CN103954663B

CN103954663B - 采用细胞电极电化学检测细胞增殖活性的方法

Info

Publication number: CN103954663B
Application number: CN201410137557.XA
Authority: CN
Inventors: 曹同成; 尹蓉; 赵国华; 顾靓
Original assignee: Tongji University
Current assignee: Tongji University
Priority date: 2014-04-08
Filing date: 2014-04-08
Publication date: 2016-08-31
Anticipated expiration: 2034-04-08
Also published as: CN103954663A

Abstract

本发明涉及一种采用细胞电极电化学检测细胞增殖活性的方法，利用双酚A对人乳腺癌细胞（MCF-7）的作用作为细胞增殖活性的研究模型；先将多壁碳纳米管滴涂在玻碳电极上固定粘纤蛋白RGDSK，随后将细胞固定在修饰电极的表面，然后以此细胞电极为工作电极，铂电极为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极，基于差分脉冲伏安法的电化学方法，检测MCF-7细胞的增殖情况，并且根据电流与污染物的作用浓度和作用时间的绘制出线性关系曲线。与现有传统检测细胞增殖活性的MTT技术相比，细胞电极与传统方法的检测结果基本一致，同时可以避免传统检测过程中化学试剂对检测人员的伤害，操作也较传统方法快速易与操作，并且检测结果具有良好的重现性和较高的灵敏度，为检测污染物的细胞毒性提供了一个新平台，具有重要的实际应用意义。

Description

采用细胞电极电化学检测细胞增殖活性的方法

技术领域

本发明涉及属于生物化学、电化学分析与环境监测技术领域，尤其是涉及一种采用细胞电极电化学检测细胞增殖活性的方法。

背景技术

在过去的40年里，大量的证据表明环境化学品如杀虫剂和工业化学物质，已经在野生动物和人类体内起到了类激素作用。环境激素大多数为有机污染物，我们使用的农药，如2,4-二氯苯氧乙酸、甲氧滴滴涕等有机氯农药等。这类物质可对人体和动物体内正常的激素功能施加影响，抑制内分泌系统，使内分泌系统失调，导致各种生物生殖功能下降，进而阻碍生殖、发育等机能；有些作用于生命体的最基本单元——细胞，影响细胞的生长和代谢作用，破坏细胞正常的分裂增殖过程甚至有引发恶性肿瘤与生物绝种的危害。

细胞的增殖过程在生物的生命中扮演着重要的作用。如果细胞增殖发生紊乱，细胞则发生癌变。在生命科学中，细胞增殖的过程采用体外培养的肿瘤细胞作为模型，在培养过程中给予一定浓度的药物或者加入外源光照等，考察细胞质增殖活性的变化。检测细胞增殖的方法主要包括细胞计数法、盼台兰染色法、以及MTT等方法。其中MTT方法是一种最易实现也是最常见的检测细胞增殖活性的方法，它是根据测得的吸光度值（OD值）来判断活细胞数量，OD值越大，细胞增殖活性越强。但是MTT实验过程中，有机溶剂（例如DMSO）会对实验人员造成一定损伤；且实验操作中人为操作过程具有不确定性，容易对实验结果造成影响，使得这种方法存在一定的局限性。

电化学方法具有操作简单、快速，成本低，可以在线监测，环境友好等特点。BPA（双酚A）是一种典型的类雌激素性质的物质，对MCF-7细胞增殖具有促进作用。这一典型的现象能够为我们提供一个模型体系，从而考察我们制备的电化学（细胞电极）方法相比MTT方法在检测细胞增殖活性方面的优越性。最终，基于差分脉冲伏安法（DPV）的电化学方法，检测了MCF-7细胞增殖的情况，与MTT实验结果十分吻合。本文提出了一种新颖检测细胞增殖活性的方法，为检测污染物的细胞毒性提供了一个新平台，具有重要的实际应用意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种采用细胞电极电化学检测细胞增殖活性的方法，本发明利用电化学方法中的差分脉冲伏安法（DPV），快速灵敏检测MCF-7细胞增殖的情况，这与传统的检测细胞增殖活性的MTT实验结果十分吻合，同时避免了传统方法对实验人员的毒性以及检测的不确定性。这种新颖的检测细胞增殖活性方法，具有检测范围宽，灵敏度高，重复性能好等优点，为检测污染物的细胞毒性提供了一个新平台，具有重要的实际应用意义。

本发明提出的采用细胞电极电化学检测细胞增殖活性的方法，具体步骤如下：

(1) MCF-7细胞的培养

用标准培养基培养细胞，CO₂细胞培养箱(5％CO₂，37°C)孵育细胞，每天换液一次。细胞呈单层生长到70％左右即进行细胞传代。去除培养瓶内的培养残液，加入0.04％EDTA，漱洗后吸出，再加入100~200uL 0.25％胰酶(覆盖整个瓶底)，37℃孵育3-5分钟。电镜下观察细胞形态变化，待细胞变圆，折光增强，用含血清培养液中止消化，反复吹打瓶壁，制成细胞悬液，移入离心管，1500rpm，室温离心5分钟后，去上清，用新鲜培养液悬浮沉淀；

(2) 采用BPA对MCF-7细胞的作用作为研究模型，制备MCF-7细胞电极

将玻碳电极分别用1.0，0.3，0.05微米的三氧化二铝粉末研磨光滑，分别在浓HNO3：H2SO4（1:1）和乙醇溶液中超声，清洗干净的玻碳电极表面滴涂先前制备的多壁碳纳米管，红外灯下干燥后，在制备好的玻碳电极表面滴涂多肽RGDSK，将电极在37 ℃ 下恒温培养3小时取出备用，4 ℃ 保存；随后，将培养好的 MCF-7 细胞滴涂在玻碳电极表面，37 ℃ 恒温培养 2小时后取出，得到MCF-7细胞电极，立即进行电化学扫描；MCF-7细胞电极用于检测不同时间和剂量BPA作用于MCF-7细胞后，观察细胞增殖活性的变化；

(3)基于差分脉冲伏安法的电化学方法，检测MCF-细胞增殖情况

利用电化学工作站中三电极体系，步骤(2)制备得到的MCF-7细胞电极为工作电极、铂片为对电极、饱和甘汞电极为参比电极进行电化学检测，电解质为含有5mM的K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]的10Mm/L的PBS溶液，溶液PH值为7.4，利用循环伏安法（CV）和差分脉冲伏安法（DPV）对裸玻碳电极和修饰后的MCF-7细胞电极做了基本的电化学表征。根据电流与标准溶液浓度的线性关系绘制工作曲线，检测MCF-7细胞的增殖情况。

电极的组装与表征

1984年确定肽链RGD为纤粘连蛋白(fibronectin, FN)与其受体的特异性结合位点，具有粘结剂的作用。生物公司合成了环肽RGDSK用于细胞和基底的粘合剂，使用电阻率低、导电性能稳定的玻碳电极（GCE）作为基底电极。因此，选择具有雌激素受体（ER）的人卵巢上皮癌细胞（MCF-7, -ER）进行体外实验；制备合成细胞电极，电极的电镜表征图如图2所示，利用快速灵敏的电化学方法进行细胞毒性的检测，并与传统的生物方法比较，取得了理想的结果。较传统的MTT方法，电化学方法更加便捷和安全。

与现有技术相比，本发明具有以下的优点：

（1）电化学方法和MTT方法的结果在很宽的范围内都是一致的，证明了我们引入的电化学方法的准确性。

（2）电化学方法具有信号稳定，灵敏度高，对检测人员身体无危害等特点，并且检测结果准确，这样避免了传统方法的缺陷。

（3）在检测过程中，采用了多壁碳纳米管放大电信号，粘纤蛋白RGDFK很好的将细胞与电极表面附着，提出了一种新颖的细胞电极和细胞毒性的检测方法。

（4）本发明的电化学检测方法实现了对细胞毒性的检测，采用的仪器廉价便携，方法简单易行，并具有较高的灵敏度，且与传统生物方法结果一致，是电化学方法在生物领域的拓展和应用。

附图说明

图1为采用分子印迹功能化的修饰电极的光电化学分析装置的结构示意图。

图2为MCF-7细胞组装在修饰电极前后的电镜图。

图3实施例1电化学方法检测不同时间BPA作用MCF-7细胞增殖活性及与MTT方法比较。

图4实施例1电化学方法检测不同浓度BPA作用MCF-7细胞增殖活性及与MTT方法比较。

图5实施例2电化学方法检测不同时间BPA作用MCF-7细胞增殖活性及与MTT方法比较。

图6实施例2电化学方法检测不同浓度BPA作用MCF-7细胞增殖活性及与MTT方法比较。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

本1984年确定肽链RGD为纤粘连蛋白(fibronectin, FN)与其受体的特异性结合位点，具有粘结剂的作用。生物公司合成了环肽RGDSK用于细胞和基底的粘合剂，使用电阻率低、导电性能稳定的玻碳电极（GCE）作为基底电极。因此，选择具有雌激素受体（ER）的人卵巢上皮癌细胞（MCF-7, -ER）进行体外实验；制备合成细胞电极，电极的电镜表征图如图2所示，利用快速灵敏的电化学方法进行细胞毒性的检测，并根据细胞毒性检测实验的要求，设定BPA浓度效应为1000 nM、100 nM、10 nM、1 nM、0.1 nM的递减浓度，孵育24 h，BPA对MCF-7细胞的作用效果如示意图3所示。可以发现，随着BPA作用浓度的不断递增，细胞不断增殖，可见BPA的加入促进了细胞的增殖。且在相同的作用浓度下，进行MTT实验，利用MTT和电化学方法所对应的增值率基本一致。示意图4。

实施例2

以环肽RGDSK用于细胞和基底的粘合剂，使用电阻率低、导电性能稳定的玻碳电极（GCE）作为基底电极。因此，选择具有雌激素受体（ER）的人卵巢上皮癌细胞（MCF-7, -ER）进行体外实验；制备合成细胞电极。实验中，我们根据检测细胞增殖活性的一般方法，设定检测浓度和时间，我们可以发现，首先，BPA确实是促进了MCF-7细胞的增殖，这与文献的报道是一致的；其次，电化学方法和MTT方法的结果在很宽的范围内都是一致的，证明了我们引入的电化学方法的准确性。时间效应为48 h、24 h、12 h、8 h、4 h，采用1000 nM的BPA浓度，BPA对MCF-7细胞的作用效果如图5所示。可以发现，随着BPA作用时间的不断递增，细胞不断增殖，可见BPA的加入促进了细胞的增殖。且不同的时间点，利用MTT和电化学方法所对应的增值率基本一致。示意图6。

实施例3

此外，我们还在其他细胞和不同环境雌激素作用的MCF-7细胞中推广使用了这种检测方法，我们选择了HEK293细胞中分别加入环境污染物BPA、BDE，利用我们的细胞电极进行检测。因为HEK293细胞对环境污染物BDE本身的响应就大于对BPA的响应，且其他实验和文献都发现，上述两种污染物是抑制HEK293细胞增殖的，这与细胞电极的检测结果是一致的。可见我们的细胞电极是可以得到通用的，但是检测的结果不是很准确，而且与加入BPA的MCF-7细胞比较发现，其灵敏度较低，这表明我们开发的电化学方法对MCF-7细胞的专一性更强。当然，一些本身就具有电化学活性的细胞对此实验方法并不适用，特此说明。

细胞电极采用以下步骤制作：以制备的细胞电极为工作电极，Pt电极为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极，在三电极体系中，将玻碳电极分别用1.0，0.3，0.05微米的三氧化二铝粉末研磨光滑，分别在浓HNO₃：H₂SO₄（1:1）和乙醇溶液中超声，清洗干净的电极表面滴涂先前制备的多壁碳纳米管，红外灯下干燥后，在制备好的电极表面滴涂多肽RGDSK，将电极在37 ℃ 下恒温培养3小时取出备用，4 ℃ 保存。随后，将培养好的 MCF-7 细胞滴涂在电极表面，37 ℃ 恒温培养 2小时后取出，立即进行电化学扫描。细胞电极用于检测不同时间和剂量BPA作用于MCF-7后，细胞增殖活性的变化。

利用电化学工作站中三电极体系，制备的细胞电极为工作电极、铂片为对电极、饱和甘汞电极为参比电极进行电化学检测，电解质为含有5mM的K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆]的10Mm/L的PBS溶液，实验装置图如图1所示。

Claims

1.一种采用细胞电极电化学检测细胞增殖活性的方法，其特征在于具体步骤如下：

(1) MCF-7细胞的培养

用标准培养基培养细胞，5％CO₂，37°C 的CO₂细胞培养箱中孵育细胞，每天换液一次；细胞呈单层生长到68-72％即进行细胞传代；去除培养瓶内的培养残液，加入0.04％EDTA，漱洗后吸出，再加入100~200uL 0.25％胰酶，胰酶覆盖整个瓶底，37℃孵育3-5分钟；电镜下观察细胞形态变化，待细胞变圆，折光增强，用含血清培养液中止消化，反复吹打瓶壁，制成细胞悬液，移入离心管，1500rpm，室温离心5分钟后，去上清，用新鲜培养液悬浮沉淀；

将玻碳电极分别用1.0，0.3，0.05微米的三氧化二铝粉末研磨光滑，分别在体积比为１：１的浓HNO₃和H₂SO₄以及乙醇溶液中超声，清洗干净的玻碳电极表面滴涂多壁碳纳米管，红外灯下干燥后，在制备好的玻碳电极表面滴涂多肽RGDSK，将玻碳电极在37 ℃ 下恒温培养3小时取出备用，4 ℃ 保存；随后，将培养好的 MCF-7 细胞滴涂在玻碳电极表面，37 ℃ 恒温培养 2小时后取出，得到MCF-7细胞电极，立即进行电化学扫描；MCF-7细胞电极用于检测不同时间和剂量双酚Ａ(ＢＰＡ)作用于MCF-7细胞后，观察细胞增殖活性的变化；

(3)基于差分脉冲伏安法的电化学方法，检测MCF-细胞增殖情况

利用电化学工作站中三电极体系，步骤(2)制备得到的MCF-7细胞电极为工作电极、铂片为对电极、饱和甘汞电极为参比电极进行电化学检测，电解质为含有5mM的K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆]的10mＭ/L的PBS溶液，利用循环伏安法和差分脉冲伏安法对裸玻碳电极和修饰后的MCF-7细胞电极做了基本的电化学表征；根据电流与双酚Ａ(ＢＰＡ)的作用浓度和作用时间绘制出线性关系曲线，检测MCF-7细胞的增殖情况。