CN110146592A - 一种连续动态监测细胞容积调节的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种连续动态监测细胞容积调节的分析方法。通过石英晶体微天平对传感界面上固定的细胞中水分子移动所引起频率和质量的变化进行监测,实现对细胞容积调节变化的在线追踪。该分析方法包括将待监测细胞固定于羧基功能化的QCM芯片,得到频率Δf1;通入工作液,读取细胞膨胀最大值频率Δf2,待细胞趋于回缩后逐渐稳定,读取频率Δf3,计算频率Δf2和频率Δf3的差值ΔF1;计算频率Δf2和频率Δf1的差值ΔF2;ΔF1/ΔF2≥10%即可判断细胞容积调节值,同时还可分析细胞是否发生或发生何种容积调节行为。本发明具有实时在线分析、连续动态监测、灵敏度高、操作简单、分析快速等优势,在临床分析和基础医学研究领域具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于细胞容积调节与药物筛选检测领域,特别涉及一种以石英晶体微天平技术连续动态监测细胞容积调节的分析方法。
背景技术
细胞容积调节是细胞基本功能之一,主要包括:细胞调节性容积减小和细胞调节性容积增加,前者指细胞处于低渗刺激时,细胞发生肿胀,诱发细胞自身容积调节性机制使细胞外排KCl、有机渗透物和水,从而使细胞容积回缩趋于肿胀之前的容积;反之,则为细胞容积调节性增加。由于在细胞的新陈代谢、增殖、分化、分裂及细胞凋亡过程中,均伴有渗透压的变化,所以细胞维持容积相对恒定的功能是细胞完成正常生理功能的重要前提,并对细胞具有保护作用,因此,对细胞容积调节的监测具有重要意义。传统的检测方法有库尔特计数、相差显微镜、荧光显微镜等方法。库尔特技术利用小孔电阻原理,逐个测量细胞的直径大小,然后统计得出细胞尺寸的分布,由于其较快的采样率而被广泛应用,但其不能实现对细胞容积调节变化进行连续动态测量,且要求悬浮状态细胞样品。相差显微镜在观察细胞时由于细胞周围有一圈明亮的光晕,妨碍了对细胞边界的精确测定而易产生检测误差,影响细胞容积测量准确度,且需辅助软件的繁琐计算进行测量。综上,这些技术只能记录某一时刻的细胞容积大小,不能实现细胞容积的动态监测。并且,由于渗透压和水分含量对细胞容积的影响,细胞形状可能发生变化,所以精确检测细胞容积仅仅依赖于对细胞几何形状的检测是困难的。因此,寻找一种新的方法监测细胞容积调节变化具有重要意义。
活细胞是一个复杂的生物系统,所以发展一种可实时在线、简单的方法更准确地监测细胞容积调节具有应用价值。石英晶体微天平(QCM)是一种基于压电效应的纳克级质量型传感器,它通过频率的变化(Δf)反应界面粘附物质的质量变化,具有灵敏度高、可在流通系统进行实时、原位分析等优点。目前,QCM已广泛应用于生命科学、环境,能源等领域。由于QCM传感器能原位、非侵袭的方式实时在线监测细胞-细胞或细胞-基质之间的反应,使得其在细胞生物物理性质如细胞形态学,细胞力学,细胞运动性,细胞信号传导等领域的研究显得尤为突出。但目前未见将该技术应用于细胞容积调节领域中的相关报道。而要实现连续动态监测更是尚有不少关键技术问题需要解决,例如:怎样将待监测的细胞在无损伤的、合适的生理环境前提下有效固定在传感界面,同时如何控制细胞数量以给予细胞足够的空间去调控其自身容积,再者如何保证传感界面细胞含量不变以保证实验的准确度等等。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足,提供一种实时在线、连续动态监测细胞容积调节的分析方法。本发明首次建立以QCM技术连续动态监测细胞容积调节的分析新方法,通过使用石英晶体微天平对在不同介质环境下,传感界面上固定的细胞中水分子移动所引起频率和质量的变化进行监测,从而实现对细胞容积调节变化的在线追踪。本发明该方法解决了传统技术不能实时、连续动态监测的问题,具有实时在线分析、连续动态监测、灵敏度高、操作简单、分析快速等优势,在临床分析和基础医学研究领域具有广阔的应用前景。
本发明的目的通过下述技术方案实现:
一种以石英晶体微天平技术连续动态监测细胞容积调节的分析方法,包括如下步骤:
(1)对QCM芯片进行羧基功能化,得到羧基功能化的QCM芯片;
(2)将步骤(1)得到羧基功能化的QCM芯片装入石英晶体微天平的反应器中,采用自动进样装置,向反应器中通入工作液1,得到稳定的基线;
(3)通入103~105个/mL的待监测细胞,待曲线趋势平稳后,通入所述的工作液1冲洗掉未固定在QCM芯片上的细胞,读取石英晶体微天平监测到的频率Δf1;
(4)将工作液2以0.1~5mL·min-1的流速通入反应器中,细胞迅速发生变化,读取石英晶体微天平监测到的变化最大值频率Δf2,随后细胞逐渐稳定,读取趋于平稳的频率Δf3;
(5)计算及结果分析:计算频率Δf2和频率Δf3的差值ΔF1;计算频率Δf2和频率Δf1的差值ΔF2;求出ΔF1与ΔF2的比值,得到ΔF1/ΔF2即为细胞容积调节值,
当Δf2≠Δf3时,5/Δf2≥0.2判断细胞发生膨胀,5/Δf3≥0.2判断细胞发生回缩,ΔF1/ΔF2≥10%表明细胞产生容积调节性减小;反之,-5/Δf2≥0.2判断细胞发生回缩,-5/Δf3≥0.2判断细胞发生膨胀,ΔF1/ΔF2≥10%则表明细胞产生容积调节性增加;当Δf2=Δf3时,则表明细胞未发生细胞容积调节。
所述的细胞容积调节包括细胞容积调节性减小和细胞容积调节性增加,本方法基于石英晶体微天平构建,成功通过细胞中水分子移动引起频率与质量变化来反映细胞容积变化。
步骤(2)中所述的工作液1为工作液2的对照液,其目的是为了在装入芯片通入溶液前获得一个稳定的基线。
步骤(4)中所述的工作液2为可刺激待测细胞产生细胞调节性容积变化的试剂,例如,可为低渗溶液、中渗溶液、高渗溶液或药物刺激等。
所述的低渗溶液可为NaCl、MgCl2、CaCl2、HEPES和甘露醇的混合水溶液,NaCl的浓度为30~80mM,MgCl2的浓度为0.1~10mM,CaCl2的浓度为1~20mM,HEPES的浓度为10~30mM,甘露醇的浓度为10~50mM的混合溶液。
所述的高渗溶液可为NaCl、MgCl2、CaCl2、HEPES和甘露醇的混合水溶液,NaCl的浓度为30~80mM,MgCl2的浓度为0.1~10mM,CaCl2的浓度为1~20mM,HEPES的浓度为10~30mM,甘露醇的浓度为200mM的混合溶液。
步骤(1)中所述的羧基功能化优选为聚赖氨酸功能化。
步骤(1)中所述的QCM芯片优选为金基底的QCM芯片。
步骤(1)中所述的对QCM芯片进行羧基功能化,其具体操作步骤为:
①将所述的QCM芯片浸泡到浓度为1mg·mL-1~10mg·mL-1的带巯基的酸溶液中,室温孵育10h~20h;
②将QCM芯片表面用1μg·mL-1~10mg·mL-1羧基化试剂孵育1h~3h,冲洗,吹干,即得所述的羧基功能化的QCM芯片。
所述的对QCM芯片进行羧基功能化中,在步骤①的孵育完成后,还可以包括活化处理,可以使细胞在QCM芯片上固定效果进一步提高;所述的活化处理的具体步骤为:将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶液按照1:(3~10)摩尔比滴在QCM芯片表面,孵育1h~2h。
步骤①中所述的带巯基的酸优选为巯基丁二酸、11-巯基十一烷酸中的一种或至少两种。
步骤②中所述的羧基化试剂优选为聚赖氨酸溶液。
步骤②中所述的冲洗优选采用去离子水冲洗。
步骤(2)中所述的通入工作液1的流速优选为0.1~5mL·min-1。
步骤(3)中所述的通入待监测细胞的流速优选为0.1~5mL·min-1。
步骤(3)中所述的通入工作液1的流速优选为0.1~5mL·min-1。
步骤(3)中所述的细胞为具有细胞容积调节功能的正常细胞和/或癌细胞。
步骤(3)中所述的工作液1优选为NaCl、MgCl2、CaCl2、HEPES和甘露醇的混合水溶液,工作液1中NaCl的浓度为30~80mM,MgCl2的浓度为0.1~10mM,CaCl2的浓度为1~20mM,HEPES的浓度为10~30mM,甘露醇的浓度为100~150mM。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
1.本发明提供一种以QCM技术动态监测细胞容积调节的在线分析新方法,包括传感界面构建、反应器中细胞的固定以及流通体系条件的控制,具有高灵敏度、简便、可实时动态监测等优势,有望在临床分析和基础医学领域推广应用。
2.本发明提供了一种高准确度和更为简单的技术用于实时监测细胞容积调节行为,有效的节约了成本,并为细胞功能研究提供更为可靠的检测数据。
附图说明
图1为实施例1的刺激条件下细胞的QCM图。
图2为实施例2的刺激条件下细胞的QCM图。
图3为实施例3的刺激条件下细胞的QCM图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
实施例1工作液2刺激下癌细胞容积调节的监测
步骤一、将金基底的QCM芯片浸泡到浓度为2mg·mL-1的巯基丁二酸溶液中,室温孵育20h;然后取200μL 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶液按照1:3摩尔比混合均匀的溶液滴在QCM芯片表面,孵育1h;随后取100μL 3mg·mL-1聚赖氨酸溶液孵育3h,用去离子水冲洗,吹干,得到聚赖氨酸功能化的QCM芯片。
步骤二、将步骤一的聚赖氨酸功能化的QCM芯片装入石英晶体微天平的反应器中,采用自动进样装置,向反应器中以0.1mL·min-1的流速通入工作液1,得到稳定的基线;然后以0.1mL·min-1的流速,通入1.5×103个/mL的鼻咽癌CNE-2Z细胞,待曲线趋势稳定后,以0.1mL·min-1的流速通入工作液1冲洗QCM芯片,读取石英晶体微天平监测到的频率Δf1;所述工作液1为NaCl、MgCl2、CaCl2、HEPES和甘露醇的混合水溶液,工作液1中NaCl的浓度为70mM,MgCl2的浓度为0.5mM,CaCl2的浓度为1mM,HEPES的浓度为20mM,甘露醇的浓度为110mM。
步骤三、将工作液2以0.1mL·min-1的流速通入步骤二后的QCM芯片中,读取石英晶体微天平检测到的变化幅度最大频率Δf2,随后读取石英晶体微天平监测到的趋势趋于稳定的频率Δf3,计算频率Δf2和频率Δf3的差值ΔF1;计算频率Δf2和频率Δf1的差值ΔF2;求出ΔF1与ΔF2的比值,得到ΔF1/ΔF2,且Δf2≠Δf3,5/Δf2≥0.2判断细胞发生膨胀,5/Δf3≥0.2判断细胞发生回缩,ΔF1/ΔF2≥10%,表明该细胞发生了细胞容积调节性减小其值为56.3%;所述工作液2为NaCl、MgCl2、CaCl2、HEPES和甘露醇的混合水溶液,工作液2中NaCl的浓度为70mM,MgCl2的浓度为0.5mM,CaCl2的浓度为1mM,HEPES的浓度为20mM,甘露醇的浓度为0mM;
步骤四、将步骤二中所用的工作液1通入到步骤三后的反应器中,待曲线趋势平稳后,读取石英晶体微天平监测到的频率Δf4。
结果如图1所示,在通入鼻咽癌细胞后,细胞逐渐粘附在QCM芯片,得到频率Δf1;在工作液2通入后,鼻咽癌细胞大约2~3分钟迅速膨胀到最值,随后,即使仍处于工作液2环境中,细胞质量逐渐变小,即细胞容积逐渐减小,约在工作液2中10分钟后趋于稳定,但未恢复到频率Δf1大小。Δf2≠Δf3,5/Δf2≥0.2判断细胞发生膨胀,5/Δf3≥0.2判断细胞发生回缩,ΔF1/ΔF2≥10%,则表明该细胞发生了细胞容积调节性减小,其值ΔF1/ΔF2为56.3%。
实施例2工作液3刺激下癌细胞容积调节的监测
步骤一、将金基底的QCM芯片浸泡到浓度为2mg·mL-1的巯基丁二酸溶液中,室温孵育20h;然后取200μL 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶液按照1:3摩尔比混合均匀的溶液滴在QCM芯片表面,孵育1h;随后取100μL 3mg·mL-1聚赖氨酸溶液孵育3h,用去离子水冲洗,吹干,得到聚赖氨酸功能化的QCM芯片。
步骤二、将步骤一的聚赖氨酸功能化的QCM芯片装入石英晶体微天平的反应器中,采用自动进样装置,向反应器中以1.0mL·min-1的流速通入工作液1,得到稳定的基线然后以1.0mL·min-1的流速,通入4×104个/mL的鼻咽癌通入细胞,待曲线趋势稳定后,以1.0mL·min-1的流速通入工作液1冲洗QCM芯片,读取石英晶体微天平监测到的频率Δf1;所述工作液1为NaCl、MgCl2、CaCl2、HEPES、和甘露醇的混合水溶液,工作液1中NaCl的浓度为70mM,MgCl2的浓度为0.5mM,CaCl2的浓度为1mM,HEPES的浓度为20mM,,甘露醇的浓度为110mM;所用细胞为鼻咽癌细胞CNE-2Z。
步骤三、将工作液3以1.0mL·min-1的流速继续通入步骤二后的反应器中,读取石英晶体微天平检测到的变化幅度最大频率Δf2,随后读取石英晶体微天平监测到的趋势趋于稳定的频率Δf3,计算频率Δf2和频率Δf3的差值ΔF1;计算频率Δf2和频率Δf1的差值ΔF2;求出ΔF1与ΔF2的比值,得到ΔF1/ΔF2,并且Δf2=Δf3,,判定细胞未发生细胞容积性调节;所述工作液3与步骤二所用工作液1一致。
步骤四、将步骤二中所用的工作液1通入到步骤三后的反应器中,待曲线趋势平稳后,读取石英晶体微天平监测到的频率Δf4。
结果如图2所示,在通入鼻咽癌细胞后,细胞逐渐粘附在QCM芯片,得到频率Δf1;在工作液3通入后,约13分钟内细胞响应频率与质量未发生明显变化,Δf2=Δf3,判定细胞未发生细胞容积性调节。
实施例3工作液4刺激下癌细胞容积调节的监测
步骤一、将金基底的QCM芯片浸泡到浓度为2mg·mL-1的巯基丁二酸溶液中,室温孵育20h;然后取200μL 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶液按照1:3摩尔比混合均匀的溶液滴在QCM芯片表面,孵育1h;随后取100μL 3mg·mL-1聚赖氨酸溶液孵育3h,用去离子水冲洗,吹干,得到聚赖氨酸功能化的QCM芯片。
步骤二、将步骤一聚赖氨酸功能化的QCM芯片装入石英晶体微天平的反应器中,采用自动进样装置,向反应器中以4.0mL·min-1的流速通入工作液1,获得稳定的基线然后以4.0mL·min-1的流速通入105个/mL细胞,待曲线趋势稳定后,以4.0mL·min-1的流速通入工作液1冲洗QCM芯片,读取石英晶体微天平监测到的频率Δf1;所述工作液1为NaCl、MgCl2、CaCl2、HEPES和甘露醇的混合水溶液,工作液1中NaCl的浓度为70mM,MgCl2的浓度为0.5mM,CaCl2的浓度为1mM,HEPES的浓度为20mM,甘露醇的浓度为110mM;所用细胞为鼻咽癌细胞CNE-2Z。
步骤三、将工作液4以4.0mL·min-1的流速通入步骤二后的QCM芯片中,读取石英晶体微天平检测到的变化最大频率Δf2,随后读取石英晶体微天平监测到的趋势趋于稳定的频率Δf3,计算频率Δf2和频率Δf3的差值ΔF1;计算频率Δf2和频率Δf1的差值ΔF2;求出ΔF1与ΔF2的比值,并且Δf2≠Δf3,-5/Δf2≥0.2判断细胞发生回缩,-5/Δf3≥0.2判断细胞发生膨胀,ΔF1/ΔF2≥10%则表明该细胞发生了细胞容积调节性增加,其值为细45.5%;所述工作液4为NaCl、MgCl2、CaCl2、HEPES和甘露醇的混合水溶液,工作液4中NaCl的浓度为70mM,MgCl2的浓度为0.5mM,CaCl2的浓度为1mM,HEPES的浓度为20mM,甘露醇的浓度为200mM;
步骤四、将步骤二中所用的工作液1通入到步骤三后的反应器中,待曲线趋势平稳后,读取石英晶体微天平监测到的频率Δf4。
结果如图3所示,在通入鼻咽癌细胞后,细胞逐渐粘附在QCM芯片,得到频率Δf1;在工作液4通入后,鼻咽癌细胞大约2~3分钟迅速膨胀到最值,随后,即使仍处于工作液4环境中,细胞质量逐渐变小,约在工作液2中10分钟后趋于稳定。Δf2≠Δf3,-5/Δf2≥0.2判断细胞发生回缩,-5/Δf3≥0.2判断细胞发生膨胀,ΔF1/ΔF2≥10%则表明,该细胞发生了细胞容积调节性增加,其值ΔF1与ΔF2为45.5%。
上述实施例通过计算频率变化的比值ΔF1/ΔF2,对不同渗透压或刺激下细胞容积调节的变化进行了实时、连续的在线检测,有效提高了实验的准确性,有望在基础医学领域中推广应用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种连续动态监测细胞容积调节的分析方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)对QCM芯片进行羧基功能化,得到羧基功能化的QCM芯片;
(2)将步骤(1)得到羧基功能化的QCM芯片装入石英晶体微天平的反应器中,采用自动进样装置,向反应器中通入工作液1,得到稳定的基线;
(3)通入103~105个/mL的待监测细胞,待曲线趋势平稳后,通入所述的工作液1冲洗掉未固定在QCM芯片上的细胞,读取石英晶体微天平监测到的频率Δf1;
(4)将工作液2以0.1~5mL·min-1的流速通入反应器中,细胞迅速发生变化,读取石英晶体微天平监测到的变化最大值频率Δf2,随后细胞逐渐稳定,读取趋于平稳的频率Δf3;
(5)计算及结果分析:计算频率Δf2和频率Δf3的差值ΔF1;计算频率Δf2和频率Δf1的差值ΔF2;求出ΔF1与ΔF2的比值,得到ΔF1/ΔF2即为细胞容积调节值,当Δf2≠Δf3时,5/Δf2≥0.2判断细胞发生膨胀,5/Δf3≥0.2判断细胞发生回缩,ΔF1/ΔF2≥10%表明细胞产生容积调节性减小,反之,-5/Δf2≥0.2判断细胞发生回缩,-5/Δf3≥0.2判断细胞发生膨胀,ΔF1/ΔF2≥10%则表明细胞产生容积调节性增加;当Δf2=Δf3时,则表明细胞未发生细胞容积调节。
2.根据权利要求1所述的连续动态监测细胞容积调节的分析方法,其特征在于,步骤(1)中所述的对QCM芯片进行羧基功能化,其具体操作步骤为:
①将所述的QCM芯片浸泡到浓度为1mg·mL-1~10mg·mL-1的带巯基的酸溶液中,室温孵育10h~20h;
②将QCM芯片表面用1μg·mL-1~10mg·mL-1羧基化试剂孵育1h~3h,冲洗,吹干,即得所述的羧基功能化的QCM芯片。
3.根据权利要求2所述的连续动态监测细胞容积调节的分析方法,其特征在于:
所述的对QCM芯片进行羧基功能化中,在步骤①的孵育完成后,还包括活化处理。
4.根据权利要求3所述的连续动态监测细胞容积调节的分析方法,其特征在于,所述的活化处理的具体步骤为:
将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶液按照1:(3~10)摩尔比滴在QCM芯片表面,孵育1h~2h。
5.根据权利要求2所述的连续动态监测细胞容积调节的分析方法,其特征在于:
步骤①中所述的带巯基的酸为巯基丁二酸、11-巯基十一烷酸中的一种或至少两种;
步骤②中所述的羧基化试剂为聚赖氨酸溶液。
6.根据权利要求1所述的连续动态监测细胞容积调节的分析方法,其特征在于:
步骤(2)中所述的通入工作液1的流速为0.1~5mL·min-1;
步骤(3)中所述的通入待监测细胞的流速为0.1~5mL·min-1;
步骤(3)中所述的通入工作液1的流速为0.1~5mL·min-1。
7.根据权利要求1~6任一项所述的连续动态监测细胞容积调节的分析方法,其特征在于:
步骤(4)中所述的工作液2为可刺激待测细胞产生细胞调节性容积变化的试剂。
8.根据权利要求1所述的连续动态监测细胞容积调节的分析方法,其特征在于:
步骤(1)中所述的羧基功能化为聚赖氨酸功能化;
步骤(1)中所述的QCM芯片为金基底的QCM芯片。
9.根据权利要求1所述的连续动态监测细胞容积调节的分析方法,其特征在于:
步骤(3)中所述的待监测细胞为具有细胞容积调节功能的正常细胞和/或癌细胞。
10.根据权利要求1所述的连续动态监测细胞容积调节的分析方法,其特征在于:
步骤(3)中所述的工作液1为NaCl、MgCl2、CaCl2、HEPES和甘露醇的混合水溶液,工作液1中NaCl的浓度为30~80mM,MgCl2的浓度为0.1~10mM,CaCl2的浓度为1~20mM,HEPES的浓度为10~30mM,甘露醇的浓度为100~150mM。
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Title |
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---|---|---|---|---|
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CN110146592B (zh) | 2021-10-01 |
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