CN112708663A - 一种抑制剂对肠道菌落的作用观测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抑制剂对肠道菌落的作用观测方法，包括如下步骤：S1、制备致比菲德氏菌，作为待检测样品模板：使用1μL接种环刮取营养双层血琼脂平板或斜面上培养16h～22h的菌落，使其悬浮在200μL的0.85％灭菌生理盐水中，充分打散制成菌悬液，放入12800r/min的离心机中离心处理5min，弃掉上清液；S2、收集上清液；S3、处理上清液；S4、取步骤S3中的上清液通入石英晶体微天平传感器中，随着多肽分子在芯片表面的吸附集聚；S5、每个样品2个荧光定量PCR反应体系，对应检测的N个目标基因；S6、结果分析，根据体系1和体系2中的荧光信号判定致比菲德氏菌的种类，可以更好更全面的对抑制剂的使用提供有效的观测数据，对其的开发研究提供有效帮助。
Description
技术领域
本发明属于抑制剂技术领域，更具体地说，尤其涉及一种抑制剂对肠道菌落的作用观测方法。
背景技术
抑制剂(又称为缓聚剂)是一种用来阻滞或降低化学反应速度的物质，作用与负催化剂相同。它不能停止聚合反应，只是减缓聚合反应。借以抑制或缓和化学反应的物质。肠道病毒包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒(Coxsackievirus)、致肠细胞病变人孤儿病毒(ECHO)及新型肠道病毒。肠道病毒，颗粒小，呈20面体，直径24～30nm，不含类脂体，核心有单链核糖核酸，耐乙醚和其它脂溶剂，耐酸，对各种抗生素、抗病毒药、去污剂有抵抗作用。多数病毒在细胞培养中产生细胞病变。属于小RNA病毒科，为裸露病毒，不同肠道病毒可引起相同的症状，同一种病毒可引起不同临床表现。肠道病毒多见隐性感染，可引起轻微上感、腹部不适和腹泻等症状。偶尔侵犯中枢神经系统，引起弛缓型麻痹。
目前正在研发的抗肠道病毒的药物主要包括以下几种：受体结合阻断剂、病毒衣壳阻断剂、酶抑制剂和核苷类似物等。研究发现肠道病毒EV71的受体不只一种，包括清道夫受体B2、P选择素糖蛋白配体等。抗SCARB2抗体和可溶的SCARB2结合剂能够阻止EV71的侵入。可溶性的PSGL-1单克隆抗体和纯化的唾液酸多糖也能阻断EV71的感染。但在EV71滴度较高的情况下，这些受体结合阻断剂都不能有效的抑制感染，这可能与EV71存在多种细胞受体有关。因此，只针对一种受体的抑制剂不能彻底抑制病毒的感染。普拉康纳利(Pleconaril)是一种病毒衣壳阻断剂，能够通过与病毒的蛋白衣壳结合而干扰病毒的吸附和脱壳，是一类广谱的抗微小核糖核酸病毒药物。其咪唑啉酮衍生物，能够抑制EV71在横纹肌肉瘤细胞中引起的病变效应且细胞毒性较低。蛋白酶是微小核糖核酸病毒属病毒复制所必需的特异蛋白酶之一。最终发现，其衍生物10b是一种有前景的抑制剂，并且没有明显的细胞毒性，但其在体内是否仍然具有抗病毒活性有待于进一步验证。随着EV71分子生物学研究的深入，已经针对EV71复制过程中不同靶点设计了诸多抗病毒药物，但对其在体内的抗病毒效应及不良反应等大多还需进一步的体内试验和临床验证。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种抑制剂对肠道菌落的作用观测方法，可以更好更全面的对抑制剂的使用提供有效的观测数据，对其的开发研究提供有效帮助。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种抑制剂对肠道菌落的作用观测方法，包括如下步骤：
S1、制备致比菲德氏菌，作为待检测样品模板：使用1μL接种环刮取营养双层血琼脂平板或斜面上培养16h～22h的菌落，使其悬浮在200μL的0.85％灭菌生理盐水中，充分打散制成菌悬液，放入12800r/min的离心机中离心处理5min，弃掉上清液；
S2、收集上清液：加入1mL灭菌去离子水充分混匀菌体，于100℃水浴或者金属浴维持10min，冰浴冷却后，12800r/min离心3min，收集上清液；
S3、处理上清液：按1∶10的比例用灭菌去离子水稀释上清液，取2μL作为荧光定量PCR检测的模板；
S4、取步骤S3中的上清液通入石英晶体微天平传感器中，随着多肽分子在芯片表面的吸附集聚，QCM频率信号和能量耗散将发生改变，检测到的信号作为参考性指标对照，同样，在得到QCM基线后，将聚集抑制剂二硫化钼的水溶液通入QCM传感器得到的QCM频率和能量耗散信号作为聚集抑制剂评价的参考性指标对照使用，获取二硫化钼的水溶液，且浓度为100-200μg/mL；
S5、在包含上下游扩增引物、探针等的反应体系中的二硫化钼的水溶液进行多重荧光定量PCR扩增；每个样品2个荧光定量PCR反应体系，对应检测的N个目标基因；
S6、结果分析，测定样品基因检测有对应荧光增幅现象，且Ct值小于或等于36，则判定样品含有此荧光信号，根据体系1和体系2中的荧光信号判定致比菲德氏菌的种类。
优选的，步骤S1中所述制备致比菲德氏菌的方法如下：将健康人粪便按照1∶3-5的质量体积比加入的无菌去氧生理盐水，对样本进行搅拌；对样本进行均质化；对均质化的液体进行逐级过滤；将滤液离心后重悬，所得悬液即人肠道菌群全菌组合物；所述方法在厌氧条件下进行。
优选的，所述第一次离心条件为50g-200g，离心1-15分钟；第二次离心条件为4000g-5500g，离心1-15分钟。
优选的，步骤S2中所述所有处理后的DNA模板直接用于荧光定量PCR反应或暂存于4℃并当天进行荧光定量PCR反应；否则，应在-20℃以下保存备用(1周内)。
优选的，步骤S5中所述扩增过程中，配置好的反应体系置于荧光定量PCR仪器中，按照反应程序，荧光定量PCR仪自动采集扩增产物的荧光信号，其中反应体系25μL，配置方式如下：TaqMan PCR Master Mix12.5μL；上下游扩增引物各10pmol；探针2pmol；模板2.5μL；ddH2O补足至25μL；将配置好的反应体系置于荧光定量PCR仪器中，扩增条件：
第一阶段：95℃下预变性30s；
第二阶段：40次循环：95℃变性5s，55℃退火20s，72℃收集荧光15s。
在第二阶段的退火步骤结束时，收集记录发光信号。
优选的，产肠毒素大肠埃希氏菌：体系1中存在FAM、Cy5荧光信号一种或两种；肠道集聚性大肠埃希氏菌：体系1中存在ROX荧光信号；
肠道侵袭性大肠埃希氏菌：体系2中存在FAM荧光信号；
肠道致病性大肠埃希氏菌：体系2中存在ROX荧光信号；
致比菲德氏菌：体系2中存在Cy5荧光信号。
本发明的技术效果和优点：本发明的目的是提供一种抑制剂对肠道菌落的作用观测方法，该方法快速、简便、成本低，灵敏度高，可以对口腔清洁用品功效进行快速有效的筛查并能广泛应用。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种抑制剂对肠道菌落的作用观测方法，包括如下步骤：
S1、制备致比菲德氏菌，作为待检测样品模板：使用1μL接种环刮取营养双层血琼脂平板或斜面上培养16h～22h的菌落，使其悬浮在200μL的0.85％灭菌生理盐水中，充分打散制成菌悬液，放入12800r/min的离心机中离心处理5min，弃掉上清液；
S2、收集上清液：加入1mL灭菌去离子水充分混匀菌体，于100℃水浴或者金属浴维持10min，冰浴冷却后，12800r/min离心3min，收集上清液；
S3、处理上清液：按1∶10的比例用灭菌去离子水稀释上清液，取2μL作为荧光定量PCR检测的模板；
S4、取步骤S3中的上清液通入石英晶体微天平传感器中，随着多肽分子在芯片表面的吸附集聚，QCM频率信号和能量耗散将发生改变，检测到的信号作为参考性指标对照，同样，在得到QCM基线后，将聚集抑制剂二硫化钼的水溶液通入QCM传感器得到的QCM频率和能量耗散信号作为聚集抑制剂评价的参考性指标对照使用，获取二硫化钼的水溶液，且浓度为100-200μg/mL；
S5、在包含上下游扩增引物、探针等的反应体系中的二硫化钼的水溶液进行多重荧光定量PCR扩增；每个样品2个荧光定量PCR反应体系，对应检测的N个目标基因；
S6、结果分析，测定样品基因检测有对应荧光增幅现象，且Ct值小于或等于36，则判定样品含有此荧光信号，根据体系1和体系2中的荧光信号判定致比菲德氏菌的种类。
具体的，步骤S1中所述制备致比菲德氏菌的方法如下：将健康人粪便按照1∶3-5的质量体积比加入的无菌去氧生理盐水，对样本进行搅拌；对样本进行均质化；对均质化的液体进行逐级过滤；将滤液离心后重悬，所得悬液即人肠道菌群全菌组合物；所述方法在厌氧条件下进行。
具体的，所述第一次离心条件为50g-200g，离心1-15分钟；第二次离心条件为4000g-5500g，离心1-15分钟。
具体的，步骤S2中所述所有处理后的DNA模板直接用于荧光定量PCR反应或暂存于4℃并当天进行荧光定量PCR反应；否则，应在-20℃以下保存备用(1周内)。
具体的，步骤S5中所述扩增过程中，配置好的反应体系置于荧光定量PCR仪器中，按照反应程序，荧光定量PCR仪自动采集扩增产物的荧光信号，其中反应体系25μL，配置方式如下：TaqMan PCR Master Mix12.5μL；上下游扩增引物各10pmol；探针2pmol；模板2.5μL；ddH20补足至25μL；将配置好的反应体系置于荧光定量PCR仪器中，扩增条件：
第一阶段：95℃下预变性30s；
第二阶段：40次循环：95℃变性5s，55℃退火20s，72℃收集荧光15s。
在第二阶段的退火步骤结束时，收集记录发光信号。
优选的，产肠毒素大肠埃希氏菌：体系1中存在FAM、Cy5荧光信号一种或两种；肠道集聚性大肠埃希氏菌：体系1中存在ROX荧光信号；
肠道侵袭性大肠埃希氏菌：体系2中存在FAM荧光信号；
肠道致病性大肠埃希氏菌：体系2中存在ROX荧光信号；
致比菲德氏菌：体系2中存在Cy5荧光信号。
综上所述：本发明的目的是提供一种抑制剂对肠道菌落的作用观测方法，该方法对应不同目标的检测基因，同时该方法找到不同目标条带种类及组合，确定肠道菌落的种类，节省人力且可以更好更全面的对抑制剂的使用提供有效的观测数据，对其的开发研究提供有效帮助。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、同替换、改进，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种抑制剂对肠道菌落的作用观测方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、制备致比菲德氏菌，作为待检测样品模板：使用1μL接种环刮取营养双层血琼脂平板或斜面上培养16h～22h的菌落，使其悬浮在200μL的0.85％灭菌生理盐水中，充分打散制成菌悬液，放入12800r/min的离心机中离心处理5min，弃掉上清液；
S2、收集上清液：加入1mL灭菌去离子水充分混匀菌体，于100℃水浴或者金属浴维持10min，冰浴冷却后，12800r/min离心3min，收集上清液；
S3、处理上清液：按1∶10的比例用灭菌去离子水稀释上清液，取2μL作为荧光定量PCR检测的模板；
S4、取步骤S3中的上清液通入石英晶体微天平传感器中，随着多肽分子在芯片表面的吸附集聚，QCM频率信号和能量耗散将发生改变，检测到的信号作为参考性指标对照，同样，在得到QCM基线后，将聚集抑制剂二硫化钼的水溶液通入QCM传感器得到的QCM频率和能量耗散信号作为聚集抑制剂评价的参考性指标对照使用，获取二硫化钼的水溶液，且浓度为100-200μg/mL；
S5、在包含上下游扩增引物、探针等的反应体系中的二硫化钼的水溶液进行多重荧光定量PCR扩增；每个样品2个荧光定量PCR反应体系，对应检测的N个目标基因；
S6、结果分析，测定样品基因检测有对应荧光增幅现象，且Ct值小于或等于36，则判定样品含有此荧光信号，根据体系1和体系2中的荧光信号判定致比菲德氏菌的种类。
2.根据权利要求1所述的一种抑制剂对肠道菌落的作用观测方法，其特征在于：步骤S1中所述制备致比菲德氏菌的方法如下：将健康人粪便按照1∶3-5的质量体积比加入的无菌去氧生理盐水，对样本进行搅拌；对样本进行均质化；对均质化的液体进行逐级过滤；将滤液离心后重悬，所得悬液即人肠道菌群全菌组合物；所述方法在厌氧条件下进行。
3.根据权利要求2所述的一种抑制剂对肠道菌落的作用观测方法，其特征在于：所述第一次离心条件为50g-200g，离心1-15分钟；第二次离心条件为4000g-5500g，离心1-15分钟。
4.根据权利要求1所述的一种抑制剂对肠道菌落的作用观测方法，其特征在于：步骤S2中所述所有处理后的DNA模板直接用于荧光定量PCR反应或暂存于4℃并当天进行荧光定量PCR反应；否则，应在-20℃以下保存备用(1周内)。
5.根据权利要求1所述的一种抑制剂对肠道菌落的作用观测方法，其特征在于：步骤S5中所述扩增过程中，配置好的反应体系置于荧光定量PCR仪器中，按照反应程序，荧光定量PCR仪自动采集扩增产物的荧光信号，其中反应体系25μL，配置方式如下：TaqMan PCRMaster Mix12.5μL；上下游扩增引物各10pmol；探针2pmol；模板2.5μL；ddH2O补足至25μL；将配置好的反应体系置于荧光定量PCR仪器中，扩增条件：
第一阶段：95℃下预变性30s；
第二阶段：40次循环：95℃变性5s，55℃退火20s，72℃收集荧光15s。
在第二阶段的退火步骤结束时，收集记录发光信号。
6.根据权利要求1所述的一种抑制剂对肠道菌落的作用观测方法，其特征在于：产肠毒素大肠埃希氏菌：体系1中存在FAM、Cy5荧光信号一种或两种；肠道集聚性大肠埃希氏菌：体系1中存在ROX荧光信号；
肠道侵袭性大肠埃希氏菌：体系2中存在FAM荧光信号；
肠道致病性大肠埃希氏菌：体系2中存在ROX荧光信号；
致比菲德氏菌：体系2中存在Cy5荧光信号。
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Citations (2)
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| CN104502219A (zh) * | 2014-12-18 | 2015-04-08 | 江苏大学 | 一种淀粉样多肽聚集抑制剂及其抑制效果评估和验证方法 |
| CN107475349A (zh) * | 2017-07-05 | 2017-12-15 | 成都奇璞生物科技有限公司 | 一种基于qcm‑d的快速检测细菌耐药性方法 |
-
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Patent Citations (2)
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| Title |
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| 胡世超等: "石英晶体微天平生物传感体系构建及其分析应用研究进展", 分析科学学报, vol. 30, no. 5, pages 735 - 741 * |
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