CN101672814B - 一种电化学受体生物传感器及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种以重组EGFP-β2-AR细胞膜作为生物传感器识别元件的电化学生物受体传感器及其在检测β2-激动剂中应用。本发明的电化学受体生物传感器，包括工作电极、对电极和参比电极，其特征在于所述的工作电极采用重组EGFP-β2-AR细胞膜修饰的金电极；所述的对电极采用铂丝电极；所述的参比电极采用饱和甘汞电极。本发明建立的表达系统是成功的，不仅为我们β2受体—配体检测系统奠定了坚实的技术基础，同时也强烈提示，利用该β2受体—配体检测系统结合电化学生物传感器探索建立β2-激动剂的快速、灵敏、广谱检测提供了可行性。
Description
技术领域
本发明涉及一种新的电化学受体生物传感器及其应用，特别是一种以重组EGFP-β2-AR细胞膜作为生物传感器识别元件的电化学生物受体传感器及其在检测β2-激动剂中应用。
技术背景
β2-肾上腺素能激动剂(简称β2-激动剂、β2-兴奋剂、β2-配体)是一类激素类药物，其成员为数众多，包括Clenbuterol(克伦特罗，俗称瘦肉精)、Salbutamol(沙丁胺醇)、Ractopamine(莱克多巴胺)等数十种(俗称瘦肉精)，其作用机制是：β2-配体首先结合于β2-肾上腺素能受体(简称β2-受体)，通过G蛋白偶联的cAMP信号转导途径发挥生理效应，临床上用于治疗哮喘和支气管痉挛等相关疾病。遵循同样的作用机制，β2-激动剂还具有增强肌肉，减少脂肪的副效应，已被滥用作生长促进剂以提高家畜瘦肉率，肉类食品中的该类药物残留严重危害人民身体健康。
以电化学为基础发展起来的受体生物传感器技术如今受到了极大的关注。电化学受体生物传感器是以固定在表面的材料所具有的离体的或整合的膜受体蛋白作为分子识别元件与待测定的配体分析物发生亲合性结合，再将这种结合作用转换成可检测的电化学信号的配体小分子检测技术。这种技术灵敏度高、操作方便、价格便宜、结构轻巧、能满足装置微型化的要求、能与现在微电子技术很好地兼容、对样品的混浊度要求很低。这些巨大的优势使它最有希望成为未来的违禁药物等检测技术。
受体生物传感器技术领域，目前研究较深入的是日本科研小组，主要相关工作有：
2001年日本科学家Masaharu Murata等人利用受体-配体系统建立的亲和型受体生物传感器技术快速检测雌激素配体17-β雌二醇，整个受体生物传感器系统主要基于雌激素配体17-β雌二醇与修饰于电极表面的雌激素受体发生特异性结合，以此达到检测配体小分子的目的。
2003年日本科学家Masaharu Murata等利用甲状腺激素受体-配体系统，构建甲状腺激素受体蛋白修饰电极快速、方便检测三碘甲腺原氨酸(T3)配体配体。
2003年日本科学家Masaharu Murata等利用甲状腺激素受体-配体相互作用，构建甲状腺激素受体蛋白修饰电极快速、方便检测三碘甲腺原氨酸(T3)配体配体。
2005年Hwi Jin Ko等研究者利用重组表达于人胚肾细胞(HEK-293细胞)中的鼠源嗅觉受体蛋白I7进行压电受体生物传感器技术研究，以此达到检测配体小分子的目的。
2006年Jong Hwan Sung等研究者利用重组表达于大肠杆菌宿主中的C.elegans嗅觉受体蛋白ODR-10进行压电受体生物传感器技术研究，以此达到检测配体小分子的目的。
综上所述：采用重组EGFP-β2-AR细胞膜作为生物识别元件是首次，而且以EGFP-β2-AR受体-配体系统建立的受体生物传感器技术也是首次，并将该技术初步应用于β2-激动剂残留检测中的工作也属首次。目前，国内外仍没有任何科研团队进行过β2-AR受体生物传感器技术的相关研究工作，
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种新的电化学受体生物传感器。
本发明的目的之二在于提供该传感器的制备方法。
本发明的目的之三在于提供该传感器在检测β2-激动剂中的应用。
本发明以嵌合有EGFP-β2-AR受体蛋白的重组EGFP-β2-AR细胞膜为生物识别元件，建立基于循环伏安法的亲和型电化学受体生物传感器技术并初步应用到β2-激动剂残留的快速检测中，研究表明，重组EGFP-β2-AR细胞膜能够与β2-激动剂发生特异性受体-配体结合作用，迅速引起铁氰化钾峰值电流下降，而且随β2-激动剂浓度递增，铁氰化钾峰值电流下降程度越大，峰值电流变化大小与β2-激动剂浓度呈剂量依赖关系。
结果表明：基于循环伏安法构建的电化学受体生物传感器技术对β2-激动剂克伦特罗响应迅速，浓度在1.0×10-10M至1.0×10-4M7个数量级范围内与铁氰化钾峰值电流变化值呈现良好的线性关系，相关系数为R2＝0.9762，检测浓度下限可以达到0.03ppb。
对于重组EGFP-β2-AR细胞膜能与与β2-激动剂发生特异性受体-配体结合作用后，引起[Fe(CN)6]3-/4-峰值电流下降的具体实验机制，查阅相关文献工作主要有两点：
1.受体-配体作用形成受体-配体复合物后，改变了工作电极表面修饰重组EGFP-β2-AR细胞膜蛋白层的静电性质，阻碍铁氰化钾探针与工作电极表面接触而导致峰值电流下降。
2.受体-配体作用形成受体-配体复合物后，重组受体自身构象改变阻碍铁氰化钾探针与工作电极表面接触而导致峰值电流下降。
根据上述理论，本发明采用如下技术方案：
一种电化学受体生物传感器，包括工作电极、对电极和参比电极，其特征在于所述的工作电极采用重组EGFP-β2-AR细胞膜修饰的金电极；所述的对电极采用铂丝电极；所述的参比电极采用饱和甘汞电极。
一种根剧上述的电化学受体生物传感器的制备方法，其特征在于该方法的具体步骤为：
a.在Pichia pastoris GS115宿主菌中构建表达EGFP-β2-AR酵母菌株；
b.摇瓶发酵法获得重组表达EGFP-β2-AR受体蛋白酵母菌体；
c.采用玻璃珠法破碎提取获得重组EGFP-β2-AR细胞膜；
d.取50uL1.0mg/mL重组EGFP-β2-AR细胞膜与50uL1.0mg/mL卵磷脂重悬缓冲液于eppndorf管中充分混合后，得到细胞膜重悬缓冲液；将该细胞膜重悬缓冲液倒扣于已抛光的裸金电极表面，置于4℃冰箱过夜后取出金电极，用细胞膜重悬缓冲液淋洗该金电极；
e.将步骤d得到的金电极作为工作电极，铂丝电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极，即得到电化学受体生物传感器。
一种应用根据权利要求1所述的电化学受体生物传感器检测β2-激动剂的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：
a.建立标准工作曲线：将根据权利要求1所述的传感器中的工作电极，置于含标准梯度浓度β2-激动剂的反应体系中，使工作电极分别与各反应体系中的β2-激动剂充分结合；再将工作电极转移到浓度为0.4mol/L、pH为7.40的[K3Fe(CN)6]磷酸盐缓冲液中，用循环伏安法扫描，建立受体-配体相互作用前后[Fe(CN)6]3-/4-峰值电流变化值大小，建立峰值电流变化值与β2-激动剂浓度关系曲线，即为标准工作曲线；
b.检测未知β2-激动剂浓度的反应体系中β2-激动剂的浓度：将根据权利要求1所述的传感器中的工作电极至于待检测溶液中，使其与检测溶液中的β2-激动剂充分结合，再将工作电极置于浓度为0.4mol/L、pH为7.40的[K3Fe(CN)6]磷酸盐缓冲液中，用循环伏安法扫描，得到[Fe(CN)6]3-/4-峰值电流变化值，对照步骤a建立的标准工作曲线，得到未知样品中β2-激动剂的浓度。
本发明在Pichia pastoris GS115宿主菌中成功构建表达EGFP-β2-AR酵母菌株，摇瓶发酵获得重组表达EGFP-β2-AR受体蛋白酵母菌体，采用经典的玻璃珠法破碎提取获得重组EGFP-β2-AR细胞膜；同时，选取不同时间点的重组表达了EGFP-β2-AR酵母细胞、破碎后嵌合有EGFP-β2-AR受体蛋白的细胞膜，对比绿色荧光蛋白(EGFP)荧光强弱米确定重组表达EGFPβ2-AR受体蛋白量最大的时间点，理论上，单位量荧光强度越强，表明重组表达EGFP-β2-AR受体蛋白量越大，以此确定重组表达EGFP-β2-AR受体蛋白量最佳时间点；更为重要的是，重组EGFP-β2-AR细胞的功能鉴定事关整个检测系统的成败。放射配体结合分析实验结果表明，嵌合有EGFP-β2-AR受体蛋白的重组细胞膜，Kd为0.44nM；Alprenolol的Ki为7.22×10-9，与文献(Biochem.J.(1998)330，1137)报道((-)-[3H]CGP-12177的Kd为0.5nM，Alprenolol的Ki为2.6×10-9)基本一致，表明生物活性良好。
重组酵母工程菌细胞膜EGFP-β2-AR受体，与所检查的所有β2-激动剂(包括抑制剂)都有结合能力，证明重组EGFP-β2-AR细胞膜不仅具有生物活性，而且生物功能完整。
根据形态、生化、免疫学以及功能等鉴定结果，充分表明本发明建立的表达系统是成功的，不仅为我们β2受体—配体检测系统奠定了坚实的技术基础，同时也强烈提示，利用该β2受体—配体检测系统结合电化学生物传感器探索建立β2-激动剂的快速、灵敏、广谱检测提供了可行性。
本发明具有下列优点：
1)高特异性：受体-配体检测系统中受体与配体的结合具有严格的立体构象互补性，保证了电化学受体生物传感器技术检测β2-激动剂克伦特罗残留的高度特异性。
2)高灵敏度：电化学受体生物传感器技术检测β2-激动剂克伦特罗灵敏度可与放射配基结合实验相媲美。
3)操作简单：一旦重组EGFP-β2-AR细胞膜自组装修饰成功，只要取微量检测样品(配体)加入到电化学检测体系，冰水浴环境，就可以判断检测样品是否含有β2-激动剂并作出定量。
4)快速、高效检测：冰水浴环境整个检测反应需30min即可完成，若在室温环境下5min即可以完成样品检测。
5)样品用量少：每个检测样品只需4.0-5.0微升。
本发明的检测体系可以在冰水浴条件下，快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到β2-激动剂，不需要复杂仪器，为食品安全检测提供了新的技术平台，能较好满足目前对β2-激动剂现场检测的迫切需要，用于进出口检疫、食品卫生部门、畜牧饲养场等的现场检测，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
附图说明
图1为本发明的传感器的修饰工作电极在[K3Fe(CN)6]溶液的电化学表征。其中(A)为裸金电极(RJ)与重组细胞膜受体修饰电极(XS)在[K3Fe(CN)6]溶液中的电化学行为；(B)为裸金电极(RJ)与GS115细胞膜修饰电极(XS)在[K3Fe(CN)6]溶液中的电化学行为。
图2为修饰工作电极在含10nM克伦特罗(CLB)的K3[Fe(CN)6]-K4[Fe(CN)6]的循环伏安扫描图。其中(A)为Au/EGFP-β2-AR细胞膜受体修饰工作电极的循环伏安扫描图；(B)为Au/GS115酵母细胞膜修饰工作电极的循环伏安扫描图。
图3为电化学受体生物传感器技术检测克伦特罗灵敏度。其中(A)为重组EGFP-β2-AR细胞膜修饰金工作电极循环伏安扫描(RJ：裸金电极XS：修饰电极)；(B)为GS115酵母细胞膜修饰工作电极循环伏安扫描(RJ：裸金电极XS：修饰电极)。
图4[Fe(CN)6]3-/4-峰值电流变化大小与克伦特罗浓度负对数值之间的标准曲线。系列1：重组EGFP-β2-AR细胞膜 系列2：阴性对照GS115酵母细胞膜 系列3：(系列1)-(系列2)
图5为电化学受体生物传感器技术应用于克伦特罗添加回收实验。其中(A)为重组EGFP-β2-AR细胞膜修饰金工作电极循环伏安扫描(RJ：裸金电极XS：修饰电极)；(B)为GS115酵母细胞膜修饰工作电极循环伏安扫描(RJ：裸金电极XS：修饰电极)。
具体实施方式
1.重组EGFP-β2-AR细胞膜的制备：本发明选用诱导表达阶段培养30h的重组EGFP-β2-AR酵母细胞，采用经典的玻璃珠法破碎提取获得重组EGFP-β2-AR细胞膜，并对重组EGFP-β2-AR细胞膜进行形态电镜鉴定、荧光鉴定以及放射配基结合分析实验鉴定，结果表明：重组EGFP-β2-AR细胞膜不仅具有生物活性，而且生物功能完整。阴性对照系统，未重组GS115酵母细胞膜的制备采用与上述相同的方法获得。
2.重组EGFP-β2-AR细胞膜修饰工作电极制备：取50uL1.0mg/mL重组EGFP-β2-AR细胞膜与50uL1.0mg/mL卵磷脂重悬缓冲液于eppndorf管中充分混合后，倒扣于已抛光的裸金电极表面，置于4℃冰箱过夜后取出金电极，用适量细胞膜重悬缓冲液淋洗工作电极，再放入到5mL0.4mol/L的[K3Fe(CN)6]磷酸盐缓冲液(pH7.40)中，进行循环伏安法(CV)扫描。阴性对照系统，未重组GS115酵母细胞膜采用上述相同方法制备修饰金电极。
将重组EGFP-β2-AR细胞膜修饰工作电极置于5mL0.4mol/L的[K3Fe(CN)6]磷酸盐缓冲液(pH7.40)中，进行循环伏安法扫描获得扫描图，参见图1(A)；阴性对照系统，未重组GS115酵母细胞膜修饰工作电极采用上述相同方法获得循环伏安法扫描图，参见图1(B)。
结果表明，重组EGFP-β2-AR细胞膜成功在电极表面形成了一层自组装膜，抑制了[Fe(CN)6]3-/4-向金电极表面的扩散，对[Fe(CN)6]3-/4-电子转移起到了明显的阻碍作用，可以应用于后续β2-激动剂残留检测。阴性对照系统，未重组GS115酵母细胞膜也成功修饰于电极表面。
3.电化学循环伏安法直接检测β2-激动剂配体-受体亲和作用
自组装修饰到工作电极表面重组EGFP-β2-AR细胞膜探针保持了特异性识别β2-激动剂的能力，能与浓度为1.0×10-8M的克伦特罗结合生成受体-配体复合物，进一步阻碍[Fe(CN)6]3-/4-探针到达工作电极表面进行电子交换，明显降低[Fe(CN)6]3-/4-氧化还原峰值电流，参见图2(A)；阴性对照系统，未重组GS115酵母细胞膜修饰工作电极对克伦特罗没有识别能力，对[Fe(CN)6]3-/4-氧化还原峰值电流影响甚微，参见图2(B)。
结果表明：基于循环伏安技术构建的电化学生物传感器结合重组EGFP-β2-AR受体-配体检测系统检测克伦特罗残留具有实际可行性。
4.电化学受体生物传感器检测体系灵敏性、特异性分析
以克伦特罗标准品进行检测体系的特异性分析。电化学受体生物传感器检测体系的特异性测试良好，可以检测到β2-激动剂克伦特罗。
以10-3、10-4……10-10稀释度的克伦特罗标准品进行电化学受体生物传感器检测方法的灵敏度分析。电化学受体生物传感器检测方法灵敏度比普通免疫学检测法至少高10倍。
其检测程序为：
(1)反应体系
①重组EGFP-β2-AR细胞膜修饰工作电极
②克伦特罗结合反应体系(5ml)配置
| phosphatebuffer(pH7.4) | 10-7MCLB母液 | 10-6MCLB母液 | 10-5MCLB母液 | 10-4MCLB母液 | 10-3MCLB母液 | 10-2MCLB母液 | 10-1MCLB母液 | 100MCLB母液 |
| 5.0mL | 5.0μL | 4.5μL | 4.5μL | 4.5μL | 4.5μL | 4.5μL | 4.5μL | 4.5μL |
③电化学受体生物传感器检测体系溶液(5mL)配置
5mL0.4mol/L的[K3Fe(CN)6]磷酸盐缓冲液(pH7.40)
(2)电化学受体生物传感器检测克伦特罗
重组EGFP-β2-AR细胞膜修饰工作电极，置于克伦特罗结合反应体系中，电极表面修饰的重组EGFP-β2-AR细胞膜探针与克伦特罗充分结合后，将修饰工作电极转移到检测体系溶液中，循环伏安法扫描获得扫描图，参见图3(A)，阴性对照系统，未重组GS115酵母细胞膜采用相同方法获得循环伏安扫描图，参见图3(B)，观察铁氰化钾峰值电流大小的变化与克伦特罗浓度的关系：
结果表明：重组EGFP-β2-AR细胞膜修饰工作电极对克伦特罗响应迅速，而且克伦特罗浓度在1.0×10-10M至1.0×10-4M7个数量级范围内与铁氰化钾峰值电流变化值均呈良好的线性关系，检测下限可以达到0.03ppb；阴性对照系统，未重组GS115酵母细胞膜修饰工作电极对克伦特罗基本没有响应，[Fe(CN)6]3-/4-氧化还原电流峰值基本上没有变化，即使克伦特罗的浓度达到1.0mM时，氧化还原电流峰值也没有很明显变化，进一步证实受体-配体结合在一定程度上抑制了[Fe(CN)6]3-/4-向金电极表面的扩散，对[Fe(CN)6]3-/4-电子转移起到了一定的阻碍作用。
对于受体-配体结合能够在一定程度上抑制了[Fe(CN)6]3-/4-向工作电极表面扩散的机理，通过相关文献工作，我们推测是由于重组EGFP-β2-AR细胞膜与克伦特罗作用形成复合物后，改变了修饰于电极表面蛋白层的静电性质。
[Fe(CN)6]3-/4-峰值电流变化大小与克伦特罗浓度负对数值之间的标准曲线，参见图4：
我们已成功应用该技术于尿样中β2-激动剂克伦特罗添加回收测定实验，基于循环伏安法构建的电化学受体生物传感器技术检测尿样基质中β2-激动剂克伦特罗残留时，响应迅速，添加浓度分别为1.0nM、10nM、100nM时其检测回收率高达为63.1％、79.4％、125％，检测结果见图5，重组EGFP-β2-AR细胞膜修饰工作电极循环伏安扫描图，参见图5(A)，阴性对照系统，未重组GS115酵母细胞膜修饰工作电极循环伏安扫描图，参见图5(B)。
上述结果表明：运用循环伏安技术构建的基于重组EGFP-β2-AR细胞膜受体-配体相互作用的新型电化学受体生物传感器技术是成功的，我们相信经过实验条件进一步优化后，该技术在β2-激动剂残留检测中的应用是完全能够达到快速、灵敏、广谱等检测指标，具有一定应用性和创新性。本发明充分说明了新型电化学受体生物传感器技术的应用研究前景，并为亲和型电化学受体生物传感器的进一步研究提供实验技术基础。
Claims (2)
1.一种电化学受体生物传感器的制备方法，所述的电化学受体生物传感器包括工作电极、对电极和参比电极，所述的工作电极采用重组EGFP-β2-AR细胞膜修饰的金电极；所述的对电极采用铂丝电极；所述的参比电极采用饱和甘汞电极，其特征在于该方法的具体步骤为：
a.在Pichia pastoris GS115宿主菌中构建表达EGFP-β2-AR酵母菌株；
b.摇瓶发酵法获得重组表达EGFP-β2-AR受体蛋白酵母菌体；
c.采用玻璃珠法破碎提取获得重组EGFP-β2-AR细胞膜；
d.取50uL1.0mg/mL重组EGFP-β2-AR细胞膜与50uL1.0mg/mL卵磷脂重悬缓冲液于eppndorf管中充分混合后，得到细胞膜重悬缓冲液；将该细胞膜重悬缓冲液倒扣于已抛光的裸金电极表面，置于4℃冰箱过夜后取出金电极，用细胞膜重悬缓冲液淋洗该金电极；
e.将步骤d得到的金电极作为工作电极，铂丝电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极，即得到电化学受体生物传感器。
2.一种应用电化学受体生物传感器检测β2-激动剂的方法，所述的电化学受体生物传感器包括工作电极、对电极和参比电极，所述的工作电极采用重组EGFP-β2-AR细胞膜修饰的金电极；所述的对电极采用铂丝电极；所述的参比电极采用饱和甘汞电极，其特征在于该方法的具体步骤为：
a.建立标准工作曲线：将所述的工作电极置于含标准梯度浓度β2-激动剂的反应体系中，使工作电极分别与各反应体系中的β2-激动剂充分结合；再将工作电极转移到浓度为0.4mol/L、pH为7.40的[K3Fe(CN)6]磷酸盐缓冲液中，用循环伏安法扫描，建立受体-配体相互作用前后[Fe(CN)6]3-/4-峰值电流变化值，建立峰值电流变化值与β2-激动剂浓度关系曲线，即为标准工作曲线；
b.检测未知β2-激动剂浓度的反应体系中β2-激动剂的浓度：将所述的工作电极置于待检测溶液中，使其与检测溶液中的β2-激动剂充分结合，再将工作电极置于浓度为0.4mol/L、pH为7.40的[K3Fe(CN)6]磷酸盐缓冲液中，用循环伏安法扫描，得到[Fe(CN)6]3-/4-峰值电流变化值，对照步骤a建立的标准工作曲线，得到未知样品中β2-激动剂的浓度。
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Granted publication date: 20121107 Termination date: 20150927 |
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