CN108048537A - DNA分子探针及对S1核酸酶的肿瘤细胞内miRNA实时定量PCR检测上的应用 - Google Patents

DNA分子探针及对S1核酸酶的肿瘤细胞内miRNA实时定量PCR检测上的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种DNA分子探针，所述的分子探针为miRNA Let‑7b的DNA分子探针，该DNA分子探针带有茎环结构。本发明将该DNA分子探针用于检测肿瘤细胞内miRNA上，实验结果表明miRNA Let‑7b在人非小细胞肺癌细胞、乳腺癌细胞和宫颈癌细胞中低表达，在正常人肺上皮细胞、乳腺癌上皮细胞和人胚肾上皮细胞中高表达，能简便有效的检测肿瘤细胞内miRNA的表达水平。

Description

DNA分子探针及对S1核酸酶的肿瘤细胞内miRNA实时定量PCR 检测上的应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别是指一种肿瘤细胞内miRNA(microRNA,微小RNA)的检测方法和用途。
背景技术
miRNA是生物体内源性表达的单链小分子RNA，属于非编码RNA的一种，其能够在转录后水平和翻译水平调控真核基因表达，由此广泛参与真核生物的发育、细胞分化以及免疫调节和肿瘤发生等生理病理过程。miRNA自身的表达异常是肿瘤发生发展的重要因素，因此检测肿瘤细胞内miRNA表达水平是抗肿瘤研究的重要技术之一。然而成熟的miRNA长度仅在20-24个核苷酸左右，而且没有多聚腺苷酸尾端，因而不能采用mRNA(信使RNA)的检测方法，即通过逆转录获得cDNA第一链后以特异性PCR引物扩增进行检测。
目前广泛采用的miRNA表达水平检测方法有三种：
1)Northern blot，
2)微阵列(microarray)分析，
3)实时定量PCR(quantitative Real-Time PCR)。
上述检测方法的优缺点是：
Northern blot法的原理是基于分子杂交，其操作复杂，需要使用放射性同位素，因此不适用于大规模的筛选实验，限制了其应用。微阵列分析法和Northern blot的实验原理，并且二者都无法清楚的区分序列差异很小的不同miRNA，也无法区分具有相同序列的前体miRNA和成熟miRNA。而且，此两种方法要求样本量较多，因而检测灵敏度不高，无法对表达丰度较低的miRNA进行检测。
目前广泛应用的是实时定量PCR法。该方法采用一种能与成熟的miRNA 3′端互补结合的特异性茎环(stem-loop)状引物进行miRNA的反转录，从而将非常短的成熟miRNA分子扩展并且增加一个通用的3′引物位点然后再进行定量实时PCR，实现miRNA表达水平的特异性的定量检测。然而，该方法仍然需要反转录反应扩增获得miRNA的cDNA第一链，因此实验步骤较多，必然增加实验误差；当该方法用于高通量的筛选实验时，其耗时而且检测误差较大。
S1核酸酶是一种具有高度单链特异性的核酸内切酶，也可以降解DNA:DNA，RNA:RNA或DNA:RNA双链中的单链部分以及由于碱基错配所造成的单链部分(包括茎环结构)，从而将单链DNA或RNA降解成为5'-P单核苷酸。
本发明涉及的miRNA检测方法是通过利用S1核酸酶上述特性，结合特别设计的DNA分子探针进行肿瘤细胞内miRNA表达水平的检测，以提高当前miRNA检测方法的灵敏度和简便性。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提出一种DNA分子探针及肿瘤细胞内的miRNA检测方法。
一种DNA分子探针带有茎环结构、通用引物序列、DNA分子探针骨架和用于miRNA检测的互补DNA序列(以miRNA Let-7b为例)，其结构式为：
所述的引物序列为
5’端通用引物5’-GTGATCATAGCACGATCTGATG-3’
3’端特异性引物miRNA Let-7b 5’-GGGAAGGCAGTAGGTTGTATAG-3’。
本发明将上述的DNA分子探针检测肿瘤细胞的miRNA上的应用。
包括如下步骤：
1)传代培养肿瘤细胞到细胞培养板，于含小牛血清(10％体积百分比)的DMEM培养基(培养基溶液中包含4.5g/L D-葡萄糖，80mg/L甘氨酸，0.584g/L L-谷氨酰胺,4mg/L盐酸吡哆醇，110mg/L丙酮酸钠和3.7g/L的碳酸氢钠，并使用盐酸调整pH值到7.3)中培养至细胞生长达到80％及以上融合后，使用PBS缓冲液洗去残余细胞培养基，然后加入Trizol试剂，按照标准总RNA提取操作步骤((方法学参考文献：Preston Campbell J,Mulcrone P，andElefteriou F,etal.TRIzol and Alu qPCR-based quantification of metastaticseeding within the skeleton.Sci Rep,5:12635,2015.doi:10.1038/srep12635.)提取肿瘤细胞的总RNA；
2)在总RNA中加入miRNA Let-7b的DNA分子探针，混匀、孵育使DNA分子探针互补链退火形成茎环结构并与miRNA Let-7b形成DNA：RNA杂交双链；
3)往步骤2)中加入S1核酸酶缓冲液，混匀后加入S1核酸酶(S1核酸酶加入量为0.5-2个酶活性单位)，混匀后孵育、然后于85℃孵育10分钟灭活；
4)往步骤3)中加入无水乙醇，乙酸钾和鲑精DNA，混匀后离心分离，然后加入乙醇重悬沉淀，再次离心分离后弃去上清液，室温下静置使残留乙醇蒸发后加入蒸馏水溶解沉淀；
5)取上述获得的细胞的DNA沉淀加入RNA酶至终浓度60ug/mL于37℃孵育30分钟。随后加入miRNA Let-7的DNA分子探针5’端通用引物和与miRNA Let-7b序列相同的3’端特异性引物进行实时定量PCR扩增；
6)实时定量PCR反应内参照：以上述获得的细胞总RNA反转录所得cDNA第一链为PCR模板，以Beta-Actin引物扩增细胞内管家基因Beta-Actin的表达，即可完成对肿瘤细胞的miRNA的检测。
上述的步骤2)所述的孵育是将总RNA加入miRNA Let-7b的DNA分子探针后于70-90℃孵育3-10分钟后，置于15-30℃孵育10-25分钟，然后置于50-60℃孵育3-10分钟使DNA分子探针互补链退火形成茎环结构并与miRNA Let-7b形成DNA:RNA杂交双链。
进一步优选为步骤2)所述的孵育是将总RNA加入miRNA Let-7b的DNA分子探针后于80℃孵育5分钟后，置于20℃孵育15分钟；然后置于56℃孵育5分钟使DNA分子探针互补链退火形成茎环结构并与miRNA Let-7b形成DNA:RNA杂交双链。
所述的步骤3)所述的孵育是将步骤2)中加入S1核酸酶缓冲液，混匀后加入S1核酸酶(S1核酸酶加入量为0.5-2个酶活性单位)，混匀后于30-45℃孵育3-10分钟，然后于80-90℃孵育5-15分钟灭活。
进一步优选为步骤3)所述的孵育是将步骤2)中加入S1核酸酶缓冲液，混匀后加入S1核酸酶，混匀后于37℃孵育5分钟，然后于85℃孵育10分钟灭活。
所述的步骤4)中无水乙醇的加入量为步骤5)灭活后混合液体积的1-3倍；乙酸钾的摩尔浓度为2-4M，其添加量为灭火后混合液体积的1/15-1/5倍；步骤1)提取的总RNA、步骤2)所述的miRNA Let-7b的DNA分子探针与步骤4)所述的鲑精DNA的质量比为4-6：1：1。
所述的步骤5)中实时定量PCR采用Takara公司SYBR试剂盒，设定的反应条件为：90-95℃变性25-35秒，55-65℃退火25-35秒，70-75℃延伸25-35秒，进行30-40个循环。进一步优选为步骤5)中实时定量PCR采用Takara公司SYBR试剂盒，设定的反应条件为：94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，进行35个循环。
所述的肿瘤细胞包括但不限于人非小细胞肺癌NCI-H460细胞。
如图1所示，本方法的原理是：通过设计带有与待测miRNA完全互补序列的茎环结构DNA分子探针捕获待测miRNA，然后以S1核酸酶处理，降解掉未与待测miRNA结合的DNA分子探针单链部分。miRNA表达水平越高，其结合的DNA分子探针越多；再以与miRNA相同序列的特异性PCR引物和通用3’引物扩增原DNA分子探针，进行实时定量PCR分析即可高度特异和灵敏的检测miRNA的表达水平。
基于上述目的、本发明所用的S1核酸酶，具有以下特性：
1)单链特异性核酸内切酶，能够降解单链DNA&RNA、双链DNA&RNA和DNA-RNA杂交体中的单链部分和由于碱基错配所造成的单链部分(包括茎环结构)，生成具有5’-P末端的单核苷酸或寡核苷酸。
2)过量的酶还可以降解双链DNA、RNA或者DNA-RNA杂交体。
3)在37℃的条件下，1分钟内完全水解1μg的单链DNA所需要的酶量定义为1个活性单位(unit)。
4)85℃热处理能使本酶完全失活。
附图说明
图1为本发明实施例式I所用实验方法示意图。
图2为本发明实施例式I所用检测miRNA Let-7b的DNA分子探针的结构图。
图3为本发明实施例式I所用检测miRNA Let-7b的DNA分子探针的DNA碱基序列组成与结构图。
图4为本发明实施例式I所示miRNA Let-7b检测的PCR扩增图。
图5为本发明实施例式I所示miRNA Let-7b检测的实时定量PCR图，T-检验，**p<0.01。
图6为本发明实施例式2所示miRNA Let-7b检测的PCR扩增图。
图7为本发明实施例式2所示miRNA Let-7b检测的实时定量PCR图，T-检验，**p<0.01。
具体实施方式
下面结合实施例来进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。
实施例1
1)实验分为正常细胞对照组(人支气管上皮HBE细胞)和肿瘤细胞实验组(人非小细胞肺癌NCI-H460细胞)，两组细胞的培养和其它实验操作条件相同。预期PCR扩增产物的理论长度为66bp左右。
2)分别传代培养人非小细胞肺癌NCI-H460细胞和人支气管上皮HBE细胞到6孔细胞培养板，于含10％小牛血清(体积百分比)的DMEM培养基((培养基溶液中包含4.5g/L D-葡萄糖，80mg/L甘氨酸，0.584g/L L-谷氨酰胺,4mg/L盐酸吡哆醇，110mg/L丙酮酸钠和3.7g/L的碳酸氢钠，并使用盐酸调整pH值到7.3))中常规培养(95％湿度，37℃，5％CO2(体积百分比)至细胞生长达到80％融合，使用PBS缓冲液洗去残余细胞培养基，然后加入Trizol试剂，按照标准总RNA提取操作步骤((方法学参考文献：Preston Campbell J,Mulcrone P，and Elefteriou F,etal.TRIzol and Alu qPCR-based quantification ofmetastatic seeding within the skeleton.Sci Rep,5:12635,2015.doi:10.1038/srep12635.)提取NCI-H460细胞和人支气管上皮HBE细胞总RNA。
3)在总体积40uL的5ug总RNA中加入图2所示miRNA Let-7b的DNA分子探针4uL(1ug)，混匀并于80℃孵育5分钟后，置于20℃孵育15分钟。然后置于56℃孵育5分钟使DNA分子探针互补链退火形成茎环结构并与miRNA Let-7b形成DNA：RNA杂交双链。
4)加入S1核酸酶缓冲液5uL，混匀后加入1个单位(1uL)的S1核酸酶，混匀并于37℃孵育5分钟。然后于85℃孵育10分钟灭活。
5)加入100uL无水乙醇和5uL 3M乙酸钾(pH5.2)和1ug鲑精DNA，混匀后12000转/分4℃离心10分钟。然后加入1mL 70％乙醇重悬沉淀，12000转/分4℃离心2分钟，弃去上清液，静置于室温5分钟使残留乙醇蒸发后加入蒸馏水20uL溶解沉淀。
6)分别取上述获得的两种细胞的DNA沉淀加入RNA酶(1mg/mL)2uL至终浓度60ug/mL于37℃孵育30分钟，然后加入式I所示miRNA Let-7的DNA分子探针5’端通用引物和与miRNA Let-7b序列相同的3’端特异性引物进行实时定量PCR扩增。实时定量PCR采用Takara公司SYBR试剂盒，设定的反应条件为：94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，进行35个循环。使用美国Bio-Rad IQ5实时荧光定量PCR仪完成。
引物序列：5’端通用引物5’-GTGATCATAGCACGATCTGATG-3’
3’端特异性引物5’-GGGAAGGCAGTAGGTTGTATAG-3’
7)实时定量PCR反应内参照：以上述获得的两种细胞总RNA反转录所得cDNA第一链为PCR模板，以Beta-Actin引物扩增两种细胞内管家基因Beta-Actin的表达。
阳性对照组：以上述第三步操作获得的细胞总RNA与DNA分子探针的混合物不加S1核酸酶处理，直接作为模板进行实时定量PCR反应。
阴性对照组：以DNA分子探针加S1核酸酶处理并灭活后，直接作为模板进行实时定量PCR反应。
上述各组的实时定量PCR扩增产物的2.5％琼脂糖凝胶电泳图图4)显示(：
阳性对照组经实时定量PCR扩增获得66bp大小的DNA条带，与预期一致。
阴性对照组则无DNA条带产生，亦于预期一致。
正常细胞对照组(人支气管上皮HBE细胞)和肿瘤细胞实验组(NCI-H460细胞)经实时定量PCR扩增均可获得66bp大小的DNA条带，但肿瘤细胞实验组DNA条带亮度显著低于正常细胞对照组，而二者的Beta-Actin检测基因条带(约270bp)亮度基本一致。因Let-7b是一种抑癌基因，其在人非小细胞肺癌细胞系中低表达，而在正常细胞中高表达，故该结果与预期相符。
实时定量PCR结果显示(图5)：对照组的miRNA Let-7b表达水平是实验组的7.94倍。
实施例2
其他肿瘤细胞增殖检测案例：
1)实验分为正常细胞对照组(乳腺正常上皮细胞MCF-10A–parental、人胚肾上皮293T细胞)和肿瘤细胞实验组(人乳腺癌MCF-7细胞和人宫颈癌Siha细胞)，两组细胞的培养和其它实验操作条件相同。预期PCR扩增产物的理论长度为66bp左右。
2)分别传代培养MCF-10A-parental,MCF-7、293T和Siha细胞到6孔细胞培养板，按照实施例1描述的方法进行细胞培养。
3)采用实施例1描述的方法设置阳性对照和阴性对照，同时以Beta-Actin为样本内参照。
4)采用实施例1描述的方法进行RNA提取、反转录PCR、S1核酸酶消化和实时定量PCR等实验操作，实验所用PCR引物与实施例1相同。
上述各组的实时定量PCR扩增产物的3％琼脂糖凝胶电泳图显示(图6)：
阳性对照组经实时定量PCR扩增获得66bp大小的DNA条带，与预期一致。
阴性对照组则无DNA条带产生，亦于预期一致。
正常细胞对照组(乳腺正常上皮细胞MCF-10A–parental、人胚肾上皮293T细胞)和肿瘤细胞实验组(人乳腺癌MCF-7细胞和人宫颈癌Siha细胞)经实时定量PCR扩增均可获得66bp大小的目的DNA条带，但肿瘤细胞实验组DNA条带亮度显著低于对照组，而二者的Beta-Actin检测基因条带(约270bp)亮度基本一致。
实时定量PCR结果显示(图7)：正常细胞对照组的miRNA Let-7b表达水平是肿瘤细胞实验组的3-4倍。该结果与已发表的研究结果一致(Kim S J,Shin J Y,Lee K D,etal.MicroRNA let-7a suppresses breast cancer cell migration and invasionthrough downregulation of CC chemokine receptor type 7[J].Breast CancerResearch,2012,14(1):R14.)。
由上述描述可以看出，本发明提供的一种基于S1核酸酶和DNA分子探针的肿瘤细胞内miRNA的检测方法简单易行，能够有效检测肿瘤细胞内miRNA的表达水平。

Claims (10)

1.一种DNA分子探针，其特征在于，所述的分子探针为用于miRNA检测的分子探针，该NDA分子探针包括茎环结构、通用引物序列、DNA分子探针骨架和用于miRNA检测的互补DNA序列，具体为miRNA Let-7b互补序列，其结构式为：
2.权利要求1所述的DNA分子探针，其特征在于，所述的引物序列为
5’端通用引物5’-GTGATCATAGCACGATCTGATG-3’
3’端特异性引物5’-GGGAAGGCAGTAGGTTGTATAG-3’；
所述的3’端特异性引物为miRNA Let-7b特异性引物。
3.采用权利要求1或2所述的DNA分子探针在基于S1核酸酶的肿瘤细胞内miRNA实时定量PCR检测上的应用。
4.权利要求3所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
1)传代培养肿瘤细胞到细胞培养板，于含小牛血清的DMEM培养基中培养至细胞生长达到80％及以上融合后，使用PBS缓冲液洗去残余细胞培养基，然后加入Trizol试剂，按照标准总RNA提取操作步骤提取肿瘤细胞的总RNA；
2)在总RNA中加入miRNA，具体为miRNA Let-7b的DNA分子探针，混匀、孵育使DNA分子探针互补链退火形成茎环结构并与miRNA Let-7b形成DNA：RNA杂交双链；
3)往步骤2)中加入S1核酸酶缓冲液，混匀后加入S1核酸酶，混匀后孵育、然后灭活S1核酸酶；
4)往步骤3)中加入无水乙醇，乙酸钾和鲑精DNA，混匀后离心分离，然后加入乙醇重悬沉淀，再次离心分离后弃去上清液，室温下静置使残留乙醇蒸发后加入蒸馏水溶解沉淀；
5)取上述获得的细胞的DNA沉淀加入RNA酶混匀后孵育，然后加入miRNA Let-7的DNA分子探针5’端通用引物和与miRNA Let-7b序列互补的3’端特异性引物进行实时定量PCR扩增；
6)实时定量PCR反应内参照：以上述获得的细胞总RNA反转录所得cDNA第一链为PCR模板，以Beta-Actin引物扩增细胞内管家基因Beta-Actin的表达，即可完成对肿瘤细胞的miRNA的检测。
5.权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤2)所述的孵育是将总RNA加入miRNA Let-7b的DNA分子探针后于70-90℃孵育3-10分钟后，置于15-30℃孵育10-25分钟，然后置于50-60℃孵育3-10分钟使DNA分子探针互补链退火形成茎环结构并与miRNA Let-7b形成DNA:RNA杂交双链。
6.权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤2)所述的孵育是将总RNA加入miRNA Let-7b的DNA分子探针后于80℃孵育5分钟后，置于20℃孵育15分钟；然后置于56℃孵育5分钟使DNA分子探针互补链退火形成茎环结构并与miRNA Let-7b形成DNA:RNA杂交双链。
7.权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤3)所述的孵育是将步骤2)中加入S1核酸酶缓冲液，混匀后加入S1核酸酶，混匀后于30-45℃孵育3-10分钟，然后于80-90℃孵育5-15分钟灭活，
进一步优选为步骤3)所述的孵育是将步骤2)中加入S1核酸酶缓冲液，混匀后加入S1核酸酶，混匀后于37℃孵育5分钟，然后于85℃孵育10分钟灭活；
S1核酸酶的加入量为0.5-2个酶活性单位。
8.权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤4)中无水乙醇的加入量为步骤5)灭火后混合液体积的1-3倍；乙酸钾的摩尔浓度为2-4M，其添加量为灭活后混合液体积的1/15-1/5倍；步骤1)提取的总RNA、步骤2)所述的miRNA Let-7b的DNA分子探针与步骤4)所述的鲑精DNA的质量比为4-6：1：1。
9.权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤5)中加入RNA酶至终浓度60ug/mL于37℃孵育30分钟，步骤5)中实时定量PCR采用Takara公司SYBR试剂盒，设定的反应条件为：90-95℃变性25-35秒，55-65℃退火25-35秒，70-75℃延伸25-35秒，进行30-40个循环。
10.权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤细胞包括但不限于人非小细胞肺癌NCI-H460细胞。
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