CN108048537A - DNA分子探针及对S1核酸酶的肿瘤细胞内miRNA实时定量PCR检测上的应用 - Google Patents

DNA分子探针及对S1核酸酶的肿瘤细胞内miRNA实时定量PCR检测上的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108048537A
CN108048537A CN201711424723.4A CN201711424723A CN108048537A CN 108048537 A CN108048537 A CN 108048537A CN 201711424723 A CN201711424723 A CN 201711424723A CN 108048537 A CN108048537 A CN 108048537A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mirna
dna
molecular probe
incubated
added
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201711424723.4A
Other languages
English (en)
Inventor
曹春雨
王发玲
杨建林
王艳林
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Three Gorges University CTGU
Original Assignee
China Three Gorges University CTGU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Three Gorges University CTGU filed Critical China Three Gorges University CTGU
Priority to CN201711424723.4A priority Critical patent/CN108048537A/zh
Publication of CN108048537A publication Critical patent/CN108048537A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种DNA分子探针，所述的分子探针为miRNA Let‑7b的DNA分子探针，该DNA分子探针带有茎环结构。本发明将该DNA分子探针用于检测肿瘤细胞内miRNA上，实验结果表明miRNA Let‑7b在人非小细胞肺癌细胞、乳腺癌细胞和宫颈癌细胞中低表达，在正常人肺上皮细胞、乳腺癌上皮细胞和人胚肾上皮细胞中高表达，能简便有效的检测肿瘤细胞内miRNA的表达水平。

Description

DNA分子探针及对S1核酸酶的肿瘤细胞内miRNA实时定量PCR 检测上的应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别是指一种肿瘤细胞内miRNA(microRNA,微小RNA)的检测方法和用途。
背景技术
miRNA是生物体内源性表达的单链小分子RNA，属于非编码RNA的一种，其能够在转录后水平和翻译水平调控真核基因表达，由此广泛参与真核生物的发育、细胞分化以及免疫调节和肿瘤发生等生理病理过程。miRNA自身的表达异常是肿瘤发生发展的重要因素，因此检测肿瘤细胞内miRNA表达水平是抗肿瘤研究的重要技术之一。然而成熟的miRNA长度仅在20-24个核苷酸左右，而且没有多聚腺苷酸尾端，因而不能采用mRNA(信使RNA)的检测方法，即通过逆转录获得cDNA第一链后以特异性PCR引物扩增进行检测。
目前广泛采用的miRNA表达水平检测方法有三种：
1)Northern blot，
2)微阵列(microarray)分析，
3)实时定量PCR(quantitative Real-Time PCR)。
上述检测方法的优缺点是：
Northern blot法的原理是基于分子杂交，其操作复杂，需要使用放射性同位素，因此不适用于大规模的筛选实验，限制了其应用。微阵列分析法和Northern blot的实验原理，并且二者都无法清楚的区分序列差异很小的不同miRNA，也无法区分具有相同序列的前体miRNA和成熟miRNA。而且，此两种方法要求样本量较多，因而检测灵敏度不高，无法对表达丰度较低的miRNA进行检测。
目前广泛应用的是实时定量PCR法。该方法采用一种能与成熟的miRNA 3′端互补结合的特异性茎环(stem-loop)状引物进行miRNA的反转录，从而将非常短的成熟miRNA分子扩展并且增加一个通用的3′引物位点然后再进行定量实时PCR，实现miRNA表达水平的特异性的定量检测。然而，该方法仍然需要反转录反应扩增获得miRNA的cDNA第一链，因此实验步骤较多，必然增加实验误差；当该方法用于高通量的筛选实验时，其耗时而且检测误差较大。
S1核酸酶是一种具有高度单链特异性的核酸内切酶，也可以降解DNA:DNA，RNA:RNA或DNA:RNA双链中的单链部分以及由于碱基错配所造成的单链部分(包括茎环结构)，从而将单链DNA或RNA降解成为5'-P单核苷酸。
本发明涉及的miRNA检测方法是通过利用S1核酸酶上述特性，结合特别设计的DNA分子探针进行肿瘤细胞内miRNA表达水平的检测，以提高当前miRNA检测方法的灵敏度和简便性。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提出一种DNA分子探针及肿瘤细胞内的miRNA检测方法。
一种DNA分子探针带有茎环结构、通用引物序列、DNA分子探针骨架和用于miRNA检测的互补DNA序列(以miRNA Let-7b为例)，其结构式为：
所述的引物序列为
5’端通用引物5’-GTGATCATAGCACGATCTGATG-3’
3’端特异性引物miRNA Let-7b 5’-GGGAAGGCAGTAGGTTGTATAG-3’。
本发明将上述的DNA分子探针检测肿瘤细胞的miRNA上的应用。
包括如下步骤：
1)传代培养肿瘤细胞到细胞培养板，于含小牛血清(10％体积百分比)的DMEM培养基(培养基溶液中包含4.5g/L D-葡萄糖，80mg/L甘氨酸，0.584g/L L-谷氨酰胺,4mg/L盐酸吡哆醇，110mg/L丙酮酸钠和3.7g/L的碳酸氢钠，并使用盐酸调整pH值到7.3)中培养至细胞生长达到80％及以上融合后，使用PBS缓冲液洗去残余细胞培养基，然后加入Trizol试剂，按照标准总RNA提取操作步骤((方法学参考文献：Preston Campbell J,Mulcrone P，andElefteriou F,etal.TRIzol and Alu qPCR-based quantification of metastaticseeding within the skeleton.Sci Rep,5:12635,2015.doi:10.1038/srep12635.)提取肿瘤细胞的总RNA；
2)在总RNA中加入miRNA Let-7b的DNA分子探针，混匀、孵育使DNA分子探针互补链退火形成茎环结构并与miRNA Let-7b形成DNA：RNA杂交双链；
3)往步骤2)中加入S1核酸酶缓冲液，混匀后加入S1核酸酶(S1核酸酶加入量为0.5-2个酶活性单位)，混匀后孵育、然后于85℃孵育10分钟灭活；
4)往步骤3)中加入无水乙醇，乙酸钾和鲑精DNA，混匀后离心分离，然后加入乙醇重悬沉淀，再次离心分离后弃去上清液，室温下静置使残留乙醇蒸发后加入蒸馏水溶解沉淀；
5)取上述获得的细胞的DNA沉淀加入RNA酶至终浓度60ug/mL于37℃孵育30分钟。随后加入miRNA Let-7的DNA分子探针5’端通用引物和与miRNA Let-7b序列相同的3’端特异性引物进行实时定量PCR扩增；
6)实时定量PCR反应内参照：以上述获得的细胞总RNA反转录所得cDNA第一链为PCR模板，以Beta-Actin引物扩增细胞内管家基因Beta-Actin的表达，即可完成对肿瘤细胞的miRNA的检测。
上述的步骤2)所述的孵育是将总RNA加入miRNA Let-7b的DNA分子探针后于70-90℃孵育3-10分钟后，置于15-30℃孵育10-25分钟，然后置于50-60℃孵育3-10分钟使DNA分子探针互补链退火形成茎环结构并与miRNA Let-7b形成DNA:RNA杂交双链。
进一步优选为步骤2)所述的孵育是将总RNA加入miRNA Let-7b的DNA分子探针后于80℃孵育5分钟后，置于20℃孵育15分钟；然后置于56℃孵育5分钟使DNA分子探针互补链退火形成茎环结构并与miRNA Let-7b形成DNA:RNA杂交双链。
所述的步骤3)所述的孵育是将步骤2)中加入S1核酸酶缓冲液，混匀后加入S1核酸酶(S1核酸酶加入量为0.5-2个酶活性单位)，混匀后于30-45℃孵育3-10分钟，然后于80-90℃孵育5-15分钟灭活。
进一步优选为步骤3)所述的孵育是将步骤2)中加入S1核酸酶缓冲液，混匀后加入S1核酸酶，混匀后于37℃孵育5分钟，然后于85℃孵育10分钟灭活。
所述的步骤4)中无水乙醇的加入量为步骤5)灭活后混合液体积的1-3倍；乙酸钾的摩尔浓度为2-4M，其添加量为灭火后混合液体积的1/15-1/5倍；步骤1)提取的总RNA、步骤2)所述的miRNA Let-7b的DNA分子探针与步骤4)所述的鲑精DNA的质量比为4-6：1：1。
所述的步骤5)中实时定量PCR采用Takara公司SYBR试剂盒，设定的反应条件为：90-95℃变性25-35秒，55-65℃退火25-35秒，70-75℃延伸25-35秒，进行30-40个循环。进一步优选为步骤5)中实时定量PCR采用Takara公司SYBR试剂盒，设定的反应条件为：94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，进行35个循环。
所述的肿瘤细胞包括但不限于人非小细胞肺癌NCI-H460细胞。
如图1所示，本方法的原理是：通过设计带有与待测miRNA完全互补序列的茎环结构DNA分子探针捕获待测miRNA，然后以S1核酸酶处理，降解掉未与待测miRNA结合的DNA分子探针单链部分。miRNA表达水平越高，其结合的DNA分子探针越多；再以与miRNA相同序列的特异性PCR引物和通用3’引物扩增原DNA分子探针，进行实时定量PCR分析即可高度特异和灵敏的检测miRNA的表达水平。
基于上述目的、本发明所用的S1核酸酶，具有以下特性：
1)单链特异性核酸内切酶，能够降解单链DNA&RNA、双链DNA&RNA和DNA-RNA杂交体中的单链部分和由于碱基错配所造成的单链部分(包括茎环结构)，生成具有5’-P末端的单核苷酸或寡核苷酸。
2)过量的酶还可以降解双链DNA、RNA或者DNA-RNA杂交体。
3)在37℃的条件下，1分钟内完全水解1μg的单链DNA所需要的酶量定义为1个活性单位(unit)。
4)85℃热处理能使本酶完全失活。
附图说明
图1为本发明实施例式I所用实验方法示意图。
图2为本发明实施例式I所用检测miRNA Let-7b的DNA分子探针的结构图。
图3为本发明实施例式I所用检测miRNA Let-7b的DNA分子探针的DNA碱基序列组成与结构图。
图4为本发明实施例式I所示miRNA Let-7b检测的PCR扩增图。
图5为本发明实施例式I所示miRNA Let-7b检测的实时定量PCR图，T-检验，**p<0.01。
图6为本发明实施例式2所示miRNA Let-7b检测的PCR扩增图。
图7为本发明实施例式2所示miRNA Let-7b检测的实时定量PCR图，T-检验，**p<0.01。
具体实施方式
下面结合实施例来进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。
实施例1
1)实验分为正常细胞对照组(人支气管上皮HBE细胞)和肿瘤细胞实验组(人非小细胞肺癌NCI-H460细胞)，两组细胞的培养和其它实验操作条件相同。预期PCR扩增产物的理论长度为66bp左右。
2)分别传代培养人非小细胞肺癌NCI-H460细胞和人支气管上皮HBE细胞到6孔细胞培养板，于含10％小牛血清(体积百分比)的DMEM培养基((培养基溶液中包含4.5g/L D-葡萄糖，80mg/L甘氨酸，0.584g/L L-谷氨酰胺,4mg/L盐酸吡哆醇，110mg/L丙酮酸钠和3.7g/L的碳酸氢钠，并使用盐酸调整pH值到7.3))中常规培养(95％湿度，37℃，5％CO2(体积百分比)至细胞生长达到80％融合，使用PBS缓冲液洗去残余细胞培养基，然后加入Trizol试剂，按照标准总RNA提取操作步骤((方法学参考文献：Preston Campbell J,Mulcrone P，and Elefteriou F,etal.TRIzol and Alu qPCR-based quantification ofmetastatic seeding within the skeleton.Sci Rep,5:12635,2015.doi:10.1038/srep12635.)提取NCI-H460细胞和人支气管上皮HBE细胞总RNA。
3)在总体积40uL的5ug总RNA中加入图2所示miRNA Let-7b的DNA分子探针4uL(1ug)，混匀并于80℃孵育5分钟后，置于20℃孵育15分钟。然后置于56℃孵育5分钟使DNA分子探针互补链退火形成茎环结构并与miRNA Let-7b形成DNA：RNA杂交双链。
4)加入S1核酸酶缓冲液5uL，混匀后加入1个单位(1uL)的S1核酸酶，混匀并于37℃孵育5分钟。然后于85℃孵育10分钟灭活。
5)加入100uL无水乙醇和5uL 3M乙酸钾(pH5.2)和1ug鲑精DNA，混匀后12000转/分4℃离心10分钟。然后加入1mL 70％乙醇重悬沉淀，12000转/分4℃离心2分钟，弃去上清液，静置于室温5分钟使残留乙醇蒸发后加入蒸馏水20uL溶解沉淀。
6)分别取上述获得的两种细胞的DNA沉淀加入RNA酶(1mg/mL)2uL至终浓度60ug/mL于37℃孵育30分钟，然后加入式I所示miRNA Let-7的DNA分子探针5’端通用引物和与miRNA Let-7b序列相同的3’端特异性引物进行实时定量PCR扩增。实时定量PCR采用Takara公司SYBR试剂盒，设定的反应条件为：94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，进行35个循环。使用美国Bio-Rad IQ5实时荧光定量PCR仪完成。
引物序列：5’端通用引物5’-GTGATCATAGCACGATCTGATG-3’
3’端特异性引物5’-GGGAAGGCAGTAGGTTGTATAG-3’
7)实时定量PCR反应内参照：以上述获得的两种细胞总RNA反转录所得cDNA第一链为PCR模板，以Beta-Actin引物扩增两种细胞内管家基因Beta-Actin的表达。
阳性对照组：以上述第三步操作获得的细胞总RNA与DNA分子探针的混合物不加S1核酸酶处理，直接作为模板进行实时定量PCR反应。
阴性对照组：以DNA分子探针加S1核酸酶处理并灭活后，直接作为模板进行实时定量PCR反应。
上述各组的实时定量PCR扩增产物的2.5％琼脂糖凝胶电泳图图4)显示(：
阳性对照组经实时定量PCR扩增获得66bp大小的DNA条带，与预期一致。
阴性对照组则无DNA条带产生，亦于预期一致。
正常细胞对照组(人支气管上皮HBE细胞)和肿瘤细胞实验组(NCI-H460细胞)经实时定量PCR扩增均可获得66bp大小的DNA条带，但肿瘤细胞实验组DNA条带亮度显著低于正常细胞对照组，而二者的Beta-Actin检测基因条带(约270bp)亮度基本一致。因Let-7b是一种抑癌基因，其在人非小细胞肺癌细胞系中低表达，而在正常细胞中高表达，故该结果与预期相符。
实时定量PCR结果显示(图5)：对照组的miRNA Let-7b表达水平是实验组的7.94倍。
实施例2
其他肿瘤细胞增殖检测案例：
1)实验分为正常细胞对照组(乳腺正常上皮细胞MCF-10A–parental、人胚肾上皮293T细胞)和肿瘤细胞实验组(人乳腺癌MCF-7细胞和人宫颈癌Siha细胞)，两组细胞的培养和其它实验操作条件相同。预期PCR扩增产物的理论长度为66bp左右。
2)分别传代培养MCF-10A-parental,MCF-7、293T和Siha细胞到6孔细胞培养板，按照实施例1描述的方法进行细胞培养。
3)采用实施例1描述的方法设置阳性对照和阴性对照，同时以Beta-Actin为样本内参照。
4)采用实施例1描述的方法进行RNA提取、反转录PCR、S1核酸酶消化和实时定量PCR等实验操作，实验所用PCR引物与实施例1相同。
上述各组的实时定量PCR扩增产物的3％琼脂糖凝胶电泳图显示(图6)：
阳性对照组经实时定量PCR扩增获得66bp大小的DNA条带，与预期一致。
阴性对照组则无DNA条带产生，亦于预期一致。
正常细胞对照组(乳腺正常上皮细胞MCF-10A–parental、人胚肾上皮293T细胞)和肿瘤细胞实验组(人乳腺癌MCF-7细胞和人宫颈癌Siha细胞)经实时定量PCR扩增均可获得66bp大小的目的DNA条带，但肿瘤细胞实验组DNA条带亮度显著低于对照组，而二者的Beta-Actin检测基因条带(约270bp)亮度基本一致。
实时定量PCR结果显示(图7)：正常细胞对照组的miRNA Let-7b表达水平是肿瘤细胞实验组的3-4倍。该结果与已发表的研究结果一致(Kim S J,Shin J Y,Lee K D,etal.MicroRNA let-7a suppresses breast cancer cell migration and invasionthrough downregulation of CC chemokine receptor type 7[J].Breast CancerResearch,2012,14(1):R14.)。
由上述描述可以看出，本发明提供的一种基于S1核酸酶和DNA分子探针的肿瘤细胞内miRNA的检测方法简单易行，能够有效检测肿瘤细胞内miRNA的表达水平。

Claims (10)

1.一种DNA分子探针，其特征在于，所述的分子探针为用于miRNA检测的分子探针，该NDA分子探针包括茎环结构、通用引物序列、DNA分子探针骨架和用于miRNA检测的互补DNA序列，具体为miRNA Let-7b互补序列，其结构式为：
2.权利要求1所述的DNA分子探针，其特征在于，所述的引物序列为
5’端通用引物5’-GTGATCATAGCACGATCTGATG-3’
3’端特异性引物5’-GGGAAGGCAGTAGGTTGTATAG-3’；
所述的3’端特异性引物为miRNA Let-7b特异性引物。
3.采用权利要求1或2所述的DNA分子探针在基于S1核酸酶的肿瘤细胞内miRNA实时定量PCR检测上的应用。
4.权利要求3所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
1)传代培养肿瘤细胞到细胞培养板，于含小牛血清的DMEM培养基中培养至细胞生长达到80％及以上融合后，使用PBS缓冲液洗去残余细胞培养基，然后加入Trizol试剂，按照标准总RNA提取操作步骤提取肿瘤细胞的总RNA；
2)在总RNA中加入miRNA，具体为miRNA Let-7b的DNA分子探针，混匀、孵育使DNA分子探针互补链退火形成茎环结构并与miRNA Let-7b形成DNA：RNA杂交双链；
3)往步骤2)中加入S1核酸酶缓冲液，混匀后加入S1核酸酶，混匀后孵育、然后灭活S1核酸酶；
4)往步骤3)中加入无水乙醇，乙酸钾和鲑精DNA，混匀后离心分离，然后加入乙醇重悬沉淀，再次离心分离后弃去上清液，室温下静置使残留乙醇蒸发后加入蒸馏水溶解沉淀；
5)取上述获得的细胞的DNA沉淀加入RNA酶混匀后孵育，然后加入miRNA Let-7的DNA分子探针5’端通用引物和与miRNA Let-7b序列互补的3’端特异性引物进行实时定量PCR扩增；
6)实时定量PCR反应内参照：以上述获得的细胞总RNA反转录所得cDNA第一链为PCR模板，以Beta-Actin引物扩增细胞内管家基因Beta-Actin的表达，即可完成对肿瘤细胞的miRNA的检测。
5.权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤2)所述的孵育是将总RNA加入miRNA Let-7b的DNA分子探针后于70-90℃孵育3-10分钟后，置于15-30℃孵育10-25分钟，然后置于50-60℃孵育3-10分钟使DNA分子探针互补链退火形成茎环结构并与miRNA Let-7b形成DNA:RNA杂交双链。
6.权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤2)所述的孵育是将总RNA加入miRNA Let-7b的DNA分子探针后于80℃孵育5分钟后，置于20℃孵育15分钟；然后置于56℃孵育5分钟使DNA分子探针互补链退火形成茎环结构并与miRNA Let-7b形成DNA:RNA杂交双链。
7.权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤3)所述的孵育是将步骤2)中加入S1核酸酶缓冲液，混匀后加入S1核酸酶，混匀后于30-45℃孵育3-10分钟，然后于80-90℃孵育5-15分钟灭活，
进一步优选为步骤3)所述的孵育是将步骤2)中加入S1核酸酶缓冲液，混匀后加入S1核酸酶，混匀后于37℃孵育5分钟，然后于85℃孵育10分钟灭活；
S1核酸酶的加入量为0.5-2个酶活性单位。
8.权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤4)中无水乙醇的加入量为步骤5)灭火后混合液体积的1-3倍；乙酸钾的摩尔浓度为2-4M，其添加量为灭活后混合液体积的1/15-1/5倍；步骤1)提取的总RNA、步骤2)所述的miRNA Let-7b的DNA分子探针与步骤4)所述的鲑精DNA的质量比为4-6：1：1。
9.权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤5)中加入RNA酶至终浓度60ug/mL于37℃孵育30分钟，步骤5)中实时定量PCR采用Takara公司SYBR试剂盒，设定的反应条件为：90-95℃变性25-35秒，55-65℃退火25-35秒，70-75℃延伸25-35秒，进行30-40个循环。
10.权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤细胞包括但不限于人非小细胞肺癌NCI-H460细胞。
CN201711424723.4A 2017-12-25 2017-12-25 DNA分子探针及对S1核酸酶的肿瘤细胞内miRNA实时定量PCR检测上的应用 Pending CN108048537A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711424723.4A CN108048537A (zh) 2017-12-25 2017-12-25 DNA分子探针及对S1核酸酶的肿瘤细胞内miRNA实时定量PCR检测上的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711424723.4A CN108048537A (zh) 2017-12-25 2017-12-25 DNA分子探针及对S1核酸酶的肿瘤细胞内miRNA实时定量PCR检测上的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108048537A true CN108048537A (zh) 2018-05-18

Family

ID=62131835

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711424723.4A Pending CN108048537A (zh) 2017-12-25 2017-12-25 DNA分子探针及对S1核酸酶的肿瘤细胞内miRNA实时定量PCR检测上的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108048537A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3957751A4 (en) * 2019-04-19 2023-05-03 Xenohelix Co., Ltd SHORT RNA DETECTION TECHNIQUE BASED ON SHORT RNA PRIMED XENON SENSOR MODULE AMPLIFICATION

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005253427A (ja) * 2004-03-15 2005-09-22 Aisin Seiki Co Ltd 核酸検出方法及び核酸単離方法
CN102851352A (zh) * 2011-06-27 2013-01-02 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 一种新型荧光实时定量检测miRNA的方法
CN104342486A (zh) * 2013-07-30 2015-02-11 中国科学院上海生命科学研究院 miRNA检测方法及应用
CN105132577A (zh) * 2015-09-30 2015-12-09 基因科技（上海）有限公司 一种对miRNA进行多重定量检测的方法
WO2016142719A1 (en) * 2015-03-12 2016-09-15 Genome Research Limited Biallelic genetic modification
CN106119371A (zh) * 2016-06-12 2016-11-16 深圳市人民医院 一种利用单链特异性核酸酶检测microRNA含量的方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005253427A (ja) * 2004-03-15 2005-09-22 Aisin Seiki Co Ltd 核酸検出方法及び核酸単離方法
CN102851352A (zh) * 2011-06-27 2013-01-02 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 一种新型荧光实时定量检测miRNA的方法
CN104342486A (zh) * 2013-07-30 2015-02-11 中国科学院上海生命科学研究院 miRNA检测方法及应用
WO2016142719A1 (en) * 2015-03-12 2016-09-15 Genome Research Limited Biallelic genetic modification
CN105132577A (zh) * 2015-09-30 2015-12-09 基因科技（上海）有限公司 一种对miRNA进行多重定量检测的方法
CN106119371A (zh) * 2016-06-12 2016-11-16 深圳市人民医院 一种利用单链特异性核酸酶检测microRNA含量的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CAIFU CHEN等: "Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》 *
陈宏: "《基因工程原理与应用》", 31 January 2004, 中国农业出版社 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3957751A4 (en) * 2019-04-19 2023-05-03 Xenohelix Co., Ltd SHORT RNA DETECTION TECHNIQUE BASED ON SHORT RNA PRIMED XENON SENSOR MODULE AMPLIFICATION

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20130225432A1 (en) Solution-based methods for rna expression profiling
CN113604564A (zh) 一种检测外泌体相关microRNA分子的方法
CN103923983B (zh) 一种在食管鳞癌中显著上调的长链非编码rna的检测及应用
Huang et al. Detection and analysis of the hedgehog signaling pathway-related long non-coding RNA (lncRNA) expression profiles in keloid
CN101082060B (zh) 新型微核糖核酸定量pcr（聚合酶链式反应）检测方法
CN104789667B (zh) 一种基于无偏识别与恒温扩增的小rna检测试剂盒及定量方法
CN103834719A (zh) miRNA检测探针及miRNA的扩增检测方法
CN105177132A (zh) 一种定量检测miRNA的RT-PCR方法
CN108866244A (zh) 检测对虾虹彩病毒的rpa引物和探针、试剂盒及其方法
CN107841566B (zh) 快速突变y染色体短串联重复序列的复合扩增体系、试剂盒及应用
Qu et al. A fluorescence strategy for circRNA quantification in tumor cells based on T7 nuclease-assisted cycling enzymatic amplification
CN109251964B (zh) 循环microRNAs检测试剂盒和特异性检测循环microRNAs的方法及应用
CN105219881A (zh) 一种定量检测ercc1-202的试剂盒及应用
CN107385037B (zh) 一种miRNA间接实时荧光定量PCR检测方法
CN109022583A (zh) hsa_circ_0021977在制备诊断乳腺癌产品上的应用
CN108048537A (zh) DNA分子探针及对S1核酸酶的肿瘤细胞内miRNA实时定量PCR检测上的应用
CN108823302A (zh) 一种耳聋基因突变检测的引物探针组合及其应用
CN106566875A (zh) 用于检测骨髓异常增生综合征mds基因突变的引物、试剂盒及方法
CN107058486B (zh) 检测鼻咽癌糖酵解相关基因分型的引物组及试剂盒
CN110273004B (zh) 基因甲基化检测的试剂、方法和试剂盒
CN107988332A (zh) DNA分子探针及在绿豆核酸酶的肿瘤细胞内miRNA实时定量PCR检测上的应用
CN106755317B (zh) 一种用于检测水稻橙叶病植原体的引物、方法及应用
CN102851352A (zh) 一种新型荧光实时定量检测miRNA的方法
CN112159836A (zh) 一种双发夹连接介导恒温扩增的核酸检测新方法
CN112195257A (zh) 一种检测副溶血弧菌的引物组、试剂、试剂盒及检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180518