CN107988332A - DNA分子探针及在绿豆核酸酶的肿瘤细胞内miRNA实时定量PCR检测上的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种DNA分子探针,所述的分子探针为miRNA Let‑7b的DNA分子探针,该NDA分子探针带有茎环结构。本发明将该DNA分子探针用于检测肿瘤细胞内miRNA上,实验结果表明miRNA Let‑7b在人非小细胞肺癌细胞、乳腺癌细胞和宫颈癌细胞中低表达,在正常人肺上皮细胞、乳腺癌上皮细胞和人胚肾上皮细胞中高表达,能简便有效的检测肿瘤细胞内miRNA的表达水平。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,特别是指一种肿瘤细胞内miRNA(microRNA,微小RNA)的检测方法和用途。
背景技术
miRNA是生物体内源性表达的单链小分子RNA,属于非编码RNA的一种,其能够在转录后水平和翻译水平调控真核基因表达,由此广泛参与真核生物的发育、细胞分化以及免疫调节和肿瘤发生等生理病理过程。miRNA自身的表达异常是肿瘤发生发展的重要因素,因此检测肿瘤细胞内miRNA表达水平是抗肿瘤研究的重要技术之一。然而成熟的miRNA长度仅在20-24个核苷酸左右,而且没有多聚腺苷酸尾端,因而不能采用mRNA(信使RNA)的检测方法,即通过逆转录获得cDNA第一链后以特异性PCR引物扩增进行检测。
目前广泛采用的miRNA表达水平检测方法有三种:
1)Northern blot,
2)微阵列(microarray)分析,
3)实时定量PCR(quantitative Real-Time PCR)。
上述检测方法的优缺点是:
Northern blot法的原理是基于分子杂交,其操作复杂,需要使用放射性同位素,因此不适用于大规模的筛选实验,限制了其应用。微阵列分析法和Northern blot的实验原理,并且二者都无法清楚的区分序列差异很小的不同miRNA,也无法区分具有相同序列的前体miRNA 和成熟miRNA。而且,此两种方法要求样本量较多,因而检测灵敏度不高,无法对表达丰度较低的miRNA进行检测。
目前广泛应用的是实时定量PCR法。该方法采用一种能与成熟的miRNA3′端互补结合的特异性茎环(stem-loop)状引物进行miRNA的反转录,从而将非常短的成熟miRNA分子扩展并且增加一个通用的3′引物位点然后再进行定量实时PCR,实现miRNA表达水平的特异性的定量检测。然而,该方法仍然需要反转录反应扩增获得miRNA的cDNA第一链,因此实验步骤较多,必然增加实验误差;当该方法用于高通量的筛选实验时,其耗时而且检测误差较大。
绿豆核酸酶是一种具有高度单链特异性的核酸内切酶,也可以降解DNA:DNA,RNA:RNA或DNA:RNA双链中的单链部分,其能将单链DNA或RNA降解成为5'-P单核苷酸。
本发明涉及的miRNA检测方法是通过利用绿豆核酸酶上述特性,结合特别设计的DNA 分子探针进行肿瘤细胞内miRNA表达水平的检测,以改善当前miRNA检测方法的灵敏度和简便性。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提出一种DNA分子探针及在肿瘤细胞内的miRNA检测方法。
一种DNA分子探针,所述的分子探针为miRNALet-7b的DNA分子探针,该NDA分子探针带有茎环结构、通用引物序列、DNA分子探针骨架和用于miRNA检测的互补DNA 序列(以miRNALet-7b为例),其结构式为:
所述的引物序列为
5’端通用引物5’-AGACTCAAGCTCACCACACCT-3’
3’端miRNALet-7b特异性引物5’-GGGAAGGCAGTAGGTTGTATAG-3’。
本发明采用所述的DNA分子探针在基于绿豆核酸酶的肿瘤细胞内miRNA实时定量PCR 检测上的应用。包括如下步骤:
1)传代培养肿瘤细胞到细胞培养板,于含小牛血清(10%体积百分比)的DMEM培养基(培养基溶液中包含4.5g/L D-葡萄糖,80mg/L甘氨酸,0.584g/L L-谷氨酰胺,4mg/L盐酸吡哆醇, 110mg/L丙酮酸钠和3.7g/L的碳酸氢钠,并使用盐酸调整pH值到7.3)中培养至细胞生长达到80%及以上融合后,使用PBS缓冲液洗去残余细胞培养基,然后加入Trizol试剂,按照标准总RNA提取操作步骤((方法学参考文献:Preston Campbell J,Mulcrone P,and Elefteriou F, etal.TRIzol and Alu qPCR-based quantification of metastaticseeding within the skeleton.Sci Rep, 5:12635,2015.doi:10.1038/srep12635.)提取肿瘤细胞的总RNA;
2)在总RNA中加入miRNALet-7b的DNA分子探针,混匀、孵育使DNA分子探针互补链退火形成茎环结构并与miRNALet-7b形成DNA:RNA杂交双链;
3)往步骤2)中加入绿豆核酸酶缓冲液,混匀后加入绿豆核酸酶,混匀后孵育、灭活;
4)往步骤3)中加入无水乙醇,乙酸钾和鲑精DNA,混匀后离心分离,然后加入乙醇重悬沉淀,再次离心分离后弃去上清液,室温下静置使残留乙醇蒸发后加入蒸馏水溶解沉淀;
5)取上述获得的细胞的DNA沉淀加入RNA酶至终浓度60ug/mL于37℃孵育30分钟。随后加入miRNALet-7的DNA分子探针5’端通用引物和与miRNALet-7b序列互补的3’端特异性引物进行实时定量PCR扩增;
6)实时定量PCR反应内参照:以上述获得的细胞总RNA反转录所得cDNA第一链为PCR 模板,以Beta-Actin引物扩增细胞内管家基因Beta-Actin的表达,即可完成对肿瘤细胞的 miRNA的检测。
所述的步骤2)所述的孵育是将总RNA加入miRNALet-7b的DNA分子探针后于70-90℃孵育3-10分钟后,然后置于50-60℃孵育3-10分钟使DNA分子探针互补链退火形成茎环结构并与miRNALet-7b形成DNA:RNA杂交双链。
进一步优选为步骤2)所述的孵育是将总RNA加入miRNALet-7b的DNA分子探针后于80℃孵育5分钟后;然后置于56℃孵育5分钟使DNA分子探针互补链退火形成茎环结构并与miRNALet-7b形成DNA:RNA杂交双链。
所述的步骤3)所述的孵育是将步骤2)中加入绿豆核酸酶缓冲液,混匀后加入绿豆核酸酶,混匀后于30-45℃孵育3-10分钟,然后于80-90℃孵育5-15分钟灭活;
进一步优选为步骤3)所述的孵育是将步骤2)中加入绿豆核酸酶缓冲液,混匀后加入绿豆核酸酶,混匀后于37℃孵育5分钟,然后于85℃孵育10分钟灭活;
绿豆核酸酶加入量为0.5-2个酶活性单位。。
所述的步骤4)中无水乙醇的加入量为步骤5)灭火后混合液体积的1-3倍;乙酸钾的摩尔浓度为3-4M,其添加量为灭火后混合液体积的1/15-1/5倍;步骤1)提取的总RNA、步骤2)所述的miRNALet-7b的DNA分子探针与步骤4)所述的鲑精DNA的质量比为4-6: 1:1。
所述的步骤5)中实时定量PCR采用Takara公司SYBR试剂盒,设定的反应条件为:90-95℃变性25-35秒,55-65℃退火25-35秒,70-75℃延伸25-35秒,进行30-40个循环。
所述的肿瘤细胞包括包括但不限于人非小细胞肺癌A549细胞。
如图1所示,本方法的原理是:通过设计带有与待测miRNA完全互补序列的茎环结构 DNA分子探针捕获待测miRNA,然后以绿豆核酸酶处理,降解掉未与待测miRNA结合的DNA分子探针单链部分。miRNA表达水平越高,其结合的DNA分子探针越多;再以RNA 酶消化miRNA,然后用与miRNA相同序列的特异性PCR引物和通用3’引物扩增原DNA分子探针,进行实时定量PCR分析即可高度特异和灵敏的检测miRNA的表达水平。
基于上述目的、本发明所用的绿豆核酸酶,具有以下特性:
1)单链特异性核酸内切酶,能够降解单链DNA&RNA、双链DNA&RNA 和DNA-RNA杂交体中的单链部分,(但不能切断切口互补链如茎环结构)生成具有5’-P 末端的单核苷酸或寡核苷酸。
2)过量的酶还可以降解双链DNA、RNA或者DNA-RNA杂交体,这时,它会选择性地降解富含AT的区域。
3)以热变性小牛胸腺DNA为底物,在37℃、pH5.0的条件下,1分钟内产生1μg的酸可溶性物质所需要的酶量定义为1个活性单位(unit)。
4)85℃及以上热处理能使本酶完全失活。
附图说明
图1为本发明实施例式1所用实验方法示意图。
图2为本发明实施例式1所用DNA分子探针的结构图
图3为本发明实施例式1所用检测miRNALet-7b的DNA分子探针的DNA碱基序列组成与结构图。
图4为本发明实施例式1所示miRNALet-7b检测的PCR扩增图。
图5为本发明实施例式1所示miRNALet-7b检测的实时定量PCR图,T-检验,**p<0.01。
图6为本发明实施例式2所示miRNALet-7b检测的PCR扩增图。
图7为本发明实施例式2所示miRNALet-7b检测的实时定量PCR图,T-检验,**p<0.01。
具体实施方式
下面结合实施例来进一步说明本发明,但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。
实施例1
1)实验分为正常细胞对照组(人支气管上皮HBE细胞)和肿瘤细胞实验组(人非小细胞肺癌A549细胞),两组细胞的培养和其它实验操作条件相同。预期PCR扩增产物的理论长度为 65bp左右。
2)分别传代培养人非小细胞肺癌A549细胞和人支气管上皮HBE细胞到6孔细胞培养板,于含10%小牛血清(体积百分比)的DMEM培养基中常规培养(95%湿度,37℃,5%CO2(体积百分比)至细胞生长达到80%融合。
3)弃去细胞培养基,使用PBS缓冲液洗去残余细胞培养基,然后加入Trizol试剂,按照标准总RNA提取操作步骤提取A549细胞和人支气管上皮HBE细胞总RNA。
4)在总体积35uL的5ug总RNA中加入图2所示miRNALet-7b的DNA分子探针1ug(10uM/uL,4uL),混匀并于80℃孵育5分钟,然后置于56℃孵育5分钟使DNA分子探针互补链退火形成茎环结构并与miRNALet-7b形成DNA:RNA杂交双链。
5)加入绿豆核酸酶缓冲液10uL,混匀后加入2个单位(1uL)的绿豆核酸酶,混匀并于37℃孵育5分钟,然后于85℃孵育10分钟灭活。
6)加入100uL无水乙醇和5uL 3M乙酸钾(pH5.2)和1ug鲑精DNA,混匀后12000转/分4℃离心10分钟。然后加入1mL 70%乙醇重悬沉淀,12000转/分4℃离心2分钟,弃去上清液,静置于室温5分钟使残留乙醇蒸发后加入蒸馏水20uL溶解沉淀。
7)分别取上述获得的两种细胞的DNA沉淀加入RNA酶(1mg/mL)2uL于37℃孵育30分钟,然后加入式I所示DNA分子探针5’端通用引物和与miRNALet-7b序列相同的3’端特异性引物进行实时定量PCR扩增。实时定量PCR采用Takara公司SYBR试剂盒,设定的反应条件为:94℃变性30秒,60℃退火30秒,72℃延伸30秒,进行35个循环。使用美国Bio-Rad IQ5实时荧光定量PCR仪完成。
引物序列:
5’端通用引物5’-AGACTCAAGCTCACCACACCT-3’
3’端miRNALet-7b特异性引物5’-GGGAAGGCAGTAGGTTGTATAG-3’
8)实时定量PCR反应内参照:以上述获得的两种细胞总RNA反转录所得cDNA第一链为 PCR模板,以Beta-Actin引物扩增两种细胞内管家基因Beta-Actin的表达。
阳性对照组:以上述第三步操作获得的细胞总RNA与DNA分子探针的混合物不加绿豆核酸酶处理,直接作为模板进行实时定量PCR反应。
阴性对照组:以DNA分子探针加绿豆核酸酶处理并灭活后,直接作为模板进行实时定量PCR 反应。
上述各组的实时定量PCR扩增产物的3%琼脂糖凝胶电泳图显示:
阳性对照组经实时定量PCR扩增获得65bp大小的DNA条带,与预期一致。
阴性对照组则无DNA条带产生,亦于预期一致。
正常细胞对照组(人支气管上皮HBE细胞)和肿瘤细胞实验组(A549细胞)经实时定量PCR扩增均可获得65bp大小的DNA条带,但肿瘤细胞实验组DNA条带亮度显著低于正常细胞对照组,而二者的Beta-Actin检测基因条带(约270bp)亮度基本一致。因Let-7b是一种抑癌基因,其在人非小细胞肺癌细胞系中低表达,而在正常细胞中高表达,故该结果与预期相符。
实时定量PCR结果显示:正常细胞对照组的miRNALet-7b表达水平是肿瘤细胞实验组的7.1倍。
由上述描述可以看出,本发明提供的一种肿瘤细胞内miRNA的检测方法简单易行,能够有效检测肿瘤细胞内miRNA的表达水平。
实施例2:
其他肿瘤细胞增殖检测案例:
1)实验分为正常细胞对照组(乳腺正常上皮细胞MCF-10A–parental、人胚肾上皮293T 细胞)和肿瘤细胞实验组(人乳腺癌MDA-MB-231细胞和人宫颈癌Hela细胞),两组细胞的培养和其它实验操作条件相同。预期PCR扩增产物的理论长度为65bp左右。
2)分别传代培养MCF-10A-parental,MDA-MB-231、293T和Hela细胞到6孔细胞培养板,按照实施例1描述的方法进行细胞培养。
3)采用实施例1描述的方法设置阳性对照和阴性对照,同时以Beta-Actin为样本内参照。
4)采用实施例1描述的方法进行RNA提取、反转录PCR、绿豆核酸酶消化和实时定量PCR等实验操作,实验所用PCR引物与实施例1相同。
上述各组的实时定量PCR扩增产物的3%琼脂糖凝胶电泳图显示(图6):
阳性对照组经实时定量PCR扩增获得65bp大小的DNA条带,与预期一致。
阴性对照组则无DNA条带产生,亦于预期一致。
正常细胞对照组(乳腺正常上皮细胞MCF-10A–parental、人胚肾上皮293T细胞)和肿瘤细胞实验组(人乳腺癌MDA-MB-231细胞和人宫颈癌Hela细胞)经实时定量PCR扩增均可获得65bp大小的目的DNA条带,但肿瘤细胞实验组DNA条带亮度显著低于对照组,而二者的Beta-Actin检测基因条带(约270bp)亮度基本一致。
实时定量PCR结果显示(图7):正常细胞对照组的miRNALet-7b表达水平是肿瘤细胞实验组的3-4倍。该结果与已发表的研究结果一致(Kim S J,Shin J Y,Lee K D,et al.MicroRNAlet-7a suppresses breast cancer cell migration and invasion throughdownregulation of CC chemokine receptor type 7[J].Breast Cancer Research,2012,14(1):R14.)。
由上述描述可以看出,本发明提供的一种基于绿豆核酸酶和DNA分子探针的肿瘤细胞内miRNA的检测方法简单易行,能够有效检测肿瘤细胞内miRNA的表达水平。
Claims (10)
1.一种DNA分子探针,其特征在于,所述的分子探针为用于miRNA检测的分子探针,该NDA分子探针包括茎环结构、通用引物序列、DNA分子探针骨架和用于miRNA检测的互补DNA序列,具体为miRNA Let-7b互补序列,其结构式为:
2.权利要求1所述的DNA分子探针,其特征在于,所述的引物序列为
5’端通用引物5’-AGACTCAAGCTCACCACACCT-3’;
3’端特异性引物5’-GGGAAGGCAGTAGGTTGTATAG-3’;
所述的3’端特异性引物为miRNA Let-7b特异性引物。
3.采用权利要求1或2所述的DNA分子探针在基于绿豆核酸酶的肿瘤细胞内miRNA实时定量PCR检测上的应用。
4.权利要求3所述的应用,其特征在于,包括如下步骤:
1)传代培养肿瘤细胞到细胞培养板,于含小牛血清的DMEM培养基中培养至细胞生长达到80%及以上融合后,使用PBS缓冲液洗去残余细胞培养基,然后加入Trizol试剂,按照标准总RNA提取操作步骤提取肿瘤细胞的总RNA;
2)在总RNA中加入miRNA Let-7b的DNA分子探针,混匀、孵育使DNA分子探针互补链退火形成茎环结构并与miRNA形成DNA:RNA杂交双链;
3)往步骤2)中加入绿豆核酸酶缓冲液,混匀后加入绿豆核酸酶,混匀后孵育、然后灭活绿豆核酸酶;
4)往步骤3)中加入无水乙醇,乙酸钾和鲑精DNA,混匀后离心分离,然后加入乙醇重悬沉淀,再次离心分离后弃去上清液,室温下静置使残留乙醇蒸发后加入蒸馏水溶解沉淀;
5)取上述获得的细胞的DNA:RNA杂交双链沉淀物中加入RNA酶混匀后孵育,然后加入DNA分子探针5’端通用引物和与miRNA Let-7b序列相同的3’端特异性引物进行实时定量PCR扩增;
6)实时定量PCR反应内参照:以上述获得的细胞总RNA反转录所得cDNA第一链为PCR模板,以Beta-Actin引物扩增细胞内管家基因Beta-Actin的表达,即可完成对肿瘤细胞的miRNA的检测。
5.权利要求4所述的应用,其特征在于,步骤2)所述的孵育是将总RNA加入miRNA Let-7b的DNA分子探针后于70-90℃孵育3-10分钟后,然后置于50-60℃孵育3-10分钟使DNA分子探针互补链退火形成茎环结构并与miRNA Let-7b形成DNA:RNA杂交双链。
6.权利要求4所述的应用,其特征在于,步骤2)所述的孵育是将总RNA加入miRNA Let-7b的DNA分子探针后于80℃孵育5分钟后;然后置于56℃孵育5分钟使DNA分子探针互补链退火形成茎环结构并与miRNA Let-7b形成DNA:RNA杂交双链。
7.权利要求4所述的应用,其特征在于,步骤3)所述的孵育是将步骤2)中加入绿豆核酸酶缓冲液,混匀后加入绿豆核酸酶,混匀后于30-45℃孵育3-10分钟,然后于80-90℃孵育5-15分钟灭活;
进一步优选为步骤3)所述的孵育是将步骤2)中加入绿豆核酸酶缓冲液,混匀后加入绿豆核酸酶,混匀后于37℃孵育5分钟,然后于85℃孵育10分钟灭活;
绿豆核酸酶的加入量为0.5-2个酶活性单位。
8.权利要求4所述的应用,其特征在于,步骤4)中无水乙醇的加入量为步骤5)灭火后混合液体积的2-3倍;乙酸钾的摩尔浓度为3-4M,其添加量为灭活后混合液体积的1/10倍;步骤1)提取的总RNA、步骤2)所述的miRNA Let-7b的DNA分子探针与步骤4)所述的鲑精DNA的质量比为4-6:1:1。
9.权利要求4所述的应用,其特征在于,步骤5)中加入RNA酶至终浓度60ug/mL于37℃孵育30分钟;步骤5)中实时定量PCR采用Takara公司SYBR试剂盒,设定的反应条件为:90-95℃变性25-35秒,55-65℃退火25-35秒,70-75℃延伸25-35秒,进行30-40个循环。
10.权利要求4所述的应用,其特征在于,所述的肿瘤细胞包括但不限于人非小细胞肺癌A549细胞。
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