CN109632949A - 一种基于细胞容积调节分析细胞功能的方法及应用 - Google Patents

一种基于细胞容积调节分析细胞功能的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于细胞容积调节分析细胞功能的方法及应用，该方法为：首先在石英晶体微天平芯片表面固定细胞，然后分别通入工作液1和工作液2并利用石英晶体微天平动态监测细胞容积调节，最后求出ΔF1/ΔF2的值即为细胞容积调节值，进而分析细胞迁移、凋亡功能。本发明所述方法是一种操作简单、准确度高、实时动态的检测方法，能够用于区分不同迁移能力的细胞，并精确检测药物对细胞迁移的抑制，通过精确监测药物作用下细胞容积调节的改变，分析细胞是否发生凋亡；本发明所述方法在细胞功能研究、生化分析及临床诊断等生命科学研究领域具有广阔的应用前景。

Description

一种基于细胞容积调节分析细胞功能的方法及应用
技术领域
本发明属于细胞功能研究与药物筛选检测技术领域。具体地，涉及一种基于细胞容积调节分析细胞功能的方法及应用。
背景技术
细胞容积调节是细胞保持自身内环境稳定的一种基本生理调节功能，能够调控细胞的形态变化，并在多种细胞功能中发挥重要作用，如细胞迁移、细胞凋亡、细胞增殖和新陈代谢等。细胞功能的发挥往往伴随着细胞生理生化和形态学特征的改变，如在细胞迁移过程中往往会发生膜突起、伪足形成、细胞收缩和尾部回缩等细胞体积和形态的改变；细胞凋亡过程中往往伴随着细胞胞体皱缩、容积减小、凋亡相关酶类被激活并形成凋亡小体等变化。
现有技术中主要采用相差显微镜技术测量细胞容积调节开展对细胞功能的研究（Cell Research, 15(5): 371-378），然而，由于相差显微镜技术限制难以高准确度和连续监测细胞容积调节，导致对细胞容积调节和细胞功能的相关性难以进行更深入的研究，因此需要一种准确灵敏的技术用于监测细胞容积调节的动态过程研究细胞的功能。
石英晶体微天平技术具有实时、动态、高灵敏、高准确度的优点，因而被广泛应用于基因、蛋白和细胞等生命科学领域。CN102505043B公开了一种利用石英晶体微天平检测DNA甲基化的方法，采用对质量变化灵敏的QCM与传统的甲基化酶切技术结合，可有效区分DNA的甲基化状况，具有检测速度快，效率高，重复性良好的优点；CN102393342B公开了一种利用石英晶体微天平筛选端粒酶抑制剂的方法，该方法首先将芯片表面羧基功能化，利用石英晶体微天平检测到的频率，计算ΔF’/ΔF，当ΔF’/ΔF的值不大于50%时，判定待测液中含有端粒酶抑制剂；所述方法具有无标记、能够实现实时检测等优势。然而目前尚未发现有关利用石英晶体微天平动态监测细胞容积调节的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种基于细胞容积调节分析细胞功能的方法及应用，利用石英晶体微天平技术的优势动态监测细胞容积调节进而分析细胞功能。
本发明的第二个目的是提供上述方法在分析细胞功能中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种基于细胞容积调节分析细胞功能的方法及应用，包括以下步骤：
S1.对石英晶体微天平芯片表面进行修饰，然后通入细胞悬浮液；
S2.待检测曲线趋势稳定后，通入工作液1，并记录其稳定频率Δf 1；
S3.继续通入工作液2，读取频率变化最大值Δf 2，随后读取趋于平稳的频率Δf 3；
S4.通过频率Δf 2和Δf 3的差值求出ΔF1，频率Δf 2和Δf 1的差值求出ΔF2，ΔF1/ΔF2的值即为细胞容积调节值；
所述工作液1和工作液2均为能够调节细胞渗透压的溶液。
上述工作液1和工作液2用于调节石英晶体微天平监测过程中细胞内外的渗透压；在石英晶体微天平监测过程中，向细胞悬浮液中分别加入浓度不同的工作液1和工作液2来改变细胞的渗透压，从而通过细胞形态的变化引起细胞容积调节的改变，进而利用石英晶体微天平监测细胞变化过程中产生的频率，再通过计算即得细胞容积调节值。
具体地，所述工作液1和工作液2涵盖所有可以调节渗透压（低渗、等渗、高渗）的溶液，包括灌流液、磷酸盐缓冲溶液、氯化钠溶液、葡萄糖溶液、生理盐水一种或几种。
具体地，本发明所用灌流液为MHGIso灌流液、MHGHypo灌流液。
优选地，所述MHGIso灌流液和MHGHypo灌流液均为由NaCl、MgCl2、CaCl2、HEPES和甘露醇组成的混合液。
本发明将质量变化灵敏的石英晶体微天平与细胞容积调节机制相结合，建立了一种简便、快速、高灵敏度、高准确性、连续动态分析细胞功能的新方法，以利用石英晶体微天平技术实时、动态监测细胞容积调节变化分析待检测细胞的功能。
优选地，步骤S3完成后，再次通入工作液1，并利用石英晶体微天平监测得到稳定的频率Δf 4，以监测细胞结构是否被破坏；将所得Δf 4与Δf 1进行比较，当Δf 4与Δf 1大小接近时说明待测细胞未受到损伤，否则说明待测细胞受到损伤，影响试验结果。
优选地，所述对石英晶体微天平芯片表面进行修饰的修饰液为巯基酸和/或聚赖氨酸。
优选地，所述巯基酸浓度为1～10 mg·mL-1。
更优选地，所述巯基酸为巯基丁二酸。
优选地，所述聚赖氨酸浓度为1～10 mg·mL-1。
优选地，所述细胞悬浮液的流速为0.1～5 mL·min-1。
更优选地，所述细胞悬浮液的浓度为103～106个/mL。
优选地，所述工作液1为MHGIso灌流液，具体由30～80mM NaCl、0.1～10mM MgCl2、1～20mM CaCl2、10～30mM HEPES、10～150 mM甘露醇混合而成。
工作液2可通过调节MHGIso灌流液组分中的甘露醇浓度获得，其他成分浓度不变。
优选地，所述工作液2为MHGHypo灌流液，具体由30～80mM NaCl、0.1～10mM MgCl2、1～20mM CaCl2、10～30mM HEPES、0～100 mM甘露醇混合而成。
优选地，所述工作液1通入的流度为20～200 μL·min-1，通入体积为1～3 mL。
优选地，所述工作液2通入的流度为20～200 μL·min-1，通入体积为1～3 mL。
当向上述工作液中引入各种功能的药物刺激细胞后，会导致细胞功能的改变，从而引起容积调节的相应变化；通过计算细胞容积调节值从而研究细胞容积调节和细胞功能之间的关系。因此，本发明还请求保护上述利用石英晶体微天平技术动态监测细胞容积调节的方法在分析细胞容积调节与细胞功能的关系中的应用。
优选地，所述细胞为脊椎动物的癌细胞或正常细胞。
更优选地，所述癌细胞为乳腺癌细胞、鼻咽癌细胞、宫颈癌细胞中的任一种。
更优选地，所述正常细胞为红细胞、表皮细胞、内皮细胞中的任一种。
优选地，所述细胞功能为细胞迁移、细胞凋亡或细胞增殖中的一种或几种。
本研究中，所用药物为能够诱导细胞功能发生变化的药物，包括能够诱导细胞凋亡、增殖的药物以及抑制细胞迁移能力的药物，还可以为其他能够影响细胞容积调节变化的药物。
同时，本发明还请求保护上述方法在分析细胞容积调节与细胞迁移、细胞凋亡或细胞增殖的关系中的应用。
发明人通过创造性的劳动将石英晶体微天平用于监测细胞容积，从而建立了一种新的分析平台，然后利用石英晶体微天平技术实时、高灵敏度、高准确性、能够动态追踪细胞容积调节过程的优势对细胞容积调节进行监测进而分析细胞功能。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明将质量变化灵敏的石英晶体微天平与细胞容积调节机制相结合，通过石英晶体微天平技术实时、动态监测细胞容积调节变化，进而分析待测细胞的功能；本发明所述方法是一种操作简单、准确度高、实时动态的检测方法，能够用于区分不同迁移能力的细胞，并精确检测药物对细胞迁移的抑制；通过精确监测药物作用下细胞容积调节的改变，分析细胞是否发生凋亡；本发明所述方法在细胞功能研究、生化分析及临床诊断等生命科学研究领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例1的条件下细胞的容积调节图。
图2为实施例2的条件下细胞的容积调节图。
图3为实施例3的条件下MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞的容积调节和细胞迁移能力柱状图。
图4为实施例4的条件下姜黄素作用下MDA-MB-231细胞的容积调节和凋亡率之间的相关性。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 基于石英晶体微天平技术动态监测细胞容积调节
一、方法
（1）对石英晶体微天平芯片表面进行修饰，所用修饰液为1 mg·mL-1的巯基丁二酸和1mg·mL-1的聚赖氨酸，然后以0.1 mL·min-1的流速通入5×103个/mL的MDA-MB-231细胞悬浮液2 mL；
（2）待曲线趋势稳定后，以0.2 mL·min-1的流速通入1.5 mL工作液1，利用石英晶体微天平监测得到稳定的频率Δf 1，所述工作液1中NaCl的浓度为70 mM，MgCl2的浓度为0.5 mM，CaCl2的浓度为1 mM，HEPES的浓度为20 mM，甘露醇的浓度为150 mM；
（3）继续以0.2 mL·min-1的流速通入3 mL工作液2，利用石英晶体微天平监测得到频率的动态变化过程，读取频率变化最大值Δf 2，随后读取趋于平稳的频率Δf 3，所述工作液2中NaCl的浓度为70 mM，MgCl2的浓度为0.5 mM，CaCl2的浓度为1 mM，HEPES的浓度为20 mM；
（4）再次通入工作液1，利用石英晶体微天平监测得到稳定的频率Δf 4；
（5）计算频率Δf 2和频率Δf 3的差值ΔF1；计算频率Δf 2和频率Δf 1的差值ΔF2；求出细胞容积调节值ΔF1/ΔF2。
二、结果
如图1所示，从图中可以看出，Δf 1= -30.8，Δf 2= -49.2，Δf 3= -41.3，Δf 4= -31.2，ΔF1=7.9，ΔF2=18.4，ΔF1/ΔF2=42.9%。结果说明：具有高迁移能力的乳腺癌MDA-MB-231细胞其细胞容积调节值为42.9%。
实施例2 基于石英晶体微天平技术动态监测细胞容积调节
一、方法
（1）对石英晶体微天平芯片表面进行修饰，所用修饰液为10 mg·mL-1的巯基丁二酸和10 mg·mL-1的聚赖氨酸，然后以5 mL·min-1的流速通入106个/mL的MCF-7细胞悬浮液2 mL；
（2）待曲线趋势稳定后，以5 mL·min-1的流速通入1.5 mL工作液1，利用石英晶体微天平监测得到稳定的频率Δf 1，所述工作液1中NaCl的浓度为30 mM，MgCl2的浓度为10 mM，CaCl2的浓度为20 mM，HEPES的浓度为30 mM，甘露醇的浓度为110 mM；
（3）继续以0.2 mL·min-1的流速通入3 mL工作液2，利用石英晶体微天平监测得到频率的动态变化过程，读取频率变化最大值Δf 2，随后读取趋于平稳的频率Δf 3，所述工作液2中NaCl的浓度为30 mM，MgCl2的浓度为10 mM，CaCl2的浓度为20 mM，HEPES的浓度为30 mM；
（4）再次通入工作液1，利用石英晶体微天平监测得到稳定的频率Δf 4；
（5）计算频率Δf 2和频率Δf 3的差值ΔF1；计算频率Δf 2和频率Δf 1的差值ΔF2；求出细胞容积调节值ΔF1/ΔF2。
二、结果
如图2所示，从图中可以看出，Δf 1= -31.3，Δf 2= -52.3，Δf 3= -46.6，Δf 4= -30.9，ΔF1=5.7，ΔF2=21，ΔF1/ΔF2=27.1%。结果说明：具有低迁移能力的乳腺癌MCF-7细胞其细胞容积调节值为27.1%。
从实施例1和2的结果可以看出，本发明所述方法可以根据细胞容积调节值的差异，区分不同迁移能力的细胞株系。
实施例3 细胞容积调节与细胞迁移能力的分析
一、方法
（1）本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于：对石英晶体微天平芯片表面修饰后，以0.1 mL·min-1的流速分别通入5×103个/mL的MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞悬浮液；
（2）待曲线趋势稳定后，以0.2 mL·min-1的流速通入1.5 mL工作液1，测得稳定的频率Δf 1，所述工作液1中NaCl的浓度为70 mM，MgCl2的浓度为0.5 mM，CaCl2的浓度为1 mM，HEPES的浓度为20 mM，甘露醇的浓度为150 mM；
（3）继续以0.2 mL·min-1的流速通入3 mL工作液2，监测频率的动态变化过程，读取Δf 2和Δf 3，所述工作液2中NaCl的浓度为70 mM，MgCl2的浓度为0.5 mM，CaCl2的浓度为1 mM，HEPES的浓度为20 mM；
（4）再次通入工作液1，测得频率Δf 4；
（5）计算并求出两种细胞的容积调节值ΔF1/ΔF2。进一步采用划痕实验检测MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞的迁移能力。
二、结果
如图3所示，MDA-MB-231细胞容积调节值为48.2%，MCF-7细胞容积调节值为34.7%，两种细胞的容积调节值和迁移能力有显著性差异（*P﹤0.05）。当不同细胞之间容积调节值的变动系数≥ 5%时，以此判断两种细胞具有不同的迁移能力。
实施例4 细胞容积调节与细胞凋亡的分析
一、方法
（1）本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于：对石英晶体微天平芯片表面修饰后，分别通入不同浓度姜黄素（0 μM、10 μM、30 μM、50 μM）处理的MDA-MB-231细胞悬浮液；
（2）待曲线趋势稳定后，以0.2 mL·min-1的流速通入1.5mL工作液1，测得稳定的频率Δf 1，所述工作液1中NaCl的浓度为70 mM，MgCl2的浓度为0.5 mM，CaCl2的浓度为1 mM，HEPES的浓度为20 mM，甘露醇的浓度为150 mM；
（3）以0.2 mL·min-1的流速通入3mL工作液2，监测频率的动态变化过程，读取Δf 2和Δf 3，所述工作液2中NaCl的浓度为70 mM，MgCl2的浓度为0.5 mM，CaCl2的浓度为1 mM，HEPES的浓度为20 mM；
（4）再次通入工作液1，测得频率Δf 4；
（5）计算并求出两种细胞的容积调节值ΔF1/ΔF2。进一步采用流式细胞仪检测不同浓度姜黄素作用下MDA-MB-231细胞的凋亡率。
二、结果
如图4所示，随着姜黄素的浓度逐渐增加，MDA-MB-231细胞容积调节的抑制程度逐渐上升；流式实验结果显示细胞的凋亡程度也随姜黄素浓度的增加而升高。分析结果表明，在姜黄素作用下细胞容积调节抑制与细胞凋亡率之间具有良好的正相关性，线性方程为：凋亡率（%）=2.1686 × RVD抑制率（%）–10.1791，相关系数R2=0.9759。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于细胞容积调节分析细胞功能的方法及应用，其特征在于，包括以下步骤：
S1.对石英晶体微天平芯片表面进行修饰，然后通入细胞悬浮液；
S2.待检测曲线趋势稳定后，通入工作液1，并记录其稳定频率Δf 1；
S3.继续通入工作液2，读取频率变化最大值Δf 2，随后读取趋于平稳的频率Δf 3；
S4.通过频率Δf 2和Δf 3的差值求出ΔF1，频率Δf 2和Δf 1的差值求出ΔF2，ΔF1/ΔF2的值即为细胞容积调节值；
所述工作液1为工作液1和工作液2均为能够调节细胞渗透压的溶液。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S3完成后，再次通入工作液1，并利用石英晶体微天平监测得到稳定的频率Δf 4。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述对石英晶体微天平芯片表面进行修饰的修饰液为巯基酸和/或聚赖氨酸。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述细胞悬浮液的流速为0.1～5 mL·min-1。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述细胞悬浮液的浓度为103～106个/mL。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述细胞为脊椎动物的癌细胞或正常细胞。
7.权利要求1～6任一所述方法在分析细胞容积调节与细胞功能的关系中的应用。
8.权利要求1～6任一所述方法在分析细胞容积调节与细胞迁移的关系中的应用。
9.权利要求1～6任一所述方法在分析细胞容积调节与细胞凋亡的关系中的应用。
10.权利要求1～6任一所述方法在分析细胞容积调节与细胞增殖的关系中的应用。
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