μl，室温震荡反应1小时，探针的氨基与酶标板表面的马来酸酐基团发生酰胺反应，得到连接探针的酶标板；
再用200μl 10mg/mL牛血清白蛋白溶液(用pH值为7.2、浓度为0.01M的PBS缓冲液溶解)加入连接探针的酶标板各孔中，室温震荡反应3小时，封闭酶标板上未参与反应的马来酸酐基团，pH值为7.2、浓度为0.01M的PBS缓冲液(8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于1000ml水中)清洗三遍后，酶标板用塑料膜覆盖，存储于4℃环境中，得到封闭处理后酶标板。
2)含有杂交产物的酶标板
将上述一的待测样本分别加入到上述封闭处理后酶标板上各孔中，每孔加入200μl，45℃杂交2小时，使探针与其目标microRNA杂交，形成含有杂交产物的酶标板。
3)、SSSN酶酶切
向上述含有杂交产物的酶标板的每个孔中加入10U/mL SSSN酶(S1核酸酶，ThermoScientific,EN0321)，每孔加入200μl，37℃反应1小时，使SSSN酶识别并剪切核酸杂交中碱基错配和部分互补的核酸；然后PBS溶液清洗三遍，得到酶切后酶标板(即为反应后酶标板)。
3、化学发光法检测荧光信号或荧光强度值
1)酶促化学发光放大microRNA检测信号
向上述酶切后酶标板中各孔中加入200μl的200μg/mL的HRP标记链霉亲和素(SA-HRP，Thermo Scientific,21140)，该蛋白与探针上生物素标记迅速结合，反应15min，用PBS溶液清洗三遍，得到结合HRP的酶标板；
再向结合HRP的酶标板各孔中添加200μl的化学发光试剂(SuperSignal ELISAFemto Substrate；Thermo Scientific,37074)，使化学发光中的Luminol、H2O2与结合HRP的酶标板中的HRP发生酶促反应产生强烈的425nm荧光，得到酶促反应后孔板。
2)检测
用荧光酶标仪(化学发光模式)检测上述酶促反应后孔板中各孔荧光强度值。
若某孔有荧光信号或荧光强度值，则该孔中加入的待测样本中或候选含有所述目标microRNA；若某孔没有荧光信号或荧光强度值，则该孔中加入的待测样本不含有或候选不含有目标microRNA。
结果如表1所示，浓度为0.1fM至100nM的microRNA let-7a溶液作为待测样本所在孔中均有荧光强度值，表明本发明的方法可以检测待测样本是否含有microRNA。
表1为浓度为0.1fM至100nM的microRNA let-7a溶液作为待测样本的荧光强度值
待测样本(fM) 0.5 1 5 10 50 100 500 1000
相对荧光值 38787 99000 580957 1183000 6002640 12026737 60219497 120460447
实施例2、利用SSSN酶检测待测样本中microRNA let-7a含量的方法
一、待测样本和标准品
不同浓度的标准品为浓度为0.5fM、1fM、5fM、50fM、500fM、1000fM的microRNAlet-7a溶液；
待测样本为浓度为10fM的microRNA let-7a溶液和浓度为100fM的microRNA let-7a溶液。
上述溶液中的溶质为microRNA let-7a，溶剂为pH值为7.2、浓度为0.01M的PBS缓冲液(8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于1000ml水中)。
二、利用SSSN酶高通量检测microRNA let-7a含量的方法
1、microRNA let-7a探针制备
与实施例1相同。
2、反应后酶标板的获得
1)连接探针的酶标板
与实施例1相同。
2)含有杂交产物的酶标板
将上述一的不同浓度的标准品分别加入到上述封闭处理后酶标板上各孔中，每孔加入200μl，45℃杂交2小时，使探针与其目标microRNA杂交，形成含有杂交产物的酶标板。
3)、SSSN酶酶切
与实施例1相同。
3、化学发光法检测标准品荧光信号或荧光强度值
1)酶促化学发光放大microRNA检测信号
与实施例1相同。
2)检测
用荧光酶标仪(化学发光模式)检测上述酶促反应后孔板中各孔荧光强度值，得到浓度为0.5fM、1fM、5fM、50fM、500fM、1000fM的microRNA let-7a溶液标准品的荧光强度值，根据标准品的不同浓度及各自对应的荧光强度值做标准曲线(图2)。
4、待测样本中microRNA let-7a的含量
将浓度为10fM的microRNA let-7a溶液和浓度为100fM的microRNA let-7a溶液分别替换步骤2中不同浓度的标准品，重复步骤2和3，得到浓度为10fM的microRNA let-7a溶液和浓度为100fM的microRNA let-7a溶液的荧光强度值，将该荧光强度值代入上述标准曲线中，计算得到待测样本中microRNA let-7a的含量(见表1所示)。
可以看出，本发明检测出待测样本中microRNA let-7a的含量与已知样本浓度一致，表明本发明能检测待测microRNA let-7a的浓度。

Claims (10)

1.一种利用SSSN酶检测待测样本中是否含有目标microRNA的方法，包括如下步骤：
1)制备目标microRNA探针；
所述目标microRNA探针为：NH2-A-B-生物素；
所述A为(CH2)n，其中，n为6-12的整数；
所述B为与所述目标microRNA反向互补的单链DNA分子；
2)将所述目标microRNA探针、待测样本、SSSN酶依次加入酶标板各孔中，得到反应后酶标板；
3)通过化学发光法检测所述反应后酶标板，确定待测样本中是否含有目标microRNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述目标microRNA探针、待测样本、SSSN酶依次加入酶标板各孔中包括如下步骤：
A)将所述目标microRNA探针固定到酶标板各孔中，得到连接探针的酶标板；
B)将所述待测样本的RNA加入所述连接探针的酶标板，进行杂交反应，得到含有杂交产物的酶标板；
C)将SSSN酶加入所述含有杂交产物的酶标板各孔中，酶切反应，得到反应后酶标板。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
在步骤A和步骤C之间，还包括封闭所述连接探针的酶标板的步骤。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：
步骤A中，所述酶标板为马来酸酐基团修饰的酶标板；
所述目标microRNA探针通过酰胺反应固定到酶标板。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：
所述确定待测样本中是否含有目标microRNA的方法为：若所述待测样本所在孔有荧光信号或荧光强度值，则所述待测样本中或候选含有所述目标microRNA；若所述待测样本所在孔没有荧光信号或荧光强度值，则所述待测样本不含有或候选不含有所述目标microRNA。
6.一种利用SSSN酶检测待测样本中目标microRNA含量的方法，包括如下步骤：
1)制备目标microRNA探针；
所述目标microRNA探针为：NH2-A-B-生物素；
所述A为(CH2)n，其中，n为6-12的整数；
所述B为与所述目标microRNA反向互补的单链DNA分子；
2)将所述目标microRNA探针、不同浓度的目标microRNA溶液、SSSN酶依次加入酶标板各孔中，得到反应后酶标板；
3)通过化学发光法检测所述反应后酶标板，得到不同浓度的目标microRNA溶液的荧光强度，根据所述不同浓度的目标microRNA溶液的浓度及各自对应的荧光强度做标准曲线；
4)将所述待测样本的RNA替换步骤2)中不同浓度的目标microRNA溶液，重复步骤2)和3)，得到待测样本的RNA对应的荧光强度，将该荧光强度值代入所述标准曲线中，计算得到待测样本中目标microRNA的含量。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述SSSN酶为S1核酸酶。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：所述(CH2)n为(CH2)6、(CH2)9、(CH2)12、(CH2)18或(CH2)24；
和/或，所述目标microRNA具体为microRNA let-7a；
和/或，所述microRNA let-7a探针为NH2-(CH2)12-B-生物素，其中所述B为序列1所示的单链DNA分子；
和/或，所述microRNA let-7a的核苷酸序列具体为序列2。
9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于：所述待测样本为离体血浆或离体血清或RNA溶液。
10.SSSN酶或S1核酸酶在检测或辅助检测microRNA中的应用；
或权利要求1-9中任一所述方法中的探针。
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