CN118127022B - 变异链球菌环状RNA circcsbD及应用、其过表达菌株及构建方法和应用 - Google Patents
变异链球菌环状RNA circcsbD及应用、其过表达菌株及构建方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了变异链球菌环状RNA circcsbD及应用、其过表达菌株及构建方法和应用，属于生物医学技术领域。circcsbD的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其可作为龋病生物标记物、及在制备预防或治疗口腔龋病的制剂中的应用。本发明公开了检测circcsbD的引物及试剂盒，公开了circcsbD过表达的变异链球菌及构建方法，并公开了过表达菌株的应用。本发明首次在原核生物变异链球菌中发现了内源性环状RNA circcsbD，其表达水平能够实现对龋病的预测，可作为的龋病相关生物标记物和治疗靶点，其过表达菌株具有抑制变异链球菌生物膜胞外多糖代谢，降低变异链球菌致龋性的作用。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及变异链球菌环状RNA circcsbD及应用、其过表达菌株及构建方法和应用。
背景技术
龋病是发生在牙齿硬组织上的，由牙体组织脱矿形成的慢性感染性疾病。我国第四次口腔流行病学调查结果显示，成年人的患龋率高达89.0%；国外研究发现，牙科疾病负担严重，在因病花销中仅次于糖尿病和心血管疾病。龋病带来一系列经济、健康负担，其防治具有重要的现实社会意义。
口腔微生物形成的菌斑生物膜是龋病的始动因子，变异链球菌凭借胞外多糖合成以及生物膜形成能力在其中占据了重要地位。变异链球菌胞外多糖参与营养物质及代谢产物的运输，提供稳定的三维框架结构，包裹微生物群落相互交错成网状，构成具有高度组织性的致龋牙菌斑生物膜，当其结构致密性被破坏，生物膜的致病性将减弱。因此，对生物膜胞外多糖代谢进行控制是龋病防治的重要举措，生物膜形成受阻可以有效降低龋坏的发生率。
环状RNA是转录组中广泛存在的一类非编码RNA，目前在真核生物中研究较为广泛，相关技术方法较为成熟。然而在原核生物中，仅有研究报道在古细菌、病毒存在内源性环状RNA，变异链球菌中未曾报道过相关内容，其验证技术及相关应用尚不明晰。
发明内容
本发明的目的之一在于，提供变异链球菌环状RNA circcsbD，其具有与真核生物环状RNA相同的闭合环状结构，对于变异链球菌从低致龋状态到高致龋状态的改变更为敏感，其表达水平能够实现对龋病的辅助预测，可作为新型的龋病相关生物标记物和治疗靶点。
本发明的目的之二在于，提供原核生物环状RNA闭合环状结构的鉴定方法。
本发明的目的之三在于，提供该变异链球菌环状RNA circcsbD的应用。
本发明的目之四在于，提供一株环状RNA circcsbD过表达的变异链球菌。
本发明的目的之五在于，提供环状RNA circcsbD过表达的变异链球菌的构建方法。
本发明的目的之六在于，提供环状RNA circcsbD过表达的变异链球菌的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明公开了一种变异链球菌环状RNA circcsbD，其核苷酸序列如为SEQ ID NO:1所示，具体为：
GTGCTATTGAAAAAACAGTTGCTAAAGCAAAAGACAGCATCAAAGATATCAAGGACGGTGTAGAAGGTGCTGCTGAAGGTATTAAAAGTACTTTTTCTAACAAAGAATAATCTAAATATAAAAGAGCAGAAATCCTATCTAATTAGTAGTAGAATTAGTTAGAACTTCTGTCTTTG。
本发明公开了上述变异链球菌环状RNA circcsbD作为龋病生物标记物的应用。
本发明公开了变异链球菌环状RNA circcsbD在制备用于预防或治疗口腔龋病的制剂中的应用。
本发明公开了变异链球菌环状RNA circcsbD的引物，上游引物序列如SEQ ID NO:2所示，下游引物序列如SEQ ID NO:3所示，具体为：
circcsbD-FAGTTAGAACTTCTGTCTTTGGTGCT
circcsbD-RCCTTCTACACCGTCCTTGATATCTT
本发明公开了一种用于检测上述的变异链球菌环状RNA circcsbD的试剂盒，包括上述引物。
本发明公开了一株环状RNA circcsbD过表达的变异链球菌Streptococcus mutans，其保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国湖北省武汉市武汉大学，保藏日期2024年03月27日，保藏号为CCTCC NO：M2024567，命名为Streptococcus mutanspDL278-circ4-202403。
本发明公开了环状RNA circcsbD过表达的变异链球菌的构建方法，包括如下步骤：根据上述的变异链球菌环状RNA的序列上游设计启动子序列，合成连接有启动子的变异链球菌环状RNA核苷酸序列，并在合成的核苷酸序列上下游加入限制性核酸内切酶BamHI和EcoRI限制性酶切位点，用限制性内切酶BamHI/EcoRI进行酶切，将酶切后的序列连接到经同样双酶切后的pDL278载体上，构建circcsbD重组表达质粒，最后采用质粒转化的方法构建变异链球菌环状RNA过表达株。
本发明公开了环状RNA circcsbD过表达的变异链球菌在制备用于预防或治疗口腔龋病的制剂中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明首次在原核生物变异链球菌中发现了内源性环状RNA circcsbD，其对于变异链球菌从低致龋状态到高致龋状态的改变更为敏感，其表达水平能够实现对龋病的辅助预测，可作为龋病相关生物标记物和治疗靶点。
本发明通过构建circcsbD过表达变异链球菌菌株，发现过表达circcsbD具有抑制变异链球菌生物膜胞外多糖代谢，降低变异链球菌致龋性的作用。
附图说明
图1为环状RNA高通量测序聚类热图，其中Count表示比对定量；Color Key andHistogramg表示色键分布；Row Z-score表示Z值缩放；
图2为circcsbD与来源基因csbD序列对比分析图；
图3为circcsbD环化位点Sanger测序峰图；
图4为RNase R酶处理对circcsbD丰度的影响结果图；
图5为变异链球菌低致龋状态（浮游状态）下环状RNA表达量图；
图6为变异链球菌高致龋状态（生物膜状态）下环状RNA表达量图；
图7为circcsbD过表达菌株序列构建图；
图8为实施例3的革兰染色后的变异链球菌circcsbD过表达菌株pDL278-circ4-202403（即pDL278-circcsbD）与变异链球菌标准株UA159显微形态比较图；
图9为实施例3的变异链球菌circcsbD过表达菌株pDL278-circcsbD与变异链球菌标准株UA159电子显微比较图；
图10为与变异链球菌标准株UA159相比，circcsbD过表达菌株的circcsbD表达丰度变化图；
图11为circcsbD过表达菌株的生物膜形成能力考察结果图；
图12为circcsbD过表达菌株的生物膜形成情况扫描电子显微镜观察图；
图13为circcsbD过表达菌株生物膜胞外多糖合成量考察结果图；
图14为circcsbD过表达菌株生物膜胞外多糖形成以及分布、三维结构的激光共聚焦显微镜观察图；
图15为circcsbD过表达菌株生物膜表面形貌特征的原子力显微镜观察图；各组的上图为原子力显微镜扫描图，下图为原子力显微镜扫描三维重建图；
图16为circcsbD过表达菌株生物膜表面粗糙度比较图；
图17为circcsbD过表达菌株生物膜菌体表面黏附力比较图；
图18为circcsbD过表达菌株用于大鼠龋病防治试验结果图；Blank：空白对照组；UA159：UA159阳性对照组；pDL278-circcsbD：实验组；各试验组的左上图为体视显微镜镜下图，右上图为micro-CT扫描三维彩色重建图，左下图为micro-CT扫描剖面图，右下图为micro-CT扫描三维黑白重建图；箭头表示龋坏；
图19为circcsbD过表达菌株用于大鼠龋病防治试验的窝沟龋防治试验结果图；
图20为circcsbD过表达菌株用于大鼠龋病防治试验的浅龋防治试验结果图；
图21为circcsbD过表达菌株用于大鼠龋病防治试验的中龋防治试验结果图；
图22为circcsbD过表达菌株用于大鼠龋病防治试验的深龋防治试验结果图。
其中附图19-图22中的ns表示not significant（无统计学差异）；*表示 *P＜0.05（差异有统计学意义且P值小于0.05）；**表示 **P＜0.01（差异有统计学意义且P值小于0.01）。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例对技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
除非另有特别说明，本申请中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
本发明所述的变异链球菌标准株UA159（即:Streptococcus mutansUA159, 简称“S.mutansUA159”）从位于中国四川省成都市的口腔疾病防治全国重点实验室处获取。
本发明实施例中使用的仪器、试剂试药如下：
厌氧培养箱（Gene-Science Scientific lnstruments，USA），型号Anaerobox Ⅳ，美国基因科学仪器有限公司；
比浊仪（BD PhoenixSpecTM，BD，USA），美国碧迪公司；
加糖牛心脑浸液培养基（BHIS，加蔗糖1%（m/V），四川省成试化学试剂开发中心，中国）；
TRIzol®试剂（ThermoFisher Scientific，USA），美国赛默飞世尔科技公司；
Ribo-Zero rRNA Removal Kit( Illumina，USA）:Ribo-Zero rRNA 移除试剂盒，美国因美纳公司；
CircRNA Enrichment Kit（Cloud-seq，USA）：CircRNA 富集试剂盒，上海云序生物科技有限公司；
NEBNext®UltraTMⅡ Directional RNA Library Prep Kit：NEBNext®UltraTMⅡ定向 RNA 文库制备试剂盒，新英格兰生物实验室股份有限公司；
illumina Novaseq 6000：因美纳Novaseq 6000试剂盒，美国因美纳公司；
PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara，Japan）：去除基因组TaKaRa逆转录试剂盒，宝日医生物技术（北京）有限公司；
PCR Master Mix试剂盒（GenSeq Biotech，Inc.）：PCR扩增试剂盒，上海云序生物科技有限公司；
1×TBE缓冲液（Solarbio，中国），北京索莱宝科技有限公司；
2%的琼脂糖凝胶（Invitrogen，USA）：美国英杰生命技术有限公司；
TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0：TaKaRaMiniBEST 琼脂糖凝胶 DNA 提取试剂盒 4.0 版，日本宝日医公司；
Master PureTMComplete DNA and RNA Purification Kit（Lucigen，epicentre，USA）：Master PureTM全DNA和RNA纯化试剂盒，美国Epicentre生物技术公司；
MPC Protein Precipitation Reagent：MPC 蛋白沉淀试剂，美国Epicentre生物技术公司；
NanoDropTM2000c Spectrophotometer，ThermoFisher Scientific，USA）：NanoDropTM2000c 核酸蛋白分析仪，美国赛默飞世尔科技公司；
Ribonuclease R（Lucigen，epicentre，USA）试剂盒，美国Epicentre生物技术公司；
TB GreenTMPremix Ex Taq Ⅱ：TB GreenTMPremix Ex Taq Ⅱ荧光PCR试剂盒，日本宝日医公司；
LightCycler 480（Roche，Switzterland）：罗氏LC480实时荧光定量PCR仪,瑞典罗氏公司；
变异链球菌感受态CSP，郑州派和泰德医药科技有限公司，中国）；
革兰染色试剂盒，北京索莱宝科技有限公司；
扫描电子显微镜（FEI），型号Inspect F，美国赛默飞世尔科技公司；
酶标仪（BioTek，USA：SpectraMax®iD5，美国伯腾仪器有限公司；
Alexa Fluor 647 （Invitrogen，USA），美国英杰生命技术有限公司；
无菌玻底培养皿（biosharp，中国），白鲨，北京兰杰柯科技有限公司；
SYTO 9核酸染料（Invitrogen，USA）：美国英杰生命技术有限公司；
抗荧光衰减封片剂（Solarbio，中国），北京索莱宝科技有限公司；
原子力显微镜（SHIMADZU，Kyoto，Japan）：型号Shimadzu SPM-9700 system，日本岛津公司；
原子力显微镜探针（AppNano，USA），型号HYDRA-ALL-G-20，美国美国应用纳米技术集团公司；
Keyes2000#致龋饲料：南通特洛菲饲料科技有限公司。
本发明实施例所述的m/V，表示物质与溶剂的质量体积比。如蔗糖1%（m/V）表示100ml水中加入1g蔗糖。实施例1
本实施例公开了本发明的环状RNA circcsbD的发现及验证试验。
1. 本实施例采用变异链球菌标准株UA159进行试验。分别对其高致龋状态（生物膜状态）和低致龋状态（浮游状态）中差异表达的环状RNA进行高通量测序。具体如下：
将25%（体积/体积: v/v）甘油保种的变异链球菌标准株UA159接种于牛心脑浸液培养基（BHI），在厌氧培养箱（37℃, 5%CO2, 10%H2, 85% N2）中过夜复苏，复苏16小时后以1:20体积比重悬于新鲜的BHI中，培养至对数生长中期，比浊仪测量OD600nm=0.4-0.5，得到变异链球菌标准株UA159低致龋状态（浮游状态），待用。
吸取一部分对数生长中期菌液，以1:100体积比重悬于加糖牛心脑浸液培养基中（BHIS, 加蔗糖1%（m/V）, 成试, 中国），在厌氧培养箱中培养24小时形成生物膜，得到变异链球菌标准株UA159高致龋状态（生物膜状态），待用。
按照TRIzol®试剂说明书提取上述高致龋状态（生物膜状态）和低致龋状态（浮游状态）菌体样本总核酸，核糖体RNA (rRNA) Removal Kit去除核糖体rRNA（Ribo-Zero rRNARemoval Kit），CircRNA Enrichment Kit富集环状RNA。将回收纯化的环状RNA随机断裂成短的RNA 片段，再使用NEBNext®UltraTMⅡ Directional RNA Library Prep Kit对其进行预处理，合成并纯化双链cDNA产物，以T4 DNA聚合酶和klenow DNA聚合酶修复整平其粘性末端进行最后处理，随后构建测序文库，分别对高致龋状态（生物膜状态）和低致龋状态（浮游状态）中差异表达的环状RNA进行高通量150 bp双端测序（illumina Novaseq 6000）。为了得到准确可靠的测序结果，将原始数据后使用cutadapt (v1.9.3) 去接头，去低质量reads，获得高质量clean reads。使用Bowtie2将clean reads匹配到基因组上，使用find_circ技术鉴定circRNA，对比circBase数据库，circ2Trait疾病数据库对所鉴定的环状RNA进行注释。再使用edgeR (v3.16.5) 进行数据标准化和差异表达circRNA筛选。
结果发现内源性环状RNA circcsbD在变异链球菌基因组定位为[NC_004350.2:c1564318-1564143 Streptococcus mutans UA159, complete sequence]，对应的线性基因是csbD；该环状RNA长176个碱基，序列如SEQ ID NO:1所示，具体如下：
GTGCTATTGAAAAAACAGTTGCTAAAGCAAAAGACAGCATCAAAGATATCAAGGACGGTGTAGAAGGTGCTGCTGAAGGTATTAAAAGTACTTTTTCTAACAAAGAATAATCTAAATATAAAAGAGCAGAAATCCTATCTAATTAGTAGTAGAATTAGTTAGAACTTCTGTCTTTG。
变异链球菌环状RNA高通量测序聚类热图如附图1所示。
circcsbD与csbD序列对比分析图如附图2所示，结果发现，两者有41.2%的一致性。
2. 验证
本发明首次发现circcsbD具有与真核生物环状RNA相同的闭合环状结构。变异链球菌环状RNA闭合环状结构验证主要包括Sanger测序以及RNase R酶耐受实验。
2.1 Sanger测序
同上方法提取变异链球菌标准株UA159对数生长中期总核酸，将总核酸样本按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser说明书配置相应反应体系去除gDNA以及进行逆转录，得到cDNA样本，然后将样本按照PCR Master Mix试剂盒说明书进行PCR扩增反应。引物序列：
FAAAAGAGCAGAAATCCTATCT，如SEQ ID NO:4所示。
RTCTTTGATGCTGTCTTTTGC，如SEQ ID NO:5所示。
PCR反应体系如下：
表1PCR反应体系
PCR反应条件如下：
预变性：98℃ 30秒；1个循环
变性：98℃ 10秒
退火：58℃ 30秒
变性、退火30个循环；
延伸：72℃ 30秒
最终延伸：72℃ 5分钟
使用1×TBE缓冲液配置浓度为2%的琼脂糖凝胶，对上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0切胶回收目的PCR产物，将上述回收纯化的PCR产物进行Sanger测序，使用分析软件Chromas对测序结果进行分析，检测其特异性剪接位点，确认环状RNA闭合环状位点。
2.2 RNase R酶耐受实验
将变异链球菌标准株UA159按照Master PureTMComplete DNA and RNAPurification Kit说明书提取样本总核酸，该实验在无酶环境中进行且各反应均在冰上进行操作，具体实验步骤如下：
（1）细菌破壁：在样品中加入1×Tissue and Cell Lysis Solution和ProteinaseK，震荡10秒充分混匀，干热仪65℃孵育15分钟，每5分钟震荡1次，将破壁后的样本置冰上冷却3-5分钟；
（2）蛋白沉淀：在上述样本中加入MPC Protein Precipitation Reagent，轻柔震荡10秒后4℃ 12800 rpm离心10分钟；
（3）转移上清液至无酶1.5 mL离心管中；
（4）核酸沉淀：加入预冷异丙醇上下颠倒混匀30-40次，4℃ 12800 rpm离心10分钟，取沉淀；
（5）去除杂质：用预冷的70%乙醇漂洗上述沉淀两次，室温下晾干，时间不超过10分钟；
（6）得到总核酸样本：用无酶水充分溶解核酸沉淀，测量核酸样品的浓度和纯度（OD260/A280, NanoDropTM2000c Spectrophotometer, ThermoFisher Scientific, USA），样本放-80℃备用。
将总核酸样本按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser说明书配置相应反应体系去除gDNA，该实验在无酶环境和冰上进行，反应体系及操作步骤如下：
表2去gDNA反应体系及操作步骤
42℃孵育2分钟，最终得到浓度约50 ng/μL的已纯化的总RNA样本。
将上述总RNA样本等量分为两组，一组作为实验组，用RNase R对该组RNA样本进行处理以去除其中的线性RNA；另一组作为对照组加入等量的无酶水。按照Ribonuclease R试剂盒说明书配置实验组反应体系，使RNase R作用于实验组中的线性RNA，反应体系具体如下：
表3 实验组RNase R耐受酶实验反应体系
对照组按照实验组反应体系，加入等量的无酶水，具体反应体系如下：
表4 对照组耐受酶实验反应体系
实验组与对照组均在37℃条件下孵育15分钟。将上述两份RNA样本在同样的条件下，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser说明书配置相应反应体系进行逆转录，反应体系及操作步骤如下：
表5逆转录反应体系
逆转录反应：37℃孵育15分钟，酶失活：85℃孵育5秒，得到两份cDNA样本。
采用相对定量法，以变异链球菌标准株UA159 BHI培养条件下gyrA基因mRNA表达量作为内参，由于实验组中gyrA基因mRNA为线性RNA，正常情况下已被RNase R降解，故实验组中的gyrA基因mRNA表达量参考对照组中的gyrA基因mRNA表达量，同样，qPCR扩增后通过2-ΔΔct法计算实验组表达倍数差异。将上述cDNA样本按照TB GreenTMPremix Ex Taq Ⅱ说明书配置相应反应体系，每个样设三个复孔，该实验在冰上进行，在LightCycler 480运行qPCR程序，反应体系及反应条件如下：
表6RT-qPCR反应体系
引物序列如下：
circcsbD-FAGTTAGAACTTCTGTCTTTGGTGCT，如SEQ ID NO:2所示；
circcsbD-RCCTTCTACACCGTCCTTGATATCTT，如SEQ ID NO:3所示。反应条件如下：
预变性：95℃ 30秒；1个循坏；
PCR：分析模式-定量分析 95℃ 5秒，60℃ 30秒；40个循环；
融解：分析模式-融解曲线 95℃ 5秒，60℃ 1分钟，95℃；1个循坏；
降温：50℃ 30秒；1个循坏。
2.3 结果
circcsbD闭合环状结构验证结果如附图3和附图4所示。其中图3为circcsbD环化位点测序峰图，其circcsbD剪切位点：TGGT。图4为RNase R酶处理对circcsbD丰度的影响结果图。*P＜0.05。
结果表明RNA circcsbD具有与真核生物环状RNA相同的闭合环状结构。
实施例2
根据circcsbD环化位点设计发散性引物，退火温度60℃，产物大小87 bp，经NCBIPrimer BLAST（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi）验证其特异性，为能扩增出circcsbD环化位点的引物对，引物序列如下：
circcsbD-FAGTTAGAACTTCTGTCTTTGGTGCT，如SEQ ID NO:2所示；
circcsbD-RCCTTCTACACCGTCCTTGATATCTT，如SEQ ID NO:3所示。
变异链球菌多以生物膜的形式发挥致龋作用，生物膜为其高致龋状态，为了检测circcsbD分别在低致龋状态和高致龋状态下的表达量，将变异链球菌标准株UA159同上过夜复苏16小时后以1:20体积比重悬于新鲜的加糖牛心脑浸液培养基中，培养至对数生长中期，得到与高致龋状态相同培养条件下的变异链球菌标准株UA159低致龋状态（浮游状态），并将之与上述培养得到的生物膜状态变异链球菌标准株UA159对比。将上述样本按照Master PureTMComplete DNA and RNA Purification Kit说明书提取样本总核酸，将总核酸样本按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser说明书去除gDNA以及进行逆转录，最后按照TB GreenTMPremix Ex Taq Ⅱ说明书配置相应反应体系，在LightCycler480运行qPCR程序。
引物序列如下：
circcsbD-FAGTTAGAACTTCTGTCTTTGGTGCT，如SEQ ID NO:2所示；
circcsbD-RCCTTCTACACCGTCCTTGATATCTT，如SEQ ID NO:3所示。
通过qRT-PCR发现circcsbD在变异链球菌低致龋状态（浮游状态）下加糖培养表达量改变无统计学差异，在高致龋状态（生物膜状态）下表达量显著增加，如附图5和图6所示。
提示circcsbD表达量对于变异链球菌从低致龋状态到高致龋状态的改变较为敏感，检测其表达水平能够实现对龋病的辅助预测，可作为新型的龋病相关生物标记物和治疗靶点。
实施例3
本实施例公开了环状RNA circcsbD过表达的变异链球菌的构建方法。
通过NCBI数据库，获得circcsbD序列（SEQ ID NO:1），并在该序列的上游设计启动子序列（如附图7所示的下划线序列）。合成连接有启动子的circcsbD片段核苷酸序列，并在合成的核苷酸序列上游5’端和下游3’端引入BamHI和EcoRI限制性酶切位点（如附图7所示的小写字母序列），对带有启动子序列的circcsbD序列（如附图7）用BamHI/EcoRI双酶切，将酶切片段与经同样双酶切后的pDL278质粒连接，得到circcsbD重组表达载体。采用质粒转化的方法构建变异链球菌circcsbD过表达株，将变异链球菌标准株UA159同上过夜复苏16小时后以1:20体积比重悬于新鲜的牛心脑浸液培养基中，培养至对数生长中期，加入终浓度1μg/mL的变异链球菌感受态CSP和终浓度0.5-1 ng/μL的重组质粒培养3小时。转化体系具体如下：
表7重组质粒转化体系
pDL278质粒带有壮观霉素抗性基因，转化进质粒的菌体具有壮观霉素抗性，将混合培养物接种在壮观霉素终浓度为1000 μg/mL的BHI壮观霉素抗性平板上培养48小时，在筛选抗生素平板上挑选单菌落，再次接种在壮观霉素终浓度为1000 μg/mL的BHI壮观霉素抗性平板上培养48小时，挑选单菌落，用PBS重悬后均匀涂抹在载玻片上，室温下晾干。按照革兰染色试剂盒（Solarbio, 中国）说明书对载玻片上的菌体进行染色，染色完成后使用光学显微镜进行观察。结果如附图8所示：筛选菌落为革兰染色阳性，链状球形菌，与变异链球菌标准株UA159形态无明显不同。进一步，挑选单菌落，进行菌落形态显微镜检查，在壮观霉素终浓度为1000 μg/mL的BHI中复苏16小时，1:20体积比重悬于新鲜的BHI中，培养至对数生长中期，1:100体积比重悬于新鲜的BHIS中，使用12孔板加入无菌细胞爬片及2 mL上述BHIS重悬的菌液培养3小时。使用扫描电子显微镜（FEI, Eindhoven, Holland）观测菌体形态结构，具体处理步骤如下：
（1）3小时后，将黏附好菌体的细胞爬片取出，转移于新的12孔板中；
（2）PBS轻柔漂洗样本3次，吸干液体，室温静置晾干；
（3）在湿润状态下，用2.5%（体积/体积）戊二醛溶液固定样本，4℃下避光放置4小时；
（4）吸干戊二醛溶液，依次使用30%，50%，75%，85%，95%，99%（体积/体积）浓度乙醇溶液对样本进行梯度脱水，每个浓度脱水15分钟；
（5）脱水完成后吸干乙醇溶液，将样本经过乙酸正戊酯处理后进行干燥、喷金等一系列处理，完成样本处理步骤；
（6）扫描电子显微镜观察细菌形态并采集5000×、20000×、50000×倍数下的图像。
结果如附图9所示：筛选菌落菌体形态与变异链球菌标准株UA159无明显差异，呈链状结构。
挑选单菌落，在壮观霉素终浓度为1000μg/mL的BHI中复苏16小时，1:20体积比重悬于新鲜的BHI中，培养至对数生长中期；变异链球菌标准株UA159在BHI中，相同的培养条件下培养至对数生长中期，离心收集菌体。将样本按照Master PureTMComplete DNA andRNA Purification Kit（Lucigen, epicentre, USA）说明书提取样本总核酸，将总核酸样本按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara, Japan）说明书去除gDNA以及进行逆转录，最后按照TB GreenTMPremix Ex Taq Ⅱ（Takara, Japan）说明书配置相应反应体系，在LightCycler 480（Roche, Switzterland）运行qPCR程序。
引物序列如下：
circcsbD-FAGTTAGAACTTCTGTCTTTGGTGCT，如SEQ ID NO:2所示；
circcsbD-RCCTTCTACACCGTCCTTGATATCTT，如SEQ ID NO:3所示。
通过qRT-PCR验证变异链球菌标准株UA159以及筛选菌株中circcsbD的表达情况，结果发现筛选菌株过表达circcsbD，结果如附图10所示，将该circcsbD过表达菌株pDL278-circ4-202403命名为pDL278-circcsbD。
试验例1
本试验例测定circcsbD过表达菌株生物膜总量，并采用扫描电子显微镜观察过表达菌株的生物膜形成情况。
1.采用结晶紫染色实验测定circcsbD过表达菌株生物膜总量，考察circcsbD过表达菌株的生物膜形成能力。将变异链球菌标准株UA159和circcsbD过表达菌株分别接种于BHI培养基和壮观霉素终浓度为1000 μg/mL的BHI培养基中，在厌氧培养箱（37℃, 5%CO2,10%H2, 85% N2）中过夜复苏，复苏16小时后以1:20体积比重悬于新鲜的BHI中，培养至对数生长中期，以1:100体积比重悬于加糖牛心脑浸液培养基中（BHIS, 加蔗糖1%（m/V）, 成试,中国），在上述厌氧培养箱中培养24小时形成生物膜。生物膜形成后用PBS轻柔漂洗样本3次，吸干液体，室温静置15分钟晾干，每孔加入0.5倍体积菌液的结晶紫溶液（0.01%，质量/体积），染色10分钟；染色完成后，用流水洗净多余染料，孔板倒置于吸水纸上，室温静置15分钟晾干。每孔加入1.25倍体积菌液的冰醋酸溶液（33%，体积/体积），置于恒温摇床37℃150 rpm洗脱5分钟。吸取上述样本至96孔板中，每孔200 μL，酶标仪读取OD575nm数值。
结果如附图11所示：circcsbD过表达菌株生物膜总量较变异链球菌标准株UA159少，其生物膜形成能力较变异链球菌标准株UA159弱。
2.采用扫描电子显微镜实验观察circcsbD过表达菌株的生物膜形成情况。
将变异链球菌标准株UA159和circcsbD过表达菌株分别接种于BHI培养基和壮观霉素终浓度为1000 μg/mL的BHI培养基中，在厌氧培养箱（37℃, 5%CO2, 10%H2, 85% N2）中过夜复苏16小时，1:20体积比重悬于新鲜的BHI中，培养至对数生长中期，以1:100体积比重悬于加糖牛心脑浸液培养基中（BHIS, 加蔗糖1%（m/V）），使用12孔板加入无菌细胞爬片及2mL上述BHIS重悬的菌液培养在上述厌氧培养箱中培养24小时形成生物膜。使用扫描电子显微镜观测菌体形态结构，具体处理步骤同上。
结果如附图12所示：与变异链球菌标准株UA159相比，circcsbD过表达菌株生物膜胞外基质明显减少，生物膜扁平，未形成网状交联的三维立体结构，少见胞外基质包裹的细菌团簇，高倍镜下可见平铺的细菌层，未见明显胞外基质，提示circcsbD能够使变异链球菌生物膜胞外基质的形成严重受损。
试验例2
本试验例采用蒽酮硫酸实验检测circcsbD过表达菌株生物膜胞外多糖合成量，采用激光共聚焦显微镜观察circcsbD过表达菌株生物膜胞外多糖形成以及分布情况，并采用原子力显微镜观察circcsbD过表达菌株生物膜表面特征。
1. 采用蒽酮硫酸实验检测circcsbD过表达菌株生物膜胞外多糖合成量。
将变异链球菌标准株UA159和circcsbD过表达菌株分别接种于BHI培养基和壮观霉素终浓度为1000 μg/mL的BHI培养基中，在厌氧培养箱（37℃, 5%CO2, 10%H2, 85% N2;）中过夜复苏16小时，1:20体积比重悬于新鲜的BHI中，培养至对数生长中期，以1:100体积比重悬于加糖牛心脑浸液培养基中（BHIS, 加蔗糖1%（m/V）），使用6孔板，每孔中加入2 mL上述BHIS重悬的菌液，在厌氧培养箱中培养24小时以形成生物膜。生物膜形成后吸干培养基，每孔加入3 mL无菌双蒸水，细胞刮刀刮下生物膜并转移至离心管中，4℃ 4000 rpm转速离心20分钟，分离上清及沉淀；上清用0.22 µm滤器过滤，得到水溶性多糖溶液；上述沉淀用6mL 1M NaOH溶解，充分混匀，置于恒温摇床37℃ 120 rpm孵育3小时，孵育完成后4℃ 4000rpm转速离心20分钟，取上清，用0.22 µm滤器过滤，得到水不溶性多糖溶液。现用现配0.2%（质量/体积）蒽酮-硫酸试剂，以多糖溶液:蒽酮-硫酸试剂=1:3的比例充分混匀样本，95℃孵育6分钟，置冰上冷却。
配置标准浓度葡萄糖溶液以作标准曲线，标准曲线参考浓度如下：
表8 蒽酮硫酸实验标准曲线浓度
使用96孔板，每孔加样200 µL，酶标仪读取OD625nm数值，通过标准曲线计算各样本生物膜胞外多糖含量。
结果如附图13所示。其中A表示水不溶性多糖/水溶性多糖之比；B表示水不溶性多糖含量；C表示水溶性多糖含量。*P＜0.05，结果显示circcsbD过表达菌株生物膜水不溶性胞外多糖/水溶性胞外多糖比，水不溶性胞外多糖含量以及水溶性胞外多糖含量均较变异链球菌标准株UA159显著降低（*P<0.05）。提示circcsbD使变异链球菌生物膜水不溶性多糖以及水溶性多糖的合成能力皆受损。
2. 采用激光共聚焦显微镜观察circcsbD过表达菌株生物膜胞外多糖形成以及分布。
将变异链球菌标准株UA159和circcsbD过表达菌株分别接种于BHI培养基和壮观霉素终浓度为1000μg/mL的BHI培养基中，在厌氧培养箱（37℃, 5%CO2, 10%H2, 85% N2）中过夜复苏16小时，1:20体积比重悬于新鲜的BHI中，培养至对数生长中期，将上述对数生长中期的菌液以1:100体积比重悬于加糖牛心脑浸液培养基中（BHIS, 加蔗糖1%（m/V））中，在重悬的菌液中加入Alexa Fluor 647，使其终浓度为1 μL/mL，混匀，将上述混合菌液加入无菌玻底培养皿中，在厌氧培养箱中避光培养24小时以形成生物膜。生物膜形成后取出玻底培养皿，吸干悬浮液，用无菌双蒸水轻柔漂洗去除浮游菌，室温下避光晾干，在生物膜湿润状态下，每个样本滴加100 μL浓度为2.5 μM的SYTO 9核酸染料，室温下避光孵育15 min。孵育完成后，吸干染液，用无菌双蒸水轻柔漂洗去除残余染料，无菌滤纸吸干玻片边缘残余水分，室温下避光晾干，在生物膜湿润状态下，每个样本滴加适量抗荧光衰减封片剂，完成样本制备，样本避光4℃保存。使用激光共聚焦显微镜下观察生物膜三维结构及胞外多糖的形成，SYTO 9的激发波长为488 nm，Alexa Fluor 647的激发波长为640 nm，以1 μm固定层高扫描生物膜三维结构图，使用Imaris 7.2.3软件对生物膜三维图像进行重建。
其结果如附图14所示，由该图可以看出，与变异链球菌标准株UA159相比，circcsbD过表达菌株生物膜平坦，未形成明显的细菌团簇，细菌含量及胞外多糖含量均降低，胞外多糖稀疏分布。提示circcsbD使变异链球菌生物膜胞外多糖含量及分布皆受损。
3. 采用原子力显微镜观察circcsbD过表达菌株生物膜表面特征。
将变异链球菌标准株UA159和circcsbD过表达菌株分别接种于BHI培养基和壮观霉素终浓度为1000 μg/mL的BHI培养基中，在厌氧培养箱（37℃, 5%CO2, 10%H2, 85% N2;）中过夜复苏16小时，1:20体积比重悬于新鲜的BHI中，培养至对数生长中期，以1:100体积比重悬于加糖牛心脑浸液培养基中（BHIS, 加蔗糖1%（m/V）），使用12孔板加入无菌细胞爬片及2 mL上述BHIS重悬的菌液培养在上述厌氧培养箱中培养24小时形成生物膜。生物膜形成后将细胞爬片取出，转移于新的12孔板中，用无菌双蒸水轻柔漂洗去除浮游菌，室温下晾干。使用原子力显微镜观察各样本生物膜表面形貌，使用0.085 N/m的原子力显微镜探针，在接触模式下扫描10μm×10 μm范围的，测定各样本生物膜的表面粗糙度和黏附力。
其结果如附图15-图17所示，由图15可以看出，circcsbD过表达菌株生物膜菌体表面缺少胞外基质覆盖，可见清晰的个体细菌形态；图16、图17可以看出，circcsbD过表达菌株生物膜的粗糙度和黏附力均较变异链球菌标准株UA159下降（*P<0.05）；提示circcsbD使变异链球菌定植能力受损。
试验例3
本试验例公开了circcsbD过表达菌株防龋病的动物试验。
将30只SPF级别的17天龄SD大鼠，随机分为空白对照组、阳性对照组（变异链球菌标准株UA159）和实验组（circcsbD过表达菌株），每组10只，雌雄各半。用无菌棉签分别蘸取等量无菌双蒸水、对数生长中期的变异链球菌标准株UA159、circcsbD过表达菌株菌液，分别涂布于相应组别的大鼠磨牙表面。每日固定时间接种一次，连续接种7天，同时喂以Keyes2000#致龋饲料（南通特洛菲饲料科技）和灭菌5％（m/V）蔗糖溶液。菌株接种完成后以致龋饲料和5%蔗糖水继续饲养大鼠3周。最后采用CO2窒息法处死大鼠，取下颌骨标本，无菌PBS冲洗3次。
1. 体视显微镜观察大鼠磨牙龋坏程度。
0.4%（w/w）紫脲酸铵溶液染色固定后标本6小时，使用硬组织切片机近远中向半切磨牙咬合面。体视显微镜下观察大鼠磨牙龋坏程度并采集图像，使用Keyes评分法对龋损评分。
2. Micro-CT观察大鼠磨牙龋坏程度。
将下颌骨标本放于4%多聚甲醛中，4℃过夜避光固定，将标本漂洗后固定于Micro-CT 14mm样品管中，以10μm精度、500projections/180°分辨率进行扫描。使用ScancoEvaluation Software三维重建并分析图像。
3. 结果如附图18-图22所示。由图18可以看出，circcsbD过表达菌株致龋程度大于空白对照组，小于变异链球菌标准株UA159阳性对照组；图19可以看出，circcsbD过表达菌株组窝沟龋龋坏程度与空白对照组无统计学差异（*P>0.05），较变异链球菌标准株UA159致龋性下降（*P<0.05）；图20可以看出，circcsbD过表达菌株组浅龋的龋坏程度与空白对照组和变异链球菌标准株UA159相比均无统计学差异（*P>0.05）；图21可以看出，circcsbD过表达菌株组中龋的龋坏程度与空白对照组无统计学差异（*P>0.05），较变异链球菌标准株UA159致龋性下降（*P<0.05）；图22可以看出，circcsbD过表达菌株组浅龋的龋坏程度与空白对照组和变异链球菌标准株UA159相比均无统计学差异（*P>0.05）；以上结果提示circcsbD降低变异链球菌致龋性，能够降低中龋的发病率。
上述实施例仅为本发明较优实施例，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (7)
1.一种变异链球菌（Streptococcus mutans）环状RNA circcsbD，其特征在于，其核苷酸序列如下所示：
GUGCUAUUGAAAAAACAGUUGCUAAAGCAAAAGACAGCAUCAAAGAUAUCAAGGACGGUGUAGAAGGUGCUGCUGAAGGUAUUAAAAGUACUUUUUCUAACAAAGAAUAAUCUAAAUAUAAAAGAGCAGAAAUCCUAUCUAAUUAGUAGUAGAAUUAGUUAGAACUUCUGUCUUUG。
2. 如权利要求1所述的变异链球菌（Streptococcus mutans）环状RNA circcsbD在制备低致龋性变异链球菌中的应用。
3. 用于检测权利要求1所述的变异链球菌（Streptococcus mutans）环状RNAcirccsbD的引物，其特征在于，上游引物序列如SEQ ID NO:2所示，下游引物序列如SEQ IDNO:3所示。
4. 一种用于检测权利要求1所述的变异链球菌（Streptococcus mutans）环状RNAcirccsbD的试剂盒，其特征在于，包括权利要求3所述的引物。
5. 一株权利要求1所述的环状RNA circcsbD过表达的变异链球菌Streptococcus mutans pDL278-circ4-202403，其特征在于，该菌株已于2024年3月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2024567。
6. 如权利要求5所述的环状RNA circcsbD过表达的变异链球菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：根据权利要求1所述的变异链球菌环状RNA circcsbD的序列上游设计启动子序列，合成连接有启动子的变异链球菌环状RNA circcsbD核苷酸序列，并在合成的核苷酸序列上下游加入限制性核酸内切酶BamHI和EcoRI限制性酶切位点，用限制性内切酶BamHI/EcoRI进行酶切，将酶切后的序列连接到经同样双酶切后的pDL278载体上，构建circcsbD重组表达质粒，最后采用质粒转化的方法构建变异链球菌环状RNA过表达株。
7. 如权利要求5所述的环状RNA circcsbD过表达的变异链球菌在制备低致龋性微生物制剂中的应用。
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