BR112017014761B1 - detecção de capacitação quântica - Google Patents

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Abstract

O presente pedido de patente refere-se a um método de detecção que é realizado utilizando um eletrodo que compreende um substrato do eletrodo funcionalizado com elementos de detecção. O método envolve a realização de espectroscopia de impedância eletroquímica em uma pluralidade de tensões aplicadas e, em seguida, integrando os dados de medição em função da tensão. É também providenciado um dispositivo para a realização do método de detecção. O método e o dispositivo são adequados para uma ampla gama de aplicações de detecção, incluindo a detecção de biomarcadores diagnósticos, seleção de fármacos, desenvolvimento de sistemas de glicana e detecção de parâmetros ambientais, como intensidade da luz, temperatura e umidade.

Description

[001] A presente invenção refere-se a um método e dispositivo para detecção eletroquímica por sondagem da capacitação quântica de um eletrodo funcionalizado.
Estado da técnica
[002] As técnicas eletroquímicas foram utilizadas em uma ampla gama de aplicações sensíveis, por exemplo, para a detecção e quantificação de moléculas de interesse diagnóstico em amostras fisiológicas, para detectar gases tóxicos e para monitorar mudanças em parâmetros ambientais como a umidade.
[003] A espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS) é uma técnica que monitora mudanças na capacitância ou resistência à transferência de carga associada às mudanças no ambiente local de uma superfície de eletrodo adequadamente modificada. Tais mudanças podem incluir a ligação de substâncias (por exemplo, de uma espécie alvo, como um biomarcador) à superfície do eletrodo, bem como alterações nos parâmetros ambientais, tais como a temperatura. A EIS é uma técnica atraente para detectar aplicações em vista, por exemplo, de sua simplicidade de construção, sensibilidade, seletividade e aplicabilidade pronta dentro de metodologias livres de etiqueta.
[004] No trabalho recente, os presentes inventores demonstraram que os métodos de impedância eletroquímica podem ser aplicados para resolver uma gama de flutuações de carga dentro de películas moleculares confinadas em superfícies de eletrodos. Estas incluem mudanças associadas à flutuação do dipolo eletrônico e ao movimento iônico induzido pelo campo e podem ser resolvidos por Espectroscopia de Capacitância Monocamada Eletroativa de acordo com suas escalas de tempo específicas e dependência de potencial de superfície. Quando estas películas moleculares contêm uma metade com estados orbitais que são energeticamente acessíveis (redox ativo), a transferência de elétrons que resulta de/para o eletrodo metálico subjacente gera um processo de carregamento novo e sensivelmente dependente de potencial nesta interface. Esta capacitância faradaica (conhecida como capacitância redox, Cr) não é eletrostática e pode ser (para películas moleculares de alta qualidade com taxas rápidas associadas de transferência de elétrons heterogêneos), centenas de vezes maior que a contribuição de Helmholtz. Demonstrou-se que este sinal Cr pode ser integrado em películas que são adicionalmente capazes de recrutar alvos específicos de interesse (como os parceiros de antígenos de anticorpos). A mudança de capacitância redox pode então ser usada no estabelecimento de um novo formato de biodetecção livre de etiquetas de alta sensibilidade, estabilidade e conveniência. Para mais detalhes, pode-se fazer referência, por exemplo, para PCT/GB2014/051938 e para Biossensores e Bioeletrônicos 50 (2013) 437-440.
[005] Embora essas técnicas EIS permitam um método de detecção de alta sensibilidade, estável e conveniente, pode-se notar o seguinte: I. A Capacitância redox, Cr, em relatórios efetivos (através da capacitância) sobre a atividade eletroquímica dos grupos redox confinados no seu óptimo “potencial de meia onda"eletroquímico. II. Nenhuma informação é recolhida em qualquer outro potencial. III. Se a atividade eletroquímica da película for perturbada, o valor medido de Cr mudará. Perturbações devido a fenômenos diferentes do evento de ligação/reconhecimento específico (por exemplo, reações colaterais/decomposição, alterações na penetração do solvente ou do eletrólito) não se distinguem necessariamente do evento de ligação/reconhecimento em estudo.
[006] Existe, portanto, a necessidade de métodos de detecção alternativos, mas relacionados, por exemplo, com base nos princípios do EIS. Particularmente atraente seria um método de detecção que utilize uma configuração experimental simples (por exemplo, um único eletrodo de trabalho como sonda), que é amplamente aplicável para a detecção de uma variedade de parâmetros diferentes, que não sofrem de uma ou mais das desvantagens com os métodos conhecidos discutidos acima e/ou que possui alta sensibilidade e/ou seletividade à substância química ou outro parâmetro que está sendo detectado.
Resumo da invenção
[007] Os presentes inventores identificaram agora um novo método para detectar mudanças no ambiente local de uma superfície de eletrodo adequadamente funcionalizada. O novo método pode ser realizado utilizando um sistema eletroquímico particularmente simples e conveniente, que envolve apenas um único eletrodo de trabalho (isto é, uma única sonda). Além disso, não é essencial que o eletrodo de trabalho esteja funcionalizado com grupos redox, nem que esses grupos redox sejam considerados estáveis.
[008] A nova técnica desenvolvida pelos inventores é facilmente aplicável em uma ampla gama de aplicações de detecção, abrangendo, por exemplo, a detecção específica de espécies alvo em um meio transportador (por exemplo, detecção de biomarcadores diagnósticos em amostras fisiológicas), procedimentos de seleção de fármacos, uso em sistemas de glicana e também a detecção de parâmetros ambientais como a umidade ambiente, intensidade da luz e temperatura na proximidade do eletrodo de trabalho.
[009] Com mais detalhes, a técnica desenvolvida pelos inventores faz uso de um eletrodo de trabalho que é funcionalizado com elementos de detecção que são acoplados eletronicamente ao eletrodo subjacente. A distribuição de elétrons entre os elementos de detecção e o eletrodo possui uma impressão digital capacitiva (e carga dinâmica) associada que muda sensivelmente à medida que o ambiente local muda.
[0010] No método da invenção, as medidas de impedância eletroquímica são obtidas através de uma gama de diferentes potenciais aplicados (em vez do potencial subjacente único que é aplicado em um método EIS convencional). A partir da pluralidade de medidas obtidas em diferentes potenciais são obtidas medições do componente real e/ou imaginário da capacitância complexa, C’ e/ou C”, em função da tensão em uma frequência fixa (a). Verificou-se que a integração dos valores C’ e C” medidos sobre tensão fornece um valor de medição integrado que reflete intimamente e, portanto, sente a natureza do ambiente local do eletrodo de trabalho.
[0011] Especificamente, a presente invenção proporciona:
[0012] [1] Um método de detecção que compreende: (A) obter, por espectroscopia de impedância eletroquímica realizada através de uma gama de potenciais aplicados, uma pluralidade de medidas da impedância complexa, Z*, de um sistema que possui um eletrodo de trabalho que compreende um substrato do eletrodo funcionalizado com elementos de detecção cuja resposta eletroquímica aos potenciais aplicados são sensíveis a uma mudança no ambiente local do eletrodo, os elementos de detecção tendo uma dimensão de 0,5 a 10 nm; (B) converter a referida pluralidade de medidas de Z* em uma pluralidade de medidas do componente real da capacitância complexa, C’, a uma frequência selecionada a e/ou ao componente imaginário da capacitância complexa, C”, numa frequência selecionada a; (C) integrar as medidas de (a) C’, (b) C”, ou (c) qualquer combinação de C' e C", na frequência selecionada a como função da tensão aplicada para obter um valor de medição integrado; e (D) avaliar o ambiente local do eletrodo a partir do referido valor de medição integrado.
[0013] O método de detecção da invenção é adequado para detecção eletroquímica por sondagem da capacitância quântica de um eletrodo funcionalizado. Pode, portanto, ser referido como um "método de detecção de capacitância quântica".
[0014] A invenção também proporciona, portanto, um método de detecção de capacitação quântica compreendendo os passos (A), (B), (C) e (D) como definido acima para o método de detecção da invenção.
[0015] [2] Um dispositivo para utilização num método de detecção, que compreende:
[0016] um espectrômetro eletroquímico que compreende um eletrodo de trabalho, um contra eletrodo e um potenciostato, em que o referido eletrodo de trabalho compreende um substrato do eletrodo funcionalizado com elementos de detecção cuja resposta eletroquímica a potenciais aplicados é sensível a uma mudança no ambiente local do eletrodo, os elementos de detecção tendo uma dimensão de 0,5 a 10 nm;
[0017] um receptor configurado para receber, a partir do referido espectrômetro eletroquímico, dados de entrada compreendendo uma pluralidade de medidas de impedância complexa, Z*, em uma gama de potenciais aplicados; e
[0018] um processador configurado para (i) converter a referida pluralidade de medidas de Z* em uma pluralidade de medidas do componente real da capacitância complexa, C’, numa frequência selecionada o e/ou no componente imaginário da capacitância complexa, C”, em uma frequência selecionada o, e (ii) integrar as referidas medições de (a) C’, (b) C", ou (c) qualquer combinação de C' e C”, na frequência selecionada o como uma função de tensão aplicada para obter um valor de medição integrado.
[0019] [3] Um meio de armazenamento armazenando código legível por computador para implementação por um computador ou rede de computadores, o código, quando implementado, fazendo com que o computador ou a rede de computadores implemente as etapas de:
[0020] obter, a partir de um espectrômetro eletroquímico, dados de entrada compreendendo uma pluralidade de medidas de impedância complexa, Z*, em uma gama de potenciais aplicados;
[0021] converter a referida pluralidade de medidas de Z* em uma pluralidade de medidas do componente real da capacitância complexa, C’, numa frequência selecionada o e/ou o componente imaginário da capacitância complexa, C”, numa frequência selecionada o; e
[0022] integrar as referidas medições de (a) C’, (b) C”, ou (c) qualquer combinação de C' e C", na frequência selecionada o como função de tensão aplicada para obter um valor de medição integrado.
[0023] Outras características e formas de realização preferidas são descritas na descrição anexa e nas reivindicações anexas.
Breve descrição das Figuras
[0024] A Figura 1 representa as curvas analíticas construídas a partir da densidade eletrônica e suas variações de DOS associadas, obtidas como descrito no Exemplo. A caixa (b) mostra a variação de Cq = e2 g(E) (obtida a partir de medições de CS) devido à interação entre anti-CRP e CRP em uma camada molecular eletroativada em concentrações de CRP variáveis (a tendência de aumentar a concentração de CRP é indicada na Figura ). As energias absolutas são mostradas no eixo x superior. As linhas são um ajuste de dados experimentais (representados por pontos) à forma Gaussiana esperada. A caixa (a) mostra a relação linear (curva analítica) entre o logaritmo natural da concentração de CRP e a densidade eletrônica do sistema.
[0025] A Figura 2 representa mudanças de condutância e uma curva analítica associada, obtida como descrito no Exemplo. A caixa (a) mostra medidas da condutividade devido a uma variação na densidade eletrônica em várias concentrações de CRP (a tendência de aumentar a concentração de CRP é indicada na Figura). A caixa (b) mostra uma curva analítica obtida a partir da variação na condutância de elétrons na camada devido à interação entre anti-CRP e CRP.
[0026] A Figura 3 é uma representação esquemática de um eletrodo de trabalho (ouro) funcionalizado com elementos de detecção que são acoplados eletronicamente ao eletrodo subjacente. Neste exemplo, uma folha de grafeno é montada no eletrodo e uma proteína que serve como um receptor para um analito alvo está ligada ao grafeno. A densidade de estados (estados quânticos), medida experimentalmente por espectroscopia de capacitância, foi utilizada como sinal do transdutor.
[0027] A Figura 4 é um gráfico da resposta relativa (RR) expresso como uma porcentagem (eixo y) para diferentes concentrações de um analito alvo, alfa-sinucleína (α-sync), em unidades de pM (eixo x). O gráfico mostra respostas analíticas comparativas sobre uma camada de grafeno condutor disposta em uma camada de isolação no substrato de ouro. A camada de grafeno foi adequadamente modificada com anti-α-sync, para detecção de α-sync. É evidente que tanto a capacitância quântica quanto a condutância quântica são mais sensíveis do que a energia da superfície (conforme indicado na Equação 1 no Exemplo 2). A sensibilidade é evidenciada pela inclinação dos testes (S). As frequências analíticas óptimas para capacitância e parâmetro de resistência são 118 e 22 Hz, respectivamente. O desvio padrão é calculado em três medições para cada concentração dada com todos os r2> 0,99.
Descrição detalhada
[0028] As características opcionais e preferidas da presente invenção são agora descritas. Qualquer uma das características aqui descritas pode ser combinada com qualquer um dos outros recursos aqui descritos, salvo indicação em contrário.
O método de detecção
[0029] A espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS) é uma técnica conhecida pelo perito da técnica. Geralmente, um potencial variável de corrente alternada é aplicado em um potencial de polarização (ou DC) entre um eletrodo de trabalho e um eletrodo contador. Geralmente, o EIS envolve a varredura através de uma gama de frequências de corrente alternada o. A taxa do sinal de entrada (tipicamente o potencial variável) para o sinal de saída (tipicamente a corrente variável) permite que a impedância seja calculada. Geralmente, há uma diferença de fase entre o sinal de entrada e o sinal de saída, de modo que a impedância pode ser considerada como uma função complexa Z*, tendo uma parte real (às vezes denominada Z’) e uma parte imaginária (às vezes denominada Z”).
[0030] A gama de frequência do potencial de corrente alternada variável aplicado pode ser de 1 mHz a 10 MHz. A amplitude do potencial de corrente alternada aplicado, que é tipicamente na forma de uma onda senoidal, pode ser de 1 mV a 100 mV, opcionalmente de 5 mV a 50 mV, opcionalmente de 5 mV a 20 mV, opcionalmente de 5 mV a 15 MV, opcionalmente 8 mV a 12 mV, opcionalmente cerca de 10 mV.
[0031] Ao realizar uma medição de EIS, o potencial de polarização (ou potencial de corrente direta) pode ser ajustado em qualquer valor desejado. Este potencial de corrente direta ou de polarização é conhecido aqui como o potencial aplicado. O método da presente invenção envolve a obtenção de uma pluralidade de medidas da impedância complexa através de uma gama de potenciais aplicados (o que permite a integração subsequente sobre a tensão aplicada), isto é, um número de medições EIS são obtidas, cada uma, em diferentes tensões selecionadas. Normalmente, a pluralidade de medidas da impedância complexa obtida por EIS é pelo menos três medidas, de preferência pelo menos cinco medidas, como pelo menos dez ou mesmo pelo menos vinte medidas, ou seja, a gama de potenciais aplicados tipicamente compreende pelo menos três potenciais aplicados diferentes, de preferência pelo menos cinco potenciais aplicados diferentes, como pelo menos dez ou mesmo pelo menos vinte diferentes potenciais aplicados.
[0032] No passo de converter a pluralidade de medidas de Z* em uma pluralidade de medições do componente real da capacitância complexa, C’, medidas de C' a uma frequência (fixa/única) selecionada a são usadas. Como seria bem conhecido para um perito da técnica C’ tipicamente varia conforme a muda (isto é, C' é uma função de a). A frequência selecionada apropriada o dependerá, evidentemente, da construção de um eletrodo particular e da natureza do método de detecção que está sendo realizado. No entanto, a determinação de uma frequência selecionada adequada o é rotina. O perito da técnica poderia facilmente, por exemplo, identificar um valor de o um lugar onde os valores obtidos de C’ são satisfatoriamente elevados (por exemplo, em ou perto do valor máximo de C' em toda a gama de frequência aplicada em uma verificação EIS de rotina) e/ou responsivo à característica particular do ambiente local do eletrodo que um está procurando para sondar. Princípios análogos aplicam-se quando a pluralidade de medidas de Z* é convertida em uma pluralidade de medidas do componente imaginário da capacitância complexa, C”.
[0033] A conversão de Z* na frequência selecionada o em C’ e/ou C” é rotineira e bem conhecida na técnica. Em particular, em uma análise EIS da prática padrão, a função de impedância complexa Z* (o) em um potencial particular pode ser convertida fasorialmente em capacitância complexa C* (o) com seus componentes reais e imaginários, usando a equação C* (o) = 1/io Z*(o).
[0034] A integração das medidas de C’ e/ou C” como função da tensão aplicada também pode ser rotineiramente realizada, por exemplo, usando "área sob os métodos do gráfico" quando C', C" ou qualquer combinação de C’ e C” é plotada contra a tensão aplicada e/ou por meio de algoritmos informatizados conhecidos e rotineiros para integrar dados derivados empiricamente.
[0035] Verificou-se que a integração de C’ e C” na frequência selecionada o como função da tensão aplicada fornece um "valor de medição integrado" que é adequado para detecção, ou seja, que pode ser usado para relatar o ambiente local do eletrodo quando as medidas EIS foram realizadas. Especificamente, um valor de medição integrado derivado da integração de C’ está relacionado à densidade de estados (DOS) do sistema, isto é, reflete a capacitância quântica (como exemplificado na Figura 1 do Exemplo). Um valor de medição integrado derivado da integração de C” está relacionado à condutância do sistema (como exemplificado na Figura 2 do Exemplo).
[0036] Na prática, às vezes pode ser preferível (para pura simplicidade de operação) obter o valor de medição integrado pela integração de apenas um C’ e C” na frequência selecionada o como função da tensão aplicada. Numa primeira forma de realização preferida, portanto, a pluralidade de medidas de Z* é convertida em uma pluralidade de medidas do componente real da capacitância complexa, C’ na frequência selecionada o e estas medições são convertidas como uma função da tensão aplicada para obter o valor de medição integrado. Além disso, numa segunda forma de realização preferida, a pluralidade de medidas de Z* é convertida numa pluralidade de medidas do componente imaginário da capacitância complexa, C” na frequência selecionada o e estas medidas são convertidas como uma função da tensão aplicada para obter o valor de medição integrado.
[0037] No entanto, uma vez que ambos C’ e C” podem ser utilizados, também será evidente para o perito da técnica que um valor de medição integrado pode ser obtido integrando qualquer combinação de C' e C" na frequência selecionada o como função de tensão aplicada. Por exemplo, qualquer soma dos valores de C’ e C”(onde C' e/ou C" são possivelmente ponderados com quaisquer constantes negativas ou positivas) ou qualquer múltiplo ou quociente dos valores de C’ e C” pode ser usado.
[0038] Por conseguinte, deve ser entendido que o termo "método de detecção de capacitação quântica", tal como aqui utilizado, engloba métodos nos quais o valor de medição integrado é obtido por integração de apenas C” na frequência selecionada o como função da tensão aplicada, tal que o valor de medição integrado reflete a condutância do sistema em vez da capacitância quântica, bem como métodos em que o valor de medição integrado é obtido por integração de C’ ou integrando qualquer combinação de C' e C”, conforme explicado acima.
[0039] O passo de avaliação do ambiente local do eletrodo de trabalho é normalmente realizado comparando o valor de medição integrado com um ou mais valores de referência. O (s) valor (es) de referência pode (m) ser obtido (s) obtendo um ou mais valores de medição integrados correspondentes em condições em que o ambiente local do eletrodo já é conhecido. Por outras palavras, o (s) valor (es) de referência são utilizados para calibrar o valor de medição integrado obtido quando o método é realizado em condições de teste com valores esperados que seriam obtidos em condições específicas e conhecidas. A avaliação do ambiente local pode ser de natureza qualitativa ou quantitativa. A calibração de um dispositivo para uso em aplicações de detecção é bem conhecida e é rotina na técnica, inclusive em métodos baseados em EIS.
Construção de eletrodo de trabalho
[0040] O eletrodo de trabalho compreende um substrato do eletrodo funcionalizado com elementos de detecção.
[0041] O substrato do eletrodo pode compreender qualquer material eletricamente condutor. O substrato pode compreender um metal ou carbono. O metal pode ser um metal em forma elementar ou uma liga de metal. Opcionalmente, todo o substrato compreende um metal ou carbono. O substrato pode compreender um metal de transição. O substrato pode compreender um metal de transição selecionado de qualquer dos grupos 9 a 11 da Tabela Periódica. O substrato pode compreender um metal selecionado de, entre outros, rênio, irídio, paládio, platina, cobre, índio, rubídio, prata e ouro. O substrato pode compreender um metal selecionado de ouro, prata e platina. O substrato pode compreender um material contendo carbono, que pode ser selecionado a partir do grafite pirolítico do plano da borda, grafite pirolítico do plano basal, carbono vítreo, diamante dopado de boro, grafite pirolítico altamente ordenado, pó de carbono e nanotubos de carbono. Numa concretização preferida, o substrato compreende ouro, por exemplo, o substrato é um substrato de ouro.
[0042] A superfície do eletrodo (isto é, a superfície do substrato) pode ser planar, que inclui uma superfície geralmente plana, por exemplo, sem entalhes, protrusões e poros. Tais superfícies de substrato podem ser prontamente preparadas por técnicas tais como polimento com partículas finas, por exemplo, pulverização com partículas finas, opcionalmente em uma sequência de passos em que o tamanho das partículas finas diminui em cada passo de polimento. As partículas finas podem, por exemplo, compreender um material à base de carbono, tal como diamante, e/ou podem ter partículas com diâmetros de 10 μm ou menos, opcionalmente 5 μm ou menos, opcionalmente 3 μm ou menos, opcionalmente 1 μm ou menos, opcionalmente, 0,5 μm ou menos, opcionalmente 0,1 μm ou menos. Após o polimento, a superfície do substrato pode ser lavada, por exemplo, por ultrassom, opcionalmente num meio líquido adequado, tal como água, por exemplo, durante um período de pelo menos 1 minuto, por exemplo, de cerca de 1 minuto a 10 minutos. Opcionalmente, a superfície do substrato pode ser lavada com um abrasivo, por exemplo, solução ácida, por exemplo, seguindo os passos de polimento e, se usado, de lavagem ultrassônica. A solução abrasiva pode compreender um ácido inorgânico, por exemplo, H2SO4, e/ou um peróxido, por exemplo, H2O2, num meio líquido adequado, por exemplo, água. Opcionalmente, os substratos podem ser pulverizados eletroquimicamente, o que pode seguir quaisquer passos envolvendo um ou mais polidores com partículas finas, lavando, por exemplo, por ultrassom e/ou usando uma solução abrasiva. O polimento eletroquímico pode envolver o ciclo entre um potencial superior e menor até se atingir um pico de redução estável, por exemplo, um potencial superior de 0,5 V ou mais, opcionalmente 1 V ou mais, opcionalmente 1,25 V ou mais, e um potencial menor de 0,5 V ou menos, opcionalmente 0,25 V ou menos, opcionalmente 0,1 V ou menos.
[0043] O substrato do eletrodo é funcionalizado com elementos de detecção. Os elementos de detecção são confinados na superfície do eletrodo. Em combinação com o substrato do eletrodo, os elementos de detecção são capazes de gerar uma resposta eletroquímica quando o EIS é conduzido. Além disso, a resposta eletroquímica aos potenciais aplicados é sensível a uma mudança no ambiente local do eletrodo.
[0044] Essas características do eletrodo podem ser alcançadas garantindo que os elementos de detecção sejam acoplados eletronicamente à superfície do eletrodo. Por "acoplado eletronicamente" entende-se que os elétrons são capazes de redistribuir entre a superfície do eletrodo e os elementos de detecção. Assim, quando o eletrodo é produzido pela funcionalização da superfície do eletrodo com os elementos de detecção, ocorre uma redistribuição de elétrons entre a superfície do eletrodo e os elementos de detecção. Da mesma forma, a redistribuição das eleições entre a superfície do eletrodo e os elementos de detecção ocorre quando há uma mudança no ambiente local do eletrodo, especificamente uma mudança correspondente ao substrato ou parâmetro ambiental que está sendo detectado.
[0045] Em geral, o elemento de detecção pode ser constituído por qualquer composto químico com um potencial químico diferente de elétrons para o do eletrodo. O eletrodo e o composto químico dado devem ser separados por uma distância muito curta, isto é, dentro de uma nanoescala tal como inferior a 10 nm, por exemplo, inferior a 2 nm. Esta curta distância determina a natureza quantizada do sinal de transdução. De fato, ele conecta dois estados energéticos (os da sonda de eletrodo e outros de compostos químicos) por meio de uma região de dispersão dentro do comprimento de nanoescala.
[0046] Consequentemente, cada um dos elementos de detecção tipicamente tem uma dimensão de 10 nm ou inferior, tal como 0,5 a 10 nm, de preferência 1 a 5 nm, por exemplo, 1 a 3 nm. A referida dimensão é tipicamente a maior dimensão que se prolonga como uma linha reta a partir de uma extremidade do elemento de detecção que está ligado à superfície do eletrodo a uma extremidade do elemento de detecção que não está ligado à superfície do eletrodo. Tipicamente, todas as dimensões (isto é, todas as dimensões mensuráveis) de cada um dos elementos de detecção são de 10 nm ou menos, tais como 0,5 a 10 nm, de preferência 1 a 5 nm, por exemplo, 1 a 3 nm.
[0047] Um elemento de detecção pode consistir de um composto químico com um potencial químico diferente de elétrons para o eletrodo que é acoplado à superfície do eletrodo através de um ligador químico curto, desde que o elemento de detecção (isto é, o referido composto químico e o referido ligante) tenha uma dimensão acima de 10 nm ou inferior, tal como 0,5 a 10 nm, de preferência 1 a 5 nm, por exemplo, 1 a 3 nm.
[0048] Tipicamente, os elementos de detecção têm uma densidade finita e confinada de estados eletrônicos ("DOS"), em contraste com o substrato do eletrodo subjacente que pode ser considerado como tendo um DOS substancialmente infinito. Assim, os elementos de detecção tipicamente são diferentes do substrato do eletrodo, isto é, eles não são um substrato condutor de metal ou carbono. Exemplos de elementos de detecção adequados incluem espécies redox ativas, uma película molecular, nanopartículas, grafeno, nanotubos de carbono e pontos quânticos. A funcionalidade de substratos de eletrodos com esses materiais é bem conhecida na técnica e pode ser conseguida usando técnicas de rotina.
[0049] Exemplos representativos de espécies redox ativas adequadas incluem sistemas redox baseados em osmínio, ferrocenos, quinonas e porfirinas, incluindo seus derivados. Derivados de quinina incluem p-benzoquinona e hidroquinona. De preferência, a espécie redox ativa é ferroceno ou um seu derivado, por exemplo um derivado de alquilo (por exemplo, alquilo C1-6) ou acilo. Mais preferencialmente, a espécie redox ativa é ferroceno.
[0050] É importante dizer que, embora os elementos de detecção possam compreender espécies redox ativas, não é essencial que os elementos de detecção sejam redox ativos. Assim, numa concretização da presente invenção, o eletrodo de trabalho é funcionalizado com elementos de detecção, mas o eletrodo de trabalho não está funcionalizado com nenhuma espécie redox ativa. Por exemplo, os elementos de detecção desta forma de realização podem ser selecionados a partir de uma película molecular, nanopartículas, grafeno, nanotubos de carbono e pontos quânticos. Por exemplo, os elementos de detecção não compreendem espécies redox ativas.
[0051] Numa concretização preferida, os elementos de detecção compreendem o grafeno. Muitas vezes, por exemplo, o substrato do eletrodo compreende ouro (por exemplo, o substrato pode ser um substrato de ouro) e os elementos de detecção compreendem o grafeno. O grafeno pode estar presente na forma oxidada, isto é, como óxido de grafeno.
[0052] O eletrodo de trabalho pode ainda compreender uma camada intermediária disposta entre o substrato do eletrodo e os elementos de detecção. A camada intermediária pode ser uma monocamada auto-montada de um composto particular, por exemplo, cisteína. O composto em questão pode ser referido como um isolador.
[0053] Numa concretização, o substrato do eletrodo compreende o ouro, o eletrodo de trabalho compreende ainda uma camada intermediária disposta no substrato do eletrodo, e os elementos de detecção, que estão dispostos na camada intermediária, compreendem o grafeno. O grafeno pode estar presente na forma oxidada, isto é, como óxido de grafeno. A camada intermediária, tipicamente, compreende cisteína.
[0054] O termo "elementos de detecção"pode ser usado de forma intercambiável com o termo "entidades nanométricas", que também descreve a natureza do material funcionalizado na superfície do eletrodo.
Aplicações do método de detecção
[0055] Os princípios da presente invenção podem ser aplicados amplamente. Em particular, é possível sentir uma substância física ou um parâmetro ambiental diferente de uma substância física. Substancialmente, qualquer substância ou parâmetro ambiental pode ser detectado desde que uma alteração na quantidade dessa substância ou parâmetro resulte em uma mudança no ambiente local do eletrodo de trabalho e, portanto, uma mudança na distribuição de elétrons entre os elementos de detecção e o substrato do eletrodo. O eletrodo de trabalho pode, portanto, ser projetado em relação ao método de detecção pretendido para o qual ele será usado.
Detecção de substâncias físicas
[0056] Numa concretização, o método é um método para detectar uma substância química, isto é, um composto químico ou um grupo de compostos químicos. Nesta forma de realização, no passo (A), o eletrodo de trabalho que está em contato com um meio transportador que pode compreender a substância e a resposta eletroquímica dos elementos de detecção aos potenciais aplicados é sensível à presença da referida substância. Se o meio transportador contiver a substância, então será obtido um valor de medição integrado particular. O valor de medição integrado será diferente se o meio transportador não contiver a substância. Da mesma forma, as mudanças no valor de medição integrado ocorrerão à medida que a concentração da substância no meio transportador muda.
[0057] O meio transportador está preferencialmente em forma líquida, embora também sejam possíveis meios gasosos. O líquido transportador (ou gás) pode ser qualquer líquido (ou gás) no qual a substância pode ser suspensa ou dissolvida (ou dispersa). Numa concretização, o líquido transportador compreende água. Numa concretização, o líquido transportador compreende um fluido biológico. Um fluido biológico pode ser um fluido que tenha sido obtido de um indivíduo, que pode ser um ser humano ou um animal. Numa concretização, o líquido transportador compreende um fluido biológico não diluído. Um fluido biológico não diluído no presente contexto é um fluido biológico obtido de um sujeito, por exemplo, um humano ou animal, que não foi diluído com outro líquido. O fluido biológico pode ser selecionado de sangue, urina, lágrimas, saliva, suor e líquido cerebrospinal. Opcionalmente, o meio transportador compreende um fluido biológico obtido a partir de um indivíduo, por exemplo, um humano ou animal e um diluente. O diluente pode ser adicionado ao fluido biológico depois de ter sido obtido a partir do sujeito. O diluente pode incluir um meio líquido, por exemplo, um meio líquido selecionado de água e um álcool, por exemplo, um álcool, por exemplo, etanol. O meio transportador pode ainda compreender um tampão. O tampão pode compreender um fosfato.
[0058] Num aspecto preferido deste método da invenção, o eletrodo de trabalho compreende metades do receptor que são capazes de se ligar à referida substância, e a resposta eletroquímica dos elementos de detecção aos potenciais aplicados é sensível à ligação da referida substância às metades do receptor. De preferência, as metades do receptor são capazes de se ligar especificamente à substância. "Capaz de se ligar especificamente à substância"tipicamente significa ter uma constante de ligação à substância pelo menos 50 vezes maior que a constante de ligação a qualquer outra (s) substância (s) presente no meio transportador, de preferência pelo menos 100 vezes maior e mais preferencialmente ainda pelo menos 200 vezes maior.
[0059] As metades do receptor podem estar compreendidas nos próprios elementos de detecção ou, em alternativa, o substrato do eletrodo pode ser funcionalizado tanto com elementos de detecção como com partes de receptores que são diferentes dos elementos de detecção.
[0060] Exemplos de metades do receptor incluem anticorpos, fragmentos de anticorpo, ácidos nucleicos, aptâmero, oligossacarídeos, peptídeos e proteínas. De preferência, as metades do receptor são selecionadas de anticorpos, ácidos nucleicos e peptídeos. Mais preferencialmente, as metades do receptor são anticorpos.
[0061] O anticorpo, ou o fragmento de anticorpo, podem ser selecionados de uma ou mais das classes IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Numa concretização preferida, o anticorpo, ou fragmento de anticorpo, é do tipo IgG. O anticorpo se liga de forma seletiva à substância de interesse. O anticorpo, ou fragmento de anticorpo, pode ser derivado de um mamífero, incluindo, mas não limitado a, um mamífero selecionado de um humano, um rato, um rato, um coelho, uma cabra, uma ovelha e um cavalo. O aptâmero pode ser selecionado a partir de um aptâmero peptídico, um aptâmero de DNA e um aptâmero de ARN.
[0062] O anticorpo pode, por exemplo, ser anticorpo anti-alfa sinucleína (anti-α-sync).
[0063] Claramente, a escolha das metades do receptor para um determinado eletrodo é determinada pela identidade da substância de interesse, isto é, o "alvo" de interesse.
[0064] Por exemplo, o alvo pode ser alfa sinucleína (α-sync), caso em que as metades do receptor tipicamente compreendem ou consistem em anti-α-sync.
[0065] Numa concretização, o eletrodo de trabalho compreende metades do receptor; os elementos de detecção compreendem o grafeno; e o substrato do eletrodo compreende ouro. As metades do receptor podem ser como acima definidas acima, por exemplo, elas podem compreender ou consistir em anti-α-sync. O grafeno pode estar presente na forma oxidada, isto é, como óxido de grafeno, pois isto pode facilitar a ligação das metades do receptor.
[0066] O eletrodo de trabalho pode compreender ainda uma camada intermediária disposta no substrato do eletrodo, entre o substrato do eletrodo e os elementos de detecção. A camada intermediária tipicamente compreende cisteína.
Detecção de uma espécie alvo, por exemplo, para aplicações de diagnóstico.
[0067] A substância pode ser uma espécie alvo, isto é, uma espécie que pode ou não estar presente no meio transportador, opcionalmente em conjunto com uma ou mais outras espécies não visadas, e que os usuários desejam detectar. Mais tipicamente, o método é um para determinar a concentração das referidas espécies alvo no referido meio transportador.
[0068] Embora este método possa ser usado para detectar uma gama de espécies alvo, um aspecto particularmente útil é a detecção de uma espécie de interesse diagnóstico. A detecção sensível de biomarcadores em amostras fisiológicas é cada vez mais interessante no diagnóstico. Os métodos da presente invenção podem ser utilizados de forma sensível e seletiva para detectar (e determinar a concentração) de biomarcadores específicos, especificamente fornecendo um substrato do eletrodo que é funcionalizado com metades do receptor que são capazes de se ligar especificamente ao biomarcador de interesse.
[0069] Exemplos de espécies alvo incluem aqueles selecionados do grupo que consiste em proteína CRP, insulina e um marcador de uma ou mais neurodegeneração, câncer, infarto do miocárdio, diabetes e trauma geral.
[0070] Mais geralmente, espécies alvo adequadas para detecção de acordo com os métodos da invenção incluem proteínas, polipeptídeos, anticorpos, nanopartículas, fármacos, toxinas, gases nocivos, produtos químicos perigosos, explosivos, partículas virais, células, organismos multicelulares, citocinas e quimiocinas, gametócitos, organelas, lipídios, sequências de ácidos nucleicos, oligossacarídeos, intermediários químicos de caminhos metabólicos e macromoléculas. Em formas de realização preferidas, a espécie alvo compreende, consiste essencialmente, ou consiste em uma molécula biológica, mais adequadamente uma macromolécula biológica, mais adequadamente um polipeptídeo. Um biomarcador é um exemplo de uma molécula biológica de particular interesse.
[0071] Se a espécie alvo é ou compreende uma proteína, a proteína pode ser selecionada de, mas não está limitado a, proteínas nativas, proteínas desnatadas, fragmentos de proteínas e proteínas procarióticas ou eucarióticamente expressas. A proteína pode ter o seu significado normal na técnica, e mais preferencialmente a "proteína"refere-se a uma molécula de polipeptídeo. Esse polipeptídeo pode compreender modificações tais como a glicosilação; Fosforilação ou outras modificações desse tipo.
[0072] Se a espécie alvo for um anticorpo, o anticorpo pode ser selecionado de uma ou mais das classes IgA, IgD, IgE, IgG e IgM.
[0073] Se a espécie alvo for uma nanopartícula, a nanopartícula pode ser selecionada de, mas não se limita a, uma ou mais nanopartículas isolantes, metálicas ou semicondutoras.
[0074] Se a espécie alvo for um fármaco, o fármaco pode ser selecionado de, entre outros, álcool (por exemplo, etanol), anfetaminas, nitrato de amilo, heroína, cetamina, esteróides anabolizantes, LSD, solventes, cannabis, cocaína (como cloridrato de cocaína ou "coca"), tabaco, tranquilizantes, crack (isto é, base livre de cocaína), ecstasy e/ou gama hidroxibutirato (GHB). Alternativamente, em algumas formas de realização, o fármaco pode ser uma substância medicinal.
[0075] A espécie alvo pode ser um fármaco candidato, por exemplo, uma entidade química ou biológica que pode ser testada ou rastreada para uma atividade ou propriedade particular usando a presente invenção.
[0076] Se a espécie alvo for uma toxina, a toxina pode ser selecionada de, mas não está limitada a, uma ou mais toxinas provenientes de animais, plantas ou bactérias.
[0077] Se a espécie alvo for uma partícula viral, a partícula viral pode ser selecionada de, mas não está limitada a, uma ou mais partículas virais com e sem um genoma.
[0078] Se a espécie alvo for uma célula, a célula pode ser selecionada de, mas não está limitada a, uma ou mais células progenitoras pluripotentes, células humanas (por exemplo, células B, células T, mastócitos, fagócitos, neutrófilos, eosinófilos, macrófagos, células endoteliais), células cancerosas (por exemplo, as que são originárias do fígado, ossos cervicais, pancreáticos, colorretais, próstatos, epidérmicos, cérebro, mama, pulmão, testicular, renal, câncer de bexiga), organismos unicelulares de origem não humana, algas, fungos, bactérias, células vegetais, ovos parasitas, plasmodium e micoplasma.
[0079] Se a espécie alvo for uma organela, a organela pode ser selecionada de, entre outros, um ou mais núcleos, mitocôndrias, dispositivo de Golgi, retículo endoplasmático, lisossomo, fagosomo, membranas intracelulares, membranas extracelulares, citoesqueleto, membrana nuclear, cromatina, matriz nuclear e cloroplastos.
[0080] Se a espécie alvo é um lipídio, o lipídio pode ser selecionado de, entre outros, um ou mais lipídios de sinalização, lipídios estruturais, fosfolipídios, glicolipídios e ácidos graxos.
[0081] Se a espécie alvo for a sequência de ácido nucleico, a sequência de ácido nucleico pode ser selecionada de, mas não está limitada a, um ou mais de DNA, cDNA, RNA, rRNA, mRNA, miRNA e tRNA.
[0082] Se a espécie alvo for um oligossacarídeo, o oligossacarídeo pode ser selecionado de, mas não está limitado a, um ou mais oligossacarídeos de origem humana, animal, vegetal, fúngica ou bacteriana.
[0083] A espécie alvo pode ser qualquer antígeno ou analito que seja indicativo de uma determinada doença. O alvo pode ser selecionado de, por exemplo, proteína C reativa (proteína CRP), enzima conversora de angiotensina I (peptidil-dipeptidase A) 1; adiponectina; receptor específico de produto final de glicosilação avançada; alfa-2-HS-glicoproteína; angiogenina, ribonuclease, família RNase A, 5; apolipoproteína A-l; apolipoproteína B (incluindo antígeno Ag (x)); apolipoproteína E; Proteína X associada a BCL2; célula-B CLL/linfoma 2; complemento C3; ligando de quimiocina (assunto C-C) 2; CD 14, solúvel; CD 40, solúvel; cdk5 ;, relacionado à pentraxina; catepsina B; dipeptidil peptidase IV; fator de crescimento epidérmico; endoglin; Fas; fibrinogênio; ferritina; hormônio de crescimento 1; alanina aminotransferase; fator de crescimento dos hepatócitos; haptoglobina; choque térmico 70kDa proteína 1 B; molécula de adesão intercelular 1; fator de crescimento semelhante a insulina 1 (somatomedina C); receptor do fator de crescimento semelhante a insulina 3; interleucina 18; receptor de interleucina 2, alfa; receptor de interleucina 2, beta; Interleucina 6 (interferão, beta 2); receptor de interleucina 6; transdutor de sinal de interleucina 6 (gp130, receptor de oncostatina M); interleucina 8; activina A; leptina (homólogo da obesidade, rato); ativador de plasminogênio, tecido; Pró-opiomelanocortina (adrenocorticotropina/beta-lipotropina/hormônio estimulante alfa- melanócito/hormônio estimulante de beta-melanócito/beta-endorfina); proinsulina; resistina; selectina e (molécula de adesão endotelial 1); selectina P (proteína de membrana granulada 140kDa, antígeno CD62); inibidor da serpina peptidase, clade E (nexina, inibidor do ativador do plasminogênio tipo 1), membro 1; cinase regulada por soro/glucocorticóide; globulina de ligação hormonal sexual; fator de crescimento transformante, beta 1 (doença de Camurati-Engelmann); TIMP metallopeptidase inibidor 2; superfamília do receptor do fator de necrose tumoral, membro 1 B; Molécula 1 de adesão celular vascular (VCAM-1); fator de crescimento endotelial vascular; Factor II, Factor V, Factor VIII, Factor IX, Factor XI, Factor XII, F/produtos de degradação de fibrina, complexo de trombina-antitrombina III, fibrinogênio, plasminogênio, protrombina e fator de von Willebrand e semelhantes. Os marcadores úteis para diabetes incluem, por exemplo, proteína C-reativa; glicose; insulina; TRIG; GPT; HSPA1 B; IGFBP2; LEP; ADIPOQ; CCL2; ENG; HP; IL2RA; SCp; SHBG; e TIMP2. As espécies alvo atualmente preferidas incluem uma espécie alvo selecionada do grupo que consiste em proteína CRP, insulina e um marcador de uma ou mais neurodegeneração, câncer, infarto do miocárdio, diabetes e trauma geral.
[0084] As espécies alvo podem, por exemplo, compreender ou consistir em alfa-sinucleína (α-sync). Se a espécie alvo é, ou compreende, α-sync, as metades do receptor podem compreender ou consistir em um anticorpo de α-sync.
[0085] As espécies alvo podem ser um alvo associado ao monitoramento da diabetes. Numa concretização, o alvo pode ser selecionado a partir de glicose, insulina, alfa receptor de Interleucina 2 (IL2- RA), proteína C reativa (CRP) e hemoglobina glicada (HbAlc). Se a espécie alvo for a glicose, as metades receptoras podem ser selecionadas, por exemplo, do elemento de reconhecimento molecular do ensaio GDH-FAD ou de uma proteína de ligação a glicose/galactose ("GGBP") (Scholle et al., Mol. Gen. Genet 208: 247-253 (1987)). Se o alvo for IL-2RA, as metades do receptor podem compreender ou consistir num anticorpo monoclonal específico para IL-2RA. Se a espécie alvo é ou compreende proteína C-reativa, de preferência esta é proteína C-reativa humana. Se a espécie alvo é ou compreende proteína C-reativa, as metades do receptor podem compreender ou consistir em anti-CRP. Se a espécie alvo é ou compreende insulina, as metades do receptor podem compreender consistindo em um anticorpo de insulina.
Métodos baseados em Glicana
[0086] Os métodos da invenção também podem ser usados em aplicações que envolvem glicana. Uma glicana é uma matriz em que cada unidade de matriz compreende metades de carboidratos específicos (que diferem das metades de carboidrato nas outras unidades de matriz). No contexto da presente invenção, a matriz compreende uma pluralidade de sistemas eletroquímicos endereçáveis separadamente, sendo o eletrodo de trabalho, cada um dos quais, sendo funcionalizado com metades do receptor que são metades de carboidratos. Por exemplo, o conjunto de metades de carboidratos pode constituir o glicana ou uma porção do glicana de um organismo, como um ser humano.
[0087] Assim, numa forma de realização do método da invenção, a substância (que está sendo detectada) é selecionada a partir de uma proteína de lectina, uma glicoenzima e um anticorpo de ligação de carboidratos, enquanto as metades do receptor são metades de carboidratos. Além disso, neste método de detecção, o eletrodo de trabalho pode formar parte de uma glicana compreendendo uma pluralidade de eletrodos de trabalho, cada um deles, funcionalizado com diferentes metades de carboidrato. O método pode assim compreender a realização das etapas do método (A) - (D) em cada um dos eletrodos de trabalho incluídos no glicana.
Seleção/descoberta de fármacos
[0088] Outra aplicação para os métodos da invenção está no campo da seleção e descoberta de fármacos. Em sistemas conhecidos baseados em matriz para seleção de fármacos, cada unidade de matriz compreende metades receptoras acessíveis às quais a ligação por um fármaco candidato indicaria prima facie que o candidato a fármaco pode ser de interesse terapêutico. Por exemplo, existem métodos de seleção conhecidos que se baseiam no modelo de taxol-tubulina. Neste modelo, a atividade de interação do taxol de fármacos anti-câncer conhecido, com a tubulina proteína, é usada como uma referência contra a qual os novos fármacos candidatos são comparados.
[0089] Em particular, no método da invenção, a substância (a ser detectada) pode ser um candidato a fármaco e as metades de receptor podem ser metades que são capazes de se ligar a um fármaco de referência conhecido. Assim, a detecção da ligação do fármaco candidato às metades do receptor seria correlacionada com o fármaco candidato comportando-se de forma análoga ao fármaco de referência conhecido (e, portanto, sendo digno de estudo posterior). Em contrapartida, a falta de ligação pode levar à rejeição do fármaco candidato.
[0090] Será apreciado que, neste método de detecção, o eletrodo de trabalho pode formar parte de uma matriz compreendendo uma pluralidade de eletrodo de trabalho cada um funcionalizado com as referidas metades de receptor, sendo a referida matriz apropriada para usar a seleção simultânea de uma pluralidade de fármacos candidatos. Esta configuração de matriz permite o rastreio de alto rendimento de vários fármacos candidatos por vez.
Detecção de parâmetros ambientais
[0091] Ainda numa outra forma de realização, o método é um método para detectar uma alteração num parâmetro ambiental no ambiente local do eletrodo. Exemplos de tais parâmetros ambientais incluem a temperatura do ambiente local, a intensidade da luz no ambiente local (por exemplo, intensidade da luz visível ou, alternativamente ou adicionalmente, a intensidade da luz UV) e a umidade no ambiente local.
[0092] Em tais métodos, a interação da luz, temperatura ou água ambiente/superfície afeta o DOS medido ou a densidade eletrônica (obtidos a partir do DOS integrado) nos elementos de detecção. A mudança associada na resposta eletroquímica é mensurável e pode ser facilmente calibrada para posterior aplicação.
Dispositivo
[0093] A presente invenção também proporciona um dispositivo para utilização num método de detecção, tipicamente um método de detecção da presente invenção. Este dispositivo compreende um espectrômetro eletroquímico cujo eletrodo de trabalho é funcionalizado com elementos de detecção, isto é, um espectrômetro eletroquímico especialmente adaptado para a realização do método da presente invenção. O eletrodo de trabalho é como aqui descrito.
[0094] O dispositivo compreende ainda (a) um receptor configurado para receber, a partir do referido espectrômetro eletroquímico, dados de entrada compreendendo uma pluralidade de medidas de impedância complexa, Z*, através de uma gama de potenciais aplicados; e (b) um processador configurado para (i) converter a referida pluralidade de medidas de Z* em uma pluralidade de medidas do componente real e/ou imaginário da capacitância complexa, C’ e/ou C”, numa frequência selecionada o, e (ii) integrar as referidas medições de C’, C” ou combinação de C' e C", na frequência selecionada o como função da tensão aplicada para obter um valor de medição integrado. O receptor e o processador podem fazer parte de um computador. A funcionalidade do receptor e do processador pode ser conseguida através da programação do computador para receber dados de entrada do método da invenção e para processar esses dados em um valor de medição integrado como aqui descrito.
[0095] O receptor pode receber os dados de entrada diretamente do espectrômetro, ou indiretamente, por exemplo, lendo os dados de um arquivo de dados criado pelo espectrômetro.
[0096] Por "programação" entende-se que o computador possui um código legível por computador que fornece instruções para executar as etapas de receber os dados de entrada, convertendo-se em partes reais e/ou imaginárias de capacitância complexa, C’ e/ou C” e integrando para obter um valor de medição integrado de forma automática, por exemplo, sem intervenção de um usuário. O computador pode, por exemplo, incluir um computador físico programado com um programa de computador adequado. Esse programa poderia, por exemplo, ser fornecido em um meio de armazenamento para implementação pelo computador ou uma rede de computadores. O meio de armazenamento pode ser parte integrante do próprio computador, como um disco rígido ou um meio de armazenamento removível, como um disco óptico ou dispositivo de armazenamento portátil, como um dispositivo de memória flash USB.
[0097] O dispositivo pode assim ser utilizado para executar um método da presente invenção, pelo que um operador conduz as medições EIS necessárias do passo (A), do método da invenção, usando o espectrômetro eletroquímico e em que os passos subsequentes são então executados automaticamente para completar o método de detecção.
[0098] O computador pode ser ainda programado para produzir dados gerados a partir do referido valor de medição integrado. Essa saída pode ser para uma exibição e/ou para um arquivo de computador e/ou como um fluxo de dados para outro dispositivo. Esses dados podem incluir dados numéricos simples correspondentes ao próprio valor de medição integrado. Alternativamente, os dados podem incluir uma indicação da presença, ausência ou concentração de uma substância a ser detectada ou uma indicação qualitativa ou quantitativa de um parâmetro ambiental detectado no sistema em estudo. Como será evidente para o perito da técnica, o computador pode ser rotineiramente programado para fornecer esses dados, programando-o adicionalmente com valores de calibração (referência) relativos ao valor de medição integrado.
[0099] Além disso, a invenção fornece um meio de armazenamento que armazena código legível por computador. Quando implementado, este código é capaz de provocar um receptor e processador como aqui definido (isto é, como um computador como explicado acima) para executar as etapas associadas ao receptor e ao processador no dispositivo da presente invenção.
Exemplo 1
[00100] Um eletrodo de trabalho foi preparado como se segue. As monocamadas auto-montadas misturadas (SAM) foram geradas em um substrato do eletrodo de ouro por incubação em uma solução de pentadecanotiol e 11-Ferrocenil-Undecanodiol. As superfícies receptivas foram preparadas por imersão destes em Anti-CRP.
[00101] As alíquotas de Proteína C-Reativa (CRP) foram adicionadas à interface com concentrações variando de 0 nmol/L a 8,0 nmol/L em PBS (especificamente, as medidas foram realizadas em concentrações de 0, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0 e 8.0 nmol/L). As medidas eletroquímicas foram realizadas com um potenciostato usando uma configuração de três eletrodos com Ag/AgCl como referência, platina como um contador e o eletrodo de trabalho acima. Todos os experimentos foram realizados em triplicado e os valores de medição apresentados nas Figuras são valores médios calculados em conformidade.
[00102] As medidas de espectroscopia de impedância eletroquímica foram realizadas em uma variedade de potenciais entre 0,2 e +0,8V versus Ag/AgCl com um passo potencial de 15 mV e uma frequência constante de 20 mHz.
[00103] Os DOS das Figuras 1 e 2 foram assim obtidos. As formas da Figura 1 (b) foram construídas diretamente da parte real da capacitância complexa a 20 mHz. Especificamente, a forma do DOS reflete a forma da capacitância quântica, isto é, e2DOS. As linhas são um encaixe de dados experimentais (representados pelos pontos aqui) a uma gaussiana que incorpora os efeitos do alargamento térmico. Assim, a densidade eletrônica, (com ampliação térmica) é dada pela integral desta Gaussiana como
Figure img0001
[00104] onde: gr(me)é a função DOS (Gaussiana como função do potencial como mostrado na Figura 1b), Eré o potencial redox das espécies redox associadas ao eletrodo, kBé a constante de Boltzmann, Té a temperatura absoluta e meé o potencial químico dos elétrons no eletrodo, relacionado ao potencial como me = -cV.
[00105] N foi então contabilizado como uma função da concentração de CRP, como mostrado na Figura 1(a). Especificamente, a densidade eletrônica foi calculada pela integração das curvas na Figura 1 (b) normalizada pelo volume da camada molecular (um comprimento de 3,5 nm foi usado para a camada molecular 11-ferrocenil-undecanodiol).
[00106] A Figura 2 foi construída a partir do termo capacitância imaginária da capacitância complexa a 20 mHz; ele explica a condutância da película redox (veja a Figura 2 (a)). A integral da condutância também fornece uma densidade eletrônica. Esta densidade de eletrônica também fornece um meio de detectar eventos de ligação na película molecular (veja a curva analítica mostrada na Figura 2 (b)).
Exemplo 2
[00107] Os inventores demonstraram que, ao usar a metodologia de espectroscopia de capacitância, é possível acessar experimentalmente estados quantificados moleculares e sua ocupação (capacitância quântica) e utilizar esse sinal como transdutor para aplicações a biossensores; isso pode ser feito porque a capacitância medida é muito sensível a qualquer alteração (eletrostática ou química) do meio ambiente. Além disso, os inventores demonstraram que tanto a capacitância quântica do sistema quanto a resistência quantizada, comunicando os estados quânticos acessíveis moleculares ao eletrodo/sonda, podem ser usadas como sinais do transdutor. Os inventores também perceberam que, de acordo com a Density Functional Theory (metodologia mecânica quântica), a função da densidade eletrônica, está intimamente relacionada à espectroscopia de capacitância da seguinte forma
Figure img0002
[00108] Onde c_-- é a capacitância eletroquímica que contém duas contribuições C. í.;"(quântica) e C/..") (eletrostática). Segue-se que qualquer dispositivo miniaturizado que contenha estados eletrônicos restritos ou dimensões de nanoescala conectados a um eletrodo pode potencialmente ser usado em um formato sensorial, desde que os estados mecânicos quânticos contidos em y/udemi mudem com algum evento externo (ligação de uma proteína, por exemplo). Os inventores demonstram aqui, no caso de uma folha de grafeno montada sobre uma sonda de eletrodo de trabalho, que o sistema pode ser muito sensível a tais mudanças quando uma proteína ligada a ela serve como receptor de um analito (proteína alvo) como ilustrado na Figura 3. Neste sistema, a energia dos estados mecânicos quânticos, a capacitância e a resistência (associada ao acoplamento entre os estados eletrônicos do grafeno e os do eletrodo de ouro/sonda) podem ser utilizadas como sinais transdutores. Isso está ilustrado na Figura 4.
[00109] Os dispositivos foram fabricados por deposição de óxido de grafeno no eletrodo de ouro (mecanicamente e eletroquimicamente polido) através de uma monocamada auto-montada intermediária (camada isoladora da Figura 3, feita de cisteína) deixando cair uma dispersão de grafeno em água dentro de um tempo de incubação de 8 h. Os receptores foram anexados após o CBMA, um monômero zwitteriônico, foi imobilizado por montagem eletrostática (no terminal de óxido de grafeno carregado negativamente) no eletrodo para criar uma superfície de baixa incrustação. Antes da imbolização da espécie receptiva (anti-α-sync), os eletrodos modificados na superfície foram enxaguados com H2O e secados em um fluxo de nitrogênio gasoso. Os grupos carboxila terminais foram então ativados com 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) (0,4 M) e N- Hidroxisuccinimida (NHS) (0,1 M) em água desionizada durante 40 min e depois reagiu com 1 MM da respectiva molécula receptora em solução de PBS durante 1 h, à temperatura ambiente. As interfaces foram então imersas em etanolamina 1 M (pH cerca de 8,5) para desativar quaisquer grupos carboxílicos ativados que não reagiram e lavados com PBS antes das medidas (esquematicamente representadas na Figura 3).
[00110] A resposta (*) obtida para cada parâmetro (da Figura 4), isto é, capacitância quântica
Figure img0003
condutância quântica
Figure img0004
e energia de superfície (£[/?]) [ver também a Equação. (1)], foram avaliados em uma gama de concentração de alvo (α-sync). Para normalizar o sinal de transdução para cada um desses parâmetros, utilizou-se a resposta relativa. A resposta relativa (r;'^), para diferentes concentrações de alvo na frequência de ressonância, isto é, onde .- = ç /Ç_ maximiza, foi calculado, assim, como
Figure img0005
[00111] Onde representa o valor inicial dos parâmetros na ausência de analito (medida em branco) e r?is..-s. é o valor do parâmetro depois de expor o eletrodo funcionalizado do receptor à concentração alvo correspondente na mesma frequência A'. Coletando sobre uma gama de concentração alvo, foi possível plotar as curvas analíticas para cada um dos parâmetros como mostrado na Figura 4.

Claims (17)

1. Método de detecção para detecção de uma substância química caracterizado pelo fato de compreender: (A) obter, por espectroscopia de impedância eletroquímica realizada através de uma gama de potenciais aplicados, uma pluralidade de medidas da impedância complexa, Z*, de um sistema que possui um eletrodo de trabalho que está em contato com um meio transportador que pode compreender a referida substância química, o eletrodo de trabalho compreendendo metades do receptor que são capazes de se ligar à referida substância química, em que o eletrodo de trabalho compreende um substrato do eletrodo funcionalizado com elementos de detecção cuja resposta eletroquímica aos potenciais aplicados é sensível à ligação da referida substância química às referidas metades do receptor , os elementos de detecção tendo uma dimensão de 0,5 a 10 nm; (B) converter a referida pluralidade de medidas de Z* em uma pluralidade de medidas do componente real da capacitância complexa, C’, a uma frequência selecionada o e/ou ao componente imaginário da capacitância complexa, C”, numa frequência selecionada o; (C) integrar as medidas de (a) C’, (b) C”, ou (c) qualquer combinação de C' e C", na frequência selecionada o como função da tensão aplicada para obter um valor de medição integrado; e (D) avaliar se a substância química está presente no meio transportador a partir do referido valor de medição integrado.
2. Método de detecção, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por no passo (A) a referida obtenção, por espectroscopia de impedância eletroquímica conduzida através de uma gama de potenciais aplicados, uma pluralidade de medidas da impedância complexa, compreende a obtenção de pelo menos cinco medidas da impedância complexa em diferentes potenciais aplicados.
3. Método de detecção, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pela referida avaliação no passo (D) ser realizada comparando o referido valor de medição integrado com um ou mais valores de referência obtidos executando os passos (A), (B) e (C) em condições onde o ambiente local do eletrodo é conhecido.
4. Método de detecção, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pela referida substância química ser uma espécie alvo à qual as referidas metades do receptor são capazes de se ligar especificamente, e em que o referido método é um método para determinar a concentração das referidas espécies alvo no referido meio transportador.
5. Método de detecção, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pela referida espécie alvo ser selecionada do grupo que consiste em proteína CRP, insulina e um marcador de uma ou mais neurodegeneração, câncer, infarto do miocárdio, diabetes e trauma geral.
6. Método de detecção, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pela referida substância química ser selecionada a partir de uma proteína de lectina, uma glicoenzima e um anticorpo de ligação de carboidratos, e em que as referidas metades do receptor são metades de carboidratos.
7. Método de detecção, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo referido eletrodo de trabalho fazer parte de uma glicana compreendendo uma pluralidade de eletrodos de trabalho que são cada um funcionalizados com diferentes partes de carboidrato.
8. Método de detecção, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pela referida substância ser um candidato a fármaco. E em que as referidas metades do receptor são metades que são capazes de se ligar a um fármaco de referência.
9. Método de detecção, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo referido eletrodo de trabalho formar parte de uma matriz que compreende uma pluralidade de eletrodos de trabalho que são cada um funcionalizado com as referidas metades do receptor, a referida matriz sendo apropriada para utilização na seleção simultânea de uma pluralidade de fármacos candidatos.
10. Método de detecção, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelos referidos elementos de detecção compreendem uma ou mais espécies redox ativas, uma película molecular, nanopartículas, grafeno, nanotubos de carbono ou pontos quânticos.
11. Método de detecção, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo referido eletrodo de trabalho não estar funcionalizado com uma espécie ativa redox.
12. Método de detecção, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelas referidas metades do receptor, que são capazes de se ligar à referida substância, compreenderem um anticorpo ou um fragmento de anticorpo.
13. Método de detecção, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelos referidos elementos de detecção compreenderem grafeno.
14. Método de detecção, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por ser um método de detecção de capacitância quântica.
15. Dispositivo para utilização num método de detecção para detecção de uma substância química, caracterizado por compreender: - um espectrômetro eletroquímico que compreende um eletrodo de trabalho, um contra eletrodo e um potenciostato, o referido eletrodo de trabalho compreendendo metades de receptor que são capazes de se ligar à referida substância química, em que o referido eletrodo de trabalho compreende um substrato do eletrodo funcionalizado com elementos de detecção cuja resposta eletroquímica a potenciais aplicados é sensível a ligação da referida substância química às referidas metades de receptor, os elementos de detecção tendo uma dimensão de 0,5 a 10 nm; - um receptor configurado para receber, a partir do referido espectrômetro eletroquímico, dados de entrada compreendendo uma pluralidade de medidas de impedância complexa, Z*, em uma gama de potenciais aplicados; e - um processador configurado para (i) converter a referida pluralidade de medidas de Z* em uma pluralidade de medidas do componente real da capacitância complexa, C’, numa frequência selecionada o e/ou no componente imaginário da capacitância complexa, C”, Em uma frequência selecionada o, e (ii) integrar as referidas medições de (a) C’, (b) C", ou (c) qualquer combinação de C' e C”, na frequência selecionada o como uma função de tensão aplicada para obter um valor de medição integrado.
16. Dispositivo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por compreender adicionalmente uma unidade de saída configurada para produzir dados de saída gerados a partir do referido valor de medição integrado.
17. Meio de armazenamento que armazena um código legível por computador para implementação por um computador ou rede de computadores, caracterizado por ser o código, quando implementado, faz com que o computador, ou rede de computadores, implemente as etapas de: - obter, a partir de um espectrômetro eletroquímico, dados de entrada compreendendo uma pluralidade de medidas de impedância complexa, Z*, em uma gama de potenciais aplicados; - converter a referida pluralidade de medidas de Z* em uma pluralidade de medidas do componente real da capacitância complexa, C’, numa frequência selecionada o e/ou o componente imaginário da capacitância complexa, C”, numa frequência selecionada o; e - integrar as referidas medições de (a) C’, (b) C”, ou (c) qualquer combinação de C' e C", na frequência selecionada o como função de tensão aplicada para obter um valor de medição integrado.
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