CN107233572A - 一种基于淀粉样多肽为模板的光热剂的制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于淀粉样多肽为模板的光热剂的制备方法及用途，制备如下：1、制备六氟异丙醇分散的多肽溶液；2、制备多肽粉末；3、制备多肽溶液；4、制备光热剂溶液。本发明以淀粉样多肽为模板，利用简单，温和的合成条件，制备出形貌均匀可控的具有较好光热效果金纳米颗粒光热剂，在近红外光作用下，有效的杀死耐药菌。

Description

一种基于淀粉样多肽为模板的光热剂的制备方法及用途

技术领域

本发明涉及一种光热剂的制备方法及其用途，特指基于淀粉样多肽为模板合成的金纳米颗粒光热剂的制备方法及其利用近红外(NIR)光照射进行光热杀耐药菌，属于材料制备技术领域。

背景技术

金纳米颗粒作为纳米材料中非常重要的一种，因其独特的局域表面等离子体共振特性，高度可调的尺寸比例和光学特性，以及良好的生物相容性，使金纳米颗粒在生物及医学领域有了广泛的应用空间。其在肿瘤的光热治疗、生物传感和分子影像方面独特的性质已成为基础研究及应用研究的热点。尤其是近年来发展起来的基于金纳米颗粒的光热剂应用于肿瘤的选择性光热治疗取得了进展。

光热治疗是指具有较高光热转换效率的光热剂，在易穿透组织的NIR照射下，将光能转化为热能通过细胞热消融途径来实现不可逆细胞破坏的一种治疗方法。近些年来，光热治疗不仅在肿瘤治疗上得到巨大发展，其在杀菌领域也得到了广泛关注。因此，利用金纳米颗粒作为光热剂，通过近红外光作用进行光热杀菌具有很好的前景。

对于金纳米颗粒，传统的物理制备法过程繁琐，而传统的化学制备法存在一些极端反应条件等缺点。近些年，利用生物分子(如多肽、酶、抗体、DNA)合成金纳米颗粒的方法被广泛应用，相比于传统的化学合成方法，生物分子合成途径可在温和的反应环境条件下，利用环境友好型的还原剂可控制备出金纳米颗粒。在众多生物分子中，多肽由于其能识别无机物表面而广泛的应用于金纳米颗粒的合成和自组装。

基于对淀粉样多肽的研究，我们利用不同类型的淀粉样多肽作为生物模板，制备出具有较好光热效果的金纳米颗粒，并应用于光热抗耐药菌。

发明内容

本发明利用淀粉样多肽为模板制备具有光热效果的金纳米颗粒光热剂，并用于光热杀菌。其优点在于利用多肽作为生物模板制备金纳米颗粒光热剂，制备方法简单，反应条件温和，且所制备的金纳米颗粒形貌均匀可控，同时具有较高的光热效果。

本发明采用的技术方案是：

一种基于淀粉样多肽为模板的光热剂的制备方法，步骤如下：

步骤1、将六氟异丙醇溶液加入含有淀粉样多肽粉末的试管中，放置于25℃的恒温摇床中摇晃溶解24小时，得到六氟异丙醇分散的多肽溶液，并置于-20℃冰箱保存；

步骤2、取步骤1中的六氟异丙醇分散的多肽溶液于离心管中，用封口膜封住离心管的口，并用针头在封口膜上扎小孔，放置于真空干燥箱中干燥，得到多肽粉末；

步骤3、向步骤2中干燥后的含有多肽粉末的离心管中加入200μL溶剂，超声3秒，振荡3秒，并重复3次，放置于37℃恒温摇床孵育，并控制孵育时间，得到多肽溶液；

步骤4、将氯金酸(AuCl₃·HCl·4H₂O)溶于去离子水中，得到氯金酸溶液，将200μL氯金酸溶液加入到步骤3中的多肽溶液，搅拌5分钟，得到混合液A；

步骤5、将硼氢化钠(NaBH₄)溶于冰的去离子水中，得到硼氢化钠溶液，将400μL硼氢化钠溶液滴加到步骤4中所得到的混合液A中，得到混合液B，即光热剂溶液。

步骤6、取180μL所制备的光热剂与20μL细菌悬浮液混合，静置放置1h，用近红外光照射后，取5μL光照射的混合溶液稀释于5ml的磷酸盐缓冲溶液中，并取100μL稀释后的溶液涂在固体琼脂培养基上，在37℃培养箱培养24h，计算最终细菌存活率。

步骤1中，所用淀粉样多肽为Aβ10-20，Aβ25-35，Aβ33-42，Aβ42中的一种，溶解多肽粉末时，六氟异丙醇与多肽粉末用量比为1mL：2mg。

步骤2中，提取多肽粉末时，所取的用于干燥的多肽溶液为10～40μL，所用真空干燥箱的温度为室温，干燥的时间为1小时。

步骤3中，制备多肽溶液时，所加入的溶剂为去离子水，控制孵育的时间为12h。

步骤4中，制备所得氯金酸溶液的浓度为10mM，制备混合液A时，所使用的氯金酸溶液与多肽溶液的浓度的比值为25～100：1。

步骤5中，制备所得的硼氢化钠溶液的浓度为10mM，制备混合液B时，所使用的硼氢化钠溶液与氯金酸溶液的浓度的比值为2：1。

一种光热剂溶液。

一种将所述溶液用于光热杀耐药菌的用途，杀菌步骤如下：

步骤6中，所用近红外光的波长为808nm，功率为3～5W，照射时间为5～20min，所用的细菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA,ATCC 43300)，耐万古霉素肠球菌(VRE,ATCC29212)中的一种。所有细菌均由江苏大学附属医院提供。

上述的技术方案中所述的六氟异丙醇，其作用分散剂，将淀粉样多肽粉末溶解分散，以便提取出不同质量的多肽粉末。

上述的技术方案中所述的淀粉样多肽溶液，其作用是作为模板。

上述的技术方案中所述的氯金酸溶液，其作用是提供制备光热剂金纳米颗粒时所需的Au³⁺离子。

上述的技术方案中所述的硼氢化钠溶液，其作用是还原剂。

有益效果：

本技术发明以淀粉样多肽为模板，利用简单，温和的合成条件，制备出形貌均匀可控的具有较好光热效果金纳米颗粒光热剂，在近红外光作用下，有效的杀死耐药菌。

具体实施方式

上述技术方案所制备的金纳米颗粒光热剂应用于光热杀耐药菌，下面结合具体实施实例对本发明做进一步说明。

本发明以制备所得的光热剂总体积为800μL为例。

实施例1

(1)多肽溶液的制备：

将1mL的六氟异丙醇溶液加入到含有2mg多肽淀粉样多肽Aβ10-20粉末的试管中，放置在25℃的恒温摇床上摇晃溶解24小时，得到分散于六氟异丙醇中的多肽溶液，取10μL分散于六氟异丙醇中的多肽溶液于1.5mL的离心管中，用封口膜封住离心管的口，并用针头在封口膜上扎4个小孔，放置于25℃的真空干燥箱中干燥1小时，然后向离心管中加入去离子水200μL，随后在超声波中超声3秒，在漩涡振荡器上振荡3秒，重复三次，放置于37℃恒温摇床孵育，控制孵育时间为12h，最终得到多肽溶液。

(2)金纳米颗粒光热剂的制备：

取200μL浓度为10mM的氯金酸溶液，加入到步骤(1)所得到的多肽溶液中，搅拌5分钟，得到氯金酸和多肽溶液浓度比值为100的混合溶液，取400μL浓度为10mM的冰水制备的硼氢化钠溶液，滴加到氯金酸和多肽的混合溶液中，振荡5秒，静置放置1小时，最终得到金纳米颗粒光热剂。

金纳米颗粒光热剂光热杀耐药菌实验

取180μL所制备的光热剂与20μL MRSA细菌悬浮液混合，静置放置1h，用功率为5W，波长为808nm近红外光照射20min后，取5μL光照射的混合溶液稀释于5ml的磷酸盐缓冲溶液中，并取100μL稀释后的溶液涂在固体琼脂培养基上，在37℃培养箱培养24h，计算最终细菌存活率。所得细菌存活率见表1。

实施例2

同实施例1，仅改变实施例1步骤(1)中所取的用于干燥的分散于六氟异丙醇中的多肽溶液的体积为20μL和40μL，即最终制备所得的光热剂中氯金酸溶液和多肽溶液浓度比值为50和25，所得细菌存活率见表1。结果表明，提高氯金酸溶液与多肽溶液的比值，所制备的光热剂的光热杀菌效果有明显的提升。

表1不同氯金酸和多肽溶液的浓度的比值对所制备的光热剂的杀菌影响

氯金酸与多肽溶液浓度比值	细菌存活率(％)
		25	31.2
50	15.8
		100	0

实施例3

同实施例1，仅改变实施例1中所用的淀粉样多肽为Aβ25-35、Aβ33-42、Aβ42，所制备的光热剂进行光热杀菌，所得细菌存活率见表2。结果表明，同一条件下，利用不同淀粉样多肽制备的光热剂，都具有较好的光热杀菌效果。

表2不同淀粉样多肽种类对所制备的光热剂的杀菌影响

淀粉样多肽种类	细菌存活率(％)
		Aβ10-20	0
Aβ25-35	0
		Aβ33-42	0
Aβ42	0

实施例4

同实施例1，仅改变实施例1步骤(3)中近红外的功率为3、3.5、4、4.5W，所得细菌存活率见表3。结果表明，加大近红外光的功率，可以提高所制备的光热剂的光热杀菌效率。

表3不同近红外光功率对所制备的光热剂光热杀菌的影响

近红外光功率(W)	细菌存活率(％)
		3	21.8
3.5	14.7
		4	5.2
4.5	0
		5	0

实施例5

同实施例1，仅改变实施例1步骤(3)中的光照时间为5、10、15min，所得细菌存活率见表4。结果表明，随着近红外光照射时间的延长，所制备的光热剂的光热杀菌效果越明显。

表4不同近红外光照射时间对所制备的光热剂光热杀菌的影响

实施例6

同实施例1，仅改变实施例1步骤(3)中所用细菌为VRSA和VRE，所得细菌存活率见表5。结果表明，在相同条件下，所制备的光热剂在近红外作用下可以杀死多种耐药菌。

表5所制备的光热剂对不同细菌种类的光热杀菌的影响

细菌类型	细菌存活率(％)
		MRSA	0
VRE	0

Claims (8)

1.一种基于淀粉样多肽为模板的光热剂的制备方法，其特征在于，步骤如下：

步骤1、将六氟异丙醇溶液加入含有淀粉样多肽粉末的试管中，放置于25 ℃的恒温摇床中摇晃溶解24小时，得到六氟异丙醇分散的多肽溶液，并置于-20 ℃冰箱保存；

步骤2、取步骤1中的六氟异丙醇分散的多肽溶液于离心管中，用封口膜封住离心管的口，并用针头在封口膜上扎小孔，放置于真空干燥箱中干燥，得到多肽粉末；

步骤3、向步骤2中干燥后的含有多肽粉末的离心管中加入200 μL溶剂，超声3秒，振荡3秒，并重复3次，放置于37 ℃恒温摇床孵育，并控制孵育时间，得到多肽溶液；

步骤4、将氯金酸溶于去离子水中，得到氯金酸溶液，将200 μL氯金酸溶液加入到步骤3中的多肽溶液，搅拌5分钟，得到混合液A；

步骤5、将硼氢化钠溶于冰的去离子水中，得到硼氢化钠溶液，将400 μL硼氢化钠溶液滴加到步骤4中所得到的混合液A中，得到混合液B，即光热剂溶液;

步骤6、取180 μL所制备的光热剂与20 μL细菌悬浮液混合，静置放置1 h，用近红外光照射后，取5 μL光照射的混合溶液稀释于5 ml的磷酸盐缓冲溶液中，并取100 μL稀释后的溶液涂在固体琼脂培养基上，在37℃培养箱培养24 h，计算最终细菌存活率。

2.根据权利要求1所述的一种基于淀粉样多肽为模板的光热剂的制备方法，其特征在于，步骤1中，所用淀粉样多肽为Aβ10-20，Aβ25-35，Aβ33-42，Aβ42中的一种，溶解多肽粉末时，六氟异丙醇与多肽粉末用量比为1 mL:2 mg。

3.根据权利要求1所述的一种基于淀粉样多肽为模板的光热剂的制备方法，步骤2中，所述干燥的时间为1小时。

4.根据权利要求1所述的一种基于淀粉样多肽为模板的光热剂的制备方法，步骤3中，制备多肽溶液时，所加入的溶剂为去离子水，控制孵育的时间为12 h。

5.根据权利要求1所述的一种基于淀粉样多肽为模板的光热剂的制备方法，步骤4中，制备所得氯金酸溶液的浓度为10 mM，制备混合液A时，所使用的氯金酸溶液与多肽溶液的浓度的比值为25 ~ 100:1。

6.根据权利要求1所述的一种基于淀粉样多肽为模板的光热剂的制备方法，步骤5中，制备所得的硼氢化钠溶液的浓度为10 mM，制备混合液B时，所使用的硼氢化钠溶液与氯金酸溶液的浓度的比值为2:1。

7.一种权利要求1~6任意一项所述的方法制备得到的光热剂溶液。

8.一种利用权利要求7所述的光热剂溶液用于光热杀耐药菌的用途。