WO2023092210A1 - Método e dispositivo de amplificação de sinal transdutor para ensaios capacitivos - Google Patents

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WO2023092210A1 PCT/BR2022/050464 BR2022050464W WO2023092210A1 WO 2023092210 A1 WO2023092210 A1 WO 2023092210A1 BR 2022050464 W BR2022050464 W BR 2022050464W WO 2023092210 A1 WO2023092210 A1 WO 2023092210A1
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electrochemical
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Paulo Roberto BUENO
Laís Cristine LOPES
Beatriz Lucas GARROTE
Adriano DOS SANTOS
Yuliana Pérez SÁNCHEZ
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Universidade Estadual Paulista Julio De Mesquita Filho
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    • G01R27/26—Measuring inductance or capacitance; Measuring quality factor, e.g. by using the resonance method; Measuring loss factor; Measuring dielectric constants ; Measuring impedance or related variables

Definitions

  • This invention deals with a new method and device for amplifying the transducer signal, of an electrical or electrochemical nature, which are used for the development of sensors and/or biosensors for the detection/quantification of species of environmental and clinical interest, among others, that form an analyte.
  • the device is an interface containing a density of electrochemical states or of another nature modified with receptors such as antibodies, aptamers and enzymes, among others, which results in the amplification of the signal, in such a way that small changes in the environment external interface such as the receptor-analyte interaction, can be measured by varying the electrical/electrochemical properties of this interface in contact with an electroactive species in solution, offering analytical gains such as greater sensitivity and/or detection, resulting in a method of procedure of ultrasensitive signal transduction for the detection or quantification of analytes in trace amounts for different types of samples.
  • receptors such as antibodies, aptamers and enzymes, among others
  • the transducer signal amplification device and method for capacitive tests is intended for the field of electrochemistry and electronics molecular for the development of new sensors and biosensors for the detection and quantification of species of environmental and clinical interest, more specifically for molecular and clinical diagnosis of the label-free and point-of-care type.
  • the transducer signal amplification method and device for capacitive tests object of the present invention, aims to offer the relevant area of application an efficient and reliable method and device for the development of more sensitive and reliable sensors and biosensors for the detection and quantification of species of environmental and clinical interest, through an analyte and amplified transduction mechanism, thus offering analytical gains such as greater sensitivity and/or detection for various applications.
  • the (bio) sensors are devices composed of a surface containing a receptor species, which will recognize the analyte of interest through a transducer and a circuit for data processing.
  • the transducer is one of the most important components, as it makes it possible to transform the biological recognition signal into another measurable one, such as an electrical one, which can be used to detect or quantify the analyte.
  • electroactive species such as self - assembled monolayers of peptides or alkane thiols , polymers , quantum dots , nanoparticles , and / or materials that are intrinsically electroactive or that become electroactive by modifying it with an electroactive species covalently or physically bonded to the electrode material or directly to the electrode surface, which may be based on gold, carbon, among others.
  • This electroactive interface has density of states ( DOS ) that can be coupled to the electrode when a specific electric potential ( formal potential , for example ) is applied . Changes in the interface environment cause DOS variations, making DOS variation a sensitive and versatile transducer mechanism strategy for the development of label-free biosensors.
  • DOS density of states
  • the properties of the electroactive interface can be accessed by the technique of electrochemical impedance spectroscopy ( EIE ) , by other immittance functions such as modulus, capacitance, admittance and their mathematical relationships, or by, in general, alternating current (AC) techniques.
  • EIE electrochemical impedance spectroscopy
  • AC alternating current
  • DOS which is characterized by a finite or discrete amount of electronic levels in an energy range.
  • DOS can be measured using the technique of capacitance derived from electrochemical impedance spectroscopy (EIS), performing a potential sweep in a typical range of around the formal potential of the interface electroactive Figure 1b), maintaining a fixed frequency value. This frequency value is obtained from the semicircle diameter of the capacitive Nyquist diagram ( Figure 2b) , and predominantly corresponds to (capacitance electrochemistry) in the E in .
  • the present invention addresses a method and a device that uses the density of states of the electroactive interface susceptible to electronic coupling with the DOS of electroactive species in solution, which have formal potential (or Fermi level) equal to or similar to that interface , as a strategy for transducer signal amplification.
  • This situation represents a promising alternative to increase the sensitivity of mesoscopic and label-free electrochemical biosensors in a way that allows the identification/quantification of analytes in concentrations and traces through the amplification of the transducer signal using mainly AC or transient techniques.
  • One of the advantages of employing an AC technique, such as EIA and its derivations, is that they provide more detailed information on electronic dynamics and DOS distribution processes ( Figure 1b) than DC techniques. This information obtained from the AC techniques is important to propose a system electronically coupled and which allows the amplification of the transducer signal, raising the sensitivity by several orders of magnitude.
  • Patent document No. BR 11 2014 027490 8 A2 ( PCT No. GB2013051124 and WO No. 2013/164613 ) which deals with an electrochemical test method comprising comparing how the immittance functions and their components vary with a change on a parameter of interest in order to be able to select a specific value of one of them for use in a quantitative electrochemical test.
  • the document also includes a computer program and apparatus necessary for the analysis;
  • Patent document No. BR 11 2014 027489 4 A2 (PCT No. GB2013051121 and WO No. 2013/164611) deals with an electrode for use in the electrochemical detection of a target species, modified with non-electroactive molecular probes that are capable of selectively binding to the target species , maintaining the electron transfer resistance per area of the electrode between 10 and 95 Mohms cm -2 . Binding of the target species and the specific molecular probe is detected from the change in electron transfer resistance using a redox probe in solution (1.0 mM [Fe(CN) 6 ] 3/4 in PBST);
  • Patent document No. BR 11 2016 003004 4 Bl (PCT No. GB2014051938 and WO No. 2015/022483) deals with a capacitance spectroscopic method and the electrode for electrochemical detection of target species by capacitance spectroscopy.
  • the document comprises the modification of the electrode with electroactive molecular probes and the specific receptor of the target species; and the method for capacitance spectroscopy measurements in non-electroactive medium for the detection of target species;
  • Patent document No. BR 11 2017 014761 0 BI (PCT No. GB2016050162 and WO No. 2016/120606) deals with a detection method performed using an electrode functionalized with detection elements, and it is not essential that the electrode contains redox groups.
  • the capacitance of the modified electrode is characteristic and varies when detecting the target species.
  • the method involves performing electrochemical impedance spectroscopy at various potentials and then integrating the measurement data as a function of potential to obtain the electrode capacitance and quantify the variation generated by the interaction of the target species;
  • Patent document No. BR 11 2020 014894 6 A2 (PCT No. GB2019050183 and WO No.
  • Electrode suitable for use in the electrochemical detection of a target species comprises a peptide monolayer of defined length and to one end of which are attached a redox active species and a receptor which is capable of binding the target species.
  • An electrochemical method of detection of a target species is also provided , which involves the use of electrochemical impedance spectroscopy measurements in non - electroactive solutions ( ie , without redox probe in solution ) on the modified electrode ;
  • Patent document No. PI 0706054-8 A2 deals with an amplifier that includes a first device of variable capacitance of which the capacitance is variable , a second device of variable capacitance of which the capacitance is variable , electrically connected to the first variable capacitance device, and an inverse conductivity of the first variable capacitance device, and a first input unit for selectively inputting a bias voltage and a voltage signal to the first variable capacitance device and to the second variable capacitance device, where in the event that the bias voltage and voltage signal are entered for the first variable capacitance device and the second capacitance device variable, the capacitance of the first variable capacitance device and the second variable capacitance device is taken as a first value, and where the voltage signal is amplified with the capacitance of the first variable capacitance device and the second variable capacitance device as a second value less than the first value;
  • Patent document No. WO 2020070486A1 deals with a methodology for detecting the interaction event between an immobilized primary antibody and a biological complex formed by a target species linked to a secondary antibody labeled with an enzyme, using a technique of electrochemical measurement.
  • the methodology consists of a sandwich or label-based immunoassay for the detection of target species of interest, using a secondary antibody labeled with an enzyme that transforms the substrate into an insoluble precipitate.
  • the target species is detected by measuring the change in system impedance;
  • Patent document No. WO 2020120990A1 deals with the development of multiplexed microfluidic approach for label-based or sandwich immunoassays.
  • the methodology consists of using molecules that serve as anti-tags (ie molecules that recognize the marking of another molecule) immobilized on the sensor surface (a series of arrays) and modified recognition species (antibodies, aptamers, etc.) with the tag.
  • the recognition species binds to the biomarker, which is then targeted to the arrays. For each biomarker, a specific anti-tag is used;
  • Patent document No. WO 2021105696A1 deals with a methodology for detecting the presence or absence of a target species of chemical or biological nature in a sample.
  • the proposed methodology consists of an electrochemical cell containing the module of a first electrode and a second electrode, with an electronic component between both electrodes.
  • the second electrode is modified with a biological element that interacts with the target species when the sample is introduced into the electrochemical cell.
  • a secondary receptor biological element is used to detect the presence of the target species (i.e., sandwich immunoassay). The presence of the target species in the sample is confirmed if the potential variation between the first and second electrodes is greater than a cutoff value;
  • Figure 1 illustrates in (a) the representative scheme of the mechanism of resonant transfer of electrons caused by the coupling of the densities of interface states and electroactive species in solution, in the formal potential (E in ) .
  • E in formal potential
  • FIG. 1 illustrates in (a) the representative scheme of the mechanism of resonant transfer of electrons caused by the coupling of the densities of interface states and electroactive species in solution, in the formal potential (E in ) .
  • E in formal potential
  • Figure 2 illustrates (a) cyclic voltammetry, (b) capacitive Nyquist diagram of the electroactive monolayer of Pep-Fc SAM with and without FcA in solution (Pep-Fc SAM + 115 pM FcA and Pep-Fc SAM, respectively).
  • the continuous vertical line shows the potential used for measurements outside the electroactive window ⁇ E out ⁇ and the dashed line shows the formal potential used in EIE measurements (Ei n ) .
  • EIE measurements Ei n
  • Figure 3 illustrates in (a) capacitive Nyquist diagram of each stage of modification of the surface of the biosensor.
  • the experimental conditions are: measurement potential 0.365 V (vs AglAgCl, 3 M KC1) ( ⁇ ) , 10 AC, frequency range from 1 MHz to 0.1 Hz, in measurements of Pep-Fc SAM, Ab, blockade and blank 1 and 2.
  • the potential used was 0.1 V (vs AglAgCl, 3 M KC1) (E out ), 10 mV AC, frequency range from 1 MHz to 0.1 Hz.
  • FIG. 4 illustrates (a) analytical curve of the relative response variation (RR%) of 1/ ⁇ of the transducer containing Pep-Fc SAM with or without 115 pM FcA in solution (Pep-Fc SAM+ 115 pM FcA and Pep-Fc SAM, respectively) against pTaul81 protein concentrations (fg mlr 1 ) or successive incubations with undiluted commercial human serum without pTaul81 protein (Pep- Fc SAM+ 115 pM FcA 100% serum).
  • the inset in (a) shows magnification at low concentrations.
  • Figure 5 illustrates: a) Relative response, RR%, of the biosensor surface with Pep-Fc SAM (Pep-Fc SAM in orange) and of the biosensor surface with signal amplification technology using the FcA redox probe in solution (Pep-Fc SAM + 115 ⁇ M in blue) , both of which were when incubated with increasing concentrations of the NS1 analyte in the range of 0.01 to 10 6 pg mL -1 .
  • the present invention describes a transducer signal amplification methodology, of an electrical or electrochemical nature, which is of importance for the development of sensors and/or biosensors for the detection/quantification of species, that is, an analyte of environmental or clinical interest, among others.
  • a modified electrochemical interface with receptors such as antibodies, aptamers, enzymes, among others, is used, which presents a density of states (DOS), especially redox, which can electronically couple to the DOS associated with electroactive species, which have equivalent formal potential to that of the interface, which are appropriately added to the analyte measurement sample, which is the electrolyte measurement solution.
  • DOS density of states
  • the electrical or electrochemical properties of the interface such as capacitance, conductance, impedance, which can be measured by AC techniques, are modified due to the coupling of the two state densities, in order to amplify the transducer signal.
  • the detection/quantification of the analyte in this way, can be performed by varying the electrical/electrochemical properties of this interface in contact with an electroactive species in solution, making it possible to use this method as a signal transduction procedure ultrasensitive for detecting or quantification of analytes in trace amounts in different sample types.
  • the transducer signal amplification device for capacitive tests is a device with a methodology for electrochemical transducer signal amplification , such as capacitance , impedance , admittance or any other and related immittance function for qualitative or quantitative ultrasensitive detection of an analyte.
  • analyte is measured based on the coupling of the density of states ( DOS ) between an electroactive interface ( redox or not ) deposited on an electrode and the density of states ( DOS ) of an electroactive species in solution resulting in a sensor for detection / quantification cation of molecules of environmental or biological interest.
  • said interface consists of a modified electrode with molecular characteristics, deposited on the conductive substrate, with a thickness in the range of 0.2 to 5 nm, presenting mesoscopic characteristics
  • the mesoscopic material can be a conductor, semiconductor or insulator containing unidimensional materials (ID) or two-dimensional (2D) and is immersed in a supporting electrolyte containing an electroactive species with concentration and energy levels consistent with proper coupling between the densities of states and with formal potential close to or equal to the formal potential of the surface of the mesoscopic interface.
  • the Conducting Substrate can be gold, platinum, vitreous carbon, graphite, polymers such as polyaniline, polypyrrole and polythiophene, or other non-ferrous conductive materials and their alloys.
  • Mesoscopic surfaces of interest can be formed by molecular films containing electroactive species that are properly immobilized on the conducting electrode, they can be molecular structures such as alkanethiols or derivatives, peptides, aptamers, electroactive oligonucleotides or modified with electroactive groups, such as ferrocene and methylene blue, or any other species capable of forming electroactive self-assembled monolayers.
  • electroactive species such as alkanethiols or derivatives, peptides, aptamers, electroactive oligonucleotides or modified with electroactive groups, such as ferrocene and methylene blue, or any other species capable of forming electroactive self-assembled monolayers.
  • Semiconductors can be transition metal oxides (Ti, Cu, Zn, etc.) in one- or two-dimensional configuration, and similar alloys.
  • the one-dimensional materials can be single-walled and multi-walled carbon nanotubes, nanorods and nanowires, quantum dots, and materials with similar behavior.
  • the two-dimensional materials can be graphene and its derivatives, such as graphene oxide, reduced graphene oxide, graphene nanoribbons, crumpled-type graphene, hexagonal boron nitride, dichalcogenide transition metals, phosphorene, double hydroxide layers, family of monoelemental compounds, metal nitrides/carbides, oxides of the type perovskite, 2D polymers, and materials with similar properties.
  • graphene oxide such as graphene oxide, reduced graphene oxide, graphene nanoribbons, crumpled-type graphene, hexagonal boron nitride, dichalcogenide transition metals, phosphorene, double hydroxide layers, family of monoelemental compounds, metal nitrides/carbides, oxides of the type perovskite, 2D polymers, and materials with similar properties.
  • Transition metal oxides Ti, Cu, Zn, etc. in one- or two-dimensional configuration.
  • the support electrolyte may be composed of buffered aqueous solutions, biological samples such as: blood serum, blood plasma, urine, saliva, cerebrospinal fluid, among others, diluted or not, aqueous solutions containing organic solvents or only organic solvents;
  • the electroactive species can be species derived from ferrocene, ferrocene, metal ion complexes, electroactive organic molecules such as quinones, nitroxide radicals, radicals based on alkoxybenzene and radicals based on heterocyclyls, coordination compounds and organometallic complexes (Ru(bpy )3] (BF4)2, Rufacach, Cr(acac)3, [ Fe (phen) 3] 2+/3+ , among others with the same characteristics.
  • the electrode has ohmic contact (i.e., low electrical resistance contact, which allows the linear behavior of current versus voltage between circuits and different devices.
  • the electroactive interface is covalently or non-covalently modified with a receptor molecule such as aptamers, antibodies, antigens, antibody fragments, oligosaccharides, peptides, cells, bacteria, particles viruses, enzymes and proteins for application as biosensors.
  • a receptor molecule such as aptamers, antibodies, antigens, antibody fragments, oligosaccharides, peptides, cells, bacteria, particles viruses, enzymes and proteins for application as biosensors.
  • the analyte recognized by the receptor anchored in the electroactive interface can be composed of aptamers, antibodies, antigens, antibody fragments, oligosaccharides, peptides, cells, bacteria, viral particles, enzymes and proteins for application as biosensors.
  • transducer signal amplification method and device for capacitive tests must be performed by time-dependent and transient measurements, such as electrochemical impedance spectroscopy measurements, but not exclusively which allows the differentiation of changes in the electroactive interface in order to identify the analyte through signal transduction.
  • Electrochemical measurements may contain at least a single electrode modified with an electroactive interface.
  • the transducer signal amplification method for capacitive assays is a detection method by means of time-dependent and transient measurements for the sensing of an analyte, said method comprising a transduction mechanism with the steps of:
  • time-dependent and transient measurements are performed by techniques such as: square wave voltammetry (SWV), differential pulse voltammetry (DPV), impedance spectroscopy (electrical and electrochemical, EIS) are examples of this type of method (not continuous) .
  • SWV square wave voltammetry
  • DUV differential pulse voltammetry
  • impedance spectroscopy electrical and electrochemical, EIS
  • the transduction mechanism is based on the variation of the density of states (DOS) of the electroactive interface on the surface of the electrode coupled with the density of states (DOS) of the electroactive species in solution due to interaction receptor/analyte or electrode/analyte.
  • DOS density of states
  • These properties can be obtained by time-dependent and transient measurement techniques, that is, from measurements of electrical or electrochemical transfer functions, of which electrochemical impedance is a particular case. Through these techniques, it is possible to extract the values of complex capacitance (C*), complex impedance (Z*), complex conductance (G*), or any immittance function (Im*) and their obtained relations.
  • the immittance functions are complex functions (e.g., admittance, Y* , modulus, M* and capacitance, C*) that can be obtained from the results of complex impedance (Z*), calculated using relations mathematics. These complex functions contain imaginary and real components that can be applied as transduction signals to any (bio)sensing interface.
  • the present invention is a DOS coupling methodology between electroactive species present in an interface forming a modified electrode with DOS itself and coupled to DOS contained in the electrolyte or in the measurement sample (which may be added to the sample containing the analyte of interest ). in (bio)electrochemical sensors, as shown in Figure la.
  • the modification of the gold electrode was characterized by DC electrochemical measurements. and AC. (cyclic voltammetry and electrochemical impedance spectroscopy, respectively) using a three-electrode electrochemical cell, with the gold electrode as the working electrode, the AglAgCl electrode in 3 M KC1 as the reference electrode, and the platinum electrode as the counter electrode .
  • the electroactive monolayer of Pep-Fc SAM was formed by incubating the gold electrode in a solution containing 2 mM of Pep-Fc SAM for 16 hours at 24°C.
  • the immobilization of Pep-Fc SAM molecules on the gold electrode is a consequence of the interaction between gold and sulfur from the sulfhydryl groups (-SH) present in the cysteine residue at one end of the peptide.
  • tauphosphorylated protein 181 (pTaul81, analyte for Alzheimer's diagnosis) was chosen because it is present in low concentrations in clinical samples (1-80 pg/mL).
  • the electrodes were incubated in undiluted commercial human serum to assess the response of the analytical or nonspecific blank. Incubations were performed by immersing the modified electrode in these solutions for 30 min at room temperature. Subsequently, the electrodes were washed with phosphate buffer solution (12 mM, pH 7) , and characterized by EIE in the support electrolyte 20 mM TBACIO4 in acetonitrile/water (1/4, v/v) containing 115 pM FcA in solution. This step was repeated twice (Blank 1 and Blank 2 in Figure 3).
  • the proposed invention showed a detection limit of 12.4 ag/mL, demonstrating that the invention is a sensitive and versatile signal amplification tool to be applied in molecular diagnostics or other applications for detection of analytes present in low concentrations that are not possible to be identified by other techniques.
  • EXAMPLE 2
  • a second proof of concept of the present invention consisted of the development of a miniaturized biosensor surface based on a gold electrode with an area of 0.0225 cm 2 (0.15cm x 0.15cm) deposited on a silicon surface of dimensions 0.5 cm wide and 1 cm long, which was applied for the detection of the NS1 protein of the dengue virus.
  • Viral infections are a very serious health problem worldwide. Rapid and simple detection is the first tool needed to contain the spread of the virus, thus preventing a greater health crisis. To achieve this rapid detection, in the first moments of infection, biosensor methodologies need high sensitivity. Therefore, the signal amplification methodology presented here was applied for the detection of infections caused by the dengue virus, achieving a sensitivity 1000x greater than the biosensor surface without the signal amplification technology (Figure 5a).
  • the transducer signal amplification method and device for capacitive tests, object of the present invention, as described above, have a new and unique configuration and operation that give them great advantages in relation to the methods and devices currently used and found in the market for the same application.

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Abstract

Método e dispositivo para ampli ficação de sinal transdutor, de natureza elétrica ou eletroquímica, utili zados para o desenvolvimento de sensores e/ou biossensores para a detecção/quanti f icação de espécies de interesse ambiental e clínico, entre outros, que sej am um analito. 0 dispositivo é uma interface eletroquímica modi ficada com receptores como anticorpos, aptâmeros e enzimas, entre outros, resultando na ampli ficação de sinal, de forma que pequenas mudanças no ambiente externo da interface, como a interação receptor- analito, podem ser mensuradas, por meio da variação das propriedades elétricas/ eletroquímicas dessa interface em contato com uma espécie eletroativa em solução, oferendo ganhos analíticos como maior sensibilidade e/ou detecção devido ao acoplamento entres as densidades de estados da solução e da interface, resultando em método de procedimento de transdução de sinal ultrassensível para a detecção e/ou quanti ficação de analitos em quantidades traço para di ferentes tipos de amostras.

Description

MÉTODO E DISPOSITIVO DE AMPLIFICAÇÃO DE SINAL TRANSDUTOR PARA ENSAIOS CAPACITIVOS .
[ 001 ] Trata a presente invenção de um novo método e dispositivo para ampli ficação de sinal transdutor, de natureza elétrica ou eletroquimica , os quais são utili zados para o desenvolvimento de sensores e/ou biossensores para a detecção/quanti f icação de espécies de interesse ambiental e clinico , entre outros , que formam um analito . Onde o dispositivo trata-se de uma interface contendo uma densidade de estados eletroquimica ou de outra natureza modi ficada com receptores como anticorpos , aptâmeros e enzimas , entre outros , o qual resulta na ampli ficação de sinal , de tal forma que pequenas mudanças no ambiente externo da interface como a interação receptor-analito , podem ser mensuradas , por meio da variação das propriedades elétricas/eletroquimicas dessa interface em contato com uma espécie eletroativa em solução , oferendo ganhos analíticos como maior sensibilidade e/ou detecção , resultando em método de procedimento de transdução de sinal ultrassensivel para a detecção ou quanti ficação de analitos em quantidades traço para di ferentes tipos de amostras .
CAMPO DA INVENÇÃO
[ 002 ] O método e dispositivo de ampli ficação de sinal transdutor para ensaios capacitivos , obj eto da presente invenção , é destinado à área da eletroquimica e eletrônica molecular para o desenvolvimento de novos sensores e biosensores destinados à detecção e quantificação de espécies de interesse ambiental e clinico, mais especificamente ao diagnóstico molecular e clinico do tipo label-free e point-of-care .
OBJETIVO DA INVENÇÃO
[003] O método e dispositivo de amplificação de sinal transdutor para ensaios capacitivos, objeto da presenta invenção, tem por objetivo oferecer à área pertinente da aplicação um método e um dispositivo eficiente e confiável para o desenvolvimento de sensores e biosensores mais sensíveis e confiáveis para a detecção e quantificação de espécies de interesse ambiental e clinico, através de um analito e mecanismo de transdução amplificado, assim, oferendo ganhos analíticos como maior sensibilidade e/ou detecção para várias aplicações.
PROBLEMA A SER RESOLVIDO
[004] Os (bio) sensores são dispositivos compostos por uma superfície contendo uma espécie receptora, que reconhecerá o analito de interesse por meio de um transdutor e um circuito para o processamento dos dados. O transdutor é um dos componentes mais importantes, visto que ele possibilita transformar o sinal de reconhecimento biológico em outro mensurável, como o elétrico, podendo ser utilizado para detectar ou quantificar o analito. Existem diferentes tipos de transdutores , como o piezelétrico , óptico e térmico , mas os de natureza elétrica/eletroquimica oferecem maior sensibilidade e capacidade para portabilidade (point -of- care) para análise de amostras clinicas em aplicações médicas , bem como no monitoramento ambiental e em processos industriais .
[ 005 ] Entre os tipos de biossensores eletroquimicos , se destacam aqueles que contém uma espécie eletroativa como pode ser o caso de monocamadas automontadas de peptideos ou de alcanotióis , polímeros , quantum dots , nanoparticulas , e/ou materiais intrinsicamente eletroativos ou que se tornam eletroativos pela modi ficação do mesmo com uma espécie eletroativa ligada covalentemente ou fisicamente ao material de eletrodo ou diretamente à superfície do eletrodo , que pode ser a base de ouro , carbono , entre outros . Esta interface eletroativa possui densidade de estados ( DOS ) que pode ser acoplada ao eletrodo quando um determinado potencial elétrico (potencial formal , por exemplo ) é aplicado . Alterações no ambiente da interface causam variações na DOS , fazendo da variação desta uma estratégia de mecanismo transdutor que é sensível e versátil para o desenvolvimento de biossensores label - free .
[ 006 ] As propriedades da interface eletroativa podem ser acessadas pela técnica de espectroscopia de impedância eletroquimica (EIE ) , por outras funções de imitância como módulo, capacitância, admitância e suas relações matemáticas, ou por, de forma geral, técnicas de corrente alternada (A.C.) . 0 transporte e/ou a transferência de carga, ou dinâmica do elétron, produzido por uma perturbação A.C. em tais interfaces são mediados ou modulados pela DOS que é caracterizada por uma quantidade de niveis eletrônicos finitos ou discretos num intervalo de energia. A DOS pode ser mensurada por meio da técnica de capacitância derivada da espectroscopia de impedância eletroquimica (EIE) , fazendo-se uma varredura de potencial numa faixa de tipica de ao redor do potencial formal da interface
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eletroativa
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Figura 1b) , mantendo um valor de frequência fixo. Esse valor de frequência é obtido do diâmetro do semicírculo do diagrama de Nyquist capacitivo (Figura 2b) , e corresponde predominantemente à (capacitância
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eletroquimica) no Ein .
[007] A capacitância eletroquimica é consequência da
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combinação em série da capacitância geométrica ou eletrostática (Ce) , que depende da geometria do capacitor e da configuração das cargas na superfície do eletrodo (contribuição não-f aradaica) ; e da capacitância quântica , relacionada com a DOS (i.e. Cq = e2(DOS)) (contribuição
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faradaica) . Esta combinação é descrita como: (Equação 1) .
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[008] No caso em que o eletrodo é modificado com uma espécie eletroativa (interface eletroativa) , Ce »Cq, sendo a componente quântica a predominante na capacitância total (ÇJ (i.e. C^Cq = e2(DOS) ) . Portanto, como mencionado anteriormente, experimentalmente a DOS é acessado por C^.
[009] No entanto, apesar das vantagens desse tipo de biossensores , conhecidos como biossensores capacitivos, frente a outros biossensores eletroquimicos , em casos onde a concentração do analito é baixa (Figura 4b) e/ou a relação de tamanho analito/receptor não é adequada, essa abordagem apresenta falta de sensibilidade, impossibilitando o seu uso em determinadas aplicações.
[010] Para superar esse inconveniente, o uso de uma espécie eletroativa em solução, com caraterísticas eletroquimicas especificas (i.e., solubilidade e potencial formal) , possibilita aumentar a sensibilidade desde que haja um acoplamento de sua densidade de estados com aquela da interface eletroativa descrita anteriormente, visto que esse acoplamento altera as propriedades elétricas/eletroquimicas da interface eletroativa como a capacitância, condutância, impedância, etc. Assim, a DOS resultante deste acoplamento eletrônico é mais sensivel às mudanças no ambiente e permite sua aplicação no desenvolvimento de biossensores eletroquimicos baseados em interfaces eletroativas em aplicações onde uma maior sensibilidade é requerida. [Oil] Para que aconteça o acoplamento da DOS entre a espécie eletroativa em solução e a interface eletroativa, ambas estruturas devem ter o mesmo potencial, próximo do formal. Nestas condições, é observado um aumento na densidade de corrente (Figura 2a) , na
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(Figura 2b) e em outras propriedades eletroquimicas , em especial na DOS (Figura 1b) , que reflete numa amplificação da sensibilidade da interface eletrodo/solução à pequenas alterações do analito.
[012] A presente invenção aborda um método e um dispositivo que utiliza a densidade de estados da interface eletroativa susceptível ao acoplamento eletrônico com a DOS de espécies eletroativas em solução, que possuem potencial formal (ou nivel de Fermi) igual ou similar ao dessa interface, como estratégia para a amplificação de sinal transdutor. Essa situação representa uma alternativa promissora para aumentar a sensibilidade de biossensores eletroquimicos mesoscópicos e label- free de forma que possibilita a identif icação/quantif icação de analitos em concentrações e traços por meio da amplificação do sinal transdutor usando principalmente técnicas AC ou transientes. Uma das vantagens em empregar uma técnica AC, como a EIE e suas derivações, é que fornecem informação mais detalhada dos processos de dinâmica eletrônica e de distribuição da DOS (Figura 1b) do que as técnicas DC. Esta informação obtida a partir das técnicas AC é importante para propor um sistema eletronicamente acoplado e que permite à ampli ficação do sinal transdutor, elevando a sensibilidade por várias ordens de grandeza .
ESTADO DA TÉCNICA
[ 013 ] Existem alguns documentos de patente que descrevem métodos e dispositivos que descrevem métodos eletroquimicos , métodos espectroscópicos de capacitância, detecção de capacitação quântica e métodos de ampli ficação de sinal de capacitância, porém nenhum desses filtros documentos antecipa a invenção aqui . Dentre esses documentos podem-se destacar os seguintes :
[ 014 ] O documento de patente n° BR 11 2014 027490 8 A2 ( PCT n° GB2013051124 e WO n° 2013/ 164613 ) que trata de um método de teste eletroquimico compreendendo comparar como as funções de imitância e seus componentes variam com uma alteração em um parâmetro de interesse para poder selecionar um valor especi fico de uma delas para uso em um teste eletroquimico quantitativo . O documento também inclui um programa de computador e um aparelho necessários para a análise ;
[ 015 ] O documento de patente n° BR 11 2014 027489 4 A2 ( PCT n° GB2013051121 e WO n° 2013/ 164611 ) trata de um eletrodo para uso na detecção eletroquimica de uma espécie alvo , modi ficado com sondas moleculares não eletroativas que são capazes de se ligar seletivamente à espécie alvo , mantendo a resistência de transferência de elétrons por área do eletrodo entre 10 e 95 Mohms cm-2. A ligação da espécie alvo e a sonda molecular especifica é detectada a partir da variação na resistência de transferência de elétrons usando uma sonda redox em solução (1,0 mM [Fe(CN)6]3/4 em PBST) ;
[016] O documento de patente n° BR 11 2016 003004 4 Bl (PCT n° GB2014051938 e WO n° 2015/022483) trata de um método espectroscópico de capacitância e o eletrodo para a detecção eletroquimica das espécies alvo por espectroscopia de capacitância. O documento compreende a modificação do eletrodo com sondas moleculares eletroativas e o receptor especifico da espécie alvo; e o método para as medidas de espectroscopia de capacitância em meio não eletroativo para a detecção de espécies alvo;
[017] O documento de patente n° BR 11 2017 014761 0 BI (PCT n° GB2016050162 e WO n° 2016/120606) trata de um método de detecção realizado utilizando um eletrodo funcionalizado com elementos de detecção, sendo que não é essencial que o eletrodo contenha grupamentos redox. A capacitância do eletrodo modificado é característica e varia ao detectar a espécie alvo. O método envolve a realização de espectroscopia de impedância eletroquimica a vários potenciais e, em seguida, integrando os dados de medição em função do potencial, para obter a capacitância do eletrodo e quantificar a variação gerada pela interação da espécie alvo; [ 018 ] O documento de patente n° BR 11 2020 014894 6 A2 ( PCT n° GB2019050183 e WO n° 2019/ 145706 ) trata de um eletrodo adequado para uso na detecção eletroquímica de uma espécie alvo . O eletrodo compreende uma monocamada peptídica de comprimento definido e a uma extremidade da qual estão ligados uma espécie ativa redox e um receptor que é capaz de se ligar à espécie alvo . [ 008 ] Também é fornecido um método eletroquimico de detecção de uma espécie alvo , que envolve o uso de medidas de espectroscopia de impedância eletroquímica em soluções não eletroativas ( i . e . , sem sonda redox em solução ) no eletrodo modi ficado ;
[ 019 ] O documento de patente n° PI 0706054- 8 A2 trata de um ampli ficador que inclui um primeiro dispositivo de capacitância variável do qual a capacitância é variável , um segundo dispositivo de capacitância variável da qual a capacitância é variável , eletricamente conectado ao primeiro dispositivo de capacitância variável , e de uma condutividade inversa do primeiro dispositivo de capacitância variável , e um primeira unidade de entrada para, de forma seletiva, entrar uma voltagem de polari zação e um sinal de voltagem para o primeiro dispositivo de capacitância variável e para o segundo dispositivo de capacitância variável , onde no evento que a voltagem de polari zação e o sinal de voltagem são entrados para o primeiro dispositivo de capacitância variável e para o segundo dispositivo de capacitância variável, a capacitância do primeiro dispositivo de capacitância variável e do segundo dispositivo de capacitância variável é considerada com um primeiro valor, e onde o sinal de voltagem é amplificado com a capacitância do primeiro dispositivo de capacitância variável e do segundo dispositivo de capacitância variável conforme um segundo valor menor do que o primeiro valor;
[020] O documento de patente n° WO 2020070486A1 trata de uma metodologia para a detecção do evento de interação entre um anticorpo primário imobilizado e um complexo biológico formado por uma espécie alvo ligada a um anticorpo secundário marcado com uma enzima, usando uma técnica de medida eletroquimica . A metodologia consiste em um imunoensaio em formato sandwich ou com marcaje (i.e., label-based) para a detecção de espécies alvo de interesse, usando um anticorpo secundário marcado com uma enzima que transforma o substrato em um precipitado insolúvel. A espécie alvo é detectada medindo a variação na impedância do sistema;
[021] O documento de patente n° WO 2020120990A1 trata do desenvolvimento de abordagem microf luidica multiplexada para imunoensaios label-based ou em formato sandwich. A metodologia consiste em utilizar moléculas que servem como anti-tags (i.e. moléculas que reconhecem a marcação de outra molécula) imobilizados na superfície sensora (uma série de arranjos) e espécies de reconhecimento modificadas (anticorpos, aptâmeros, etc.) com o tag. As espécies de reconhecimento se ligam no biomarcador, que depois é direcionada aos arranjos. Para cada biomarcador, é utilizado um anti-tag especifico;
[022] O documento de patente n° WO 2021105696A1 trata de uma metodologia para a detecção da presença ou ausência de uma espécie alvo de natureza quimica ou biológica em uma amostra. A metodologia proposta consiste em uma célula eletroquimica contendo o módulo de um primeiro eletrodo e um segundo eletrodo, tendo um componente eletrônico entre ambos eletrodos. O segundo eletrodo é modificado com um elemento biológico que interage com a espécie alvo quando a amostra é introduzida na célula eletroquimica. Um elemento biológico receptor secundário é usado para detectar a presença da espécie alvo (i.e., imunoensaio em formato sandwich) . A presença da espécie alvo na amostra é confirmada se a variação de potencial entre o primeiro e o segundo eletrodo é maior do que um valor de corte;
[023] Assim, é fato que os documentos citados nos parágrafos acima, apesar de pertencerem a campo de aplicação correlato ora solicitado, não apresentam nenhuma das características do objeto aqui apresentado garantindo, especialmente no que se refere ao uso do acoplamento da densidade de estados (DOS) entre várias espécies eletroativas , imobilizadas na superfície sensora e/ou em solução, e que fornece uma amplificação do sinal transdutor de natureza elétrico ou eletroquimico, melhorando a sensibilidade em aplicações de biossensoriamento . Assim, o objeto aqui relatado atende aos requisitos legais de patenteabilidade .
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[024] A seguir faz-se referência às Figuras que acompanham este relatório descritivo, para melhor entendimento e ilustração do mesmo, onde se vê:
[025] A Figura 1 ilustra em (a) o esquema representativo do mecanismo de transferência ressonante de elétrons causada pelo acoplamento das densidades de estados da interface e das espécies eletroativas em solução, no potencial formal (Ein) . Em (b) a distribuição de densidade de estados em função da energia para ambas condições: em rosa, corresponde à interface em contato com eletrólito de suporte contendo FcA, enquanto em verde, o FcA está ausente. As áreas sombreadas são relativas à densidade de estados;
[026] A Figura 2 ilustra em (a) voltametria ciclica, (b) diagrama de Nyquist capacitivo da monocamada eletroativa de Pep-Fc SAM com e sem FcA em solução (Pep-Fc SAM + 115 pM FcA e Pep-Fc SAM, respectivamente) . Em (a) a linha vertical continua mostra o potencial usado para as medidas fora da janela eletroativa {Eout} e a linha tracejada mostra o potencial formal usado nas medidas de EIE (Ein) . Em (b) , é mostrado como o valor de pode ser estimado (diâmetro do semicírculo) . Onde as condições experimentais são: Voltametria cíclica: velocidade de varredura de 100 mV/s, faixa de potencial de 0,0 V a 0,7 V (vs AglAgCl, 3 M KC1) . EIE: potencial D.C. em 0,365 V (Vs AglAgCl, 3 M KC1) , 10 mV de perturbação A.C. Faixa de frequências de 1 MHz - 0,1 Hz. Eletrólito de suporte 20 mM TBACIO4 em solução de acetonitrila/água (1/4, v/v) contendo (em preto) ou não (em vermelho) 115 pM FcA em solução;
[027] A Figura 3 ilustra em (a) diagrama de Nyquist capacitivo de cada etapa de modificação da superfície do biossensor. Onde as condições experimentais são: potencial de medida 0,365 V (vs AglAgCl, 3 M KC1) (í^) , 10 A.C., faixa de frequências de 1 MHz a 0,1 Hz, nas medidas de Pep- Fc SAM, Ab, bloqueio e branco 1 e 2. Para Pep-Fc SAM Eout, o potencial utilizado foi de 0,1 V (vs AglAgCl, 3 M KC1) (Eout) , 10 mV A.C., faixa de frequências de 1 MHz a 0,1 Hz. O eletrólito de suporte foi 20 mM TBACIO4 em solução de acetonitrila/água (1/4, v/v) contendo 115 pM FcA em solução; [028] A Figura 4 ilustra em (a) curva analítica da variação da resposta relativa (RR%) de 1/Ç do transdutor contendo Pep-Fc SAM com ou sem 115 pM FcA em solução (Pep-Fc SAM+ 115 pM FcA e Pep-Fc SAM, respectivamente) frente as concentrações de proteína pTaul81 (fg mlr1) ou sucessivas incubações com soro comercial humano não diluído sem proteína pTaul81 (Pep- Fc SAM+ 115 pM FcA 100% soro) . 0 inset em (a) mostra a ampliação a baixas concentrações. Em (b) região linear da curva analítica da variação da resposta relativa (RR%) do transdutor contendo Pep-Fc SAM com 115 pM FcA em solução (Pep-Fc SAM + 115 pM) frente as concentrações de proteina pTaul81 (fg mL-1) .
[029] A Figura 5 ilustra: a) Resposta relativa, RR%, da superfície biossensora com Pep-Fc SAM (Pep-Fc SAM em laranja) e da superfície biossensora com a tecnologia de amplificação de sinal usando a sonda redox FcA em solução (Pep-Fc SAM + 115 μM em azul) , sendo que ambas foram quando incubadas com concentrações crescentes do analito NS1 no intervalo de 0,01 à 106 pg mL-1. b) Regressão linear do intervalo de menores concentrações de NS1 (0.01 a 103 pg mL-1) comparando a diferença na resposta relativa da superfície biossensora com e sem a tecnologia de amplificação de sinal (Pep-Fc SAM+ 115 pM FcA e Pep-Fc SAM, respectivamente) . Ambas superficies biossensoras foram preparadas em eletrodos miniaturizados de ouro .
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
[030] A presente invenção descreve uma metodologia de amplificação de sinal transdutor, de natureza elétrica ou eletroquimica, que é de importância para o desenvolvimento de sensores e/ou biossensores para a detecção/quantif icação de espécies, ou seja, um analito de interesse ambiental, clinico, entre outros. Nessa metodologia é utilizada uma interface eletroquimica modificada com receptores como anticorpos, aptâmeros, enzimas, entre outros, que apresenta uma densidade de estados (DOS) , especialmente redox, que pode se acoplar eletronicamente à DOS associada a espécies eletroativas , que possuem potencial formal equivalente ao da interface, que são apropriadamente adicionadas na amostra de medida do analito, que é solução eletrolitica de medida. Nestas condições, as propriedades elétricas ou eletroquimicas da interface, tais como a capacitância, a condutância, a impedância, que podem ser medidas por técnicas AC, são modificadas devido ao acoplamento das duas densidades de estados, de forma a amplificar o sinal transdutor.
[031] Devido à amplificação do sinal, pequenas mudanças no ambiente externo da interface, como a interação receptor- analito, não antes observadas por mecanismo de transdução sem amplificação, podem ser agora mensuradas, oferendo ganhos analíticos como maior sensibilidade e/ou detecção.
[032] Portanto, a detecção/quantif icação do analito, desta forma, pode ser realizada por meio da variação das propriedades elétricas/eletroquimicas dessa interface em contato com uma espécie eletroativa em solução, sendo possível utilizar esse método como procedimento de transdução de sinal ultrassensivel para a detecção ou quanti ficação de analitos em quantidades traço em di ferentes tipos de amostra .
[ 033 ] O dispositivo de ampli ficação de sinal transdutor para ensaios capacitivos , obj eto da presente invenção , trata-se de um dispositivo com uma metodologia para ampli ficação de sinal transdutor eletroquimico , tais como a capacitância, a impedância, a admitância ou qualquer função de imitância e a ela relacionada , para detecção ultrassensivel qualitativa ou quantitativa de um analito . Onde dito analito é mensurado baseado no acoplamento da densidade de estados ( DOS ) entre uma interface eletroativa ( redox ou não ) depositada sobre um eletrodo e a densidade de estados (DOS ) de uma espécie eletroativa em solução resultando um sensor para detecção/quanti f icação de moléculas de interesse ambiental ou biológico . Onde dita interface consiste num eletrodo modi ficado com características moleculares , depositado sobre o substrato condutor , com espessura no intervalo de 0 , 2 a 5 nm, apresentando características mesoscópicas , e onde o material mesoscópico pode ser um condutor, semicondutor ou isolante contendo materiais unidimensionais ( ID) ou bidimensionais ( 2D) e está imerso em um eletrólito de suporte contendo uma espécie eletroativa com concentração e niveis de energia condi zente com o acoplamento adequado entre as densidades de estados e com potencial formal próximo ou igual ao potencial formal da superfície da interface mesoscópica . [034] O Substrato Condutor pode ser ouro, platina, carbono vítreo, grafite, polímeros como a polianilina, o polipirrol e o politiofeno, ou outros materiais condutores não ferrosos e suas ligas.
[035] Superfícies mesoscópicas de interesse podem ser formadas por filmes molecular contendo espécies eletroativas que são adequadamente imobilizadas sobre o eletrodo condutor, podem ser estruturas moleculares tais como alcanotióis ou derivados, peptídeos, aptâmeros, oligonucleotídeos eletroativos ou modificados com grupos eletroativos , como o ferrocene e o azul de metileno, ou ainda qualquer outra espécie capaz de formar monocamada automontadas eletroativas.
[036] Os semicondutores podem ser óxidos de metais de transição (Ti, Cu, Zn, etc) em configuração uni ou bidimensionais, e ligas semelhantes.
[037] Os materiais unidimensionais podem ser nanotubos de carbono de parede simples e múltiplas, nanorods e nanofios, quantum dots, e matérias de comportamento similares.
[038] Os materiais bidimensionais podem ser grafeno e seus derivados, como óxido de grafeno, óxido de grafeno reduzido, nanofitas de grafeno, grafeno tipo crumpled, nitreto de boro hexagonal, metais de transição dicalcogenetos , fosforeno, camadas de hidróxidos duplos, família de compostos monoelementais , nitretos/carbonetos de metal, óxidos do tipo perovskita, polímeros 2D, e materiais com propriedades semelhantes .
[039] Os óxidos de metais de transição (Ti, Cu, Zn, etc) em configuração uni ou bidimensionais.
[040] O eletrólito de suporte pode ser composto de soluções aquosas tamponadas, amostras biológicas como: soro sanguíneo, plasma sanguíneo, urina, saliva, fluido cerebrospinal, ente outras, diluídas ou não, soluções aquosas contendo solventes orgânicos ou apenas solventes orgânicos ;
[041] A espécie eletroativa pode ser espécies derivadas de ferrocene, ferrocene, complexos de ions metálicos, moléculas orgânicas eletroativas como quinonas, radicais nitróxido, radicais baseados em alcoxibenzeno e radicais baseados em heterocí clices , compostos de coordenação e complexos organometálicos (Ru(bpy)3] (BF4)2, Rufacach, Cr(acac)3, [ Fe (phen) 3] 2+/3+, ente outras com as mesmas características.
[042] O eletrodo apresenta contato ôhmico (i.e., contato de baixa resistência elétrica, que possibilita o comportamento linear de corrente versus voltagem entre circuitos e diferentes dispositivos.
[043] A interface eletroativa é modificada covalentemente ou não-covalentemente com uma molécula receptora tais como aptâmeros, anticorpos, antígenos, fragmentos de anticorpos, oligossacarídeos , peptídeos, células, bactérias, partículas virais, enzimas e proteinas para aplicação como biossensores .
[044] O analito reconhecido pelo receptor ancorado na interface eletroativa pode ser composto por aptâmeros, anticorpos, antigenos, fragmentos de anticorpos, oligossacarideos , peptideos, células, bactérias, partículas virais, enzimas e proteinas para aplicação como biossensores .
[045] O uso do método e dispositivo de amplificação de sinal transdutor para ensaios capacitivos, objeto da presente invenção, deve ser realizado por medidas dependentes do tempo e transientes, como medidas de espectroscopia de impedância eletroquimica, mas não exclusivamente o que permite a diferenciação de mudanças na interface eletroativa com a finalidade de identificação do analito por meio da transdução do sinal. As medidas eletroquimicas podem conter no minimo um único eletrodo modificado com a interface eletroativa.
[046] O método de amplificação de sinal transdutor para ensaios capacitivos, objeto da presenta invenção, trata-se de um método de detecção por medidas dependentes do tempo e transientes para o sensoriamento de um analito, dito método compreendendo um mecanismo de transdução com as etapas de:
(a) realização do contato do eletrodo modificado com materiais mesoscópicos e eletroativos com o eletrólito de suporte a espécie eletroativa, que pode conter ou não o analito de interesse, com a interface eletroativa;
(b) obtenção de uma ou mais medidas eletroquimicas da interface eletroativa; e
(c) determinação por medidas eletroquimicas se o analito está presente no meio.
[047] Onde as medidas dependentes do tempo e transientes, são realizadas por técnicas como: a voltametria de onda quadrada (SWV) , voltametria de pulso diferencial (DPV) , a espectroscopia de impedância (elétrica e eletroquimica, EIE) são exemplos deste tipo de método (não continuo) . No caso da EIE, também envolve suas derivações tais como a espectroscopia de capacitância eletroquimica, bem como outras funções de imitância eletroquimica.
[048] O mecanismo de transdução é baseado na variação da densidade de estados (DOS) da interface eletroativa na superfície do eletrodo acoplada com a densidade de estados (DOS) da espécie eletroativa em solução devido a interação receptor/analito ou eletrodo/analito . Essas propriedades podem ser obtidas pelas técnicas de medidas dependentes do tempo e transientes, ou seja, a partir de medidas de funções de transferência elétrica ou eletroquimica, da qual a impedância eletroquimica é um caso particular. Por meio dessas técnicas, é possivel extrair os valores de capacitância complexa (C*) , impedância complexa (Z*) , condutância complexa (G*) , ou qualquer função de imitância ( Im* ) e suas relações obtidas.
[049] As funções de imitância são funções complexas (e.g., admitância, Y* , módulo, M* e capaci tância, C*) que podem ser obtidas a partir dos resultados de impedância complexa (Z*) , calculadas por meio de relações matemáticas. Essas funções complexas contêm componentes imaginários e reais que podem ser aplicados como sinais de transdução para qualquer interface (bio ) sensora .
DESCRIÇÃO DETALHADA E FORMA DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO
[050] A presente invenção é uma metodologia de acoplamento da DOS entre espécies eletroativas presentes numa interface formando um eletrodo modificado com DOS própria e acoplada a DOS contida no eletrólito ou na amostra de medidas (podendo essa ser adicionada a amostra contendo o analito de interesse) , sendo que a DOS própria pode ser a de um condutor, semicondutor ou isolante, sendo que a DOS da solução é principalmente (mas não somente) eletroquimica a base de par redox, constituindo-se a presente invenção como metodologia de amplificação de sinal em (bio) sensores eletroquimicos , como mostrado na Figura la.
[051] Como prova de conceito, foi usado um eletrodo de ouro comercial (Metrohm) como substrato e o qual foi modificado com uma monocamada eletroativa de peptideo contendo ferrocene (Pep-Fc SAM) como componente eletroativo, e ferroceno modificado com ácido carboxilico (FcA) em solução como componente DOS da solução eletrolitica . Esse acoplamento entre as densidades de estados do Pep-Fc SAM e do FcA em solução permite a transferência eletrônica ressonante entre a interface contento Pep-Fc SAM e as espécies eletroativas do FcA em solução, como é mostrado esquematicamente na Figura la. Além disso, esse acoplamento eletrônico entre as DOS permite acessar à densidade de estados das espécies eletroativas em solução por meio da
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do Pep-Fc SAM, que é diretamente inferida a partir de medidas de EIE, resultando no aumento da densidade de estados e sua variação sensível ao análito como mostrado pela Figura 1b.
[052] A modificação do eletrodo de ouro foi caracterizada por medidas eletroquimicas DC. e AC. (voltametria ciclica e espectroscopia de impedância eletroquimica, respectivamente) usando uma célula eletroquimica de três eletrodos, sendo o eletrodo de ouro o eletrodo de trabalho, o eletrodo de AglAgCl em 3 M KC1 o eletrodo de referência, e o eletrodo de platina como contra eletrodo.
[053] As medidas foram realizadas em um potenciostato portátil com um analisador de resposta em frequência. O eletrólito de suporte utilizado foi 20 mM de perclorato de tetrabutilamonio (TBACIO4) em uma solução de acetonitrila/água (1/4, v/v) contendo 115 pM de FcA em solução. As medidas eletroquimicas feitas nesse eletrólito de suporte foram comparadas às obtidas no eletrólito de suporte sem FcA em solução (Figura 2) .
[054] A monocamada eletroativa de Pep-Fc SAM foi formada incubando o eletrodo de ouro numa solução contendo 2 mM de Pep-Fc SAM durante 16 horas a 24°C. A imobilização das moléculas de Pep-Fc SAM no eletrodo de ouro é consequência da interação entre o ouro e o enxofre proveniente dos grupos sulfidrila (-SH) presente no residuo de cisteina em uma das extremidades do peptideo. A caracterização da monocamada por VC e EIE (no potencial formal, Ein, obtido na medida de VC linha vertical tracejada Figura 2a) mostrou um aumento de 40% e 30% da densidade de corrente (j) dos picos de oxidação e redução, respectivamente, e um aumento de 25% da capacitância eletroquimica (Cμ , quando as medidas eletroquimicas foram realizadas com 115 μM de FcA em solução quando comparado com a ausência do FcA no eletrólito de suporte (Figura 2) .
[055] Este aumento dos valores de j e Cμ, ou amplificação do sinal eletroquimico, é devido ao acoplamento do DOS entre o FcA e a interface eletroativa (Pep-Fc SAM) que causa um aumento da transferência de carga e armazenamento de energia na interface do eletrodo, conforme representado na Figura 1. [056] A caracterização da formação da monocamada por EIE também foi realizada em um potencial fora da janela eletroativa (Eout, linha vertical continua na Figura 2a e Figura 3 inset) mostrando que o valor de
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no Ein da monocamada Pep-Fc SAM contendo FcA em solução foi mais de 60 vezes maior que o valor de
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no Eout . Dessa forma, demonstra- se que a
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medida no Ein é resultado da atividade faradaica da espécie eletroativa ancorada na superfície do eletrodo e do acoplamento da mesma com a DOS das espécies eletroativas em solução.
EXEMPLO 1
[057] Como prova de conceito, a proteina taufosforilada 181, (pTaul81, analito para diagnóstico de Alzheimer) foi escolhida por estar presente em baixas concentrações em amostras clinicas (1-80 pg/mL) .
[058] Primeiramente, seu receptor especifico (anticorpo, Ab, anti-pTaul 81 ) foi imobilizado covalentemente às moléculas de Pep-Fc SAM por meio da reação carbodiimida/hidroxisuccinimida (0,4 M EDC e 0,1 M NHS [1:1] (v/v) durante 30 min) . Em seguida, o anti-pTaul81 na concentração de 0,01 μM preparado em tampão fosfato (PB) pH 7,4 foi incubado por 1 h em temperatura ambiente (24°C) . Posteriormente, a superfície foi bloqueada incubando o eletrodo por 30 min a temperatura ambiente (24°C) em solução de bloqueio ( Superblock™, ThermoFísher) . Após cada modificação, as variações de
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(e consequentemente, da DOS) foram acessadas por medidas de EIE no eletrólito de suporte 20 mM TBACIO4 em acetonitrila/água (1/4, v/v) contendo 115 pM de FcA em solução (Figura 3) .
[059] Em seguida, os eletrodos foram incubados em soro comercial humano não diluido para avaliar a resposta do branco analítico ou inespecif ica . As incubações foram realizadas por meio da imersão do eletrodo modificado nessas soluções por 30 min em temperatura ambiente. Posteriormente, os eletrodos foram lavados com solução tampão fosfato (12 mM, pH 7) , e caracterizados por EIE no eletrólito de suporte 20 mM TBACIO4 em acetonitrila/água (1/4, v/v) contendo 115 pM de FcA em solução. Essa etapa foi repetida duas vezes (Branco 1 e Branco 2 em Figura 3) .
[060] Após as medidas em apenas soro, foram feitas as incubações e medidas das amostras contendo o analito pTaul81. As concentrações de proteina pTaul81 usadas foram 1; 5; 10; 50; 100; 500; 1000; 2000; 4000; 16000; 64000; 128000; e 256000 fg/mL, todas preparadas em soro humano comercial não diluido. As amostras foram incubadas 30 min em temperatura ambiente (24 °C) .
[061] A interação entre o anticorpo anti-pTaul81 e o analito pTaul81 foi caracterizada por EIE no eletrólito de suporte 20 mM TBACIO4 em acetonitrila/água (1/4, v/v) contendo 115 pM de FcA em solução. Esse processo de incubação e caracterização foi repetido para cada amostra de pTaul81, começando pela menor até a maior concentração. A variação de Cμ foi quantificada pela variação da resposta relativa em porcentagem (RR%) do inverso de
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(1/Cμ de cada concentração de proteína comparada com os valores das medidas de
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branco seguindo a equação:
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(Equação 2)
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[062] Para comparar o efeito de amplificação de sinal na detecção da proteína pTaul81 pelo acoplamento do DOS da espécie eletroativa em solução (FcA) e da molécula eletroativa imobilizada no eletrodo (Fc) , a interação entre o anticorpo anti-pTaul81 e o analito pTaul81 na faixa de resposta linear foi caracterizada no eletrólito de suporte 20 mM TBACIO4 em acetonitrila/água (1/4, v/v) sem adição de FcA em solução (Figura 4a) . Assim, foi observado um aumento entre 30 e 400 vezes (comparado com as concentrações 1000 e 256000 fg/mL, respectivamente) da sensibilidade ou resposta analítica do biossensor. A variação de 1/Cμ apresentou um comportamento linear na faixa de concentração de 1000-256000 fg/mL (Figura 4b) .
[063] Assim, como pode ser notado a invenção proposta mostrou um limite de detecção de 12,4 ag/mL, demostrando que a invenção é uma ferramenta de amplificação de sinal sensível e versátil para ser aplicada em diagnóstico molecular ou outras aplicações para detecção de analitos presentes em baixas concentrações que não são possíveis de serem identificados por outras técnicas. EXEMPLO 2
[064] Uma segunda prova de conceito da presente invenção, consistiu no desenvolvimento de uma superfície biossensora miniaturizada baseada em um eletrodo de ouro de área 0,0225 cm2 (0,15cm x 0,15cm) depositado em uma superfície de silício de dimensões 0,5 cm de largura e 1 cm de comprimento, a qual foi aplicada para a detecção da proteína NS1 do vírus da dengue .
[065] As infecções virais constituem um problema sanitário muito grave a nível mundial. A detecção rápida e simples é a primeira ferramenta necessária para conter a propagação do vírus, evitando assim, uma crise sanitária maior. Para conseguir essa detecção rápida, nos primeiros momentos da infecção, as metodologias biossensoras precisam de uma elevada sensibilidade. Por isso, a metodologia de amplificação de sinal aqui apresentada foi aplicada para a detecção de infecções causadas pelo vírus da dengue, alcançando uma sensibilidade lOOOx maior do que a superfície biosenssora sem a tecnologia de amplificação de sinal (Figura 5a) .
[066] O protocolo seguido para a obtenção da superfície biossensora foi similar ao descrito na prova de conceito com a proteína pTaul81, onde o eletrodo de ouro foi modificado com uma monocamada eletroativa de peptideo contendo ferroceno (Pep-Fc SAM) e à amplificação do sinal foi realizada pelo acoplamento do DOS do ferrocene da monocamada e 115 μM de FcA em solução (Figura la) . 0 receptor especifico para a proteína NS1 foi o anticorpo (Ab) anti-NSl e foi ancorado nas moléculas da Pep-Fc SAM. Posteriormente, a superfície foi bloqueada com a solução de bloqueio ( Superblock™, ThermoFisher) .
[067] Após a preparação da superfície biossensora e a medição das medidas de branco com soro humano comercial sem o analito, os biossensores foram incubados em amostras contendo o analito NS1 em um intervalo de concentrações de 0,01 à 106 pg mL-1 preparadas em soro humano comercial não diluido (Figura 5a) . As amostras foram incubadas 30 min em temperatura ambiente (24 °C) . Novamente, a interação entre o Ab-NSl e o analito NS1 foi caracterizada por EIE no eletrólito de suporte 20 mM TBACIO4 em acetonitrila/água (1/4, v/v) contendo 115 μM de FcA em solução (ver dados Pep- Fc SAM + FcA em azul em Figura 5) ou sem adição de FcA em solução (ver dados Pep-Fc SAM em laranja em Figura 5) .
[068] A superfície biossensora sem amplificação de sinal mostrou uma resposta linear no intervalo de concentrações de 103 à 106 pg mL-1 com R2 = 0.965 (Figura 5a) , enquanto que a superfície biossensora com a tecnologia de amplificação de sinal mostrou duas respostas lineares: i) no intervalo de menores concentrações 0.01 à 103 pg mL-1 (R2 = 0.99) , onde o biossensor sem amplificação de sinal não tem resposta especifica (Figura 5b) ; e ii) no intervalo de maiores concentrações 5 x 104 à 106 pg mL-1 (Figura 5a) .
[069] Desta forma, foi observado que a menor concentração detectada com a tecnologia de amplificação de sinal foi 20 mil vezes menor do que a menor concentração detectada no biossensor sem amplificação de sinal (Figura 5) , demostrando que a tecnologia de amplificação apresentada nesta invenção constitui-se como uma ferramenta muito útil na aplicação de diagnóstico molecular.
[070] Portanto, o método e dispositivo de amplificação de sinal transdutor para ensaios capacitivos, objeto da presenta invenção, conforme descritos acima, apresentam configuração e funcionamento novos e únicos que lhes configuram grandes vantagens em relação aos métodos e dispositivos atualmente utilizados e encontrados no mercado para a mesma aplicação. Dentre essas vantagens podem-se citar: a possibilidade de detecção de analitos presentes em baixas concentrações que não são possíveis de serem identificados por outras técnicas e versatilidade de aplicação .
[071] Assim, pelas características de configuração e funcionamento, acima descritas, pode-se notar claramente que o MÉTODO E DISPOSITIVO DE AMPLI FICAÇÃO DE SINAL TRANSDUTOR PARA ENSAIOS CAPACITIVOS, trata-se de um dispositivo novo para o Estado da Técnica o qual reveste-se de condições de inovação, atividade inventiva e industrialização inéditas, que o fazem merecer o Privilégio de Patente de Invenção.

Claims

REIVINDICAÇÕES
1 - MÉTODO DE AMPLIFICAÇÃO DE S INAL TRANSDUTOR PARA ENSAIOS CAPACITIVOS , caracterizado por tratar-se de um método de detecção por medidas dependentes do tempo e transientes para o sensoriamento de um analito , dito método compreendendo um mecanismo de transdução com as etapas de :
( a ) reali zação do contato do eletrodo modi ficado e contendo uma densidade de estados eletrônicos ou eletroquimico com o eletrólito de suporte à espécie eletroativa, que pode conter ou não o analito de interesse ;
(b ) obtenção de uma ou mais medidas eletroquimicas dessa interface em presença da solução contendo espécies eletroativas com a densidade de estados acoplado à densidade de estados do eletrodo modi ficado ;
( c ) determinação por medidas eletroquimicas se o analito está presente no meio ; onde as medidas dependentes do tempo e transientes , são reali zadas por técnicas como : a voltametria de onda quadrada ( SWV) , voltametria de pulso di ferencial ( DPV) , a espectroscopia de impedância ( elétrica e eletroquimica, EIE ) , bem como outras funções de imitância eletroquimica .
2 - MÉTODO de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado por o mecanismo de transdução ser baseado na variação da densidade de estados ( DOS ) de uma interface eletroativa depositada na superfície do eletrodo acoplada com a densidade de estados ( DOS ) da espécie eletroativa em solução devido a interação receptor/analito ou eletrodo/analito .
3 - DISPOS ITIVO DE AMPLI FICAÇÃO DE S INAL TRANSDUTOR PARA ENSAIOS CAPACITIVOS , caracterizado por tratar-se de um dispositivo com uma metodologia para ampli ficação de sinal transdutor eletroquimico , para detecção ultrassensivel qualitativa ou quantitativa de um analito ; onde a detecção de dito analito está baseado no acoplamento da dens idade de estados ( DOS ) entre uma interface eletroativa depositada sobre um eletrodo e a densidade de estados ( DOS ) de uma espécie eletroativa em solução resultando em um sensor para detecção/quanti f icação de moléculas de interesse ambiental ou biológico ; onde dita interface consiste num material de eletrodo com características mesoscópicas (unidimensionais ou bidimensionais ) modi ficado covalentemente ou não- covalentemente com uma molécula receptora com características moleculares , depositado sobre o substrato condutor modi ficado com material cuj as características mesoscópicas é caracteri zada por uma espessura no intervalo de 0 , 2 a 5 nm, apresentando características fortemente quânticas , e onde o material de modi ficação do eletrodo ( com características mesoscópicas ) apresenta contato ôhmico e pode ser de natureza elétrica condutora, semicondutora ou isolante contendo materiais unidimensionais ( ID) ou bidimensionais ( 2D) e está imerso em um eletrólito de suporte contendo uma espécie eletroativa com concentração condizente com o acoplamento adequado entre as densidades de estados e com potencial formal próximo ou igual ao potencial formal da superfície da interface.
4 - DISPOSITIVO de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o Eletrodo poder ser ouro, platina, carbono vitreo, grafite, polímeros como a polianilina, o polipirrol e o politiofeno, ou outros materiais condutores não ferrosos e suas ligas.
5 - DISPOSITIVO de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por as Espécies eletroativas de natureza mesoscópicas imobilizadas no eletrodo condutor poder ser materiais moleculares tais como alcanotióis ou derivados, peptideos, aptâmeros, oligonucleotideos eletroativos ou modificados com grupos eletroativos, como o ferrocene e o azul de metileno, ou ainda qualquer outra espécie capaz de formar monocamada automontadas eletroativas.
6 - DISPOSITIVO de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por os Semicondutores serem óxidos de metais de transição (Ti, Cu, Zn, etc) em configuração uni ou bidimensionais, e ligas semelhantes e/ou semicondutores orgânicos de qualquer natureza.
7 - DISPOSITIVO de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por os Materiais unidimensionais serem nanotubos de carbono de parede simples e múltiplas, nanorods e nanofios, quantum dots (orgânicos e inorgânicos) , e matérias de comportamento similares.
8 - DISPOSITIVO de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por os Materiais bidimensionais serem grafeno e seus derivados, como (óxido de grafeno, óxido de grafeno reduzido, nanofitas de grafeno, grafeno tipo crumpled, nitreto de boro hexagonal, metais de transição dicalcogenetos , fosforeno, camadas de hidróxidos duplos, familia de compostos monoelementais , nitretos/carbonetos de metal, óxidos do tipo perovskita, polímeros 2D, e materiais com propriedades semelhantes.
9 - DISPOSITIVO de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por os Óxidos poderem ser de metais de transição (Ti, Cu, Zn, etc) em configuração uni ou bidimensionais .
10 - DISPOSITIVO de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o eletrólito de suporte ser composto de soluções aquosas tamponadas, amostras biológicas como: soro sanguíneo, plasma sanguíneo, urina, saliva, fluido cerebrospinal, entre outras, diluídas ou não, soluções aquosas contendo solventes orgânicos ou apenas solventes orgânicos .
11 - DISPOSITIVO de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a espécie eletroativa ser espécies derivadas de ferrocene, ferrocene, complexos de ions metálicos, moléculas orgânicas eletroativas como quinonas, radicais nitróxido, radicais baseados em alcoxibenzeno e radicais baseados em heterociclicos , compostos de coordenação e complexos organometálicos (Ru(bpy)3Í (BF4)2, Ru(acac)3, Cr(acac)3, [Fe (phen) 3] 2+/3+, ente outras com as mesmas características.
12 - DISPOSITIVO de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a molécula receptora da interface eletroativa modificada ser um aptâmeros, anticorpos, antigenos, fragmentos de anticorpos, oligossacarideos , peptideos, células, bactérias, partículas virais, enzimas e proteínas para aplicação como biossensores .
13 - DISPOSITIVO de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o analito reconhecido pelo receptor ancorado na interface eletroativa ser composto por aptâmeros, anticorpos, antigenos, fragmentos de anticorpos, oligossacarideos, peptideos, células, bactérias, partículas virais, enzimas e proteínas para aplicação como biossensores .
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GARROTE BEATRIZ LUCAS: "The potentiality and limitations of electrochemical impedance spectroscopic methods for molecular film applications", MASTER'S THESIS, UNIVERSITY OF SAO PAULO, 1 January 2018 (2018-01-01), XP093070755, Retrieved from the Internet <URL:https://repositorio.unesp.br/bitstream/handle/11449/153544/garrote_bl_me_araiq_par.pdf?sequence=3&isAllowed=y> [retrieved on 20230804] *

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