CN106434908A - 用于检测与骨髓增殖性肿瘤mpn相关基因突变的引物、试剂盒及方法 - Google Patents

用于检测与骨髓增殖性肿瘤mpn相关基因突变的引物、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种用于骨髓增殖性肿瘤(MPN)相关基因突变的引物组合、含有该引物组合的试剂盒以及检测MPN相关基因突变的方法。本发明针对三种MPN相关基因，设计了能够高效特异性扩增这三种基因的引物序列，具有高度的特异性。本发明设计的所有引物的退火温度均为58℃，可以使用同一个PCR程序一次完成扩增反应。本发明所呈现的测序峰图背景清晰、信号值高，大大降低了对突变的分析难度，并且本发明设计的引物、试剂盒以及检测方法成本经济，特异性强。

Description

用于检测与骨髓增殖性肿瘤MPN相关基因突变的引物、试剂盒 及方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及用于检测与骨髓增殖性肿瘤MPN相关基因突变的引物、试剂盒及方法。
背景技术
骨髓增殖性肿瘤(Myeloproliferative Neoplasms，MPN)是一种以一系或多系髓系细胞增殖为主要特征的克隆性造血干细胞疾病。其主要分为慢性髓性白血病(CML)、真性红细胞增多症(PV)、原发性血小板增多症(ET)和原发性骨髓纤维化(IMF)。除CML外，其余三种经典MPN的Ph染色体BCR/ABL融合基因检测为阴性。
目前已发现与MPN相关的分子标志物主要有JAK2，CARL及MPL等。2005年发现该类疾病中JAK2基因获得性突变-JAK2V617F点突变，该突变被证实在MPN中具有重要的诊断及预后意义。超过90％的PV患者及约60％的ET和PMF患者均具有V617F点突变。除此以外，近年来多项研究表明在JAK2V617F突变呈阴性的MPN病人中发现MPL突变及体细胞钙网蛋白(CALR)突变。如MPL515位点的突变，CALR 9号外显子的移码突变等。
对MPN进行多基因检测对于其诊断、进一步危险分层以及最终实现更为精确的个体化治疗显得尤为重要。目前检测MPN相关基因突变的方法主要有直接测序，等位基因特异性PCR(AS-PCR)，高分辨率溶解曲线(HRMA)等。AS-PCR方法是根据突变位点设计特异性引物进而通过PCR检测基因突变，一般适用于点突变，如JAK2V617F的检测。HRMA方法曾被报道用来检测MPN病人中CALR的基因突变，并被证实具有较高的灵敏度。然而，由于AS-PCR，HRMA只适合少数的突变类型的检测，当临床病人需要检测较多相关的基因突变时，此类方法不能够满足检测要求。而直接测序的方法能够对需要检测样本的相关基因序列进行精确测序，从而分析相关基因是否发生突变，具有简便、准确且适合批量操作的特点。目前有不少关于直接测序检测MPN相关基因突变的报道，然而往往由于引物特异性不是很好，造成测序峰图有较高背景峰，从而对突变的判断造成一定困难。因此，目前亟需一种快速、灵敏、成本经济的对MPN相关3种基因(JAK2、MPL、CALR)突变进行检测的方法。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的上述缺陷，根据GenBank最新公布的基因序列，重新设计了检测MPN相关3种基因突变的引物，并在此基础上设计了对这3种基因突变进行检测的方法。本发明的方法快速、简便、准确、灵敏、直观，且实验成本低。
为此，本发明一方面提供了一种用于检测骨髓增殖性肿瘤(MPN)相关基因突变的引物组合，其由SEQ ID NO.1-16所示的引物组成，所述MPN相关基因为JAK2、MPL和CALR。
在本发明优选的实施方案中，该引物组合进一步由第1-3组引物组成，其中第1组由SEQ ID NO.1-8所示的引物组成，第2组由SEQ ID NO.9-12所示的引物组成，第3组由SEQID NO.13-16所示的引物组成。
在本发明进一步优选的实施方案中，每条引物的浓度均为5μM。
本发明另一方面提供了一种用于检测MPN相关基因突变的试剂盒，其包含本发明所述的引物组合，所述MPN相关基因为JAK2、MPL和CALR。
在本发明优选的实施方案中，每条引物的浓度均为5μM。
本发明另一方面提供了本发明所述的引物组合在制备检测MPN相关基因突变的试剂盒中的应用，所述MPN相关基因为JAK2、MPL和CALR。
本发明再一方面提供了本发明所述的引物组合，或者本发明所述的试剂盒在检测MPN相关基因突变中的应用，所述MPN相关基因为JAK2、MPL和CALR。
本发明最后一方面提供了一种检测MPN相关基因突变的方法，其包含以下步骤：
1、获取待测样品DNA。
2、采用本发明所述的引物组合，或采用本发明所述的试剂盒，以步骤1中获取的DNA为模板，进行PCR扩增。
3、对PCR扩增产物进行Sanger测序。
4、得到测序峰图后，进行结果判读，获得待测样品中MPN相关基因突变的种类。
所述MPN相关基因为JAK2、MPL和CALR。
在本发明优选的实施方案中，步骤2中每条引物的浓度均为5μM。
在本发明进一步优选的实施方案中，步骤3中还包括测序反应后进行纯化以及进行变性处理的步骤。
由上述描述可知，与现有技术相比，本发明具备如下优点。
1、本发明根据GenBank最新公布的基因序列，针对MPN相关三种基因JAK2、MPL和CALR，采用不同的引物设计，设计了能够高效特异性地扩增这三种MPN相关基因的引物，具有高度的特异性。
2、本发明设计的所有引物的退火温度均为58℃，可以使用同一个PCR程序一次完成扩增反应。PCR反应可以将这三种相关基因的所需检测区域全部扩增出来，然后进行测序，并将测得的序列与标准序列比对，检测是否存在基因突变。除了对比已确认的突变外，还能发现新的突变。
3、本发明采用Sanger测序法，可检测MPN相关的三种基因突变，而且本发明设计的引物所扩增的产物覆盖所有待检测突变位点，在很大程度上节省了检测时间及成本，而且结果更准确。
综上所述，本发明所呈现的测序峰图背景清晰、信号值高，大大降低了对突变的分析难度，并且本发明设计的引物、试剂盒以及检测方法成本经济，特异性强。
附图说明
图1：CALR基因突变的测序峰图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。
实施例1：设计用于检测MPN相关3种基因突变的PCR引物
本实施例中，根据GenBank最新公布的基因序列，利用Primer Premier 5.0引物设计软件设计PCR引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。为了减少测序峰图底峰，最大限度地保障了测序引物的纯度，通过引物反应条件的优化和比较，筛选出了特异性好的引物。按照上述引物设计原则，本发明针对MPN相关3种基因突变所设计的具体引物情况参见表1。
表1：三种基因的扩增及测序引物序列
引物名称 序列
JAK2-12F-P TGGCAGGAATACATCAAAATCCA
JAK2-12R-P ACATCTAACACAAGGTTGGCA
JAK2-14F-P CCAGGCTTACACAGGGGTTT
JAK2-14R-P CCAATGTTATGTTGAACCTGCCA
JAK2-12F CTCCTCTTTGGAGCAATTCA
JAK2-12R CCAATGTCACATGAATGTAA
JAK2-14F-S GTCTTTCTTTGAAGCAGCAAGT
JAK2-14R ATTGCTTTCCTTTTTCACAA
MPL-10F-P CAACTAGGGTGGAGACCGC
MPL-10R-P GTTCGAGGTGGGCGGTATAG
MPL-10F TGGGCCGAAGTCTGACCCTTT
MPL-10R ACAGAGCGAACCAAGAATGCCTGT
CALR-9F-P ACCTCTGACCATCCTTCCCA
CALR-9R-P AGAGTGGAGGAGGGGAACAA
CALR-9F CATTCATCCTCCAGGTCAAG
CALR-9R AGGGGAACAAAACCAAAATC
实施例2：制备用于检测MPN相关3种基因突变的试剂盒
将合成的引物，PCR扩增反应液和测序体系进行分装后包装，组成本发明试剂盒。
其中，PCR扩增反应液包括，10×PCR Buffer、2.5mMdNTPs、LA Taq DNAPolymerase、ddH2O等。
测序体系包括，(1)PCR产物消化反应液：虾碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatas(Shrimp))和外切酶(Exonuclease I)按1:1进行混合；(2)测序反应液： Terminator V3.1 cycle Sequencing Kit、5×Bigdye buffer、ddH2O；(3)测序纯化液：EDTA(125mM)；(4)85％无水乙醇；(5)75％无水乙醇；(6)HI-DI(高度去离子甲酰胺)。
实施例3：对样本中MPN相关基因突变进行检测
按照以下具体步骤对样本中的MPN相关基因突变进行检测：
1、按照QIAamp DNA Blood Mini kit试剂盒的方法提取样本DNA。
2、以上述DNA为模板，和所述的PCR扩增引物进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物。
将所得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.5％)，电压为140V，时间为35min，电泳结束后使用凝胶成像系统观察。其中，PCR扩增体系参见表2。
表2：PCR扩增体系
PCR反应条件参见表3。
表3：PCR反应条件
3、Sanger测序
每个PCR反应体系(25μL)加入1μL消化酶，依靠Alkaline Phosphatase水解残余的dNTP，Exonuclease I水解单链核酸从而去除双链DNA以外的杂质。其消化反应条件参见表4。
表4：消化反应条件
温度 时间
37℃ 60min
80℃ 15min
4℃ ∞
得到PCR消化产物后，进行Sanger测序反应，其反应体系参见表5。
表5：Sanger测序反应体系
Sanger测序反应条件参见表6。
表6：Sanger测序反应条件
4、测序反应后纯化
纯化操作前，需预冷离心机至4℃。此步骤是将测序反应体系中除目标单链核酸片段之外的杂质尽可能地去除，以减少之后3730毛细管电泳时杂质对峰图质量的影响。
每5μL反应体系加入0.125mol/L EDTA-Na2溶液2μL，85％无水乙醇30μL，盖上硅胶垫，充分振荡3～5分钟，3000g，4℃，离心30分钟。EDTA作为金属离子螯合剂，能与测序PCR反应体系里的离子结合从而去除离子。
离心结束后，倒离心至185g时立即停止。每孔加入50μL 70％无水乙醇，DNA片段在70％乙醇中溶解度低，能通过离心沉淀下来。盖上硅胶垫，充分振荡3分钟，3000g，4℃，离心15分钟，离心结束后再次倒离心。然后将离心后产物放置避光通风处20分钟。
5、变性处理
20分钟后，在生物安全柜中操作，每孔加入8μL HI-DI甲酰胺进行变性处理，程序参见表7。
表7变性反应程序
温度 时间
95℃ 3min
4℃ ∞
变性结束并冷却离心后，上ABI3730测序仪测序。
6、结果分析
得到测序峰图后，经严格改名后加载入软件Variant ReporterTM software v1.1，自动与Genbank中相关基因野生型序列比对，并同时有阴性对照进行控制，根据实际突变情况，分析编码氨基酸的改变。
图1为样本FG 91中发现CALR突变的测序峰图，此突变发生在非编码区，无意义。
通过测序报告可发现本发明所呈现的峰图背景清晰、信号值高，大大降低了对突变的分析难度，且本发明设计的引物、试剂与方法的检测成本经济，特异性强。

Claims (10)

1.一种用于检测骨髓增殖性肿瘤(MPN)相关基因突变的引物组合，其由SEQ ID NO.1-16所示的引物组成，所述MPN相关基因为JAK2、MPL和CALR。
2.根据权利要求1所述的引物组合，其进一步由第1-3组引物组成，其中第1组由SEQ IDNO.1-8所示的引物组成，第2组由SEQ ID NO.9-12所示的引物组成，第3组由SEQ ID NO.13-16所示的引物组成。
3.根据权利要求1或2所述的引物组合，其中每条引物的浓度均为5μM。
4.一种用于检测MPN相关基因突变的试剂盒，其包含权利要求1-3中任一项所述的引物组合，所述MPN相关基因为JAK2、MPL和CALR。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中每条引物的浓度均为5μM。
6.权利要求1-3中任一项所述的引物组合在制备检测MPN相关基因突变的试剂盒中的应用，所述MPN相关基因为JAK2、MPL和CALR。
7.权利要求1-3中任一项所述的引物组合，或者权利要求4或5中所述的试剂盒在检测MPN相关基因突变中的应用，所述MPN相关基因为JAK2、MPL和CALR。
8.一种检测MPN相关基因突变的方法，其包含以下步骤：
(1)获取待测样品DNA；
(2)采用权利要求1-3中任一项所述的引物组合，或采用权利要求4或5中所述的试剂盒，以步骤(1)中获取的DNA为模板，进行PCR扩增；
(3)对PCR扩增产物进行Sanger测序；
(4)得到测序峰图后，进行结果判读，获得待测样品中MPN相关基因突变的种类；
所述MPN相关基因为JAK2、MPL和CALR。
9.根据权利要求8所述的方法，其中步骤(2)中每条引物的浓度均为5μM。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中步骤(3)中还包括测序反应后进行纯化以及进行变性处理的步骤。
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