CN116322788A - 环状rna组合物和方法 - Google Patents

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T·巴内斯
B·戈德曼
G·默茨
A·贝克尔
A·T·霍霍塔
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Abstract

本文描述了环状RNA，以及相关的组合物和方法。在一些实施方案中，本发明的环状RNA包含I组内含子片段、间隔区、IRES、双链体形成区和表达序列。在一些实施方案中，表达序列编码抗原。在一些实施方案中，与线性RNA相比，本发明的环状RNA具有改进的表达、功能稳定性、免疫原性、制造容易性和/或半衰期。在一些实施方案中，与现有RNA环化方法相比，本发明的方法和构建体产生改进的环化效率、剪接效率和/或纯度。

Description

环状RNA组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年5月19日提交的美国临时申请第63/027,292号的权益和优先权，所述临时申请的内容特此出于所有目的以引用的方式整体并入。
背景技术
常规基因疗法涉及使用DNA来将所需遗传信息插入宿主细胞中。引入细胞中的DNA通常在一定程度上整合至一个或多个转染细胞的基因组中，从而允许所引入的遗传物质在宿主中的长效作用。虽然这类持续作用可具有实质益处，但是外源性DNA整合至宿主基因组中也可具有许多有害效应。举例来说，可能所引入的DNA将插入完整基因中，导致阻碍或甚至完全消除内源性基因的功能的突变。因此，使用DNA的基因疗法可导致损害所治疗宿主的重要遗传功能，如例如，消除或有害减少必需酶的产生或干扰对于细胞生长的调控起关键作用的基因，从而导致未经调控的或癌性的细胞增殖。另外，使用常规基于DNA的基因疗法，为了有效表达所需基因产物，必需包括强启动子序列，这也可导致细胞中的正常基因表达的调控的不良变化。也可能基于DNA的遗传物质将导致诱导不需要的抗DNA抗体，其进而可触发可能致命的免疫应答。使用病毒载体的基因治疗方法也可导致不良免疫应答。在一些情况下，病毒载体甚至可整合至宿主基因组中。另外，临床级病毒载体的产生也昂贵并且费时。所引入的遗传物质使用病毒载体的靶向递送还可能难以控制。因此，虽然已经评估了基于DNA的基因疗法使用病毒载体递送分泌的蛋白(美国专利第6,066,626号；美国公布号US2004/0110709)，但这些方法可能因这些各种原因而受到限制。
与DNA相比，使用RNA作为基因治疗剂大致上更安全，因为RNA不涉及稳定整合至转染细胞的基因组中的风险，由此消除了所引入的遗传物质将干扰必需基因的正常运作或导致引起有害或致癌效应的突变的顾虑，并且外来的启动子序列不为有效翻译所编码蛋白质所需要，再次避免了可能有害的副作用。此外，mRNA不需要进入细胞核来执行其功能，而DNA必须克服这一主要障碍。
环状RNA可用于设计和产生稳定形式的RNA。RNA分子的环化为RNA结构和功能的研究提供了优点，特别是在分子易于以无活性构象折叠的情况下(Wang和Ruffner，1998)。环状RNA对体内应用也可特别令人感兴趣和有用，尤其是在基于RNA的基因表达控制和治疗学的研究领域，包括蛋白质替代疗法和疫苗接种。
在本发明之前，存在用于体外制备环化RNA的三种主要技术：夹板介导法、内含子-外显子置换法(permuted intron-exon method)和RNA连接酶介导法。然而，现有方法受到可环化的RNA的大小限制，从而限制了它们的治疗应用。
发明内容
本文描述了环状RNA，以及相关的组合物和方法。在一些实施方案中，本发明的环状RNA包含I组内含子片段、间隔区、IRES、双链体形成区和表达序列。在一些实施方案中，表达序列编码一种或多种抗原。在某些实施方案中，表达序列被非编码序列替代。在一些实施方案中，与线性RNA相比，本发明的环状RNA具有改进的表达、功能稳定性、制造容易性和/或半衰期。在一些实施方案中，本发明的环状RNA具有降低的免疫原性。在一些实施方案中，与现有RNA环化方法相比，本发明的方法和构建体产生改进的环化效率、剪接效率和/或纯度。
在一个方面，本文提供了一种环状RNA多核苷酸，所述环状RNA多核苷酸按以下顺序包含a.3'I组内含子片段，b.内部核糖体进入位点(IRES)，c.编码一种或多种抗原、佐剂、抗原样或佐剂样多肽或其片段的表达序列，和d.5'I组内含子片段。在一些实施方案中，3'I组内含子片段包含3'I组内含子剪接位点二核苷酸。在一些实施方案中，5'I组内含子片段包含5'I组内含子剪接位点二核苷酸。
在一个方面，本文提供了一种环状RNA多核苷酸，所述环状RNA多核苷酸按以下顺序包含a.3'I组内含子片段，b.内部核糖体进入位点(IRES)，c.非编码表达序列，和d.5'I组内含子片段。
在一个方面，本文提供了一种由载体的转录产生的环状RNA多核苷酸，所述载体按以下顺序包含a.5'双链体形成区，b.3'I组内含子片段，c.内部核糖体进入位点(IRES)，d.编码一种或多种抗原、佐剂、抗原样或佐剂样多肽或其片段的表达序列，e.5'I组内含子片段，和f.3'双链体形成区。
在一个方面，本文提供了一种由载体的转录产生的环状RNA多核苷酸，所述载体按以下顺序包含a.5'双链体形成区，b.3'I组内含子片段，c.内部核糖体进入位点(IRES)，d.非编码表达序列，e.5'I组内含子片段，和f.3'双链体形成区。
在一些实施方案中，载体还包含三磷酸化5'末端。在一些实施方案中，载体还包含单磷酸化5'末端。
在一些实施方案中，环状RNA多核苷酸包含位于所述5'双链体形成区与所述3'I组内含子片段之间的第一间隔区，以及位于所述5'I组内含子片段与所述3'双链体形成区之间的第二间隔区。在一些实施方案中，第一和第二间隔区各自具有约10至约60个核苷酸的长度。在一些实施方案中，第一和第二双链体形成区各自具有约9至约19个核苷酸的长度。在一些其他实施方案中，第一和第二双链体形成区各自具有约30个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，IRES具有来自以下的IRES的序列：桃拉综合征病毒、锥蝽病毒、蒂勒脑脊髓炎病毒(Theiler's encephalomyelitis virus)、猿猴病毒40、红火蚁病毒1、禾谷缢管蚜病毒、网状内皮增生病病毒、人脊髓灰质炎病毒1、斯氏珀蝽(Plautia stali)肠病毒、克什米尔蜜蜂病毒、人鼻病毒2、琉璃叶蝉病毒-1、人免疫缺陷病毒1型、琉璃叶蝉病毒-1、Himetobi P病毒、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、GB型肝炎病毒、口蹄疫病毒、人肠道病毒71、马鼻炎病毒、茶尺蠖微小RNA病毒样病毒(Ectropis obliqua picorna-likevirus)、脑心肌炎病毒、果蝇C病毒、人柯萨奇病毒B3、十字花科植物烟草花叶病毒、蟋蟀麻痹病毒、牛病毒性腹泻病毒1、黑蜂王台病毒、蚜虫致死性麻痹病毒、禽脑脊髓炎病毒、急性蜜蜂麻痹病毒、木槿褪绿环斑病毒、猪瘟病毒、人FGF2、人SFTPA1、人AML1/RUNX1、果蝇触角足、人AQP4、人AT1R、人BAG-1、人BCL2、人BiP、人c-IAPl、人c-myc、人eIF4G、小鼠NDST4L、人LEF1、小鼠HIF1α、人n.myc、小鼠Gtx、人p27kipl、人PDGF2/c-sis、人p53、人Pim-1、小鼠Rbm3、果蝇reaper、犬Scamper、果蝇Ubx、人UNR、小鼠UtrA、人VEGF-A、人XIAP、果蝇无毛、酿酒酵母TFIID、酿酒酵母YAP1、烟草蚀纹病毒、芜菁皱缩病毒、EMCV-A、EMCV-B、EMCV-Bf、EMCV-Cf、EMCV pEC9、小双节RNA病毒(Picoirnavirus)、HCV QC64、人寇沙病毒(HumanCosavirus)E/D、人寇沙病毒F、人寇沙病毒JMY、鼻病毒NAT001、HRV14、HRV89、HRVC-02、HRV-A21、萨力病毒(Salivirus)A SH1、萨力病毒FHB、萨力病毒NG-J1、人副肠孤病毒1、Crohivirus B、Yc-3、Rosavirus M-7、Shanbavirus A、Pasivirus A、Pasivirus A 2、艾柯病毒E14、人副肠孤病毒5、爱知病毒(Aichi Virus)、甲型肝炎病毒HA16、Phopivirus、CVA10、肠道病毒C、肠道病毒D、肠道病毒J、人趋肝性病毒(Pegivirus)2、GBV-C GT110、GBV-C K1737、GBV-C Iowa、趋肝性病毒A 1220、Pasivirus A 3、萨佩洛病毒(Sapelovirus)、Rosavirus B、Bakunsa病毒、震颤病毒(Tremovirus)A、猪Pasivirus1、PLV-CHN、PasivirusA、Sicinivirus、肝炎病毒K、肝炎病毒A、BVDV1、边界病病毒、BVDV2、CSFV-PK15C、SF573双顺反子病毒、微小RNA病毒样病毒、CRPV、萨力病毒A BN5、萨力病毒A BN2、萨力病毒A 02394、萨力病毒A GUT、萨力病毒A CH、萨力病毒A SZ1、萨力病毒FHB、CVB3、CVB1、艾柯病毒7、CVB5、EVA71、CVA3、CVA12、EV24或eIF4G的适体。
在一些实施方案中，环状RNA多核苷酸由天然核苷酸组成。在一些实施方案中，表达序列是密码子优化的。在一些实施方案中，环状RNA多核苷酸被优化为缺乏存在于等效的预先优化的多核苷酸中的至少一个微小RNA结合位点。在一些实施方案中，环状RNA多核苷酸被优化为缺乏存在于等效的预先优化的多核苷酸中的至少一个核酸内切酶敏感位点。在一些实施方案中，环状RNA多核苷酸被优化为缺乏存在于等效的预先优化的多核苷酸中的至少一个RNA编辑敏感位点。
在一些实施方案中，环状RNA多核苷酸的长度是约100个核苷酸至约10千碱基。
在一些实施方案中，环状RNA多核苷酸在人类中具有至少约20小时的体内治疗效果持续时间。在一些实施方案中，环状RNA多核苷酸具有至少约20小时的功能性半衰期。在一些实施方案中，环状RNA多核苷酸在人细胞中的治疗效果持续时间大于或等于包含相同表达序列的等效线性RNA多核苷酸的治疗效果持续时间。在一些实施方案中，环状RNA多核苷酸在人细胞中的功能性半衰期大于或等于包含相同表达序列的等效线性RNA多核苷酸的功能性半衰期。在一些实施方案中，环状RNA多核苷酸在人类中的体内治疗效果持续时间大于具有相同表达序列的等效线性RNA多核苷酸的体内治疗效果持续时间。在一些实施方案中，环状RNA多核苷酸在人类中的体内功能性半衰期大于具有相同表达序列的等效线性RNA多核苷酸的体内功能性半衰期。
在一些实施方案中，佐剂或佐剂样多肽选自包括以下的组：toll样受体配体、细胞因子、FLt3-配体、抗体、趋化因子、嵌合蛋白、从垂死肿瘤释放的内源性佐剂和检查点抑制蛋白。在一些实施方案中，佐剂或佐剂样多肽选自包括以下的组：BCSP31、MOMP、FomA、MymA、ESAT6、PorB、PVL、孔蛋白、OmpA、PepO、OmpU、2,4-二氧四氢蝶啶合酶、Omp16、Omp19、CobT、RpfE、Rv0652、HBHA、NhhA、DnaJ、肺炎球菌溶血素、鞭毛蛋白(Falgellin)、IFN-α、IFN-γ、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、GM-CSF、IL-1b、IL-6、TNF-a、IL-7、IL-17、IL-1β、抗CTLA4、抗PD1、抗41BB、PD-L1、Tim-3、Lag-3、TIGIT、GITR以及抗CD3。在一些实施方案中，佐剂或佐剂样多肽选自表10。
在一个方面，本文提供了一种RNA多核苷酸，所述RNA多核苷酸按以下顺序包含3'内含子片段和三磷酸化5'末端。在一些实施方案中，RNA多核苷酸包含位于3'内含子片段上游且三磷酸化5'末端下游的5'间隔区。
在一个方面，本文提供了一种RNA多核苷酸，所述RNA多核苷酸包含5'内含子片段和三磷酸化5'末端。在一些实施方案中，RNA多核苷酸包含位于5'内含子片段下游的5'间隔区。
在一些实施方案中，RNA多核苷酸还包含单磷酸化5'末端。
在一个方面，本文提供了一种RNA多核苷酸，所述RNA多核苷酸按以下顺序包含3'内含子片段和单磷酸化5'末端。在一些实施方案中，RNA多核苷酸包含位于3'内含子片段上游且单磷酸化5'末端下游的5'间隔区。
在一个方面，本文提供了一种RNA多核苷酸，所述RNA多核苷酸包含5'内含子片段和单磷酸化5'末端。在一些实施方案中，RNA多核苷酸包含位于5'内含子片段下游的5'间隔区。
在一些实施方案中，RNA多核苷酸还包含三磷酸化5'末端。
在一些实施方案中，RNA多核苷酸还包括多聚A纯化标签。在一些实施方案中，RNA多核苷酸还包含起始序列。
在一个方面，本文提供了一种RNA制剂，所述RNA制剂包含：a.如权利要求1、权利要求2或两者所述的环状RNA多核苷酸；以及b.包含以下中的至少一者的线性RNA多核苷酸：i.3'内含子多核苷酸，所述3'内含子多核苷酸包含单磷酸化5'末端和3'内含子片段；ii.5'内含子多核苷酸，所述5'内含子多核苷酸包含单磷酸化5'末端和5'内含子片段；iii.3'内含子多核苷酸，所述3'内含子多核苷酸包含三磷酸化5'末端和3'内含子片段；和iv.5'内含子多核苷酸，所述5'内含子多核苷酸包含三磷酸化5'末端和3'内含子片段，其中所述环状RNA多核苷酸占所述RNA制剂的至少90％。
在一些实施方案中，3'内含子多核苷酸或5'内含子多核苷酸包含间隔区。在一些实施方案中，3'内含子多核苷酸或5'内含子多核苷酸包含polyA序列。在一些实施方案中，3'内含子多核苷酸或5'内含子多核苷酸包含UTR。在一些实施方案中，其中3'内含子多核苷酸或5'内含子多核苷酸包含IRES。
在一个方面，本文提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本文公开的环状RNA多核苷酸、稀释剂和任选的盐缓冲剂。
在一个方面，本文提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本文公开的RNA制剂、稀释剂和任选的盐缓冲剂。
在一个方面，本文提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本文公开的环状RNA多核苷酸和聚阳离子、阳离子或聚合物化合物。
在一个方面，本文提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本文公开的RNA制剂和多阳离子、阳离子或聚合化合物。
在一些实施方案中，聚阳离子或阳离子化合物选自由以下组成的组：阳离子肽或蛋白质、碱性多肽、细胞穿透肽(CPP)、Tat来源的肽、穿膜肽、VP22来源的或类似物肽、瘟病毒Erns、HSV、VP22(单纯疱疹)、MAP、KALA或蛋白质转导结构域(PTD)、PpT620、富含脯氨酸的肽、富含精氨酸的肽、富含赖氨酸的肽、MPG-肽、Pep-1、L-寡聚物、降钙素肽、触角足来源的肽、pAntp、pIsl、FGF、乳铁蛋白、转运肽、蟾蜍肽抗生素(Buforin)-2、Bac715-24、SynB、SynB(1)、pVEC、hCT来源的肽、SAP、组蛋白、阳离子多糖、阳离子聚合物、阳离子脂质、树状聚合物、聚亚胺、聚烯丙胺、oligofectamine、或阳离子或聚阳离子聚合物、基于糖主链的聚合物、基于硅烷主链的聚合物、改性的聚氨基酸、改性的丙烯酸酯、改性的聚β氨基酯(PBAE)、改性的酰胺胺、树状聚合物、由一个或多个阳离子嵌段和一个或多个亲水性或疏水性嵌段的组合组成的嵌段聚合物。在一些实施方案中，聚合化合物选自由以下组成的组：聚胺、聚醚、聚酰胺、聚酯、聚氨基甲酸酯、聚脲、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚酰亚胺、聚砜、聚氨酯、聚乙炔、聚乙烯、聚乙烯亚胺、聚异氰酸酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯腈和聚芳酯。例如，聚合物可包括聚(己内酯)(PCL)、乙烯乙酸乙烯酯聚合物(EVA)、聚(乳酸)(PLA)、聚(L-乳酸)(PLLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(L-乳酸-共-乙醇酸)(PLLGA)、聚(D,L-丙交酯)(PDLA)、聚(L丙交酯)(PLLA)、聚(D,L-丙交酯-共-己内酯)、聚(D,L-丙交酯-共-己内酯-共乙交酯)、聚(D,L-丙交酯-共-PEO-共-D,L-丙交酯)、聚(D,L-丙交酯-共-PPO-共-D,L-丙交酯)、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚氨酯、聚-L-赖氨酸(PLL)、甲基丙烯酸羟丙酯(HPMA)、聚乙二醇、聚-L-谷氨酸、聚(羟基酸)、聚酸酐、聚原酸酯、聚(酯酰胺)、聚酰胺、聚(酯醚)、聚碳酸酯、聚烯烃如聚乙烯和聚丙烯、聚亚烷基二醇如聚(乙二醇)(PEG)、聚环氧烷(PEO)、聚对苯二甲酸亚烷基酯如聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯醚、聚乙烯酯如聚(乙酸乙烯酯)、聚乙烯卤化物如聚(氯乙烯)(PVC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚硅氧烷、聚苯乙烯、聚氨酯、衍生的纤维素如烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、丙烯酸的聚合物如聚((甲基)丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚((甲基)丙烯酸乙酯)、聚((甲基)丙烯酸丁酯)、363 5 10 15 20 2530 35WO 2021/076805 PCT/US2020/055844聚((甲基)丙烯酸异丁酯)、聚((甲基)丙烯酸己酯)、聚((甲基)丙烯酸异癸酯)、聚((甲基)丙烯酸月桂酯)、聚((甲基)丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸十八烷基酯)及其共聚物和混合物、聚二氧杂环己酮及其共聚物、聚羟基烷酸酯、聚丙烯富马酸酯、聚甲醛、泊洛沙姆(poloxamer)、泊洛沙胺(poloxamine)、聚(原酸)酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共-己内酯)、三亚甲基碳酸酯、聚(N-丙烯酰吗啉)(PAcM)、具(2-甲基-2-噁唑啉)(PMOX)、具(2-乙基-2-噁唑啉)(PEOZ)以及聚甘油。在一些实施方案中，聚阳离子或阳离子化合物选自由以下组成的组：鱼精蛋白、核仁蛋白、精胺或亚精胺、聚L-赖氨酸(PLL)、聚精氨酸、HIV结合肽、HIV-1Tat(HIV)、聚乙烯亚胺(PEI)、DOTMA：[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵、DMRIE、二-C14-脒、DOTIM、SAINT、DC-Chol、BGTC、CTAP、DOPC、DODAP、DOPE：二油酰基磷脂酰乙醇胺、DOSPA、DODAB、DOIC、DMEPC、DOGS：双十八烷基酰胺基甘氨酰基精胺、DIMRI：二肉豆蔻氧基丙基二甲基羟乙基溴化铵、DOTAP：二油酰基氧基-3-(三甲基铵)丙烷、DC-6-14：O,O-双十四烷酰基-N-.α.-三甲基铵基乙酰基)二乙醇胺氯化物、CLIP 1：外消旋-[(2,3-双十八烷基氧基丙基)(2-羟乙基)]-二甲基氯化铵、CLIP6：外消旋-[2(2,3-双十六烷基氧基丙基氧基甲基氧基)乙基]三甲基铵、CLIP9：外消旋-[2(2,3-双十六烷基氧基丙基氧基琥珀酰基氧基)乙基]-三甲基铵、β-氨基酸-聚合物或反向聚酰胺、PVP(聚(N-乙基-4-乙烯基溴化吡啶))、pDMAEMA(聚(二甲氨基乙基甲基丙烯酸酯))、pAMAM(聚(酰胺胺))、二胺端修饰的1,4丁二醇二丙烯酸酯-co-5-氨基-1-戊醇聚合物、聚丙胺树状聚合物或基于pAMAM的树状聚合物、聚亚胺、PEI：聚(乙烯亚胺)、聚(丙烯亚胺)、聚烯丙胺、基于环糊精的聚合物、基于葡聚糖的聚合物、壳聚糖和PMOXA-PDMS共聚物。
在一个方面，本文提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本文公开的环状RNA多核苷酸、纳米颗粒和任选的与所述纳米颗粒可操作地连接的靶向部分。
在一个方面，本文提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本文公开的RNA制剂、纳米颗粒和任选的与所述纳米颗粒可操作地连接的靶向部分。
在一些实施方案中，纳米颗粒是脂质纳米颗粒、核-壳纳米颗粒、生物可降解纳米颗粒、生物可降解脂质纳米颗粒、聚合物纳米颗粒或生物可降解聚合物纳米颗粒。在某些实施方案中，纳米颗粒包含选自下组的一种或多种阳离子脂质：C12-200、MC3、DLinDMA、DLinkC2DMA、cKK-E12、ICE(基于咪唑的)、HGT5000、HGT5001、DODAC、DDAB、DMRIE、DOSPA、DOGS、DODAP、DODMA和DMDMA、DODAC、DLenDMA、DMRIE、CLinDMA、CpLinDMA、DMOBA、DOcarbDAP、DLinDAP、DLincarbDAP、DLinCDAP、KLin-K-DMA、DLin-K-XTC2-DMA、HGT4003或它们的组合。
在一些实施方案中，药物组合物包含靶向部分，其中在没有细胞分离或纯化的情况下，所述靶向部分介导经受体介导的胞吞作用或直接融合至选定细胞群或组织的选定细胞中。在一些实施方案中，靶向部分是scFv、纳米抗体、肽、微型抗体、多核苷酸适体、重链可变区、轻链可变区或其片段。在一些实施方案中，环状RNA多核苷酸或RNA制剂处于有效治疗有需要的人受试者中的感染(例如，病毒感染)的量。在一些实施方案中，与包含含有编码抗原的外源性DNA的载体的药物组合物相比，所述药物组合物具有增强的安全性特征。在一些实施方案中，组合物中少于1重量％的多核苷酸是双链RNA、DNA夹板或三磷酸化RNA。在一些实施方案中，药物组合物中少于1重量％的多核苷酸和蛋白质是双链RNA、DNA夹板、三磷酸化RNA、磷酸酶蛋白质、蛋白质连接酶和加帽酶。
在一个方面，本文提供了一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含本文公开的环状RNA多核苷酸、纳米颗粒和任选的与所述纳米颗粒可操作地连接的靶向部分。在一个方面，本文提供了一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含本文公开的RNA制剂、纳米颗粒和任选的与所述纳米颗粒可操作地连接的靶向部分。
在一些实施方案中，受试者患有感染(例如，病毒感染)。在一些实施方案中，治疗有需要的受试者的方法还包括共同施用抗炎剂。
在一些实施方案中，组合物包含靶向部分，其中在没有细胞分离或纯化的情况下，所述靶向部分介导经受体介导的胞吞作用进入选定细胞群的选定细胞中。在一些实施方案中，靶向部分是scFv、纳米抗体、肽、微型抗体、重链可变区、轻链可变区或其片段。在一些实施方案中，组合物包含靶向部分，其中在没有细胞分离或纯化的情况下，所述靶向部分介导经受体介导的胞吞作用进入选定细胞群的选定细胞中。
在一些实施方案中，纳米颗粒是脂质纳米颗粒、核-壳纳米颗粒或生物可降解纳米颗粒。在一些实施方案中，纳米颗粒包含一种或多种阳离子脂质、可电离脂质或聚β-氨基酯。在一些实施方案中，纳米颗粒包含一种或多种非阳离子脂质。在一些实施方案中，纳米颗粒包含一种或多种PEG修饰的脂质、聚谷氨酸脂质或透明质酸脂质。在一些实施方案中，纳米颗粒包含胆固醇。在一些实施方案中，纳米颗粒包含花生四烯酸或油酸。在一些实施方案中，纳米颗粒包封多于一种环状RNA多核苷酸。
在一个方面，本文提供了一种用于制备环状RNA多核苷酸的载体，所述载体按以下顺序包含5'双链体形成区、3'I组内含子片段、内部核糖体进入位点(IRES)、编码一种或多种佐剂、抗原或佐剂样或抗原样多肽或其片段的表达序列、5'I组内含子片段和3'双链体形成区。
在一个方面，本文提供了一种用于制备环状RNA多核苷酸的载体，所述载体按以下顺序包含5'双链体形成区、3'I组内含子片段、内部核糖体进入位点(IRES)、非编码序列、5'I组内含子片段和3'双链体形成区。
在一些实施方案中，载体包含位于所述5'双链体形成区与所述3'I组内含子片段之间的第一间隔区，以及位于所述5'I组内含子片段与所述3'双链体形成区之间的第二间隔区。在一些实施方案中，第一和第二间隔区各自具有约20至约60个核苷酸的长度。在某些实施方案中，第一和第二间隔区各自包含至少5个核苷酸长的非结构化区域。在一些实施方案中，第一和第二间隔区各自包含至少7个核苷酸长的结构化区域。在一些实施方案中，第一和第二双链体形成区各自具有约9至50个核苷酸的长度。在一些实施方案中，载体是密码子优化的。在某些实施方案中，载体缺少存在于等效的预先优化多核苷酸中的至少一个微小RNA结合位点。
在一个方面，本文提供了一种包含本文公开的载体的原核细胞。在一个方面，本文提供了一种包含本文公开的环状RNA多核苷酸的真核细胞。在一些实施方案中，真核细胞是人细胞。在一些实施方案中，真核细胞是抗原呈递细胞。
在一个方面，本文提供了一种疫苗，所述疫苗包含：配制在脂质纳米颗粒中的至少一种环状RNA多核苷酸，所述至少一种环状RNA多核苷酸具有编码至少一种病毒抗原多肽、佐剂或佐剂样多肽或其免疫原性片段的表达序列。在一些实施方案中，佐剂或佐剂样多肽选自表10。在一些实施方案中，抗原多肽是来自以下的病毒多肽：腺病毒；单纯疱疹，1型；单纯疱疹，2型；脑炎病毒、乳头瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒；爱泼斯坦-巴尔病毒；人巨细胞病毒；人疱疹病毒，8型；人乳头瘤病毒；BK病毒；JC病毒；天花；脊髓灰质炎病毒；乙型肝炎病毒；人博卡病毒；细小病毒B19；人星状病毒；诺沃克病毒；柯萨奇病毒；甲型肝炎病毒；脊髓灰质炎病毒；鼻病毒；严重急性呼吸道综合征病毒；丙型肝炎病毒；黄热病毒；登革热病毒；西尼罗病毒；风疹病毒；戊型肝炎病毒；人免疫缺陷病毒(HIV)；流感病毒；瓜纳里托病毒；胡宁病毒；拉沙病毒；马丘波病毒；萨比亚病毒；克里米亚-刚果出血热病毒；埃博拉病毒；马尔堡病毒；麻疹病毒；腮腺炎病毒；副流感病毒；呼吸道合胞病毒；人偏肺病毒；亨德拉病毒；尼帕病毒；狂犬病病毒；丁型肝炎；轮状病毒；环状病毒；科罗拉多壁虱热病毒(Coltivirus)；版纳病毒；人肠道病毒；汉坦病毒；西尼罗病毒；中东呼吸道综合征冠状病毒；日本脑炎病毒；水疱性疱疹病毒；SARS-CoV-2；东方马脑炎或前述中的任何两种或更多种的组合。在一些实施方案中，病毒抗原多肽或其免疫原性片段选自或源自SEQ ID NO:325-336中的任一个。在一些实施方案中，病毒抗原多肽或其免疫原性片段具有与SEQ ID NO:325-336中的任一个的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且其中所述抗原多肽或其免疫原性片段具有膜融合活性，附着至细胞受体，引起病毒和哺乳动物细胞膜的融合，和/或负责将病毒结合至受感染的细胞。
在一个方面，本文提供了一种SARS-CoV2疫苗，所述疫苗包含：配制在脂质纳米颗粒中的至少一种环状RNA多核苷酸，所述至少一种环状RNA多核苷酸具有编码至少一种SARS-CoV2病毒抗原多肽或其免疫原性片段的表达序列。在一些实施方案中，SARS-CoV2病毒抗原多肽选自：SARS-CoV2刺突蛋白Nsp1–Nsp16、ORF3a、ORF6、ORF7a、ORFb、ORF8、ORF10、SARS-CoV2包膜蛋白、SARS-CoV2膜蛋白、SARS-CoV2核衣壳蛋白或SARS-CoV2的任何抗原肽或SARS-CoV2肽的片段。在一些实施方案中，SARS-CoV2病毒抗原多肽源自SARS-CoV2病毒株G、株GR、株GH、株L、株V或它们的组合。
在一些实施方案中，本文公开的疫苗(例如，SARS-CoV2疫苗)中包含的表达序列是密码子优化的。在一些实施方案中，疫苗(例如，SARS-CoV2疫苗)是多价的。在一些实施方案中，疫苗(例如，SARS-CoV2疫苗)以有效量配制以产生抗原特异性免疫应答。
在一些实施方案中，环状RNA多核苷酸包含编码第一病毒抗原多肽的第一表达序列和编码第二病毒抗原多肽的第二表达序列。
在一个方面，本文提供了一种在受试者中诱导免疫应答的方法，所述方法包括以有效在所述受试者中产生抗原特异性免疫应答的量向所述受试者施用本文所公开的疫苗。在一个方面，本文提供了一种在受试者中诱导免疫应答的方法，所述方法包括以有效在所述受试者中产生抗原特异性免疫应答的量向所述受试者施用本文所公开的SARS-CoV2。
在一些实施方案中，抗原特异性免疫应答包括T细胞应答或B细胞应答。在一些实施方案中，向受试者施用单剂量的疫苗。在一些实施方案中，向受试者施用加强剂量的疫苗。在一些实施方案中，疫苗通过鼻内施用、皮内注射或肌内注射施用于受试者。在一些实施方案中，受试者中产生的抗抗原多肽抗体滴度相对于预先确定的阈值水平增加至少1个对数。在一些实施方案中，受试者中产生的抗抗原多肽抗体滴度相对于预先确定的阈值水平增加至少1-3个对数。在一些实施方案中，受试者中产生的抗抗原多肽抗体滴度相对于预先确定的阈值水平增加至少2倍。在一些实施方案中，受试者中产生的抗抗原多肽抗体滴度相对于预先确定的阈值水平增加2-10倍。在一些实施方案中，预先确定的阈值水平是在未施用包含抗原多肽的疫苗的受试者中产生的抗抗原多肽抗体滴度。在一些实施例中，预先确定的阈值水平是在施用了包含抗原多肽的减毒活疫苗或灭活疫苗的受试者中产生的抗抗原多肽抗体滴度。在一些实施方案中，预先确定的阈值水平是在施用了包含抗原多肽的重组蛋白疫苗或纯化蛋白疫苗的受试者中产生的抗抗原多肽抗体滴度。
在一个方面，本文提供了一种环状RNA多核苷酸，所述环状RNA多核苷酸具有编码至少一种病毒抗原多肽、佐剂或佐剂样多肽或其免疫原性片段的表达序列。在一个方面，本文提供了一种表达载体，所述表达载体包含编码本文公开的至少一种环状RNA多核苷酸的工程化核酸。
在一个方面，本文提供了一种在脂质纳米颗粒中配制的环状RNA多核苷酸疫苗，所述疫苗包含本文公开的环状RNA多核苷酸。在一些实施方案中，纳米颗粒具有50-200nm的平均直径。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含阳离子脂质、PEG修饰的脂质、固醇以及非阳离子脂质。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒载体包含约20％-60％阳离子脂质、0.5％-15％PEG修饰的脂质、25％-55％固醇和25％非阳离子脂质的摩尔比。在一些实施方案中，阳离子脂质是可电离阳离子脂质，并且非阳离子脂质是中性脂质，并且固醇是胆固醇。在一些实施方案中，阳离子脂质选自2,2-二亚油基-4-二甲氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)以及二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-(二甲氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(L319)。在一些实施方案中，纳米颗粒具有小于0.4的多分散性值。在一些实施方案中，纳米颗粒在中性pH值下具有净中性电荷。
在公开的疫苗的一些实施方案中，环状RNA多核苷酸佐剂在同一纳米颗粒中与共配制。在一些实施方案中，佐剂是CpG、咪喹莫特、铝或弗氏佐剂。
在一个方面，本文提供了一种用于受试者的疫苗接种的药物组合物，所述药物组合物包含有效剂量的编码至少一种病毒抗原或佐剂或佐剂样多肽或其免疫原性片段的环状RNA多核苷酸，其中所述有效剂量足以产生通过针对所述抗原或佐剂或佐剂样多肽或其免疫原性片段的中和抗体产生的1,000-10,000中和滴度，如在施用后1-72小时在所述受试者的血清中所测量。在一个方面，本文提供了一种用于受试者的疫苗接种的药物组合物，所述药物组合物包含有效剂量的编码至少一种病毒抗原或佐剂或佐剂样多肽或其免疫原性片段的环状mRNA，其中所述有效剂量足以产生可检测水平的抗原或佐剂或佐剂样多肽或其免疫原性片段，如在施用后1-72小时在所述受试者的血清中所测量。在一些实施方案中，药物组合物用于在受试者中诱导抗原特异性免疫应答的方法中，所述方法包括以有效在所述受试者中产生抗原特异性免疫应答的量向所述受试者施用疫苗或药物组合物。
在一个方面，本文提供了一种在受试者中诱导、产生或增强免疫应答的方法，所述方法包括以有效在所述受试者中诱导、产生或增强抗原特异性免疫应答的量向所述受试者施用本文公开的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物使受试者针对病毒免疫，持续长达2年。在一些实施方案中，药物组合物使受试者针对病毒免疫，持续超过2年。在一些实施方案中，受试者已暴露于病毒，其中所述受试者感染所述病毒，或者其中所述受试者有被所述病毒感染的风险。在一些实施方案中，受试者免疫功能低下。
在一个方面，本文提供了本文公开的疫苗或药物组合物在制造用于在受试者中诱导抗原特异性免疫应答的方法中使用的药物中的用途，所述方法包括以有效在所述受试者中产生抗原特异性免疫应答的量向所述受试者施用所述疫苗。
在一个方面，本文提供了一种在哺乳动物中诱导针对多种病毒或病毒株的交叉反应性的方法，所述方法包括向有需要的哺乳动物施用任一前述权利要求所述的疫苗或任一前述权利要求所述的药物组合物。在一些实施方案中，方法包括分别向哺乳动物施用至少两种环状RNA多核苷酸，所述至少两种RNA多核苷酸具有各自编码共有病毒抗原的表达序列。在一些实施方案中，方法包括同时向哺乳动物施用至少两种环状RNA多核苷酸，所述至少两种RNA多核苷酸具有各自编码共有病毒抗原的表达序列。在一些实施方案中，方法包括。
附图说明
图1描绘用包含高斯荧光素酶表达序列和各种IRES序列的环状RNA转染后24小时HEK293细胞(图1A、1D和1E)、HepG2细胞(图1B)或1C1C7(图1C)细胞的上清液中的发光。
图2描绘用包含高斯荧光素酶表达序列和具有不同长度的各种IRES序列的环状RNA转染后24小时HEK293细胞(图2A)、HepG2细胞(图2B)或1C1C7(图2C)细胞的上清液中的发光。
图3描绘如通过发光测量的3天内HepG2(图3A)或1C1C7(图3B)细胞中选定IRES构建体的稳定性。
图4A和4B描绘如通过来自细胞的上清液中分泌的高斯荧光素酶的发光所测量的来自Jurkat细胞中的选定IRES构建体的蛋白质表达。
图5A和5B描绘如通过发光测量的3天内Jurkat细胞中的选定IRES构建体的稳定性。
图6描绘编码高斯荧光素酶的经修饰的线性、未纯化的环状或纯化的环状RNA的24小时发光(图6A)或3天内的相对发光(图6B)的比较。
图7描绘用经修饰的线性、未纯化的环状或纯化的环状RNA对Jurkat细胞进行电穿孔后IFNγ(图7A)、IL-6(图7B)、IL-2(图7C)、RIG-I(图7D)、IFN-β1(图7E)和TNFα(图7F)的转录物诱导。
图8描绘人原代单核细胞(图8A)和巨噬细胞(图8B和图8C)中编码高斯荧光素酶的环状RNA和经修饰的线性RNA的发光比较。
图9描绘用包含高斯荧光素酶表达序列和不同IRES序列的环状RNA转导后原代T细胞的上清液中3天内的相对发光(图9A)或24小时发光(图9B)。
图10描绘用包含高斯荧光素酶表达序列的环状RNA或经修饰的线性RNA转导后原代T细胞的上清液中的24小时发光(图10A)、或3天内的相对发光(图10B)以及PBMC中的24小时发光(图10C)。
图11描绘具有不同置换位点的RNA构建体的HPLC色谱图(图11A)和环化效率(图11B)。
图12描绘具有不同内含子和/或置换位点的RNA构建体的HPLC色谱图(图12A)和环化效率(图12B)。
图13描绘具有或不具有同源臂的3种RNA构建体的HPLC色谱图(图13A)和环化效率(图13B)。
图14描绘没有同源臂或具有不同长度和GC含量的同源臂的3种RNA构建体的环化效率。
图15A和15B描绘HPLC色谱图，其显示强同源臂对提高剪接效率的贡献、选定构建体中环化效率与切口之间的关系、以及假设展示提高的环化效率的置换位点和同源臂的组合。
图16示出模拟电穿孔(左)或用编码CAR的环状RNA(右)电穿孔并与表达GFP和萤火虫荧光素酶的Raji细胞共培养的T细胞的荧光图像。
图17示出模拟电穿孔(顶部)或用编码CAR的环状RNA电穿孔(底部)并与表达GFP和萤火虫荧光素酶的Raji细胞共培养的T细胞的明场(左)、荧光(中)和叠加(右)图像。
图18描绘模拟电穿孔或用编码不同CAR序列的环状RNA电穿孔的T细胞对Raji靶细胞的特异性裂解。
图19描绘用包含高斯荧光素酶表达序列和不同IRES序列的线性或环状RNA转导后24小时Jurkat细胞(左)或静息原代人CD3+T细胞(右)的上清液中的发光(图19A)，以及在3天内的相对发光(图19B)。
图20描绘用经修饰的线性、未纯化的环状或纯化的环状RNA对人CD3+T细胞进行电穿孔后的IFN-β1(图20A)、RIG-I(图20B)、IL-2(图20C)、IL-6(图20D)、IFNγ(图20E)和TNFα(图20F)的转录物诱导。
图21描绘如通过萤火虫发光检测确定的用编码CAR的circRNA电穿孔的人原代CD3+T细胞对Raji靶细胞的特异性裂解(图21A)，和用不同量的编码CAR序列的环状或线性RNA电穿孔后24小时的IFNγ转录物诱导(图21B)。
图22描绘如通过检测萤火虫发光确定的用编码CAR的环状或线性RNA以不同的E:T比率电穿孔的人原代CD3+T细胞对靶细胞或非靶细胞的特异性裂解(图22A和图22B)。
图23描绘在电穿孔后第1、3、5和7天，用编码CAR的RNA电穿孔的人CD3+T细胞对靶细胞的特异性裂解。
图24描绘用编码CD19或BCMA靶向CAR的环状RNA电穿孔的人CD3+T细胞对靶细胞的特异性裂解。
图25描绘从CD-1小鼠收获的器官的总通量，所述小鼠给予了编码FLuc并用50％脂质10b-15、10％DSPC、1.5％PEG-DMG和38.5％胆固醇配制的环状RNA。
图26示出突出显示从CD-1小鼠收获的器官的发光的图像，所述小鼠给予了编码FLuc并用50％脂质10b-15、10％DSPC、1.5％PEG-DMG和38.5％胆固醇配制的环状RNA。
图27描绘脂质10a-26和10a-27的分子表征。图27A示出脂质10a-26的质子核磁共振(NMR)谱。图27B示出通过液相色谱-质谱(LC-MS)测量的脂质10a-26的保留时间。图27C示出脂质10a-26的质谱。图27D示出脂质10a-27的质子NMR谱。图27E示出通过LC-MS测量的脂质10a-27的保留时间。图27F示出脂质10a-27的质谱。
图28描绘脂质22-S14及其合成中间体的分子表征。图28A描绘2-(十四烷基硫代)乙-1-醇的NMR谱。图28B描绘丙烯酸2-(十四烷基硫代)乙酯的NMR谱。图28C描绘双(2-(十四烷基硫代)乙基)3,3'-((3-(2-甲基-1H-咪唑-1-基)丙基)氮烷二基)二丙酸酯(脂质22-S14)的NMR谱。
图29描绘双(2-(十四烷基硫代)乙基)3,3'-((3-(1H-咪唑-1-基)丙基)氮烷二基)二丙酸酯(脂质93-S14)的NMR谱。
图30描绘8-((3-(2-甲基-1H-咪唑-1-基)丙基)(8-(壬基氧基)-8-氧代辛基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(脂质10a-54)的分子表征。图30A示出脂质10a-54的质子NMR谱。图30B示出通过LC-MS测量的脂质10a-54的保留时间。图30C示出脂质10a-54的质谱。
图31描绘8-((3-(1H-咪唑-1-基)丙基)(8-(壬基氧基)-8-氧代辛基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(脂质10a-53)的分子表征。图31A示出脂质10a-53的质子NMR谱。图31B示出通过LC-MS测量的脂质10a-53的保留时间。图31C示出脂质10a-53的质谱。
图32A描绘从CD-1小鼠收获的脾和肝的总通量，所述小鼠给予了编码萤火虫萤光素酶(FLuc)并用16:1:4:1重量比或62:4:33:1摩尔比的目标可电离脂质、DSPC、胆固醇和DSPE-PEG 2000(Avanti Polar Lipids Inc.)配制的环状RNA。图32B描绘蛋白质表达的生物分布的平均辐射度。
图33A描绘突出显示从CD-1小鼠收获的器官的发光的图像，所述小鼠给予了编码FLuc并用16:1:4:1重量比或62:4:33:1摩尔比的可电离脂质22-S14、DSPC、胆固醇和DSPE-PEG 2000(Avanti Polar Lipids Inc.)配制的环状RNA。图33B描绘CD-1小鼠的全身IVIS图像，所述小鼠给予了编码FLuc并用16:1:4:1重量比或62:4:33:1摩尔比的可电离脂质22-S14、DSPC、胆固醇和DSPE-PEG 2000(Avanti Polar Lipids Inc.)配制的环状RNA。
图34A描绘突出显示从CD-1小鼠收获的器官的发光的图像，所述小鼠给予了编码FLuc并用16:1:4:1重量比或62:4:33:1摩尔比的可电离脂质93-S14、DSPC、胆固醇和DSPE-PEG 2000(Avanti Polar Lipids Inc.)配制的环状RNA。图34B描绘CD-1小鼠的全身IVIS图像，所述小鼠给予了编码FLuc并用16:1:4:1重量比或62:4:33:1摩尔比的可电离脂质93-S14、DSPC、胆固醇和DSPE-PEG 2000(Avanti Polar Lipids Inc.)配制的环状RNA。
图35A描绘突出显示从CD-1小鼠收获的器官的发光的图像，所述小鼠给予了编码FLuc并用16:1:4:1重量比或62:4:33:1摩尔比的可电离脂质10a-26、DSPC、胆固醇和DSPE-PEG 2000(Avanti Polar Lipids Inc.)配制的环状RNA。图35B描绘CD-1小鼠的全身IVIS图像，所述小鼠给予了编码FLuc并用16:1:4:1重量比或62:4:33:1摩尔比的可电离脂质10a-26、DSPC、胆固醇和DSPE-PEG 2000(Avanti Polar Lipids Inc.)配制的环状RNA。
图36描绘突出显示从c57BL/6J小鼠收获的器官的发光的图像，所述小鼠给予了编码FLuc并包封在由脂质10b-15(图36A)、脂质10a-53(图36B)或脂质10a-54(图36C)形成的脂质纳米颗粒中的环状RNA。PBS用作对照(图36D)。
图37A和37B描绘在与含有编码萤火虫荧光素酶的环状RNA的测试脂质纳米颗粒一起孵育24小时后，人PBMC的裂解物中的相对发光。
图38示出在与含有编码GFP或CD19 CAR的环状RNA的测试脂质纳米颗粒一起孵育后，人PBMC中GFP(图37A)和CD19 CAR(图37B)的表达。
图39描绘用包含抗鼠CD19 CAR表达序列和不同IRES序列的环状RNA脂转染的1C1C7细胞中抗鼠CD19 CAR的表达。
图40示出抗鼠CD19 CAR对鼠T细胞的细胞毒性。CD19 CAR由环状RNA编码并且从环状RNA表达，所述环状RNA被电穿孔到鼠T细胞中。
图41描绘每隔一天注射测试脂质纳米颗粒的C57BL/6J小鼠的外周血(图40A和40B)或脾(图40C)中的B细胞计数，所述脂质纳米颗粒包封编码抗鼠CD19 CAR的环状RNA。
图42A和42B比较从环状RNA表达的抗人CD19 CAR的表达水平与从线性mRNA表达的抗人CD19 CAR的表达水平。
图43A和43B比较从环状RNA表达的抗人CD19 CAR的细胞毒性作用与从线性mRNA表达的抗人CD19 CAR的细胞毒性作用。
图44描绘从T细胞中的单个环状RNA表达的两种CAR(抗人CD19 CAR和抗人BCMACAR)的细胞毒性。
图45A示出在用脂质10a-27或10a-26或脂质10b-15形成的LNP处理后，各种脾免疫细胞亚群中tdTomato表达频率的代表性FACS图。图45B示出表达tdTomato的骨髓细胞、B细胞和T细胞的比例的定量(平均值+标准偏差，n＝3)，相当于用Cre环状RNA成功转染的每个细胞群的比例。图45C示出在用脂质27和26处理后表达tdTomato的额外脾免疫细胞群(包括NK细胞、经典单核细胞、非经典单核细胞、嗜中性粒细胞和树突细胞)的比例(平均值+标准差，n＝3)。
图46A描绘在内含子中具有内置多聚A序列的示例性RNA构建体设计。图46B示出未纯化的环状RNA的色谱迹线。图46C示出亲和纯化的环状RNA的色谱迹线。图46D示出用不同IVT条件和纯化方法制备的环状RNA的免疫原性。(商业＝商业IVT混合物；定制＝定制IVT混合物；Aff＝亲和纯化；Enz＝酶纯化；GMP:GTP比率＝8、12.5或13.75)。
图47A描绘具有专用结合序列作为用于杂交纯化的多聚A的替代物的示例性RNA构建体设计。图47B示出未纯化的环状RNA的色谱迹线。图46C示出亲和纯化的环状RNA的色谱迹线。
图48A示出编码肌营养不良蛋白的未纯化的环状RNA的色谱迹线。图48B示出酶纯化的编码肌营养不良蛋白的环状RNA的色谱迹线。
图49比较Jurkat细胞中在3'内含子片段/5'内部双链体区与IRES之间具有不同5'间隔区的纯化circRNA的表达(图49A)和稳定性(图49B)。(AC＝在间隔区序列中仅使用A和C；UC＝在间隔区序列中仅使用U和C。)
图50示出原代T细胞中来自含有所指示的原始或经修饰的IRES元件的环状RNA的发光表达水平和表达稳定性。
图51示出HepG2细胞中来自含有所指示的原始或经修饰的IRES元件的环状RNA的发光表达水平和表达稳定性。
图52示出1C1C7细胞中来自含有所指示的原始或经修饰的IRES元件的环状RNA的发光表达水平和表达稳定性。
图53示出HepG2细胞中来自含有插入的非翻译区(UTR)的IRES元件或杂合IRES元件的环状RNA的发光表达水平和表达稳定性。“Scr”表示乱序，其用作对照。
图54示出1C1C7细胞中来自含有可操作地连接至高斯荧光素酶编码序列的IRES和可变终止密码子盒的环状RNA的发光表达水平和表达稳定性。
图55示出1C1C7细胞中来自含有IRES和在高斯荧光素酶编码序列的起始密码子之前插入的可变非翻译区(UTR)的环状RNA的发光表达水平和表达稳定性。
图56示出Huh7细胞中来自在hEPO编码序列下游含有两个miR-122靶位点的环状RNA的人促红细胞生成素(hEPO)的表达水平。
图57示出SupT1细胞(来自人类T细胞肿瘤系)和MV4-11细胞(来自人类巨噬细胞系)中来自在体外用编码萤火虫荧光素酶的环状RNA转染的LNP的发光表达水平。
图58示出基于不同的辅助脂质、PEG脂质和可电离脂质:磷酸酯比率制剂，含有环状RNA的转染的原代人T细胞LNP对ApoE的依赖性的比较。
图59示出在有或没有ApoE3辅助下，含有编码eGFP的环状RNA的LNP到激活的原代人T细胞中的摄取。
图60示出Cre报告基因小鼠模型中来自含有编码Cre荧光蛋白的环状RNA的LNP的免疫细胞表达。
图61示出静脉内注射已经用编码mOX40L的环状RNA的LNP后，野生型小鼠中mOX40L的免疫细胞表达。
图62示出用能够表达mOX40L的环状RNA转染的LNP中mOX40L的单剂量。图62A和62B提供脾T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、NK细胞、树突细胞和其它骨髓细胞中mOX40L表达的百分比。图62C提供转染后24小时的小鼠重量变化。
图63示出小鼠中用环状RNA静脉内转染的LNP的B细胞耗减。图63A通过活的、CD45+免疫细胞的B220+B细胞定量B细胞耗减，并且图63B与表达环状RNA的荧光素酶相比，比较活的、CD45+免疫细胞的B220+B细胞的B细胞耗减。图63C提供经转染细胞的B细胞体重增加。
图64示出当用包封表达抗CD19 CAR的环状RNA的LNP处理时，外周血(图64A)和脾脏(图64B)中的CAR表达水平。抗CD20(aCD20)和编码荧光素酶(oLuc)环状RNA用于比较。
图65示出抗CD19 CAR表达的总体频率、细胞表面上抗CD19CAR表达的频率以及编码抗CD19 CAR的IRES特异性环状RNA的抗肿瘤应答对T细胞的影响。图65A示出抗CD19 CAR几何平均荧光强度，图65B示出抗CD19 CAR表达的百分比，并且图65C示出通过抗CD19 CAR进行的靶细胞裂解百分比。(CK＝山羊嵴病毒；AP＝姬鼠小核糖核酸病毒；CK*＝具有密码子优化的山羊嵴病毒；PV＝Parabovirus；SV＝萨力病毒。)
图66示出用IRES特异性环状RNA构建体处理时，A20 FLuc靶细胞的CAR表达水平。
图67示出原代人T细胞中来自环状RNA的胞质蛋白(图67A)和表面蛋白(图67B)的发光表达水平。
图68示出用IRES特异性环状构建体处理时，人T细胞中的发光表达。将环状RNA构建体中的表达与线性mRNA进行比较。图68A、图68B和图68G提供多个供体细胞中的高斯荧光素酶表达。图68C、图68D、图68E和图68F提供多个供体细胞中的萤火虫荧光素酶表达。
图69示出在用含有编码抗CD19或抗BCMA CAR的环状RNA的脂质纳米颗粒处理表达萤火虫荧光素酶的K562细胞后，人T细胞中的抗CD19 CAR(图69A和图69B)和抗BCMA CAR(图68B)表达。
图70示出通过体外电穿孔以特定抗原依赖性方式递送编码抗CD19 CAR的环状RNA所产生的抗CD19 CAR表达水平。图70A示出用抗CD19 CAR裂解Nalm6细胞。图70B示出用抗CD19 CAR裂解K562细胞。
图71示出通过在含有LNP和表达绿色荧光蛋白(GFP)的环状RNA的溶液中使用ApoE3而介导的LNP转染。图71A示出活-死结果。图71B、图71C、图71D和图71E提供多个供体的表达频率。
图72A、图72B、图72C、图72D、图72E、图72F、图72G、图72H、图72I、图72J、图72K和图72L示出不同脂质制剂的总通量和表达百分比。参见实施例74。
图73示出编码稳定化(双脯氨酸突变体)SARS-CoV2刺突蛋白的RNA分子的环化效率。图73A示出约4.5kb编码SARS-CoV2刺突的circRNA的体外转录产物。图73B示出将编码棘突的circRNA转染到293细胞中后，通过流式细胞术得到的刺突蛋白表面表达的直方图。在转染后24小时用CR3022第一抗体和APC标记的第二抗体对转染的293细胞进行染色。图73C在转染编码刺突的circRNA后，293细胞上的刺突蛋白表面表达的流式细胞术图。在转染后24小时用CR3022第一抗体和APC标记的第二抗体对转染的293细胞进行染色。
图74提供多种受控佐剂策略。如在图上所示的CircRNA需要在体外使用GTP作为指示剂分子进行未纯化的有义环状RNA剪接反应。3p-circRNA需要纯化有义环状RNA以及混合的含有三磷酸化5'末端的纯化反义环状RNA。图74A示出野生型和MAVS敲除A549细胞中的体外IFN-β诱导，并且图74B示出对使用所指示的策略生成的配制的circRNA的体内细胞因子应答。
图75示出含LNP环状RNA构建体的肌内递送。图75A提供在6小时时间段后的活体全身通量，并且75B提供在1μg剂量的LNP-环状RNA构建体后6小时全身IVIS。图75C提供在24小时时间段内的离体表达分布。
图76示出从单一脂质制剂表达多种环状RNA。图76A提供单个和混合组LNP含环状RNA构建物的hEPO滴度，而图76B提供了来自单个或混合组含LNP环状RNA构建体的生物荧光表达的总通量。
图77示出编码刺突SARS-CoV2蛋白的环状RNA的SARS-CoV2刺突蛋白表达。图77A示出刺突CoV2表达的频率；图77B示出刺突CoV2表达的几何平均荧光强度(gMFI)，并且图77C将构建体的gMFI表达与表达的频率进行比较。
具体实施方式
本文描述用于选择、设计、制备、制造、配制和/或使用环状RNA疫苗的组合物、方法、过程、试剂盒以及装置。本发明另外提供了包含一种或多种环状RNA疫苗的组合物，例如药物组合物。
本发明的环状RNA疫苗包含编码一种或多种野生型或工程化蛋白质、肽或多肽(例如，佐剂和抗原)的一种或多种环状RNA多核苷酸。在一些实施方案中，佐剂、佐剂样蛋白和抗原所来源或工程化自的传染因子包括但不限于病毒、细菌、真菌、原生动物和/或寄生虫。
在一些实施方案中提供了诱导、引发、加强或触发细胞、组织或生物体中的免疫应答的方法，所述方法包括使所述细胞、组织或生物体与本文描述或教导的环状RNA或线性mRNA中的任一种接触。
本发明的方面提供包含一种或多种RNA多核苷酸的环状RNA疫苗，所述RNA多核苷酸具有编码第一抗原多肽的表达序列。在一些实施方案中，环状RNA多核苷酸在转移媒介物(例如，脂质纳米颗粒)内配制。
在一些实施方案中，表达序列是密码子优化的。在一些实施方案中，第一抗原多肽来源于传染因子。在一些实施方案中，传染因子选自由病毒的毒株和细菌的菌株组成的组的成员。在一些实施方案中，一种或多种RNA多核苷酸编码另一抗原多肽。在一些实施方案中，其他抗原多肽由具有密码子优化的表达序列的RNA多核苷酸编码。
在一些实施方案中，一种或多种抗原多肽选自在表9中列出的那些蛋白质或其抗原片段。在一些实施方案中，一种或多种RNA多核苷酸的表达序列和/或第二RNA多核苷酸的表达序列各自独立地编码选自表9的抗原多肽或其抗原片段。在一些实施方案中，一种或多种RNA多核苷酸的每个表达序列选自表9中列出的RNA序列中的任一个或其抗原片段。
在本文提供的一些实施方案中，传染因子是选自由以下组成的组的病毒株：腺病毒；单纯疱疹，1型；单纯疱疹，2型；脑炎病毒、乳头瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒；爱泼斯坦-巴尔病毒；人巨细胞病毒；人疱疹病毒，8型；人乳头瘤病毒；BK病毒；JC病毒；天花；脊髓灰质炎病毒；乙型肝炎病毒；人博卡病毒；细小病毒B19；人星状病毒；诺沃克病毒；柯萨奇病毒；甲型肝炎病毒；脊髓灰质炎病毒；鼻病毒；严重急性呼吸道综合征病毒；丙型肝炎病毒；黄热病毒；登革热病毒；西尼罗病毒；风疹病毒；戊型肝炎病毒；人免疫缺陷病毒(HIV)；流感病毒；瓜纳里托病毒；胡宁病毒；拉沙病毒；马丘波病毒；萨比亚病毒；克里米亚-刚果出血热病毒；埃博拉病毒；马尔堡病毒；麻疹病毒；腮腺炎病毒；副流感病毒；呼吸道合胞病毒；人偏肺病毒；亨德拉病毒；尼帕病毒；狂犬病病毒；丁型肝炎；轮状病毒；环状病毒；科罗拉多壁虱热病毒；版纳病毒；人肠道病毒；汉坦病毒；西尼罗病毒；中东呼吸道综合征冠状病毒；日本脑炎病毒；水疱性疱疹病毒；以及东方马脑炎。
在一些实施方案中，病毒是甲型流感或乙型流感或其组合的毒株。在一些实施方案中，甲型流感或乙型流感的毒株与鸟、猪、马、狗、人或非人灵长类动物相关。在一些实施方案中，抗原多肽编码血凝素蛋白或其片段。在一些实施方案中，血凝素蛋白是HI、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17、H18或其片段。在一些实施方案中，血凝素蛋白不包含头部结构域(HA1)。在一些实施方案中，血凝素蛋白包含头部结构域(HA1)的一部分。在一些实施方案中，血凝素蛋白不包含细胞质结构域。在一些实施方案中，血凝素蛋白包含细胞质结构域的一部分。在一些实施方案中，血凝素蛋白是截短的血凝素蛋白。在一些实施方案中，截短的血凝素蛋白包含跨膜结构域的一部分。在一些实施方案中，血凝素蛋白的氨基酸序列或其片段包含与表9中提供的血凝素氨基酸序列中的任一个的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在一些实施方案中，病毒选自由以下组成的组：H1N1、H3N2、H7N9以及H10N8。
在一些实施方案中，传染因子是选自以下的细菌菌株：结核分枝杆菌、艰难梭菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌。在一些实施方案中，细菌对一种或多种抗生素具有耐药性。在一些实施方案中，细菌是艰难梭菌。在一些实施方案中，艰难梭菌是耐克林霉素的，和/或耐氟喹诺酮的。在一些实施方案中，细菌是金黄色葡萄球菌。在一些实施方案中，金黄色葡萄球菌是耐甲氧西林的和/或耐万古霉素的。
在一些实施方案中，环状RNA多核苷酸包含多于一个表达序列。在一些实施方案中，表达序列可编码多于一种抗原多肽。在一些实施方案中，一种或多种RNA多核苷酸的表达序列编码至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种抗原多肽。在一些实施方案中，一种或多种RNA多核苷酸的表达序列编码至少10、15、20或50种抗原多肽。在一些实施方案中，一种或多种RNA多核苷酸的表达序列编码2-10、10-15、15-20、20-50、50-100或100-200种抗原多肽。
在一些实施方案中，环状RNA多核苷酸含有仅天然存在的核酸。
另外的方面提供一种诱导受试者中的抗原特异性免疫应答的方法，所述方法包括以有效量向所述受试者施用本文所述的任何疫苗以产生抗原特异性免疫应答。在一些实施方案中，抗原特异性免疫应答包括T细胞应答。在一些实施方案中，抗原特异性免疫应答包括B细胞应答。在一些实施方案中，产生抗原特异性免疫应答的方法涉及所述疫苗的单次施用。在一些实施方案中，方法还包括施用所述疫苗的一个或多个加强剂量。在一些实施方案中，疫苗通过皮内或肌肉内注射施用至受试者。
方面还提供用于在诱导受试者中的抗原特异性免疫应答的方法中使用的本文所述的疫苗中的任一种。在一些实施方案中，方法包括以有效量向所述受试者施用所述疫苗以产生抗原特异性免疫应答。在一些实施方案中，环状RNA疫苗以有效剂量并使用施用时间表施用，使得感染性疾病的至少一种症状或特征在强度、严重程度或频率方面降低，或在发病时间上延迟。
其他方面提供一种本文所述的疫苗中的任一种在制造用于在诱导受试者中的抗原特异性免疫应答的方法中使用的药剂中的用途，所述方法包括以有效量向所述受试者施用所述疫苗以产生抗原特异性免疫应答。
在一些实施方案中，佐剂多肽包含toll样受体配体、细胞因子、FLt3-配体、抗体、趋化因子、嵌合蛋白、从垂死肿瘤释放的内源性佐剂和检查点抑制蛋白。在某些实施方案中，佐剂多肽是直接或间接地刺激T细胞、B细胞、NK细胞或骨髓细胞的蛋白质。在某些实施方案中，佐剂多肽增加抗原肽表达或抗原呈递细胞上的MHC复合物的摄取、加工、呈递。在某些实施方案中，佐剂多肽能够通过向下调制阻断MCH。
在一些实施方案中，一种或多种佐剂多肽选自在表10中列出的那些蛋白质或其佐剂片段。在一些实施方案中，一种或多种RNA多核苷酸的表达序列和/或第二RNA多核苷酸的表达序列各自独立地编码选自表10的佐剂多肽或其佐剂片段。在一些实施方案中，一种或多种RNA多核苷酸的每个表达序列选自表10中列出的RNA序列中的任一个或其佐剂片段。
在某些实施方案中，本文提供了用于制备环状RNA的载体，所述载体包含5'双链体形成区、3'I组内含子片段、任选的第一间隔区、内部核糖体进入位点(IRES)、表达序列、任选的第二间隔区、5'I组内含子片段和3'双链体形成区。在一些实施方案中，这些元件以上述顺序定位在载体中。在一些实施方案中，载体还包含位于3'I组内含子片段与IRES之间的内部5'双链体形成区以及表达序列与5'I组内含子片段之间的内部3'双链体形成区。在一些实施方案中，内部双链体形成区能够在彼此之间形成双链体但不能与外部双链体形成区形成双链体。在一些实施方案中，内部双链体形成区是第一和第二间隔区的一部分。另外的实施方案包括环状RNA多核苷酸，包括使用本文提供的载体制备的环状RNA多核苷酸；包含这种环状RNA的组合物；包含这种环状RNA的细胞；使用和制备此类载体、环状RNA、组合物和细胞的方法。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括将本文提供的环状RNA多核苷酸施用至细胞中以用于治疗或产生有用的蛋白质。在一些实施方案中，由于环状RNA对核糖核酸酶的抗性，所述方法有利于在真核细胞内产生与线性RNA相比具有更长半衰期的所需多肽。
环状RNA多核苷酸缺乏核酸外切酶介导的降解所需的游离末端，从而使它们与等效线性RNA相比对几种RNA降解机制具有抗性并允许延长的半衰期。环化可允许稳定通常具有短半衰期的RNA多核苷酸，并且可提高外源性mRNA在各种应用中的总体功效。在一个实施方案中，如通过蛋白质合成所评估，本文提供的环状RNA多核苷酸在真核细胞(例如，哺乳动物细胞，如人细胞)中的功能性半衰期是至少20小时(例如，至少80小时)。
定义
如本文所用，术语“circRNA”或“环状多核糖核苷酸”或“环状RNA”可互换使用并且是指通过共价键形成环状结构的多核糖核苷酸。
如本文所用，术语“3'I组内含子片段”是指与天然I组内含子的包含剪接位点二核苷酸和任选的一段天然外显子序列的3'-近端具有75％或更高相似性的序列。
如本文所用，术语“5'I组内含子片段”是指与天然I组内含子的包含剪接位点二核苷酸和任选的一段天然外显子序列的5'-近端具有75％或更高相似性的序列。
如本文所用，术语“置换位点”是指I组内含子中的位点，其中在内含子置换之前进行切割。这种切割产生3'和5'I组内含子片段，所述片段被置换为在一段待环化的前体RNA的任一侧上。
如本文所用，术语“剪接位点”是指部分或完全包含在I组内含子中并且在RNA环化期间其之间的磷酸二酯键被裂解的二核苷酸。
多核苷酸构建体中的表达序列可通过“裂解位点”序列隔开，这使得由所述表达序列编码的多肽一旦翻译，就可在细胞中表达为不同的且离散的单独多肽。
“自裂解肽”是指在两个相邻氨基酸之间不存在肽键的情况下翻译的肽，或使得当包含蛋白质和自裂解肽的多肽产生时，它立即被裂解或分离成不同的且离散的第一和第二多肽，而不需要任何外部裂解活性(例如，酶裂解)的功能。
如本文所用，术语“治疗性蛋白质”是指当以翻译的核酸的形式直接或间接施用于受试者时具有治疗、诊断和/或预防作用和/或引发所需的生物学和/或药理作用的任何蛋白质。
αβTCR的α链和β链统称被认为各自具有两个结构域或区，即可变结构域/区和恒定结构域/区。可变结构域由可变区和连接区的级联组成。因此，在本说明书和权利要求书中，术语“TCRα可变结构域”是指TCRα可变(TRAV)区和TCRα连接(TRAJ)区的级联，并且术语“TCRα恒定结构域”是指细胞外TCRα恒定(TRAC)区，或C末端截短的TRAC序列。同样，术语“TCRβ可变结构域”是指TCRβ可变(TRBV)、TCRβ多变(TRBD)区和TCRβ连接(TRBJ)区的级联，并且术语“TCRβ恒定结构域”是指细胞外TCRβ恒定(TRBC)区，或C末端截短的TRBC序列。
如本文所用，术语“免疫原性”是指诱导对物质的免疫应答的潜力。当生物体的免疫系统或某种类型的免疫细胞暴露于免疫原性物质时，可诱导免疫应答。术语“非免疫原性”是指缺乏或不存在对物质的高于可检测阈值的免疫应答。当生物体的免疫系统或某种类型的免疫细胞暴露于非免疫原性物质时，未检测到免疫应答。在一些实施方案中，当通过免疫原性测定测量时，如本文提供的非免疫原性环状多核糖核苷酸不会诱导高于预定阈值的免疫应答。在一些实施方案中，当生物体的免疫系统或某种类型的免疫细胞暴露于如本文提供的非免疫原性环状多核糖核苷酸时，未检测到先天性免疫应答。在一些实施方案中，当生物体的免疫系统或某种类型的免疫细胞暴露于如本文提供的非免疫原性环状多核糖核苷酸时，未检测到适应性免疫应答。
如本文所用，术语“环化效率”是指所得环状多核糖核苷酸与其线性起始材料相比的测量值。
如本文所用，术语“翻译效率”是指从核糖核苷酸转录物产生蛋白质或肽的速率或量。在一些实施方案中，翻译效率可表示为每给定量的编码蛋白质或肽的转录物所产生的蛋白质或肽的量。
术语“核苷酸”是指核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、其修饰形式或其类似物。核苷酸包括物质，所述物质包括嘌呤(例如，腺嘌呤、次黄嘌呤、鸟嘌呤及其衍生物和类似物)以及嘧啶(例如，胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶及其衍生物和类似物)。核苷酸类似物包括在碱基、糖和/或磷酸的化学结构中具有经修饰的核苷酸，包括但不限于，5'-位置嘧啶修饰、8'-位置嘌呤修饰、胞嘧啶环外胺处的修饰和5-溴-尿嘧啶的取代；和2'-位置糖修饰，包括但不限于糖修饰的核糖核苷酸，其中2'-OH被诸如H、OR、R、卤基、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN的基团取代，其中R是如本文所定义的烷基部分。核苷酸类似物还意在包括具有碱基，例如肌苷、辫苷、黄嘌呤；糖类，如2'-甲基核糖；非天然磷酸二酯键联，如甲基膦酸酯、硫代磷酸酯和肽键联的核苷酸。核苷酸类似物包括5-甲氧基尿苷、1-甲基假尿苷和6-甲基腺苷。
术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用以描述任何长度(例如大于约2个碱基、大于约10个碱基、大于约100个碱基、大于约500个碱基、大于1000个碱基或多达约10,000个或更多个碱基)、由核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成的聚合物，并且可酶促或合成产生(例如，如美国专利第5,948,902号和其中引用的参考文献中所述)，其可以类似于两种天然存在的核酸的序列特异性方式与天然存在的核酸杂交，例如可参与沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对相互作用。天然存在的核酸由核苷酸组成，所述核苷酸包括鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶(分别为G、C、A、T和U)。
如本文所用术语“核糖核酸”和“RNA”意指由核糖核苷酸组成的聚合物。
如本文所用的术语“脱氧核糖核酸”和“DNA”意指由脱氧核糖核苷酸组成的聚合物。
“分离的”或“纯化的”通常是指物质(例如，在一些实施方案中，化合物、多核苷酸、蛋白质、多肽、多核苷酸组合物或多肽组合物)的分离，使得所述物质占它所存在于其中的样品的显著百分比(例如，大于1％、大于2％、大于5％、大于10％、大于20％、大于50％或更多，通常高达约90％-100％)。在某些实施方案中，基本上纯化的组分占样品的至少50％、80％-85％或90％-95％。用于纯化目标多核苷酸和多肽的技术在本领域中是熟知的，并且包括例如离子交换色谱法、亲和色谱法以及根据密度进行沉降。通常，当物质相对于样品的其他组分以大于其天然存在的量存在于样品中时，则所述物质是纯化的。
如本文所用的术语“双链体的”、“双链的”或“杂交的”是指通过含有互补序列的核酸的两条单链的杂交形成的核酸。在大多数情况下，基因组DNA是双链的。序列可完全互补或部分互补。
如本文所用，关于RNA的“非结构化”是指未被RNAFold软件或类似预测工具预测与自身或同一RNA分子中的其他序列形成结构(例如，发夹环)的RNA序列。在一些实施方案中，可使用核酸酶保护测定来在功能上表征非结构化RNA。
如本文所用，关于RNA的“结构化”是指被RNAFold软件或类似预测工具预测与自身或同一RNA分子中的其他序列形成结构(例如，发夹环)的RNA序列。
如本文所用，当两个“双链体形成区”、“同源臂”或“同源区”与彼此的反向互补序列具有足够水平的序列同一性以充当杂交反应的底物时，所述两个区域彼此互补或是互补的。如本文所用，当多核苷酸序列与反向互补序列或“互补”序列同一或共享序列同一性时，所述多核苷酸序列具有“同源性”。双链体形成区和对应双链体形成区的反向互补序列之间的序列同一性百分比可以是允许杂交发生的任何序列同一性百分比。在一些实施方案中，本发明多核苷酸的内部双链体形成区能够与另一个内部双链体形成区形成双链体并且不与外部双链体形成区形成双链体。
线性核酸分子被称为具有“5'-末端”(5'端)和“3'-末端”(3'端)，因为核酸磷酸二酯键联存在于取代单核苷酸的糖部分的5'碳和3'碳处。多核苷酸的末端核苷酸是其5'末端核苷酸，在所述末端核苷酸处新键联将是与5'碳的键联。多核苷酸的末端核苷酸是其3'末端核苷酸，在所述末端核苷酸处新键联将是与3'碳的键联。如本文所用，末端核苷酸是位于3'-或5'-末端的末端位置处的核苷酸。
“转录”是指使用DNA分子作为模板，通过RNA聚合酶形成或合成RNA分子。本发明关于用于转录的RNA聚合酶没有限制。例如，在一些实施方案中，可使用T7型RNA聚合酶。
“翻译”是指基于RNA模板由核糖体形成多肽分子。
应当理解，本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而并非旨在进行限制。如在本说明书和所附权利要求中所使用，除非内容另外明确指明，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括复数指代物。因此，例如，提及“一个细胞”包括两个或更多个细胞的组合，或细胞的整个培养物；提及“多核苷酸”实际上包括所述多核苷酸的许多拷贝。除非明确规定或从上下文显而易见，否则如本文所使用，术语“或”被理解为包括在内。除非本文中或和说明书其余部分下文中另有定义，否则本文使用的所有技术性和科学性术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同的含义。
除非明确规定或从上下文显而易见，否则如本文所用，术语“约”应理解为在本领域的正常公差范围内，例如在平均值的2个标准偏差以内。“约”可理解为在所述值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％或0.01％内。除非另外从上下文显而易见，否则本文提供的所有数值都由术语“约”修饰。
如本文所用，术语“编码”泛指任何过程，其中聚合大分子中的信息用于指导与第一个分子不同的第二个分子的产生。第二分子可具有与第一分子的化学性质不同的化学结构。
“共同施用”是指将本文提供的治疗剂与一种或多种额外治疗剂时间上足够接近地联合施用，使得本文提供的治疗剂可增强一种或多种额外治疗剂的效果，反之亦然。
如本文所用，术语“治疗”和“预防”以及源自其的词不一定意味着100％或完全治疗或预防。而是，存在不同程度的治疗或预防，本领域普通技术人员认为所述治疗或预防具有潜在益处或治疗效果。由本文公开的方法提供的治疗或预防可包括治疗或预防疾病的一种或多种疾患或症状。此外，出于本文的目的，“预防”可包括延迟疾病或其症状或疾患的发作。
如本文所用，“自身免疫”被定义为对非感染性自身抗原的持续和进行性免疫反应，与来自细菌、病毒、真菌或寄生虫生物体的感染性非自身抗原不同，所述非自身抗原侵入并持续存在于哺乳动物和人类体内。自身免疫性疾患包括硬皮病、格雷夫斯病、克罗恩氏病、薛格连氏综合征、多发性硬化症、桥本氏病、银屑病、重症肌无力、自身免疫性多内分泌病综合征、I型糖尿病(TIDM)、自身免疫性胃炎、自身免疫性葡萄膜视网膜炎、多发性肌炎、结肠炎和甲状腺炎以及以人类狼疮为代表的广泛性自身免疫性疾病。如本文使用的“自身抗原(Autoantigen)”或“自身抗原(self-antigen)”是指哺乳动物本身的并在所述哺乳动物中具有免疫原性的抗原或表位。
如本文所用，术语“表达序列”可指编码产物例如肽或多肽、调控性核酸或非编码核酸的核酸序列。编码肽或多肽的示例性表达序列可包含多个核苷酸三联体，所述核苷酸三联体中的每一者可编码氨基酸并被称为“密码子”。
如本文所用，“间隔区”是指多核苷酸序列的范围从1个核苷酸至数百或数千个核苷酸、沿多核苷酸序列分隔两个其他元件的区域。序列可被限定或者可以是随机的。间隔区通常是非编码的。在一些实施方案中，间隔区包括双链体形成区。
如本文所用，“内部核糖体进入位点”或“IRES”是指大小范围从10nt至1000nt或更大、能够在没有典型RNA帽结构的情况下起始多肽的翻译的RNA序列或结构元件。IRES的长度通常是约500nt至约700nt。
如本文所用，“miRNA位点”是指多核苷酸内的能够与天然miRNA序列的至少8个核苷酸形成双链体的一段核苷酸。
如本文所用，“核酸内切酶位点”是指多核苷酸内能够被核酸内切酶蛋白识别并裂解的一段核苷酸。
如本文所用，“双顺反子RNA”是指包含编码两种不同蛋白质的两个表达序列的多核苷酸。这些表达序列通常被可裂解的肽如2A位点或IRES序列隔开。
如本文所用，术语“共配制”是指包含两种或更多种核酸或核酸和其他活性药物物质的纳米颗粒制剂。通常，比率是等摩尔的或定义为两种或更多种核酸或核酸与其他活性药物物质的比率计量的量。
如本文所用，“转移媒介物”包括任何标准药物载体、稀释剂、赋形剂等，其通常旨在与包括核酸在内的生物活性剂的施用结合使用。
如本文所用，短语“脂质纳米颗粒”是指包含一种或多种脂质(例如，在一些实施方案中，阳离子脂质、非阳离子脂质和PEG修饰的脂质)的转移媒介物。
如本文所用，短语“阳离子脂质”是指在选定pH，如生理pH下携带净正电荷的许多脂质种类中的任一种。
如本文所用，短语“非阳离子脂质”是指任何中性、两性离子或阴离子脂质。
如本文所使用，短语“阴离子脂质”是指在选定pH，如生理pH下携带净负电荷的许多脂质种类中的任一种。
如本文所用，短语“可电离脂质”是指在选定pH(如生理pH 4)下携带净正电荷并在其他pH(如生理pH 7)下携带中性电荷的多种脂质种类中的任一种。
术语“抗体”(Ab)包括但不限于特异性地结合至抗原的糖蛋白免疫球蛋白。一般而言，抗体可包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链，或其抗原结合分子。每条H链可包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区可包含三个恒定域，CH1、CH2和CH3。每条轻链可包含轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个恒定结构域，CL。VH和VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布着较保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL可包含三个CDR和四个FR，以下列顺序从氨基末端至羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的不同细胞(例如，效应细胞)以及经典补体系统的第一组分。抗体可包括例如单克隆抗体、重组产生的抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、工程化抗体、人源化抗体、嵌合抗体、免疫球蛋白、合成抗体、包含两个重链和两个轻链分子的四聚抗体、抗体轻链单体、抗体重链单体、抗体轻链二聚体、抗体重链二聚体、抗体轻链-抗体重链对、胞内抗体、抗体融合物(本文有时称为“抗体缀合物”)、异源缀合物抗体、单结构域抗体、单价抗体、单链抗体或单链可变片段(scFv)、骆驼化抗体、亲和体(affybody)、Fab片段、F(ab’)2片段、二硫键连接的可变片段(sdFv)、抗独特型(anti-id)抗体(包括例如抗-抗Id抗体)、微型抗体、结构域抗体、合成抗体(有时在本文中称为“抗体模拟物”)和上述任一者的抗原结合片段。在一些实施方案中，本文所述的抗体是指多克隆抗体群。
免疫球蛋白可源自任何公知的同种型，包括但不限于IgA、分泌型IgA、IgG和IgM。IgG亚类也是本领域技术人员众所周知的，包括但不限于人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。“同种型”是指由重链恒定区基因编码的Ab类或亚类(例如IgM或IgG1)。举例来说，术语“抗体”包括天然存在的和非天然存在的抗体；单克隆和多克隆抗体；嵌合和人源化抗体；人或非人抗体；全合成抗体；和单链抗体。非人抗体可通过重组方法进行人源化以降低其在人中的免疫原性。在没有明确说明的情况下并且除非上下文另有说明，否则术语“抗体”还包括任何上述免疫球蛋白的抗原结合片段或抗原结合部分，并且包括单价和二价片段或部分，以及单链抗体。
“抗原结合分子”、“抗原结合部分”或“抗体片段”是指包含所述分子所来源的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)的任何分子。抗原结合分子可包括抗原互补决定区(CDR)。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、dAb、线性抗体、scFv抗体和由抗原结合分子形成的多特异性抗体。肽体(即包含肽结合结构域的Fc融合分子)是合适的抗原结合分子的另一个实例。在一些实施方案中，抗原结合分子结合至肿瘤细胞上的抗原。在一些实施方案中，抗原结合分子结合至过度增生性疾病中所涉及的细胞上的抗原或结合至病毒或细菌抗原。在一些实施方案中，抗原结合分子结合至BCMA。在其它实施方案中，抗原结合分子是特异性地结合至抗原的抗体片段，包括其一个或多个互补决定区(CDR)。在其他实施方案中，抗原结合分子是单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，抗原结合分子包含avimer或由avimer组成。
如本文所用，术语“可变区”或“可变结构域”可互换使用并且在本领域中是常见的。可变区通常是指抗体的一部分，一般而言是轻链或重链的一部分，通常是成熟重链中的约氨基末端110至120个氨基酸和成熟轻链中的约90至115个氨基酸，其在抗体之间的序列方面广泛不同并且用于特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。序列的变异性集中在称为互补决定区(CDR)的那些区域中，而可变结构域中保守性更高的区域被称为框架区(FR)。不希望受任何特定机制或理论的束缚，据信轻链和重链的CDR主要负责抗体与抗原的相互作用和特异性。在一些实施方案中，可变区是人可变区。在一些实施方案中，可变区包含啮齿动物或鼠CDR和人框架区(FR)。在特定实施方案中，可变区是灵长类动物(例如，非人灵长类动物)可变区。在一些实施方案中，可变区包含啮齿动物或鼠类CDR和灵长类动物(例如，非人灵长类动物)框架区(FR)。
术语“VL”和“VL结构域”可互换使用来指抗体或其抗原结合分子的轻链可变区。
术语“VH”和“VH结构域”可互换使用来指抗体或其抗原结合分子的重链可变区。
CDR的许多定义是常用的：Kabat编号、Chothia编号、AbM编号或contact编号。AbM定义是Oxford Molecular的AbM抗体建模软件所使用的两者之间的折衷。接触定义是基于对可用复杂晶体结构的分析。术语“Kabat编号”和类似术语在本领域中是公认的，并且是指对抗体或其抗原结合分子的重链和轻链可变区中的氨基酸残基进行编号的系统。在某些方面，可根据Kabat编号系统来确定CDR(参见例如，Kabat EA和Wu TT(1971)Ann NY Acad Sci190:382-391以及Kabat EA等人,(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第五版，美国卫生和公共服务部,NIH出版号91-3242)。使用Kabat编号系统，抗体重链分子内的CDR通常存在于氨基酸位置31至35(其任选地可在35之后包含一个或两个另外氨基酸(在Kabat编号方案中称为35A和35B))(CDR1)、氨基酸位置50至65(CDR2)和氨基酸位置95至102(CDR3)。使用Kabat编号系统，抗体轻链分子内的CDR通常存在于氨基酸位置24至34(CDR1)、氨基酸位置50至56(CDR2)和氨基酸位置89至97(CDR3)。在一个具体实施方案中，已经根据Kabat编号方案确定了本文所述的抗体的CDR。在某些方面，可根据Chothia编号方案来确定抗体的CDR，Chothia编号方案是指免疫球蛋白结构环的位置(参见例如，Chothia C和Lesk AM,(1987),J Mol Biol 196:901-917；Al-Lazikani B等人,(1997)JMol Biol 273:927-948；Chothia C等人,(1992)J Mol Biol 227:799-817；Tramontano A等人,(1990)J Mol Biol 215(1):175-82；以及美国专利号7,709,226)。通常，当使用Kabat编号惯例时，Chothia CDR-H1环存在于重链氨基酸26至32、33或34处，Chothia CDR-H2环存在于重链氨基酸52至56处，并且Chothia CDR-H3环存在于重链氨基酸95至102，而ChothiaCDR-L1环存在于轻链氨基酸24至34处，Chothia CDR-L2环存在于轻链氨基酸50至56处，并且Chothia CDR-L3环存在于轻链氨基酸89至97处。当使用Kabat编号惯例编号时，ChothiaCDR-HI环的末端根据环的长度而在H32与H34之间变化(这是由于Kabat编号方案将插入放置于H35A和H35B处；如果35A或35B不存在，则环结束于32处；如果仅35A存在，则环结束于33处；如果35A和35B均存在，则环结束于34处)。在一个具体实施方案中，已经根据Chothia编号方案确定了本文所述的抗体的CDR。
如本文所用，术语“恒定区”和“恒定结构域”是可互换的，并且具有在本领域中通常理解的含义。恒定区是不直接参与抗体与抗原的结合、但可表现出多种效应子功能，如与Fc受体的相互作用的抗体部分，例如轻链和/或重链的羧基末端部分。相对于免疫球蛋白可变结构域，免疫球蛋白分子的恒定区通常具有更保守的氨基酸序列。
“结合亲和力”通常是指分子(例如，抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文中所用，“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如，抗体与抗原)之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可由解离常数(KD或Kd)表示。亲和力可以本领域中已知的多种方式来测量和/或表示，包括但不限于平衡解离常数(KD)和平衡缔合常数(KA或Ka)。KD是根据koff/kon的商计算的，而KA是根据kon/koff的商计算的。kon是指例如抗体与抗原的缔合速率常数，并且koff是指例如抗体与抗原的解离。kon和koff可通过本领域普通技术人员已知的技术，如
Figure GDA0004216226410000421
或KinExA来确定。
如本文所用，“保守性氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代的一种氨基酸取代。在本领域中已经定义了具有侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合分子的CDR内或框架区内的一个或多个氨基酸残基可被具有相似侧链的氨基酸残基置换。
如本文所用，术语“异源序列”是指非原生的或不是天然存在于表达所述序列的细胞或生物体中的外源序列。
如本文所用，“表位”是本领域中的术语，并且是指抗体可与其特异性地结合的抗原的局部区域。表位可以是例如多肽的连续氨基酸(线性或连续表位)，或者表位可例如来自一种或多种多肽的两个或更多个非连续区域(构象性、非线性、不连续或非连续的表位)。在一些实施方案中，抗体所特异性地结合的表位可通过例如NMR光谱法、X射线衍射晶体学研究、ELISA测定、结合质谱法的氢/氘交换(例如，液相色谱电喷雾质谱法)、基于阵列的寡肽扫描测定和/或诱变作图(例如，定点诱变作图)来确定。对于X射线晶体学，可使用本领域中任何已知的方法来完成结晶(例如，Giege R等人,(1994)Acta Crystallogr D BiolCrystallogr 50(Pt 4):339-350；McPherson A(1990)Eur J Biochem 189:1-23；ChayenNE(1997)Structure 5:1269-1274；McPherson A(1976)J Biol Chem 251:6300-6303)。抗体:抗原晶体可使用众所周知的X射线衍射技术进行研究，并且可使用计算机软件如X-PLOR(Yale University,1992,由Molecular Simulations,Inc.分售；参见例如，Meth Enzymol(1985)第114和115卷,Wyckoff HW等人编辑；美国专利公布号2004/0014194)和BUSTER(Bricogne G(1993)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1):37-60；BricogneG(1997)Meth Enzymol 276A:361-423,Carter CW编辑；Roversi P等人,(2000)ActaCrystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10):1316-1323)进行改善。
如本文所用，如果抗原与第一结合分子、抗体或其抗原结合片段之间的相互作用阻断、限制、抑制或以其他方式降低参考结合分子、参考抗体或其参考抗原结合片段与抗原相互作用的能力，则所述抗原结合分子、抗体或其抗原结合片段与参考抗体或其参考抗原结合片段“交叉竞争”。交叉竞争可以是完全的，例如结合分子与抗原的结合完全阻断参考结合分子结合抗原的能力，或者它可以是部分的，例如结合分子与抗原的结合降低参考结合分子结合抗原的能力。在一些实施方案中，与参考抗原结合分子交叉竞争的抗原结合分子与参考抗原结合分子结合相同或重叠的表位。在其他实施方案中，与参考抗原结合分子交叉竞争的抗原结合分子与参考抗原结合分子结合不同的表位。众多类型的竞争性结合测定可用于确定一种抗原结合蛋白是否与另一抗原结合蛋白竞争，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)；固相直接或间接酶免疫测定(EIA)；夹心式竞争测定(Stahli等人,1983,Methods in Enzymology 9:242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Kirkland等人,1986,J.Immunol.137:3614-3619)；固相直接标记测定；固相直接标记夹心式测定(Harlow和Lane,1988,Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press)；使用1-125标记进行的固相直接标记RIA(Morel等人,1988,Molec.Immunol.25:7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung等人,1990,Virology 176:546-552)；以及直接标记RIA(Moldenhauer等人,1990,Scand.J.Immunol.32:77-82)。
如本文所用，术语“免疫特异性地结合”、“免疫特异性地识别”、“特异性地结合”和“特异性地识别”是抗体上下文中的类似术语，并且是指结合至抗原(例如表位或免疫复合物)的分子，因此本领域技术人员可理解这种结合。例如，特异性地结合至抗原的分子可结合至其他肽或多肽，通常具有较低的亲和力，如通过例如免疫测定、
Figure GDA0004216226410000441
KinExA3000仪器(Sapidyne Instruments,Boise,ID)或本领域中已知的其他测定所确定的。在一个具体实施方案中，特异性地结合至抗原的分子以与所述分子结合至另一抗原时的KA相比至少2log、2.5log、3log、4log或更大的KA结合至抗原。
如本文所定义，术语“抗原”是指与抗原结合分子、抗体或其抗原结合片段结合的分子。例如，抗原可引发生物体的先天性或适应性免疫反应。抗原可以是任何免疫原性物质，具体地说包括蛋白质、多肽、多糖、核酸、脂质等。在一些实施方案中，抗原来源于传染因子。
术语“自体的”是指源自同一个体的任何材料，所述材料之后将被重新引入所述个体。例如，本文所述的工程化自体细胞疗法(eACTTM)方法涉及从患者收集淋巴细胞，然后将其工程化以表达例如CAR构建体，然后施用回至同一患者。
术语“同种异体”是指源自一个个体的任何材料，所述材料然后引入同一物种的另一个个体，例如同种异体T细胞移植。
如本文所用，“细胞因子”是指由一个细胞释放的非抗体蛋白，并且可与第二细胞相互作用以介导第二细胞中的反应。如本文所用的“细胞因子”是指由一个细胞群释放的作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质。细胞因子可由细胞内源性表达或施用于受试者。细胞因子可由免疫细胞(包括但不限于巨噬细胞、B细胞、T细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞)释放以传播免疫应答。细胞因子可诱导各种细胞应答。细胞因子可包括稳态细胞因子、趋化因子、促炎性细胞因子、效应细胞因子和急性期蛋白。例如，稳态细胞因子，包括白细胞介素(IL)7和IL-15促进免疫细胞存活和增殖，并且促炎性细胞因子可促进炎性应答。稳态细胞因子的实例包括但不限于IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-15和干扰素(IFN)γ。促炎性细胞因子的实例包括但不限于IL-la、IL-lb、IL-6、IL-13、IL-17a、IL-23、IL-27、肿瘤坏死因子(TNF)-α、TNF-β、成纤维细胞生长因子(FGF)2、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、可溶性细胞间粘附分子1(sICAM-1)、可溶性血管粘附分子1(sVCAM-1)、血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF-C、VEGF-D和胎盘生长因子(PLGF)。效应细胞因子的实例包括但不限于颗粒酶A、颗粒酶B、可溶性Fas配体(sFasL)、TGF-β、IL-35和穿孔素。急性期蛋白的实例包括但不限于C反应蛋白(CRP)和血清淀粉样蛋白A(SAA)。
如本文所用的术语“淋巴细胞”包括自然杀伤(NK)细胞、T细胞或B细胞。NK细胞是一种类型的细胞毒性(细胞毒性)淋巴细胞，其代表先天免疫系统的主要组分。NK细胞可诱导肿瘤和病毒感染细胞的凋亡。它们被称为“自然杀手”，因为它们不需要激活即可杀死靶细胞。T细胞在细胞介导的免疫(无抗体参与)中起主要作用。T细胞受体(TCR)区分T细胞与其它淋巴细胞类型。胸腺是免疫系统的专门器官，是T细胞成熟的主要位点。存在许多种类型的T细胞，包括：辅助T细胞(例如CD4+细胞)、细胞毒性T细胞(也称为TC、细胞毒性T淋巴细胞、CTL、T杀伤细胞、溶细胞性T细胞、CD8+T细胞或杀伤T细胞)、记忆T细胞((i)干记忆细胞(TSCM)，如初始细胞，是CD45RO-、CCR7+、CD45RA+、CD62L+(L-选择素)、CD27+、CD28+和IL-7Ra+，但也表达大量CD95、IL-2R、CXCR3和LFA-1，并显示出记忆细胞所特有的许多功能属性)；(ii)中心记忆细胞(TCM)表达L-选择素和CCR7，它们分泌IL-2，但不分泌IFNγ或IL-4，和(iii)效应记忆细胞(TEM)，然而，不表达L-选择素或CCR7，但产生效应细胞因子，如IFNγ和IL-4)、调控性T细胞(Treg、抑制性T细胞或CD4+CD25+或CD4+FoxP3+调控性T细胞)、自然杀伤T细胞(NKT)和γδT细胞。另一方面，B细胞在体液免疫(有抗体参与)中起主要作用。B细胞制造抗体，能够充当抗原呈递细胞(APC)，并且在通过抗原相互作用激活后转变为短寿命和长寿命的记忆B细胞和浆细胞。在哺乳动物中，未成熟的B细胞在骨髓中形成。
术语“遗传工程化”或“工程化”是指修饰细胞的基因组的方法，包括但不限于缺失编码或非编码区或其一部分或插入编码区或其一部分。在一些实施方案中，经修饰的细胞是淋巴细胞，例如T细胞，其可从患者或供体获得。可修饰细胞以表达掺入细胞基因组中的外源构建体，例如嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。
“免疫应答”是指免疫系统的细胞(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突细胞和嗜中性粒细胞)以及由任何这些细胞或肝脏产生的可溶性分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，所述作用导致侵入病原体、感染病原体的细胞或组织、癌细胞或其他异常细胞、或者在自身免疫性或病理性炎症的情况下正常人细胞或组织的选择性靶向、结合、损伤、破坏和/或从脊椎动物体内清除。
如本文所用，术语“序列同一性”是指在比较窗口上序列在逐个核苷酸的基础或逐个氨基酸的基础上同一的程度。因此，“序列同一性百分比”可通过以下方式进行计算：在比较窗口上比较两个最佳比对的序列、确定两个序列中出现同一核酸碱基(例如，A、T、C、G、U)或同一氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置数以得到匹配位置数，用匹配位置数除以比较窗口中的位置总数(即窗口大小)，并将结果乘以100而得到序列同一性百分比。包括与本文所述的任何参考序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸和多肽，通常其中在多肽的情况下，多肽变体保持由参考序列编码的多肽的至少一种生物活性。
如本文所用，“佐剂”是指调节抗原的免疫原性的药物或物质。
如本文所用，“疫苗”是指组合物，例如刺激、诱导、引起或改善生物体，例如动物生物体，例如哺乳动物生物体(例如人)中的免疫性的物质或制剂。在一些实施方案中，疫苗提供针对生物体的一种或多种疾病或病症的免疫，包括预防性和/或治疗性免疫。在一些实施方案中，疫苗可例如由致病微生物的活的、减毒的、经修饰的、减弱的或杀死的形式，或由此衍生的抗原，包括抗原组分的组合制成。在一些实施方案中，疫苗刺激、诱导、引起或改善生物体中的免疫性，或引起或模拟生物体中的免疫应答而不诱导任何疾病或病症。在一些实施方案中，疫苗在引入受试者的组织、细胞外空间或细胞后引发免疫应答。在一些实施方案中，本发明的多核苷酸可编码抗原，并且当在细胞中表达多核苷酸时，所表达的抗原引发所需的免疫应答。
载体、前体RNA和环状RNA
在某些方面，本文提供了包含剪接后3'I组内含子片段、任选的第一间隔区、内部核糖体进入位点(IRES)、表达序列、任选的第二间隔区和剪接后5'I组内含子片段的环状RNA多核苷酸。在一些实施方案中，这些区域按所述顺序排列。在一些实施方案中，环状RNA通过本文提供的方法或由本文提供的载体制备。
在某些实施方案中，本文提供的载体(例如，包含5'双链体形成区、3'I组内含子片段、任选的第一间隔区、内部核糖体进入位点(IRES)、第一表达序列、编码裂解位点的多核苷酸序列、第二表达序列、任选的第二间隔区、5'I组内含子片段和3'双链体形成区)的转录导致形成能够环化的前体线性RNA多核苷酸。在一些实施方案中，当在鸟苷核苷酸或核苷(例如，GTP)和二价阳离子(例如，Mg2+)存在下孵育时，此前体线性RNA多核苷酸环化。
在一些实施方案中，本文提供的载体和前体RNA多核苷酸包含第一(5')双链体形成区和第二(3')双链体形成区。在某些实施方案中，第一和第二双链体形成区可形成完美或不完美的双链体。因此，在某些实施方案中，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的第一双链体形成区和第二双链体形成区可彼此碱基配对。在一些实施方案中，预测双链体形成区与RNA中的非预期序列(例如，非双链体形成区序列)的碱基配对小于50％(例如，小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％)。在一些实施方案中，在前体RNA链的末端包括此类双链体形成区并且邻近或非常靠近I组内含子片段使I组内含子片段彼此靠近，从而增加剪接效率。在一些实施方案中，双链体形成区的长度是3至100个核苷酸(例如，长度为3-75个核苷酸、长度为3-50个核苷酸、长度为20-50个核苷酸、长度为35-50个核苷酸、长度为5-25个核苷酸、长度为9-19个核苷酸)。在一些实施方案中，双链体形成区的长度是约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。在一些实施方案中，双链体形成区具有约9至约50个核苷酸的长度。在一个实施方案中，双链体形成区具有约9至约19个核苷酸的长度。在一些实施方案中，双链体形成区具有约20至约40个核苷酸的长度。在某些实施方案中，双链体形成区具有约30个核苷酸的长度。
在某些实施方案中，本文提供的载体、前体RNA和环状RNA包含第一(5')和/或第二(3')间隔区。在一些实施方案中，在3'I组内含子片段与IRES之间包括间隔区可通过防止它们相互作用来保护那些区域中的二级结构，从而提高剪接效率。在一些实施方案中，第一间隔区(在3'I组内含子片段与IRES之间)和第二间隔区(在表达序列与5'I组内含子片段之间)包含额外的碱基配对区，所述碱基配对区被预测为与彼此碱基配对而不是与第一和第二双链体形成区碱基配对。在一些实施方案中，这种间隔区碱基配对使I组内含子片段彼此靠近，从而进一步提高剪接效率。此外，在一些实施方案中，第一双链体形成区和第二双链体形成区之间的碱基配对的组合，以及单独地第一间隔区和第二间隔区之间的碱基配对的组合，促进剪接泡的形成，所述剪接泡含有侧接相邻碱基配对区域的I组内含子片段。典型的间隔区是具有一种或多种以下特性的连续序列：1)预计可避免干扰近端结构，例如IRES、表达序列或内含子；2)长度是至少7nt且不超过100nt；3)位于3'内含子片段之后且与其相邻和/或位于5'内含子片段之前且与其相邻；和4)含有以下中的一者或多者：a)至少5nt长的非结构化区域，b)至少5nt长的与远端序列(包括另一个间隔区)碱基配对的区域，和c)范围限制于间隔区序列的至少7nt长的结构化区域。间隔区可具有若干区域，包括非结构化区域、碱基配对区域、发夹/结构化区域以及它们的组合。在一个实施方案中，间隔区具有结构化区域，所述结构化区域具有高GC含量。在一个实施方案中，间隔区内的区域与同一间隔区内的另一区域碱基配对。在一个实施方案中，间隔区内的区域与另一个间隔区内的区域碱基配对。在一个实施方案中，间隔区包含一个或多个发夹结构。在一个实施方案中，间隔区包含一个或多个发夹结构，所述发夹结构具有4至12个核苷酸的茎和2至10个核苷酸的环。在一个实施方案中，在3'I组内含子片段与IRES之间存在额外的间隔区。在一个实施方案中，这个额外的间隔区防止IRES的结构化区域干扰3'I组内含子片段的折叠或降低这种情况发生的程度。在一些实施方案中，5’间隔区序列的长度是至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30个核苷酸。在一些实施方案中，5’间隔区序列的长度不超过100、90、80、70、60、50、45、40、35或30个核苷酸。在一些实施方案中，5'间隔区序列的长度介于5与50、10与50、20与50、20与40、和/或25与35个核苷酸之间。在某些实施方案中，5'间隔区序列的长度是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。在一个实施方案中，5'间隔区序列是多聚A序列。在另一个实施方案中，5'间隔区序列是多聚AC序列。在一个实施方案中，间隔区包含约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的多聚AC含量。在一个实施方案中，间隔区包含约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的多聚嘧啶(C/T或C/U)含量。
在某些实施方案中，3'I组内含子片段是与天然I组内含子的3'近端片段，包括3'剪接位点二核苷酸和任选的长度至少1nt(例如，长度至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30nt)和至多外显子的长度的相邻外显子序列至少75％同源(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源)的连续序列。通常，5'I组内含子片段是与天然I组内含子的5'近端片段，包括5'剪接位点二核苷酸和任选的长度至少1nt(例如，长度至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30nt)和至多外显子的长度的相邻外显子序列至少75％同源(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源)的连续序列。如Umekage等人(2012)所描述，3'I组内含子片段和5'I组内含子片段的外部部分在环化中被除去，从而导致本文提供的环状RNA仅包含由长度至少1nt的任选外显子序列形成的3'I组内含子片段的部分和由长度至少1nt的任选外显子序列形成的5'I组内含子片段，如果此类序列存在于非环化前体RNA上。由环状RNA所保留的3'I组内含子片段的部分在本文中称为“剪接后3'I组内含子片段”。由环状RNA所保留的5'I组内含子片段的部分在本文中称为“剪接后5'I组内含子片段”。
在某些实施方案中，本文提供的载体、前体RNA和环状RNA包含内部核糖体进入位点(IRES)。包含IRES允许从环状RNA翻译一个或多个开放阅读框(例如，形成表达序列的开放阅读框)。IRES元件吸引真核核糖体翻译起始复合物并促进翻译起始。参见例如，Kaufman等人,Nuc.Acids Res.(1991)19:4485-4490；Gurtu等人,Biochem.Biophys.Res.Comm.(1996)229:295-298；Rees等人,BioTechniques(1996)20:102-110；Kobayashi等人,BioTechniques(1996)21:399-402；和Mosser et al.,BioTechniques 1997 22 150-161。
多种IRES序列可获得并且包括源自多种病毒的序列，如源自诸如脑心肌炎病毒(EMCV)UTR的小核糖核酸病毒的前导序列(Jang等人J.Virol.(1989)63:1651-1660)、脊髓灰质炎前导序列、甲型肝炎病毒前导序列、丙型肝炎病毒IRES、人鼻病毒2型IRES(Dobrikova等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(2003)100(25):15125-15130)、来自口蹄疫病毒的IRES元件(Ramesh等人,Nucl.Acid Res.(1996)24:2697-2700)、贾第虫病毒IRES(Garlapati等人,J.Biol.Chem.(2004)279(5):3389-3397)等。
在一些实施方案中，IRES是以下病毒的IRES序列：桃拉综合征病毒、锥椿病毒、蒂勒脑脊髓炎病毒、猿猴病毒40、红火蚁病毒1、禾谷缢管蚜病毒、网状内皮增生病病毒、人脊髓灰质炎病毒1、斯氏珀蝽肠病毒、克什米尔蜜蜂病毒、人鼻病毒2、琉璃叶蝉病毒-1、人免疫缺陷病毒1型、Himetobi P病毒、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、GB型肝炎病毒、口蹄疫病毒、人肠道病毒71、马鼻炎病毒、茶尺蠖微小RNA病毒样病毒、脑心肌炎病毒、果蝇C病毒、人柯萨奇病毒B3、十字花科植物烟草花叶病毒、蟋蟀麻痹病毒、牛病毒性腹泻病毒1、黑蜂王台病毒、蚜虫致死性麻痹病毒、禽脑脊髓炎病毒、急性蜜蜂麻痹病毒、木槿褪绿环斑病毒、猪瘟病毒、人FGF2、人SFTPA1、人AML1/RUNX1、果蝇触角足、人AQP4、人AT1R、人BAG-1、人BCL2、人BiP、人c-IAPl、人c-myc、人eIF4G、小鼠NDST4L、人LEF1、小鼠HIF1α、人n.myc、小鼠Gtx、人p27kipl、人PDGF2/c-sis、人p53、人Pim-1、小鼠Rbm3、果蝇reaper、犬Scamper、果蝇Ubx、人UNR、小鼠UtrA、人VEGF-A、人XIAP、果蝇无毛、酿酒酵母TFIID、酿酒酵母YAP1、烟草蚀纹病毒、芜菁皱缩病毒、EMCV-A、EMCV-B、EMCV-Bf、EMCV-Cf、EMCV pEC9、小双节RNA病毒、HCVQC64、人寇沙病毒E/D、人寇沙病毒F、人寇沙病毒JMY、鼻病毒NAT001、HRV14、HRV89、HRVC-02、HRV-A21、萨力病毒A SH1、萨力病毒FHB、萨力病毒NG-J1、人副肠孤病毒1、CrohivirusB、Yc-3、Rosavirus M-7、Shanbavirus A、Pasivirus A、Pasivirus A 2、艾柯病毒E14、人副肠孤病毒5、爱知病毒、甲型肝炎病毒HA16、Phopivirus、CVA10、肠道病毒C、肠道病毒D、肠道病毒J、人趋肝性病毒2、GBV-C GT110、GBV-C K1737、GBV-C Iowa、趋肝性病毒A 1220、PasivirusA 3、萨佩洛病毒、Rosavirus B、Bakunsa病毒、震颤病毒A、猪Pasivirus1、PLV-CHN、Pasivirus A、Sicinivirus、肝炎病毒K、肝炎病毒A、BVDV1、边界病病毒、BVDV2、CSFV-PK15C、SF573双顺反子病毒、微小RNA病毒样病毒、CRPV、萨力病毒A BN5、萨力病毒A BN2、萨力病毒A 02394、萨力病毒A GUT、萨力病毒A CH、萨力病毒A SZ1、萨力病毒FHB、CVB3、CVB1、艾柯病毒7、CVB5、EVA71、CVA3、CVA12、EV24或eIF4G的适体。
在一些实施方案中，本文的多核苷酸包含多于一个表达序列。
在某些实施方案中，本文提供的载体包含3'UTR。在一些实施方案中，3'UTR来自人β珠蛋白、人α珠蛋白爪蟾β珠蛋白、爪蟾α珠蛋白、人催乳素、人GAP-43、人eEFlal、人Tau、人TNFα、登革热病毒、汉坦病毒小mRNA、布尼亚病毒小mRNA、芜菁黄花叶病毒、丙型肝炎病毒、风疹病毒、烟草花叶病毒、人IL-8、人肌动蛋白、人GAPDH、人微管蛋白、木槿褪绿环斑病毒(hibiscus chlorotic rinsgspot virus)、土拨鼠肝炎病毒翻译后调控元件、辛德毕斯病毒、芜菁皱缩病毒、烟草蚀纹病毒或委内瑞拉马脑炎病毒。
在一些实施方案中，本文提供的载体包含5'UTR。在一些实施方案中，5'UTR来自人β珠蛋白、非洲爪蟾β珠蛋白、人α珠蛋白、非洲爪蟾α珠蛋白、风疹病毒、烟草花叶病毒、小鼠Gtx、登革热病毒、热休克蛋白70kDa蛋白1A、烟草醇脱氢酶、烟草蚀纹病毒、芜菁皱缩病毒或腺病毒三联前导序列。
在一些实施方案中，本文提供的载体包含多聚A区。在一些实施方案中，多聚A区是至少12个核苷酸长、至少30个核苷酸长或至少60个核苷酸长。
在一些实施方案中，本文提供的DNA(例如，载体)、线性RNA(例如，前体RNA)和/或环状RNA多核苷酸的长度介于300与15000、300与14000、300与13000、300与12000、300与11000、300与10000、400与9000、500与8000、600与7000、700与6000、800与5000、900与5000、1000与5000、1100与5000、1200与5000、1300与5000、1400与5000和/或1500与5000个核苷酸之间。在一些实施方案中，多核苷酸的长度是至少300nt、400nt、500nt、600nt、700nt、800nt、900nt、1000nt、1100nt、1200nt、1300nt、1400nt、1500nt、2000nt、2500nt、3000nt、3500nt、4000nt、4500nt、5000nt、6000nt、7000nt、8000nt、9000nt、10000nt、11000nt、12000nt、13000nt、14000nt或15000nt。在一些实施方案中，多核苷酸的长度不超过3000nt、3500nt、4000nt、4500nt、5000nt、6000nt、7000nt、8000nt、9000nt、10000nt、11000nt、12000nt、13000nt、14000nt、15000nt或16000nt。在一些实施方案中，本文提供的DNA、线性RNA和/或环状RNA多核苷酸的长度是约300nt、400nt、500nt、600nt、700nt、800nt、900nt、1000nt、1100nt、1200nt、1300nt、1400nt、1500nt、2000nt、2500nt、3000nt、3500nt、4000nt、4500nt、5000nt、6000nt、7000nt、8000nt、9000nt、10000nt、11000nt、12000nt、13000nt、14000nt或15000nt。
在一些实施方案中，本文提供了载体。在某些实施方案中，载体按以下顺序包含a)5'双链体形成区，b)3'I组内含子片段，c)任选的第一间隔区序列，d)IRES，e)第一表达序列，f)编码裂解位点的多核苷酸序列，g)第二表达序列，h)任选的第二间隔区序列，i)5'I组内含子片段，和j)3'双链体形成区。在一些实施方案中，载体包含位于5'双链体形成区上游的转录启动子。
在一些实施方案中，本文提供了载体。在某些实施方案中，载体按以下顺序包含a)5'双链体形成区，b)3'I组内含子片段，c)任选的第一间隔区序列，d)第一IRES，e)第一表达序列，f)第二IRES，g)第二表达序列，h)任选的第二间隔区序列，i)5'I组内含子片段，和j)3'双链体形成区。在一些实施方案中，载体包含位于5'双链体形成区上游的转录启动子。
在一些实施方案中，本文提供了前体RNA。在某些实施方案中，前体RNA是通过本文提供的载体的体外转录产生的线性RNA。在一些实施方案中，前体RNA按以下顺序包含a)任选的5'双链体形成区，b)3'I组内含子片段，c)任选的第一间隔区序列，d)IRES，e)第一表达序列，f)编码裂解位点的多核苷酸序列，g)第二表达序列，h)任选的第二间隔区序列，i)5'I组内含子片段，和j)任选的3'双链体形成区。在一些实施方案中，前体RNA按以下顺序包含a)5'双链体形成区，b)3'I组内含子片段，c)任选的第一间隔区序列，d)第一IRES，e)第一表达序列，f)第二IRES，g)第二表达序列，h)任选的第二间隔区序列，i)5'I组内含子片段，和j)3'双链体形成区。前体RNA可以是未经修饰的、部分经修饰的或完全经修饰的。
在某些实施方案中，本文提供了环状RNA。在某些实施方案中，环状RNA是由本文提供的载体产生的环状RNA。在一些实施方案中，环状RNA是通过本文提供的前体RNA的环化产生的环状RNA。在一些实施方案中，环状RNA按以下顺序包含a)第一间隔区序列，b)IRES，c)第一表达序列，d)编码裂解位点的多核苷酸序列，e)第二表达序列，和f)第二间隔区序列。在一些实施方案中，环状RNA按以下顺序包含a)剪接后3'I组内含子片段，b)第一间隔区序列，c)IRES,d)第一表达序列，e)编码裂解位点的多核苷酸序列，f)第二表达序列，和g)第二间隔区序列，h)剪接后5'I组内含子片段。在一些实施方案中，环状RNA按以下顺序包含a)第一间隔区序列，b)第一IRES,c)第一表达序列，d)第二IRES，e)第二表达序列，和f)第二间隔区序列。在一些实施方案中，环状RNA还包含3'I组内含子片段的位于3'剪接位点的3'的部分。在一些实施方案中，环状RNA还包含5'I组内含子片段的位于5'剪接位点的5'的部分。在一些实施方案中，环状RNA的大小是至少500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000、13000、14000或15000个核苷酸。环状RNA可以是未经修饰的、部分经修饰的或完全经修饰的。
在一些实施方案中，与包含相同表达序列的mRNA相比，本文提供的环状RNA具有更高的功能稳定性。在一些实施方案中，与包含相同表达序列、5moU修饰、优化的UTR、帽和/或多聚A尾的mRNA相比，本文提供的环状RNA具有更高的功能稳定性。
在一些实施方案中，本文提供的环状RNA多核苷酸具有至少5小时、10小时、15小时、20小时、30小时、40小时、50小时、60小时、70小时或80小时的功能性半衰期。在一些实施方案中，本文提供的环状RNA多核苷酸具有5-80、10-70、15-60和/或20-50小时的功能性半衰期。在一些实施方案中，本文提供的环状RNA多核苷酸的功能性半衰期大于(例如，至少1.5倍，至少2倍)编码相同蛋白质的等效线性RNA多核苷酸的功能性半衰期。在一些实施方案中，功能性半衰期可通过检测功能性蛋白质合成来评估。
在一些实施方案中，本文提供的环状RNA多核苷酸具有至少5小时、10小时、15小时、20小时、30小时、40小时、50小时、60小时、70小时或80小时的半衰期。在一些实施方案中，本文提供的环状RNA多核苷酸具有5-80、10-70、15-60和/或20-50小时的半衰期。在一些实施方案中，本文提供的环状RNA多核苷酸的半衰期大于(例如，至少1.5倍，至少2倍)编码相同蛋白质的等效线性RNA多核苷酸的半衰期。
在一些实施方案中，本文提供的环状RNA可具有比等效线性mRNA更高的表达量值，例如，在向细胞施用RNA后24小时具有更高的表达量值。在一些实施方案中，与包含相同表达序列、5moU修饰、优化的UTR、帽和/或多聚A尾的mRNA相比，本文提供的环状RNA具有更高的表达量值。
在一些实施方案中，当暴露于生物体的免疫系统或某种类型的免疫细胞时，本文提供的环状RNA的免疫原性可低于等效mRNA。在一些实施方案中，当暴露于生物体的免疫系统或某种类型的免疫细胞时，本文提供的环状RNA与细胞因子的调节产生相关。例如，在一些实施方案中，与包含相同表达序列的mRNA相比，当暴露于生物体的免疫系统或某种类型的免疫细胞时，本文提供的环状RNA与TNFα、RIG-I、IL-2、IL-6、IFNγ和/或1型干扰素，例如IFN-β1的产生减少相关。在一些实施方案中，与包含相同表达序列的mRNA相比，当暴露于生物体的免疫系统或某种类型的免疫细胞时，本文提供的环状RNA与更少TNFα、RIG-I、IL-2、IL-6、IFNγ和/或1型干扰素，例如IFN-β1转录诱导相关。在一些实施方案中，本文提供的环状RNA的免疫原性低于包含相同表达序列的mRNA。在一些实施方案中，本文提供的环状RNA的免疫原性低于包含相同表达序列、5moU修饰、优化的UTR、帽和/或多聚A尾的mRNA。
在一些实施方案中，在不需要核苷修饰的情况下，本文所述的组合物和方法为RNA(例如circRNA)提供比等效线性RNA更高的稳定性或功能稳定性。在一些实施方案中，由于败育转录减少，与用于产生含有核苷修饰的RNA的方法相比，用于产生缺乏核苷修饰的RNA的方法产生更高百分比的全长转录物。在一些实施方案中，本文描述的组合物和方法能够产生大型(例如，5kb至15kb、6kb至15kb、7kb至15kb、8kb至15kb、9kb至15kb、10kb至15kb、11kb至15kb、12kb至15kb、13kb至15kb、14kb至15kb、5kb至10kb、6kb至10kb、7kb至10kb、8kb至10kb、9kb至10kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、11,kb、12kb、13kb、14kb或15kb)RNA构建体，而没有添加的与含有核苷修饰的RNA相关的败育转录。
在某些实施方案中，本文提供的环状RNA可按原样转染到细胞中，或者可以DNA载体形式转染并在细胞中转录。从转染的DNA载体转录环状RNA可通过添加的聚合酶或由转染到细胞中的核酸编码的聚合酶、或优选通过内源性聚合酶进行。
在某些实施方案中，本文提供的环状RNA多核苷酸包含经修饰的RNA核苷酸和/或经修饰的核苷。在一些实施方案中，经修饰的核苷是m5C(5-甲基胞苷)。在另一个实施方案中，经修饰的核苷是m5U(5-甲基尿苷)。在另一个实施方案中，经修饰的核苷是m6A(N6-甲基腺苷)。在另一个实施方案中，经修饰的核苷是s2U(2-硫代尿苷)。在另一个实施方案中，经修饰的核苷是Ψ(假尿苷)。在另一个实施方案中，经修饰的核苷是Um(2'-O-甲基尿苷)。在其他实施方案中，经修饰的核苷是m1A(1-甲基腺苷)；m2A(2-甲基腺苷)；Am(2’-O-甲基腺苷)；ms2m6A(2-甲硫基-N6-甲基腺苷)；i6A(N6-异戊烯基腺苷)；ms2i6A(2-甲硫基-N6异戊烯基腺苷)；io6A(N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷)；ms2io6A(2-甲硫基-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷)；g6A(N6-甘氨酰氨基甲酰基腺苷)；t6A(N6-苏氨酰氨基甲酰基腺苷)；ms2t6A(2-甲硫基-N6-苏氨酰氨基甲酰基腺苷)；m6t6A(N6-甲基-N6-苏氨酰氨基甲酰基腺苷)；hn6A(N6-羟基正缬氨酰氨基甲酰基腺苷)；ms2hn6A(2-甲硫基-N6-羟基正缬氨酰氨基甲酰基腺苷)；Ar(p)(2’-O-核糖基腺苷(磷酸))；I(肌苷)；m1I(1-甲基肌苷)；m1Im(1,2’-O-二甲基肌苷)；m3C(3-甲基胞苷)；Cm(2’-O-甲基胞苷)；s2C(2-硫代胞苷)；ac4C(N4-乙酰基胞苷)；f5C(5-甲酰基胞苷)；m5Cm(5,2′-O-二甲基胞苷)；ac4Cm(N4-乙酰基-2'-O-甲基胞苷)；k2C(赖氨酸)；m1G(1-甲基鸟苷)；m2G(N2-甲基鸟苷)；m7G(7-甲基鸟苷)；Gm(2′-O-甲基鸟苷)；m2 2G(N2,N2-二甲基鸟苷)；m2Gm(N2,2’-二甲基鸟苷)；m2 2Gm(N2,N2,2’-O-三甲基鸟苷)；Gr(p)(2’-O-核糖基鸟苷(磷酸))；yW(怀丁苷)；o2yW(过氧怀丁苷)；OHyW(羟基怀丁苷)；OHyW*(修饰不足的羟基怀丁苷)；imG(怀俄苷)；mimG(甲基怀俄苷)；Q(辫苷)；oQ(环氧辫苷)；galQ(半乳糖基-辫苷)；manQ(甘露糖基-辫苷)；preQ0(7-氰基-7-脱氮鸟苷)；preQ1(7-氨基甲基-7-脱氮鸟苷)；G+(古嘌苷)；D(二氢尿苷)；m5Um(5,2’-O-二甲基尿苷)；s4U(4-硫代尿苷)；m5s2U(5-甲基-2-硫代尿苷)；s2Um(2-硫代-2'-O-甲基尿苷)；acp3U(3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷)；ho5U(5-羟基尿苷)；mo5U(5-甲氧基尿苷)；cmo5U(尿苷5-羟乙酸)；mcmo5U(尿苷5-羟乙酸甲酯)；chm5U(5-(羧基羟甲基)尿苷))；mchm5U(5-(羧基羟甲基)尿苷甲酯)；mcm5U(5-甲氧基羰基甲基尿苷)；mcm5Um(5-甲氧基羰基甲基-2'-O-甲基尿苷)；mcm5s2U(5-甲氧基羰基甲基-2-硫代尿苷)；nm5S2U(5-氨基甲基-2-硫代尿苷)；mnm5U(5-甲基氨基甲基尿苷)；mnm5s2U(5-甲基氨基甲基-2-硫代尿苷)；mnm5se2U(5-甲基氨基甲基-2-硒代尿苷)；ncm5U(5-氨基甲酰基甲基尿苷)；ncm5Um(5-氨基甲酰基甲基-2'-O-甲基尿苷)；cmnm5U(5-羧甲基氨基甲基尿苷)；cmnm5Um(5-羧甲基氨基甲基-2'-O-甲基尿苷)；cmnm5s2U(5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷)；m6 2A(N6,N6-二甲基腺苷)；Im(2'-O-甲基肌苷)；m4C(N4-甲基胞苷)；m4Cm(N4,2’-O-二甲基胞苷)；hm5C(5-羟甲基胞苷)；m3U(3-甲基尿苷)；cm5U(5-羧甲基尿苷)；m6Am(N6,2’-O-二甲基腺苷)；m6 2Am(N6,N6,O-2’-三甲基腺苷)；m2,7G(N2,7-二甲基鸟苷)；m2,2,7G(N2,N2,7-三甲基鸟苷)；m3Um(3,2’-O-二甲基尿苷)；m5D(5-甲基二氢尿苷)；f5Cm(5-甲酰基-2'-O-甲基胞苷)；m1Gm(1,2’-O-二甲基鸟苷)；m1Am(1,2’-O-二甲基腺苷)；τm 5U(5-牛磺酸甲基尿苷)；τm5s2U(5-牛磺酸甲基-2-硫代尿苷))；imG-14(4-脱甲基怀俄苷)；imG2(异怀俄苷)；或ac6A(N6-乙酰基腺苷)。
在一些实施方案中，经修饰的核苷可包括选自下组的化合物：吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、5-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙酰基胞苷、5-甲酰基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、1-甲基假异胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假异胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、泽布拉恩、5-氮杂-泽布拉恩、5-甲基-泽布拉恩、5-氮杂-2-硫代-泽布拉恩、2-硫代-泽布拉恩、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲硫基-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰氨基甲酰基腺苷、N6-苏氨酰氨基甲酰基腺苷、2-甲硫基-N6-苏氨酰氨基甲酰基腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、怀俄苷、怀丁苷、7-脱氮-鸟苷、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2,N2-二甲基鸟苷、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷和N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟苷。在另一个实施方案中，修饰独立地选自由以下组成的组：5-甲基胞嘧啶、假尿苷和1-甲基假尿苷。
在一些实施方案中，经修饰的核糖核苷包括5-甲基胞苷、5-甲氧基尿苷、1-甲基-假尿苷、N6-甲基腺苷和/或假尿苷。在一些实施方案中，此类经修饰的核苷提供额外的稳定性和对免疫激活的抗性。
在特定实施方案中，多核苷酸可以是密码子优化的。密码子优化的序列可以是这样的序列，其中编码多肽的多核苷酸中的密码子已被取代以增加多肽的表达、稳定性和/或活性。影响密码子优化的因素包括但不限于以下中的一者或多者：(i)两个或更多个生物体或基因或合成构建的偏倚表之间的密码子偏倚的变化，(ii)生物体内、基因或一组基因内的密码子偏倚程度的变化，(iii)密码子(包括背景)的系统变异，(iv)根据其解码tRNA的密码子变异，(v)根据GC％的密码子变异，无论是整体还是在三联体的一个位置中，(vi)与参考序列(例如天然存在的序列)相似度的变化，(vii)密码子频率截止的变化，(viii)从DNA序列转录的mRNA的结构性质，(ix)关于密码子取代组的设计所基于的DNA序列的功能的先前了解，和/或(x)每个氨基酸的密码子组的系统变异。在一些实施方案中，密码子优化的多核苷酸可最小化核酶碰撞和/或限制表达序列与IRES之间的结构干扰。
在某些实施方案中，本文提供的环状RNA在细胞内部产生。在一些实施方案中，前体RNA在细胞质中由噬菌体RNA聚合酶或在细胞核中由宿主RNA聚合酶II使用DNA模板(例如，在一些实施方案中，使用本文提供的载体)转录、然后环化。
在某些实施方案中，将本文提供的环状RNA注射到动物(例如，人)中，以使得由环状RNA分子编码的多肽在动物体内表达。
有效负载
本发明的环状RNA疫苗包含编码一种或多种野生型或工程化蛋白质、肽或多肽(例如，抗原、佐剂或佐剂样蛋白质)的一种或多种环状RNA多核苷酸。在一些实施方案中，一种或多种环状RNA多核苷酸编码源自传染因子的抗原或佐剂。在一些实施方案中，抗原或佐剂所来源或工程化自的传染因子包括但不限于病毒、细菌、真菌、原生动物和/或寄生虫。在一些实施方案中，抗原是病毒抗原。在一个实施方案中，抗原是SARS-CoV-2抗原。在一个实施方案中，抗原是SARS-CoV-2刺突蛋白。
在一些实施方案中，环状RNA多核苷酸包含多于一个表达序列。在一些实施方案中，表达序列可编码多于一种抗原多肽。在一些实施方案中，一种或多种RNA多核苷酸的表达序列编码至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种抗原多肽。在一些实施方案中，一种或多种RNA多核苷酸的表达序列编码至少10、15、20或50种抗原多肽。在一些实施方案中，一种或多种RNA多核苷酸的表达序列编码2-10、10-15、15-20、20-50、50-100或100-200种抗原多肽。
在一个实施方案中，抗原选自或源自由以下组成的组：轮状病毒、口蹄疫病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7、人2型副流感病毒、单纯疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、水痘病毒、猪疱疹病毒1、巨细胞病毒、狂犬病病毒、炭疽杆菌、炭疽PA和衍生物、脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、戊型肝炎、犬瘟热病毒、委内瑞拉马脑炎、猫白血病病毒、呼肠孤病毒、呼吸道合胞病毒、拉沙热病毒、多瘤肿瘤病毒、犬细小病毒、乳头状瘤病毒、蜱传脑炎病毒、牛瘟病毒、人鼻病毒物种、肠病毒物种、门戈病毒、副粘病毒、禽传染性支气管炎病毒、人T细胞白血病-淋巴瘤病毒1、人免疫缺陷病毒-1、人免疫缺陷病毒-2、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、细小病毒B19、腺病毒、风疹病毒、黄热病病毒、登革病毒、牛呼吸道合胞病毒、冠状病毒、百日咳博德特氏菌、支气管炎博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌、流产布鲁氏菌、羊布鲁氏杆菌、猪布鲁氏菌、绵羊布鲁氏菌、布鲁氏菌物种、大肠杆菌、沙门氏菌物种、伤寒沙门氏菌、链球菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、志贺氏菌、假单胞菌、结核、鸟、卡介苗、麻风分枝杆菌、肺炎球菌、葡萄球菌、肠杆菌物种、亨氏罗卡利马氏体、溶血性巴斯德菌、多杀巴斯德菌、沙眼衣原体、鹦鹉衣原体、性病淋巴肉芽肿、苍白密螺旋体、嗜血杆菌物种、牛生殖道支原体、肺炎支原体、支原体物种、伯氏疏螺旋体、嗜肺军团菌、肉毒杆菌、白喉棒状杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、立氏立克次体、伤寒立克次体、普氏立克次体、查菲埃立克体、嗜吞噬细胞无形体、恶性疟原虫、间日疟原虫、疟疾疟原虫、血吸虫、锥虫、利什曼原虫物种、丝虫线虫、滴虫病、肌肉孢子虫病、牛带绦虫、猪带绦虫、利什曼原虫、刚地弓形虫、旋毛虫、球虫病、柔嫩艾美球虫、新型隐球酵母、白色念珠菌、烟曲霉、球孢子菌病、淋病奈瑟氏菌、疟疾环子孢子蛋白、疟疾裂殖子蛋白、锥虫表面抗原蛋白、百日咳、甲病毒、腺病毒、白喉类毒素、破伤风类毒素、脑膜炎球菌外膜蛋白、链球菌M蛋白、流感血凝素、癌症抗原、肿瘤抗原、毒素、产气荚膜梭菌ε毒素、蓖麻毒素、假单胞菌外毒素、外毒素、神经毒素、细胞因子、细胞因子受体、单核因子、单核因子受体、植物花粉、动物皮屑、尘螨。
在一些实施方案中，佐剂选自或源自由以下组成的组：BCSP31、MOMP、FomA、MymA、ESAT6、PorB、PVL、孔蛋白、OmpA、PepO、OmpU、2,4-二氧四氢蝶啶合酶、Omp16、Omp19、CobT、RpfE、Rv0652、HBHA、NhhA、DnaJ、肺炎球菌溶血素、Falgellin、IFN-α、IFN-γ、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、GM-CSF、IL-1b、IL-6、TNF-a、IL-7、IL-17、IL-1β、抗CTLA4、抗PD1、抗41BB、PD-L1、Tim-3、Lag-3、TIGIT、GITR以及抗CD3。
免疫原性载体和RNA制剂
在一些实施方案中，本发明的环状RNA疫苗包含一种或多种能够在细胞中触发免疫应答的环状RNA多核苷酸或线性RNA多核苷酸对应物。非免疫原性环状RNA多核苷酸的修饰或工程化可允许佐剂样性质(Wesselhoeft，2019)。类似地，线性RNA多核苷酸可进行工程化以与非工程化线性RNA多核苷酸相比触发增加的免疫应答。线性RNA多核苷酸的增加免疫原性的实例包括各种加帽策略(Pardi，2018)。加帽策略包括但不限于，通过向体内转录反应添加单磷酸核苷酸，在末端5'端并入单磷酸化或三磷酸化。在一些实施方案中，改变RNA制剂中三磷酸化:单磷酸化5'末端帽的比率可在体内转录过程中基于改变GMP:GTP比率来进行控制。在其他实施方案中，可使用酶(例如，RppH)来控制RNA制剂中三磷酸化:单磷酸化5'末端帽的比率。基于优选的免疫原性水平，在任何RNA制剂中单磷酸化:三磷酸化的比率可以是100:1、90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、100:1。三磷酸化:单磷酸化比率的更大比率允许更大的免疫应答激活。
在一些实施方案中，可使用基于在RNA多核苷酸开发过程中提供引发剂分子的合成方法来产生单磷酸或三磷酸包含帽。在一些实施方案中，通过在体外转录反应中包含特定核苷酸和/或核苷，可控制由体外转录产生的RNA分子的5'端的三磷酸数量。这些核苷酸将以不同的效率被用作新RNA链的引发剂核苷酸/核苷。在同一实施方案中，RNA聚合酶(例如，T7 RNA聚合酶)具有从可用底物中随机选择引发剂核苷酸/核苷的能力。在一些实施方案中，将多个不同的引发剂核苷/核苷酸(例如，GTP和GMP)包含到合成中将导致一些RNA分子具有5'单磷酸，并且一些具有5'三磷酸。所使用的引发剂核苷酸/核苷的比率和特定核苷酸/核苷的并入比率将决定具有特定5'末端特性的RNA分子的比例。在用于产生具有单磷酸5'末端的RNA分子的优选实施方案中，在体外转录反应中将GMP以大于或等于GTP起始浓度的1倍、最优选4倍添加至T7 RNA聚合酶中。在一些实施方案中，可使用替代引发剂分子，如腺苷核苷酸/核苷，特别是在使用替代RNA聚合酶时。
在另一个实施方案中，单磷酸或三磷酸包含帽的方法可包括剪接方法。在I组内含子和置换I组内含子剪接过程中，鸟苷核苷酸/核苷可在5'剪接位点的第二剪接位点二核苷酸之前并入。此核苷酸/核苷可在5'位置包含0个或多个磷酸基团。包含多个不同的核苷/核苷酸(例如，GTP和GMP)将导致一些内含子产物具有5'单磷酸，并且一些具有5'三磷酸。所使用的核苷酸/核苷的比率和I组内含子对特定核苷酸/核苷的利用率将决定具有特定5'末端特性的RNA分子的比例。在优选的实施方案中，所使用的核苷/核苷酸的比率与用于前体分子的体外转录的比率相同，并且剪接协同转录地发生。通过从体外转录反应中纯化前体RNA分子并添加用于剪接的必要辅因子以及所需的核苷/核苷酸比率，可独立地控制所述比率。I组内含子通常仅接受鸟苷核苷酸/核苷作为辅因子，但有时可接受其他核苷酸/核苷，如腺苷核苷酸/核苷。
在另一个实施方案中，可使用酶方法产生单磷酸或三磷酸包含帽。三磷酸末端可通过酶处理转化为单磷酸末端或羟基末端。用RNA 5'焦磷酸水解酶(RppH)或烟草酸焦磷酸酶(TAP)处理三磷酸化RNA分子将三磷酸化末端转化为单磷酸化末端，其然后可用于由连接酶(如T4 RNA连接酶I)连接，并且将不会触发RIG-I。其他磷酸酶，如小牛肠磷酸酶(CIP/CIAP)、虾碱性磷酸酶(SAP)和其他除去末端磷酸，从而将末端单磷酸、二磷酸或三磷酸转化为末端羟基。末端羟基可使用激酶如T4多核苷酸激酶(PNK)转化为单磷酸基团。
在一些实施方案中，通过使用不同百分比的RNA多核苷酸的不同结构或配方，可使RNA制剂具有更强的免疫刺激作用。在其他实施方案中，RNA制剂可含有非免疫刺激性环状RNA多核苷酸和含有5'末端帽的线性RNA多核苷酸或免疫刺激修饰的环状RNA多核苷酸。在一些实施方案中，RNA制剂含有编码佐剂、抗原或佐剂样蛋白质的环状RNA多核苷酸，以及线性RNA多核苷酸或免疫刺激修饰的环状RNA，以帮助刺激免疫应答。
另外的靶标和组合
在一些实施方案中，提供了用于通过施用包含编码一种或多种肽的一种或多种多核苷酸的环状RNA疫苗来治疗或预防受试者中的微生物感染(例如，细菌或病毒感染)和/或与微生物或病毒感染相关的疾病、病症或疾患或其症状的方法。施用可与抗微生物剂，例如本文描述的抗细菌剂、抗微生物多肽或小分子抗微生物化合物组合。抗微生物剂可包括但不限于抗细菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂、抗原生动物剂、抗寄生虫剂以及抗朊病毒剂。
与细菌感染相关的病状
可使用本发明的环状RNA疫苗治疗的与细菌感染相关的疾病、病症或疾患包括但不限于以下中的一种或多种：脓肿、放线菌病、急性前列腺炎、嗜水气单胞菌、一年生黑麦草毒性、炭疽、杆菌性紫癜、菌血症、细菌性肠胃炎、细菌性脑膜炎、细菌性肺炎、细菌性阴道炎、细菌相关的皮肤病状、巴尔通氏体病(bartonellosis)、BCG-oma、葡萄球菌病、肉毒中毒、巴西紫癜热、布罗迪囊肿、布鲁氏菌病、布鲁利溃疡、弯杆菌病、龋齿、卡里翁氏病、猫抓病、蜂窝织炎、衣原体感染、霍乱、慢性细菌性前列腺炎、慢性复发性多灶骨髓炎、梭菌坏死性肠炎、牙髓牙周联合病变、牛传染性胸膜肺炎、白喉、白喉性口炎、埃里希体病(ehrlichiosis)、丹毒、会厌炎(piglottitis)、丹毒、菲-休-柯三氏综合征(Fitz-Hugh-Curtis syndrome)、跳蚤传播性斑疹热、脚腐病(传染性蹄部皮炎)、加雷氏硬化性骨髓炎、淋病、腹股沟肉芽肿、人粒细胞边虫病、人嗜单核细胞埃里希体病、百日咳、脓疱病、晚期先天性梅毒眼病、军团杆菌病、勒米埃综合征(Lemierre's syndrome)、麻风病(汉森氏病)、钩端螺旋体病、李氏杆菌病、莱姆病、淋巴结炎、类鼻疽、脑膜炎球菌病、脑膜炎球菌败血病、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRS A)感染、鸟胞内分枝杆菌(MAI)、支原体肺炎、坏死性筋膜炎、诺卡氏菌病、坏疽性口炎(走马疽或坏疽性口腔炎)、脐炎、眼眶蜂窝织炎、骨髓炎、无法抵抗的脾切除后感染(OPSI)、羊布鲁氏杆菌、巴氏杆菌病、眼眶周围蜂窝织炎、百日咳(pertussis)(百日咳(whooping cough))、鼠疫、肺炎球菌性肺炎、波特氏疾病、直肠炎、假单胞菌感染、鹦鹉热、脓毒症、脓性肌炎、Q热、回归热(relapsing fever)(回归热(typhinia))、风湿热、落基山斑疹热(RMSF)、立克次氏体病、沙门氏菌病、猩红热、脓毒病、沙雷氏菌感染、志贺氏菌病、南方蜱相关疹病、葡萄球菌烫伤皮肤综合征、链球菌咽炎、游泳池肉芽肿、猪布鲁氏菌病、梅毒、梅毒性主动脉炎、破伤风、中毒性休克综合征(TSS)、沙眼、战壕热、热带溃疡、结核病、土拉菌病、伤寒、斑疹伤寒、泌尿生殖器结核、尿道感染、耐万古霉素金黄色葡萄球菌感染、沃-氟二氏综合征(Waterhouse-Friderichsen syndrome)、假结核病(耶尔森氏菌)病以及耶尔森菌病。
细菌病原体
本文描述的细菌可以是革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。细菌病原体包括但不限于波美不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、包氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、犬布鲁氏菌(Brucellacanis)、马尔他布鲁氏菌(Brucella melitensis)、猪布鲁氏菌(Brucella suis)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、鹦鹉热嗜衣原体(Chlamydophila psittaci)、肉毒梭状芽胞杆菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、产气荚膜梭状芽胞杆菌(Clostridium perfringens)、破伤风杆菌(Clostridium tetani)、凝固酶阴性葡萄球菌(coagulase Negative Staphylococcus)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肠产毒性大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli)(ETEC)、肠致病性大肠杆菌(enteropathogenic E.coli)、大肠杆菌0157:H7、肠杆菌属(Enterobacter sp.)、土拉热弗朗西斯杆菌(Francisella tularensis)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、肾脏钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、卡他莫拉氏菌(Moraxella catarralis)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、奈瑟氏脑膜炎菌(Neisseria meningitides)、奇异变形杆菌(Preteus mirabilis)、变形杆菌属(Proteus sps.)、绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、立氏立克次氏体(Rickettsia rickettsii)、伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcesens)、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、松内志贺氏菌(Shigella sonnei)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、梅毒密螺旋体(Treponemapallidum)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)以及鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)。
细菌病原体还可包括引起耐药性细菌感染的细菌，例如耐克林霉素艰难梭菌、耐氟喹诺酮艰难梭菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRS A)、耐多药物粪肠球菌、耐多药物屎肠球菌、耐多药物绿脓假单胞菌、耐多药物波美不动杆菌以及耐万古霉素金黄色葡萄球菌(VRSA)。
抗生素组合
在一些实施方案中，本发明的环状RNA疫苗，例如包含本发明的一种或多种编码抗原的多核苷酸的环状RNA疫苗可与一种或多种抗细菌剂结合施用。
抗细菌剂
抗细菌剂包括但不限于氨基糖苷(例如，阿米卡星(amikacin)
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庆大霉素(gentamicin)/>
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卡那霉素(kanamycin)/>
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新霉素(neomycin)/>
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奈替米星(netilmicin)/>
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妥布霉素
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巴龙霉素(Paromomycin)/>
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)、安莎霉素(ansamycin)(例如，格尔德霉素(geldanamycin)、除莠霉素(herbimycin))、碳头孢烯(carbacephem)(例如，氯碳头孢(loracarbef)/>
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碳青霉烯(Carbapenem)(例如，厄他培南(ertapenem)/>
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多利培南(doripenem)/>
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亚胺培南(imipenem)/西司他丁(cilastatin)/>
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美罗培南(meropenem)
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头孢菌素(cephalosporin)(第一代)(例如，头孢羟氨苄/>
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头孢唑啉(cefazolin)/>
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头孢噻吩(cefalotin)或头孢噻吩(cefalothin)
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头孢氨苄(cefalexin)/>
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头孢菌素(第二代)(例如，头孢克洛
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头孢孟多(cefamandole)/>
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头孢西丁/>
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头孢丙烯/>
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头孢呋辛/>
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)、头孢菌素(第三代)(例如，头孢克肟/>
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头孢地尼/>
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头孢托仑(cefditoren)/>
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头孢哌酮(cefoperazone)/>
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头孢噻肟(cefotaxime)/>
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头孢泊肟/>
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头孢他啶/>
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头孢布烯(ceftibuten)/>
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头孢唑肟(ceftizoxime)/>
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头孢曲松(ceftriaxone)/>
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)、头孢菌素(第四代)(例如，头孢吡肟/>
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头孢菌素(第五代)(例如，头孢吡普(ceftobiprole)/>
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)、糖肽(例如，替考拉宁(teicoplanin)/>
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万古霉素/>
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特拉万星(telavancin)
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)、林可酰胺(lincosamide)(例如，克林霉素/>
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林可霉素
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)、脂肽(例如，达托霉素(daptomycin)/>
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)、大环内酯(例如，阿奇霉素/>
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)、克拉霉素/>
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地红霉素(dirithromycin)/>
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红霉素/>
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罗红霉素、醋竹桃霉素(troleandomycin)/>
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泰利霉素(telithromycin)/>
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壮观霉素(spectinomycin)/>
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单环内酰胺(例如，氨曲南(aztreonam)/>
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硝基呋喃(例如，呋喃唑酮
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呋喃妥因/>
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)、青霉素(例如，阿莫西林/>
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氨必西林/>
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阿洛西林(azlocillin)、羧苄西林(carbenicillin)/>
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氯唑西林(cloxacillin)
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双氯西林/>
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氟氯西林(flucloxacillin)
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美洛西林(mezlocillin)/>
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甲氧西林
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萘夫西林(nafcillin)/>
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苯唑西林(oxacillin)
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青霉素G/>
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青霉素V/>
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哌拉西林(piperacillin)/>
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替莫西林(temocillin)/>
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替卡西林(ticarcillin)/>
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)、青霉素组合(例如，阿莫西林/克拉维酸盐
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氨必西林/舒巴坦(sulbactam)/>
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哌拉西林/三唑巴坦(tazobactam)/>
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替卡西林/克拉维酸盐/>
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)、多肽(例如，杆菌肽、粘菌素/>
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多粘菌素B、喹诺酮(例如，环丙沙星
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依诺沙星(enoxacin)/>
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加替沙星/>
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左氧氟沙星/>
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洛美沙星/>
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莫西沙星/>
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萘啶酸/>
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诺氟沙星/>
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氧氟沙星
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曲伐沙星(trovafloxacin)/>
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格帕沙星(grepafloxacin)/>
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司帕沙星/>
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替马沙星(temafloxacin)
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)、磺胺(例如，磺胺米隆(mafenide)/>
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磺胺柯衣汀(sulfonamidochrysoidine)/>
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磺胺醋酰(sulfacetamide)(
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磺胺甲二唑(sulfamethizole)(THIOSULFIL/>
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)、磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole)/>
Figure GDA0004216226410000705
磺胺二甲异噁唑(sulfanilamide)、柳氮磺吡啶(sulfasalazine)/>
Figure GDA0004216226410000706
磺胺异噁唑(sulfisoxazole)
Figure GDA0004216226410000707
甲氧苄啶(trimethoprim)/>
Figure GDA0004216226410000708
)、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑(复方新诺明)(TMP-SMX)/>
Figure GDA0004216226410000709
)、四环素(例如，地美环素/>
Figure GDA00042162264100007010
多西环素/>
Figure GDA00042162264100007011
米诺环素/>
Figure GDA00042162264100007012
氧四环素/>
Figure GDA00042162264100007013
四环素/>
Figure GDA00042162264100007014
Figure GDA00042162264100007015
V、/>
Figure GDA00042162264100007016
)、抵抗分枝杆菌的药物(例如，氯法齐明(clofazimine)
Figure GDA00042162264100007017
氨苯砜(dapsone)/>
Figure GDA00042162264100007018
卷曲霉素(capreomycin)
Figure GDA00042162264100007019
环丝氨酸/>
Figure GDA00042162264100007020
乙胺丁醇/>
Figure GDA00042162264100007021
乙硫异烟胺/>
Figure GDA00042162264100007022
异烟肼(isoniazid)/>
Figure GDA00042162264100007023
吡嗪酰胺(ALDIN/>
Figure GDA00042162264100007024
)、利福平/>
Figure GDA00042162264100007025
利福布丁(rifabutin)/>
Figure GDA00042162264100007026
利福喷汀(rifapentine)/>
Figure GDA00042162264100007027
链霉素)以及其他抗细菌剂(例如，胂凡纳明(arsphenamine)/>
Figure GDA00042162264100007028
氯胺苯醇/>
Figure GDA00042162264100007029
磷霉素(fosfomycin)/>
Figure GDA00042162264100007030
梭链孢酸/>
Figure GDA00042162264100007031
利奈唑胺(linezolid)
Figure GDA00042162264100007032
甲硝哒唑(metronidazole)/>
Figure GDA00042162264100007033
莫匹罗星/>
Figure GDA00042162264100007034
平板霉素(platensimycin)、奎奴普丁(quinupristin)/达福普汀(dalfopristin)
Figure GDA00042162264100007035
利福昔明/>
Figure GDA00042162264100007036
甲砜霉素(thiamphenicol)、替加环素
Figure GDA00042162264100007037
替硝唑/>
Figure GDA00042162264100007038
)。
与病毒感染相关的病状
在一些实施方案中，提供了用于通过施用包含编码抗病毒多肽(例如，本文所述的抗病毒多肽)的一种或多种多核苷酸的环状RNA疫苗来治疗或预防受试者中的病毒感染和/或与病毒感染相关的疾病、病症或疾患或其症状的方法。在一些实施方案中，环状RNA疫苗与抗病毒剂(例如，本文所述的抗病毒多肽或小分子抗病毒剂)组合施用。
可使用本发明的环状RNA疫苗治疗的与病毒感染相关的疾病、病症或疾患包括但不限于急性热性咽炎、咽结膜热、流行性角结膜炎、幼儿胃肠炎、柯萨奇病毒感染(Coxsackie infection)、传染性单核细胞增多症、伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、肝细胞癌、原发性HSV-1感染(例如，儿童龈口炎、成人扁桃体炎和咽炎、角膜结膜炎)、潜伏性HSV-1感染(例如，唇疱疹和感冒疮)、原发性HSV-2感染、潜伏性HSV-2感染、无菌性脑膜炎、传染性单核细胞增多症、巨细胞包涵体病、卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma)、多中心型卡斯曼病(multicentric Castleman disease)、原发性渗出性淋巴瘤、AIDS、流感、雷依氏综合征(Reye syndrome)、麻疹、感染后脑脊髓炎、腮腺炎、上皮增生性病变(例如，寻常疣、扁平疣、足底疣和肛门生殖器疣、喉乳头状瘤、疣状表皮发育不良)、宫颈癌、鳞状细胞癌、哮吼(croup)、肺炎、毛细支气管炎、普通感冒、脊髓灰质炎、狂犬病、毛细支气管炎、肺炎、流感样综合征、重度毛细支气管炎伴肺炎、德国麻疹(Germanmeasle)、先天性风疹、水痘、带状疱疹和SARS-CoV-2。
病毒病原体
病毒传染因子的实例包括但不限于腺病毒；单纯疱疹，1型；单纯疱疹，2型；脑炎病毒、乳头瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒；爱泼斯坦-巴尔病毒；人巨细胞病毒；人疱疹病毒，8型；人乳头瘤病毒；BK病毒；JC病毒；天花；脊髓灰质炎病毒；乙型肝炎病毒；人博卡病毒；细小病毒B19；人星状病毒；诺沃克病毒；柯萨奇病毒；甲型肝炎病毒；脊髓灰质炎病毒；鼻病毒；严重急性呼吸道综合征病毒；丙型肝炎病毒；黄热病毒；登革热病毒；西尼罗病毒；风疹病毒；戊型肝炎病毒；人免疫缺陷病毒(HIV)；甲型或乙型流感病毒；瓜纳里托病毒；胡宁病毒；拉沙病毒；马丘波病毒；萨比亚病毒；克里米亚-刚果出血热病毒；埃博拉病毒；马尔堡病毒；麻疹病毒；腮腺炎病毒；副流感病毒；呼吸道合胞病毒；人偏肺病毒；亨德拉病毒；尼帕病毒；狂犬病病毒；丁型肝炎；轮状病毒；环状病毒；科罗拉多壁虱热病毒；汉坦病毒；中东呼吸道冠状病毒；基孔肯亚病毒、版纳病毒或SARS-CoV-2。病毒病原体还可包括引起抗病毒耐药性感染的病毒。
抗病毒剂
示例性抗病毒剂包括但不限于阿巴卡韦(abacavir)
Figure GDA0004216226410000721
阿巴卡韦/拉米夫定(lamivudine)/齐多夫定(zidovudine)/>
Figure GDA0004216226410000722
阿昔洛韦(aciclovir)或无环鸟苷(acyclovir)/>
Figure GDA0004216226410000723
Figure GDA0004216226410000724
阿德福韦(adefovir)
Figure GDA0004216226410000725
金刚胺/>
Figure GDA0004216226410000726
安泼那韦(amprenavir)
Figure GDA0004216226410000727
安普利近(ampligen)、阿比多尔(arbidol)、阿扎那韦(atazanavir)
Figure GDA0004216226410000728
波普瑞韦(boceprevir)、西多福韦(cidofovir)、达芦那韦(darunavir)
Figure GDA0004216226410000729
地拉韦啶(delavirdine)/>
Figure GDA00042162264100007210
去羟肌苷/>
Figure GDA00042162264100007211
二十二烷醇/>
Figure GDA00042162264100007212
依度尿苷(edoxudine)、依法韦仑(efavirenz)
Figure GDA00042162264100007213
恩曲他滨(emtricitabine)/>
Figure GDA00042162264100007214
恩曲他滨/替诺福韦(tenofovir)/依法韦仑/>
Figure GDA00042162264100007215
恩夫韦(enfuvirtide)/>
Figure GDA00042162264100007216
恩替卡韦(entecavir)/>
Figure GDA00042162264100007217
Figure GDA00042162264100007218
泛昔洛韦(famciclovir)
Figure GDA00042162264100007219
福米韦生(fomivirsen)(VITRA/>
Figure GDA00042162264100007220
)、福沙那韦(fosamprenavir)
Figure GDA00042162264100007221
Figure GDA00042162264100007222
磷卡萘替(foscarnet)/>
Figure GDA00042162264100007223
磷乙酸盐(fosfonet)、更昔洛韦(ganciclovir)/>
Figure GDA00042162264100007224
Figure GDA00042162264100007225
Figure GDA00042162264100007226
GS 9137/>
Figure GDA00042162264100007227
咪喹莫特(imiquimod)
Figure GDA00042162264100007228
茚地那韦(indinavir)
Figure GDA00042162264100007229
肌苷、异丙肌苷(inosine pranobex)/>
Figure GDA00042162264100007230
I型干扰素、II型干扰素、III型干扰素、kutapressin/>
Figure GDA00042162264100007231
拉米夫定
Figure GDA00042162264100007232
拉米夫定/齐多夫定/>
Figure GDA00042162264100007233
洛匹那韦(lopinavir)、洛韦胺(loviride)、马拉维洛克(maraviroc)
Figure GDA00042162264100007234
美替沙腙(methisazone)、MK-2048、吗啉胍、那非那韦(nelfinavir)/>
Figure GDA0004216226410000731
奈韦拉平(nevirapine)/>
Figure GDA0004216226410000732
奥塞米韦(oseltamivir)/>
Figure GDA0004216226410000733
聚乙二醇干扰素α-2a/>
Figure GDA0004216226410000734
喷昔洛韦(penciclovir)/>
Figure GDA0004216226410000735
帕拉米韦(peramivir)、普来可那立(pleconaril)、鬼臼毒素/>
Figure GDA0004216226410000736
拉替拉韦(raltegravir)/>
Figure GDA0004216226410000737
利巴韦林(ribavirin)(/>
Figure GDA0004216226410000738
和/>
Figure GDA0004216226410000739
)、金刚乙胺/>
Figure GDA00042162264100007310
利托那韦(ritonavir)/>
Figure GDA00042162264100007311
嘧啶、沙奎那韦(saquinavir)/>
Figure GDA00042162264100007312
Figure GDA00042162264100007313
司他夫定(stavudine)、茶树油(千层油(melaleuca oil))、替诺福韦/>
Figure GDA00042162264100007314
替诺福韦/恩曲他滨/>
Figure GDA00042162264100007315
替拉那韦(tipranavir)/>
Figure GDA00042162264100007316
曲氟尿苷/>
Figure GDA00042162264100007317
曲金刚胺
Figure GDA00042162264100007318
伐昔洛韦(valaciclovir)/>
Figure GDA00042162264100007319
缬更昔洛韦(valganciclovir)/>
Figure GDA00042162264100007320
维立韦罗(vicriviroc)、阿糖腺苷(vidarabine)、韦拉咪定(viramidine)、扎西他滨(zalcitabine)、扎那米韦(zanamivir)/>
Figure GDA00042162264100007321
以及齐多夫定(叠氮胸苷(AZT)、/>
Figure GDA00042162264100007322
)。
与真菌感染相关的病状
可使用本发明的环状RNA疫苗治疗的与真菌感染相关的疾病、病症或疾患包括但不限于曲霉病、芽生菌病、假丝酵母病、球孢子菌病、隐球酵母病、组织胞浆菌病、足菌肿、副球孢子菌病以及皮癣菌病。此外，具有免疫缺陷的人特别易于感染由真菌属如曲霉属(Aspergillus)、念珠菌属(Candida)、隐球菌属(Cryptoccocus)、组织胞浆菌属(Histoplasma)和肺孢子虫属(Pneumocystis)引起的疾病，所述疾病可使用本发明的环状RNA疫苗治疗。可使用本发明的环状RNA疫苗治疗的其他真菌包括可侵害眼部、指甲、头发，并且尤其皮肤(所谓的皮肤真菌和嗜角蛋白真菌)的真菌，所述真菌引起各种疾患，其中以癣菌病如脚气(athlete’s foot)较为常见。本发明的环状RNA疫苗也可用于治疗由真菌孢子和来自各种分类群的真菌引起的过敏。
真菌病原体
真菌病原体包括但不限于子囊菌门(Ascomycota)(例如，尖胞镰刀菌(Fusariumoxysporum)、卡氏肺囊虫(Pneumocystis jirovecii)、曲霉菌属(Aspergillus spp.)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)/球孢子菌(posadasii)、白色念珠菌(Candidaalbicans))、担子菌门(Basidiomycota)(例如，新型线黑粉菌(Filobasidiellaneoformans)、毛孢子菌(Trichosporon))、微孢子目(Microsporidia)(例如，家兔脑胞内原虫(Encephalitozoon cuniculi)、腹泻原虫(Enterocytozoon bieneusi))以及毛霉菌亚门(Mucoromycotina)(例如，卷枝毛霉(Mucor circinelloides)、米根霉(Rhizopus oryzae)、伞枝犁头霉(Lichtheimia corymbifera))。
抗真菌剂
可与本发明的环状RNA疫苗组合使用的抗真菌剂包括但不限于多烯抗真菌剂(例如，游霉素(natamycin)、龟裂杀菌素(rimocidin)、菲律宾菌素(filipin)、制霉菌素、两性霉素B、坎底辛(candicin)、哈霉素(hamycin))、咪唑抗真菌剂(例如，咪康唑(miconazole)
Figure GDA0004216226410000741
Figure GDA0004216226410000742
酮康唑(ketoconazole)/>
Figure GDA0004216226410000743
Figure GDA0004216226410000744
克霉唑(clotrimazole)(/>
Figure GDA0004216226410000745
AF、
Figure GDA0004216226410000746
)、益康唑(econazole)、奥莫康唑(omoconazole)、联苯苄唑(bifonazole)、布康唑(butoconazole)、芬替康唑(fenticonazole)、异康唑(isoconazole)、奥昔康唑(oxiconazole)、舍他康唑(sertaconazole)/>
Figure GDA0004216226410000747
硫康唑(sulconazole)、噻康唑(tioconazole))、三唑抗真菌剂(例如，阿泊康唑(albaconazole)、氟康唑(fluconazole)、伊曲康唑(itraconazole)、艾沙康唑(isavuconazole)、雷夫康唑(ravuconazole)、泊沙康唑(posaconazole)、伏立康唑(voriconazole)、特康唑(terconazole))、噻唑抗真菌剂(例如，阿巴芬净(abafungin))、烯丙胺(例如，特比萘芬(terbinafine)/>
Figure GDA0004216226410000748
萘替芬(naftifine)/>
Figure GDA0004216226410000749
布替萘芬(butenafine)(/>
Figure GDA00042162264100007410
Ultra))、棘白霉素(echinocandin)(例如，阿尼芬净(anidulafungin)、卡泊芬净(caspofungin)、米卡芬净(micafungin))以及其他抗真菌剂(例如，水蓼二醛(polygodial)、苯甲酸、环吡酮、托萘酯/>
Figure GDA0004216226410000751
十一碳烯酸、氟胞嘧啶或5-氟胞嘧啶、灰黄霉素(griseofulvin)、卤普罗近(haloprogin)、碳酸氢钠、蒜素)。
与原生动物感染相关的病状
可使用本发明的环状RNA疫苗治疗的与原生动物感染相关的疾病、病症或疾患包括但不限于阿米巴病、贾第虫病、滴虫病、非洲昏睡病、美国昏睡病、利什曼病(黑热病(Kala-Azar))、小袋虫病、弓形体病、疟疾、棘阿米巴角膜炎以及焦虫病。
原生动物病原体
原生动物病原体包括但不限于痢疾内变形虫(Entamoeba histolytica)、贾第鞭毛虫属(Giardia lambila)、阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)、布氏锥虫冈比亚(Trypanosoma brucei)、克氏锥虫(T.cruzi)、杜氏利什曼虫(Leishmania donovani)、肠袋虫属(Balantidium coli)、鼠弓形体(Toxoplasma gondii)、疟原虫属(Plasmodium spp.)以及田鼠巴贝虫(Babesia microti)。
抗原生动物剂
示例性抗原生动物剂包括但不限于依氟鸟氨酸(eflornithine)、呋喃唑酮(
Figure GDA0004216226410000752
DEPEND/>
Figure GDA0004216226410000753
)、美拉胂醇(melarsoprol)、甲硝唑/>
Figure GDA0004216226410000754
奥硝唑(ornidazole)、硫酸巴龙霉素(paromomycin sulfate)/>
Figure GDA0004216226410000755
喷他脒(pentamidine)、乙胺嘧啶(pyrimethamine)/>
Figure GDA0004216226410000756
以及替硝唑(tinidazole)
Figure GDA0004216226410000757
与寄生虫感染相关的病状
可使用本发明的环状RNA疫苗治疗的与寄生虫感染相关的疾病、病症或疾患包括但不限于棘阿米巴角膜炎、阿米巴病、蛔虫病、焦虫病、小袋虫病、贝蛔虫病(baylisascariasis)、查加斯病、华支睾吸虫病、锥蝇病(cochliomyia)、隐孢子虫病、裂头绦虫病、麦地那龙线虫病、包虫病、象皮病、蛲虫病、片吸虫病、姜片吸虫病、丝虫病、贾第鞭毛虫病、颚口线虫病、膜壳绦虫病、等孢子球虫病、钉螺热、利什曼病、莱姆病、疟疾、后殖吸虫病、蝇蛆病、盘尾丝虫病、虱病、疥疮、血吸虫病、昏睡病、类圆线虫病、绦虫病、弓蛔虫病、弓形体病、旋毛虫病以及鞭虫病。
寄生虫病原体
寄生虫病原体包括但不限于棘阿米巴属(Acanthamoeba)、异尖线虫(Anisakis)、人蛔虫(Ascaris lumbricoides)、马蝇(botfly)、肠袋虫属、臭虫、多节绦虫亚纲(Cestoda)、恙螨、螺旋蝇(Cochliomyia hominivorax)、痢疾内变形虫、肝片吸虫(Fasciolahepatica)、兰伯贾第虫(Giardia lamblia)、钩虫、利什曼虫属(Leishmania)、锯齿状舌形虫(Linguatula serrata)、肝吸虫、罗阿丝虫(Loa loa)、并殖吸虫属(Paragonimus)、蛲虫、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、血吸虫属(Schistosoma)、肠类圆线虫(Strongyloides stercoralis)、螨、绦虫、鼠弓形体(Toxoplasma gondii)、锥虫属(Trypanosoma)、鞭虫和班氏线虫(Wuchereria bancrofti)。
抗寄生虫剂
示例性抗寄生虫剂包括但不限于抗线虫剂(例如，甲苯咪唑、双羟萘酸噻嘧啶、噻苯达唑、乙胺嗪、伊维菌素(ivermectin))、抗绦虫剂(例如，氯硝柳胺(niclosamide)、吡喹酮(praziquantel)、阿苯达唑(albendazole))、抗吸虫剂(例如，吡喹酮)、抗变形虫剂(例如，利福平、两性霉素B)以及抗原生动物剂(例如，美拉胂醇、依氟鸟氨酸、甲硝唑、替硝唑)。
裂解位点
在一些实施方案中，多核苷酸构建体中的两个或更多个表达序列可由一个或多个裂解位点序列隔开。裂解位点可以是使两个或更多个多肽变得分离的任何序列。裂解位点可以是自裂解的，使得当产生多肽时，它立即被裂解成单独多肽，而不需要任何外部裂解活性。
在一些实施方案中，裂解位点可以是弗林蛋白酶裂解位点。弗林蛋白酶是属于枯草杆菌蛋白酶样原蛋白转化酶家族的酶。这一家族的成员是将潜在前体蛋白加工成其生物活性产物的原蛋白转化酶。弗林蛋白酶是可使前体蛋白在其成对碱性氨基酸加工位点处有效裂解的钙依赖性丝氨酸内切蛋白酶。弗林蛋白酶底物的实例包括甲状旁腺激素原、转化生长因子β1前体、原白蛋白、原β-分泌酶、膜1型基质金属蛋白酶、原神经生长因子的β亚基和冯·维勒布兰德因子。弗林蛋白酶裂解刚好在碱性氨基酸靶序列下游的蛋白(规范地表示为，Arg-X-(Arg/Lys)-Arg)，并在高尔基体中富集。
在一些实施方案中，裂解位点可编码自裂解肽。
在一些实施方案中，裂解位点可通过核糖体跳跃，如2A自裂解肽的C末端处的甘氨酰基-丙基键的跳跃来操作。在一些实施方案中，空间位阻导致核糖体跳变。在一些实施方案中，2A自裂解肽含有序列GDVEXNPGP(SEQ ID NO:324)，其中X是E或S。在一些实施方案中，在2A自裂解肽上游编码的蛋白质在翻译后连接至2A自裂解肽，除了C末端脯氨酸。在一些实施方案中，在2A自裂解肽下游编码的蛋白质在翻译后在其N末端连接至脯氨酸。
在一些实施方案中，自裂解肽可以是来自口疮病毒或心病毒的2A自裂解肽。口疮病毒和心病毒的初级2A/2B裂解是通过其自身C末端的2A裂解介导的。在口疮病毒，如口蹄疫病毒(FMDV)和马鼻炎A病毒中，2A区是由约18个氨基酸组成的小段，其与蛋白2B的N末端残基(保守的脯氨酸残基)一起代表能够介导其自身C末端的裂解的自主元件(Donelly等人(2001))。
除了口疮病毒或心病毒、“小核糖核酸病毒样”昆虫病毒、C型轮状病毒以及锥虫属和细菌序列中的重复序列外，还在小核糖核酸病毒中发现了2A样序列(Donnelly等人(2001))。在一些实施方案中，裂解位点可包含这些2A样序列中的一个，如表8中所列的那些。
在一些实施方案中，自裂解肽是F2A。在一些实施方案中，自裂解肽源自口蹄疫病毒。在一些实施方案中，自裂解肽是E2A。在一些实施方案中，自裂解肽源自马鼻炎A病毒。在一些实施方案中，自裂解肽是P2A。在一些实施方案中，自裂解肽源猪捷申病毒-1。在一些实施方案中，自裂解肽是T2A。在一些实施方案中，自裂解肽源自明脉扁刺蛾病毒。在一些实施方案中，自裂解肽具有表8中所列的序列。
在一个实施方案中，编码通过裂解位点隔开的肽的表达序列具有相同水平的蛋白质表达。
在一些实施方案中，自裂解肽描述于Liu,Z.,Chen,O.,Wall,J.B.J.等人Systematic comparison of 2A peptides for cloning multi-genes in apolycistronic vector.Sci Rep 7,2193(2017)中。
多核苷酸的产生
本文提供的载体可使用本领域技术人员已知的标准分子生物学技术制成。例如，本文提供的载体的各种元件可使用重组方法获得，如通过从细胞中筛选cDNA和基因组文库，或通过从已知包含多核苷酸的载体产生它们。
基于已知序列，本文提供的载体的各种元件也可合成产生，而不是克隆。完整序列可由通过标准方法制备并组装成完整序列的重叠寡核苷酸组装。参见例如，Edge,Nature(1981)292:756；Nambair等人,Science(1984)223:1299；和Jay等人,J.Biol.Chem.(1984)259:631 1。
因此，特定核苷酸序列可从具有所需序列的载体获得，或者在适当的情况下使用本领域已知的各种寡核苷酸合成技术如定点诱变和聚合酶链式反应(PCR)技术完全或部分地合成。获得编码所需载体元件的核苷酸序列的一种方法是使常规自动化多核苷酸合成仪中产生的重叠合成寡核苷酸的互补组退火，然后用合适的DNA连接酶连接并通过PCR扩增连接的核苷酸序列。参见例如，Jayaraman等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1991)88:4084-4088。此外，可使用寡核苷酸指导的合成(Jones等人,Nature(1986)54:75-82)、预先存在的核苷酸区域的寡核苷酸指导的诱变(Riechmann等人,Nature(1988)332:323-327和Verhoeyen等人,Science(1988)239:1534-1536)以及使用T4 DNA聚合酶对有缺口的寡核苷酸进行酶促填充(Queen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1989)86:10029-10033)。
本文提供的前体RNA可通过在允许由载体编码的前体RNA转录的条件下孵育本文提供的载体来产生。例如，在一些实施方案中，通过在允许体外转录的条件下将本文提供的载体与相容的RNA聚合酶一起孵育来合成前体RNA，所述载体在其5'双链体形成区和/或表达序列上游包含RNA聚合酶启动子。在一些实施方案中，通过噬菌体RNA聚合酶在细胞内孵育载体或通过宿主RNA聚合酶II在细胞核中孵育载体。
在某些实施方案中，本文提供了通过使用本文提供的载体作为模板(例如，具有位于5'双链体形成区上游的RNA聚合酶启动子的本文提供的载体)进行体外转录来产生前体RNA的方法。
在某些实施方案中，所得前体RNA可用于通过在镁离子和鸟苷核苷酸或核苷存在下在RNA环化发生的温度(例如介于20℃与60℃之间)下孵育来产生环状RNA(例如，本文提供的环状RNA多核苷酸)。
因此，在某些实施方案中，本文提供了制备环状RNA的方法。在某些实施方案中，方法包括通过以下方式合成前体RNA：使用本文提供的载体(例如，按以下顺序包含5'双链体形成区、3'I组内含子片段、第一间隔区、内部核糖体进入位点(IRES)、第一表达序列、编码裂解位点的多核苷酸序列、第二表达序列、第二间隔区、5'I组内含子片段和3'双链体形成区的载体)作为模板转录(例如，失控转录(run-off transcription))并在二价阳离子(例如镁离子)和GTP存在下孵育所得前体RNA，以使得其环化形成环状RNA。在一些实施方案中，本发明的前体RNA能够在不存在镁离子和GTP和/或没有与镁离子和GTP孵育的步骤的情况下环化。在一些实施方案中，在过量GMP存在下进行转录。
在一些实施方案中，包含环状RNA的组合物已被纯化。环状RNA可通过本领域常用的任何已知方法纯化，如柱色谱法、凝胶过滤色谱法和尺寸排阻色谱法。在一些实施方案中，纯化包括以下步骤中的一个或多个：磷酸酶处理、HPLC尺寸排阻纯化和RNA酶R消化。在一些实施方案中，纯化依次包括以下步骤：RNA酶R消化、磷酸酶处理和HPLC尺寸排阻纯化。在一些实施方案中，纯化包括反相HPLC。在一些实施方案中，与未纯化的RNA相比，纯化的组合物含有更少的双链RNA、DNA夹板、三磷酸化RNA、磷酸酶蛋白、蛋白连接酶、加帽酶和/或切口RNA。在一些实施方案中，纯化的组合物的免疫原性低于未纯化的组合物。在一些实施方案中，与暴露于未纯化的组合物的免疫细胞相比，暴露于纯化组合物的免疫细胞产生更少的TNFα、RIG-I、IL-2、IL-6、IFNγ和/或1型干扰素(例如，IFN-β1)。
纳米颗粒
在某些方面，本文提供了包含本文提供的环状RNA的药物组合物。在某些实施方案中，将此类药物组合物用纳米颗粒配制以促进递送。
在某些实施方案中，本文提供的环状RNA可以转移媒介物例如纳米颗粒或包含纳米颗粒的组合物的形式递送和/或靶向至细胞。在一些实施方案中，环状RNA还可以转移媒介物或包含转移媒介物的组合物形式递送给受试者。在一些实施方案中，转移媒介物是纳米颗粒。在一些实施方案中，纳米颗粒是脂质纳米颗粒、固体脂质纳米颗粒、聚合物核-壳纳米颗粒或生物可降解纳米颗粒。在一些实施方案中，转移媒介物包含或包被有一种或多种阳离子脂质、非阳离子脂质、可电离脂质、PEG修饰的脂质、聚谷氨酸聚合物、透明质酸聚合物、聚β-氨基酯、聚β氨基肽或带正电荷的肽。
在一个实施方案中，可选择和/或制备转移媒介物以优化环状RNA至靶细胞的递送。例如，如果靶细胞是抗原呈递细胞，则可优化转移媒介物的性质(例如，大小、电荷和/或pH)以有效地将这种转移媒介物递送至靶细胞，减少免疫清除和/或促进在所述靶细胞中的保留。
本发明考虑使用转移媒介物来促进将核酸递送至靶细胞。脂质体(例如，脂质体脂质纳米颗粒)通常适用于研究、工业和医学中的各种应用，尤其其在体内用作诊断性或治疗性化合物的转移媒介物(Lasic,Trends Biotechnol.,16:307-321,1998；Drummond等人,Pharmacol.Rev.,51:691-743,1999)并且通常特征为微观囊泡，其具有通过一个或多个双层膜与外部介质隔离的内部含水空间。脂质体的双层膜通常由两亲性分子形成，如合成或天然来源的脂质，所述脂质包含空间分离的亲水性和疏水性结构域(Lasic,TrendsBiotechnol.,16:307-321,1998)。脂质体的双层膜也可通过两亲性聚合物和表面活性剂(例如，聚合物囊泡、囊泡等)来形成。
在本发明的上下文中，转移媒介物通常用于将环状RNA运输至靶细胞。对于本发明的目的，转移媒介物被制备为含有或包封所需的核酸。将所需实体(例如，核酸)并入脂质体的过程通常被称为负载(Lasic等人,FEBS Lett.,312:255-258,1992)。并入脂质体的核酸可完全或部分位于脂质体的内部空间、脂质体的双层膜内，或与脂质体膜的外部表面相关联。将环状RNA并入转移媒介物如脂质体的目的经常是保护核酸免于可能含有使核酸降解的酶或化学品和/或导致核酸快速排泄的系统或受体的环境。因此，在本发明的一个实施方案中，选定的转移媒介物能够增强其中所含的环状RNA的稳定性。脂质体能够允许包封的circRNA到达靶细胞，或者可替代地限制这种环状RNA递送至其他部位或细胞，在所述部位或细胞中所施用的环状RNA的存在可能是无用的或不合乎需要的。此外，将环状RNA并入转移媒介物例如阳离子脂质体中也有助于将这种circRNA递送至靶细胞中。在一些实施方案中，本文公开的转移媒介物可用于促进例如包封在转移媒介物(例如，脂质纳米颗粒)中的内容物的内体或溶酶体释放。
理想地，转移媒介物被制备为包封一种或多种所需的环状RNA，以使得组合物展现高转染效率和增强的稳定性。虽然脂质体可促进将核酸引入靶细胞中，但添加聚阳离子(例如，聚L-赖氨酸和鱼精蛋白)作为共聚物可在一些情况下使几种类型的阳离子脂质体在体外和体内在许多细胞系中的转染效率显著增强2-28倍。(参见N J.Caplen等人,GeneTher.1995；2:603；S.Li等人,Gene Ther.1997；4,891。)
在本发明的一些实施方案中，转移媒介物被配制为脂质纳米颗粒。在一个实施方案中，脂质纳米颗粒被配制成将一种或多种circRNA递送至一种或多种靶细胞。合适脂质的实例包括磷脂酰基化合物(例如，PBAE、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂、脑苷脂和神经节苷脂)。还考虑使用聚合物作为转移媒介物，不论单独或与其它转移媒介物组合。合适的聚合物可包括例如聚丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚丙交酯、聚丙交酯-聚乙交酯共聚物、聚己内酯、葡聚糖、白蛋白、明胶、海藻酸盐、胶原、壳聚糖、环糊精、树枝状聚合物和聚乙烯亚胺。在一些实施方案中，转移媒介物被配制为脂质，如美国专利申请第US16/065,067号中所述，所述申请整体并入本文。在一些实施方案中，基于其促进circRNA转染至靶细胞的能力来选择转移媒介物。
本发明考虑使用脂质纳米颗粒作为包含阳离子脂质的转移媒介物，以负载和/或包封和/或增强将circRNA递送至靶细胞中，所述靶细胞将充当蛋白质产生的贮库。所考虑的脂质纳米颗粒可通过包括使用一种或多种阳离子脂质、非阳离子脂质和PEG-修饰是脂质的不同比率的多组分脂质混合物来制备。一些阳离子脂质已经在文献中描述，其中许多可购得。
用于本发明的组合物和方法中的合适阳离子脂质包括在国际专利公布号WO2010/053572和/或美国专利申请号US15/809,680中描述的那些，例如C12-200。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法采用脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含在2012年3月29日提交的美国临时专利申请61/617,468(以引用的方式并入本文)中描述的可电离阳离子脂质，如例如，(15Z,18Z)—N,N-二甲基-6-(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基)二十四-15,18-二烯-1-胺(HGT5000)、(15Z,18Z)—N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基)二十四-4,15,18-三烯-1-胺(HGT5001)和(15Z,18Z)—N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基)二十四-5,15,18-三烯-1-胺(HGT5002)。
在一些实施方案中，使用阳离子脂质N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵或“DOTMA”。(Felgner等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.84,7413(1987)；美国专利号4,897,355)。DOTMA可单独配制或可与中性脂质、二油酰磷脂-乙醇胺或“DOPE”或其它阳离子或非阳离子脂质组合成转移媒介物或脂质纳米颗粒，并且此类脂质体可用于增强将核酸递送至靶细胞中。其他合适的阳离子脂质包括例如，5-羧基精基甘氨酸二十八烷基酰胺或“DOGS”、2,3-二油酰基氧基-N-[2(精胺-甲酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙铵或“DOSPA”(Behr等人,Proc.Nat.'l Acad.Sci.86,6982(1989)；美国专利号5,171,678；5,334,761)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷或“DODAP”、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷或“DOTAP”。所考虑的阳离子脂质还包括1,2-二硬脂酰氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DSDMA”、1,2-二油酰氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DODMA”、1,2-二亚油醇氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DLinDMA”、1,2-二亚油烯醇氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DLenDMA”、N-二油酰基-N,N-二甲基氯化铵或“DODAC”、N,N-二硬脂酰基-N,N-二甲基溴化铵或“DDAB”、N-(1,2-二肉豆蔻氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵或“DMRIE”、3-二甲氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁烷-4-氧基)-1-(顺式,顺式-9,12-十八二烯氧基)丙烷或“CLinDMA”、2-[5'-(胆甾-5-烯-3-β-氧基)-3'-氧杂戊氧基)-3-二甲基1-1-(顺式,顺式-9',1-2'-十八二烯氧基)丙烷或“CpLinDMA”、N,N-二甲基-3,4-二油酰氧基苄胺或“DMOBA”、1,2-N,N'-二油基氨基甲酰基-3-二甲氨基丙烷或“DOcarbDAP”、2,3-二亚油醇氧基-N,N-二甲基丙胺或“DLinDAP”、1,2-N,N'-二亚油醇氨基甲酰基-3-二甲氨基丙烷或“DLincarbDAP”、1,2-二亚油醇氨基甲酰基-3-二甲氨基丙烷或“DLinCDAP”、2,2-二亚油醇-4-二甲氨基甲基-[1,3]-二氧戊环或“DLin-K-DMA”、2,2-二亚油醇-4-二甲氨基乙基-[1,3]-二氧戊环或“DLin-K-XTC2-DMA”和2-(2,2-二((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基)-1,3-二氧杂环戊-4-基)-N,N-二甲基乙胺(DLin-KC2-DMA))(参见，WO2010/042877；Semple等人,Nature Biotech.28:172-176(2010))或其混合物。(Heyes,J.等人,J Controlled Release 107:276-287(2005)；Morrissey,D.V.等人,Nat.Biotechnol.23(8):1003-1007(2005)；PCT公布WO2005/121348A1)。
本发明还考虑使用基于胆固醇的阳离子脂质。此类基于胆固醇的阳离子脂质可单独或与其它阳离子或非阳离子脂质组合来使用。合适的基于胆固醇的阳离子脂质包括，例如，GL67、DC-Chol(N,N-二甲基-N-乙基甲酰胺基胆固醇)、1,4-双(3-N-油基氨基-丙基)哌嗪(Gao等人,Biochem.Biophys.Res.Comm.179,280(1991)；Wolf等人,BioTechniques 23,139(1997)；美国专利号5,744,335)或ICE。
另外，几种试剂可商购以增强转染功效。合适的实例包括LIPOFECTIN(DOTMA:DOPE)(Invitrogen,Carlsbad,CA)、LIPOFECTAMINE(DOSPA:DOPE)(Invitrogen)、LIPOFECTAMINE2000.(Invitrogen)、FUGENE(Promega,Madison,WI)、TRANSFECTAM(DOGS)(Promega)和EFFECTENE(Qiagen,Valencia,CA)。
还考虑了阳离子脂质，如基于二烷基氨基的、基于咪唑的和基于胍的脂质，如美国专利10,413,618中描述的那些。
在其他实施方案中，本文所述的组合物和方法涉及脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含一种或多种可裂解脂质，例如像一种或多种阳离子脂质或包含可裂解二硫化物(S—S)官能团的化合物(例如，HGT4001、HGT4002、HGT4003、HGT4004和HGT4005)，如美国临时申请第61/494,745号中进一步描述，所述临时申请的完整教义以引用的方式整体并入本文。
本发明也涵盖使用聚乙二醇(PEG)修饰的磷脂和衍生脂质如衍生神经酰胺(PEG-CER)，包括N-辛酰基-鞘氨醇-1-[丁二酰(甲氧基聚乙二醇)-2000](C8 PEG-2000神经酰胺)，单独或与其它脂质组合，它们一起构成转移媒介物(例如，脂质纳米颗粒)。预期的PEG修饰的脂质包括但不限于与具有C6-C20长度的烷基链的脂质共价连接的长度多达5kDa的聚乙二醇链。添加此类组分可防止复合物聚集，并且还可提供用于增加循环寿命和增加脂质-核酸组合物递送至靶细胞的手段，(Klibanov等人(1990)FEBS Letters,268(1):235-237)，或者它们可被选择为在体内快速交换出制剂(参见美国专利第5,885,613号)。特别有用的可交换脂质是具有较短酰基链(例如，C14或C18)的PEG-神经酰胺。本发明的PEG修饰的磷脂和衍生脂质可占转移媒介物中存在的总脂质的约0％至约20％、约0.5％至约20％、约1％至约15％、约4％至约10％或约2％摩尔比。PEG端基在本文考虑。在一些实施方案中，PEG端基是-OH、-OCH3、酸、胺或胍。
在一些实施方案中，RNA(例如，circRNA)疫苗可与以下缔合：阳离子或聚阳离子化合物，包括鱼精蛋白、核碱、精胺或亚精胺；或其他阳离子肽或蛋白质，如聚-L-赖氨酸(PLL)、聚精氨酸、碱性多肽、细胞穿透肽(CPP)、包括HIV结合肽、HIV-1Tat(HIV)、Tat源性肽、穿膜肽、VP22来源的或类似物肽、猪瘟病毒、HSV、VP22(单纯疱疹)、MAP、KALA或蛋白质转导结构域(PTD)、PpT620、富含脯氨酸的肽、富含精氨酸的肽、富含赖氨酸的肽、MPG-肽、Pep-1、L-寡聚物、降钙素肽、触角足来源的肽(特别是来自果蝇触角足)、pAntp、pIsl、FGF、乳铁蛋白、转运肽、蟾蜍肽抗生素(Buforin)-2、Bac715-24、SynB、SynB(1)、pVEC、hCT来源的肽、SAP、组蛋白、阳离子多糖(例如壳聚糖)、聚苯乙烯、阳离子聚合物例如聚乙烯亚胺(PEI)、阳离子脂质例如DOTMA：[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基)]-N,N,N-三甲基氯化铵、DMRIE、二-C14-脒、DOTIM、SAINT、DC-Chol、BGTC、CTAP、DOPC、DODAP、DOPE：二油酰基磷脂酰乙醇胺、DOSPA、DODAB、DOIC、DMEPC、DOGS：双十八烷基酰胺基甘氨酰基精胺、DIMRI：二肉豆蔻酰基氧基丙基二甲基羟乙基溴化铵、DOTAP：二油酰基氧基-3-(三甲基铵基)丙烷、DC-6-14：O,O-双十四烷酰基-N-.α.-三甲铵基乙酰基)二乙醇胺氯化物、CLIP 1：外消旋-[(2,3-双十八烷基氧基丙基)(2-羟乙基)]-二甲基氯化铵、CLIP6：外消旋-[2(2,3-双十六烷基氧基丙基氧基甲基氧基)乙基]-三甲基铵、CLIP9：外消旋-[2(2,3-双十六烷基氧基丙基氧基琥珀酰基氧基)乙基]-三甲铵、寡酰胺；或阳离子或聚阳离子聚合物，例如改性的聚氨基酸，如β-氨基酸聚合物或反向聚酰胺等、改性的聚乙烯如PVP(聚(N-乙基-4-乙烯基溴化吡啶))等、改性的丙烯酸酯如pDMAEMA(聚(二甲氨基乙基甲基丙烯酸酯)等、改性的酰胺胺如pAMAM(聚(酰胺胺))等、改性的聚β氨基酯(PBAE)如二胺端改性的1,4丁二醇二丙烯酸酯-co-5-氨基-1-戊醇聚合物等、树状聚合物如聚丙胺树状聚合物或基于pAMAM的树状聚合物等、聚酰亚胺如PEI：聚(乙烯亚胺)、聚(丙烯亚胺)等、聚烯丙胺、基于糖主链的聚合物如基于环糊精的聚合物、基于葡聚糖的聚合物、壳聚糖等、基于硅烷主链的聚合物如PMOXA-PDMS共聚物等、由一个或多个阳离子嵌段(例如选自如上所述的阳离子聚合物)和一个或多个亲水性或疏水性嵌段(例如聚乙二醇)的组合组成的嵌段聚合物等。
本发明还考虑使用非阳离子脂质，包括美国专利申请号15/809,680中描述的那些。非阳离子脂质包括但不限于二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环已烷-1-甲酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰基乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰基-乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、胆固醇或其混合物。此类非阳离子脂质可单独使用或与其他赋形剂例如阳离子脂质组合使用。当与阳离子脂质组合使用，非阳离子脂质可占转移媒介物中存在的总脂质的5％至约90％或约10％至约70％摩尔比。
转移媒介物(例如，脂质纳米颗粒)可通过组合多种脂质和/或聚合物组分来制备。举例来说，转移媒介物可使用40:30:25:5摩尔比的C12-200、DOPE、胆固醇、DMG-PEG2K或18:56:20:6摩尔比的DODAP、DOPE、胆固醇、DMG-PEG2K或40:20:35:5摩尔比的HGT5000、DOPE、胆固醇、DMG-PEG2K或40:20:35:5摩尔比的HGT5001、DOPE、胆固醇、DMG-PEG2K来制备。构成脂质纳米颗粒的阳离子脂质、非阳离子脂质和/或PEG-修饰脂质的选择，以及这类脂质彼此相对摩尔比基于选定脂质的特征、预定靶细胞的性质、将要递送的circRNA的特征。额外考虑因素包括，例如，烷基链的饱和度，以及选定脂质的尺寸、电荷、pH、pKa、融合原性和毒性。因此，摩尔比可相应地调节。举例来说，在一些实施方案中，脂质纳米颗粒中阳离子脂质的百分比可大于10％、大于20％、大于30％、大于40％、大于50％、大于60％或大于70％。脂质纳米颗粒中非阳离子脂质的百分比可大于5％、大于10％、大于20％、大于30％或大于40％。脂质纳米颗粒中胆固醇的百分比可大于10％、大于20％、大于30％或大于40％。脂质纳米颗粒中PEG修饰的脂质的百分比可大于1％、大于2％、大于5％、大于10％或大于20％。
用于本发明的组合物中的转移媒介物可通过目前在本领域中已知的各种技术来制备。多层囊泡(MLV)可使用常规技术来制备，例如，通过将选定脂质沉积于合适容器或器皿的内侧壁上、将所述脂质溶解于适当溶剂中、然后蒸发溶剂以在器皿内侧留下薄膜、或喷雾干燥。水相然后可在涡旋运动下添加至器皿，其导致形成MLV。单层囊泡(ULV)然后可通过均质化、超声处理或挤出多层囊泡来形成。此外，ULV可通过洗涤剂移除技术形成。
在本发明的某些实施方案中，本发明的组合物包含转移媒介物，其中circRNA在转移媒介物的表面上缔合并且包封于相同转移媒介物内。例如，在制备本发明的组合物期间，阳离子转移媒介物可通过静电相互作用与circRNA缔合。
在某些实施方案中，本发明的组合物可负载有诊断性放射性核素、荧光材料或在体外和体内应用中均可检测的其他材料。例如，用于本发明中的合适的诊断材料可包括若丹明-二油酰磷脂酰乙醇胺(Rh-PE)、绿色荧光蛋白circRNA(GFP circRNA)、海肾荧光素酶circRNA和萤火虫荧光素酶circRNA。
在一些实施方案中，转移媒介物的合适尺寸的选择考虑了靶细胞或组织的部位，并且在一定程度上考虑了制备脂质体的应用。在一些实施方案中，可能需要限制circRNA对某些细胞或组织的转染。例如，为了靶向肝细胞，可将转移媒介物的大小设计成使得其尺寸小于内衬肝脏中的肝窦的内皮层的开窗部。因此，适当大小的转移媒介物可容易地渗透此类内皮开窗部以到达靶肝细胞。可替代地，转移媒介物的大小可被设计成使得脂质体的尺寸具有足够的直径以限制或明确避免分布到某些细胞或组织中。例如，转移媒介物的大小可被设计成使得其尺寸大于内衬肝窦的内皮层的开窗部，从而限制转移媒介物分布至肝细胞。一般而言，转移媒介物的大小在约25至250nm的范围内。在一些实施方案中，转移媒介物的大小小于约250nm、175nm、150nm、125nm、100nm、75nm、50nm、25nm或10nm。
本领域已知的多种替代方法可用于确定转移媒介物的群体的大小。一种这样的大小确定方法描述于美国专利第4,737,323号中，所述专利以引用的方式并入本文。通过水浴或探针超声处理对脂质体悬浮液进行超声处理产生大小逐渐减小至直径小于约0.05微米的小ULV。均质化是依赖于剪切能量将大脂质体破碎成较小脂质体的另一种方法。在典型均质化程序中，使MLV再循环穿过标准乳液均化器直到观察到选定脂质体大小，通常介于约0.1与约0.5微米之间。脂质体囊泡的大小可通过准电光散射(QELS)确定，如described inBloomfield,Ann.Rev.Biophys.Bioeng.,10:421-450(1981)中所描述，所述文献已引用的方式并入本文。通过对形成的脂质体进行超声处理，可减小平均脂质体直径。间歇性超声循环可与QELS评估交替进行，以引导有效的脂质体合成。
此外，在某些实施方案中，本文提供的环状RNA可使用一种或多种脂质体、脂质复合物或脂质纳米颗粒来配制。在一个实施方案中，环状RNA可配制在脂质纳米颗粒中，如在国际公布第WO2012170930号中描述的那些，所述公布以引用的方式整体并入本文。在一个实施方案中，脂质可以是可裂解脂质，如在国际公布第WO2012170889号中描述的那些，所述公布以引用的方式整体并入本文。在一个实施方案中，环状RNA的药物组合物可包含在国际公布第WO2012099755号中描述的至少一种PEG化的脂质，所述公布以引用的方式并入本文。在一个实施方案中，脂质纳米颗粒制剂可通过在国际公布第WO2011127255号或第WO2008103276号中描述的方法来配制，所述公布各自以引用的方式整体并入本文。脂质纳米颗粒可涂覆有共聚物或与共聚物缔合，如但不限于嵌段共聚物，如在国际公布第WO2013012476号中描述的支链聚醚-聚酰胺嵌段共聚物，所述公布以引用的方式整体并入本文。脂质体、脂质复合物或脂质纳米颗粒可用于提高环状RNA定向蛋白质产生的功效，因为这些制剂可能能够增加环状RNA的细胞转染，增加环状RNA的体内或体外半衰期，和/或允许受控释放。
在其他实施方案中，本文提供的环状RNA多核苷酸可使用一种或多种聚合物来配制。聚合物可包含于RNA或脂质纳米颗粒中和/或用于包封或部分包封RNA或脂质纳米颗粒。聚合物可以是生物可降解的和/或生物相容的。聚合物可选自但不限于聚胺、聚醚、聚酰胺、聚酯、聚氨基甲酸酯、聚脲、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚酰亚胺、聚砜、聚氨酯、聚乙炔、聚乙烯、聚乙烯亚胺、聚异氰酸酯、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯腈以及聚芳酯。例如，聚合物可包括聚(己内酯)(PCL)、乙烯乙酸乙烯酯聚合物(EVA)、聚(乳酸)(PLA)、聚(L-乳酸)(PLLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(L-乳酸-共-乙醇酸)(PLLGA)、聚(D,L-丙交酯)(PDLA)、聚(L丙交酯)(PLLA)、聚(D,L-丙交酯-共-己内酯)、聚(D,L-丙交酯-共-己内酯-共乙交酯)、聚(D,L-丙交酯-共-PEO-共-D,L-丙交酯)、聚(D,L-丙交酯-共-PPO-共-D,L-丙交酯)、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚氨酯、聚-L-赖氨酸(PLL)、甲基丙烯酸羟丙酯(HPMA)、聚乙二醇、聚-L-谷氨酸、聚(羟基酸)、聚酸酐、聚原酸酯、聚(酯酰胺)、聚酰胺、聚(酯醚)、聚碳酸酯、聚烯烃如聚乙烯和聚丙烯、聚亚烷基二醇如聚(乙二醇)(PEG)、聚环氧烷(PEO)、聚对苯二甲酸亚烷基酯如聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯醚、聚乙烯酯如聚(乙酸乙烯酯)、聚乙烯卤化物如聚(氯乙烯)(PVC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚硅氧烷、聚苯乙烯、聚氨酯、衍生的纤维素如烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、丙烯酸的聚合物如聚((甲基)丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚((甲基)丙烯酸乙酯)、聚((甲基)丙烯酸丁酯)、363 5 10 15 20 25 30 35WO2021/076805PCT/US2020/055844聚((甲基)丙烯酸异丁酯)、聚((甲基)丙烯酸己酯)、聚((甲基)丙烯酸异癸酯)、聚((甲基)丙烯酸月桂酯)、聚((甲基)丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸十八烷基酯)及其共聚物和混合物、聚二氧杂环己酮及其共聚物、聚羟基烷酸酯、聚丙烯富马酸酯、聚甲醛、泊洛沙姆(poloxamer)、泊洛沙胺(poloxamine)、聚(原酸)酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共-己内酯)、三亚甲基碳酸酯、聚(N-丙烯酰吗啉)(PAcM)、具(2-甲基-2-噁唑啉)(PMOX)、具(2-乙基-2-噁唑啉)(PEOZ)以及聚甘油。
在一些实施方案中，多核苷酸编码由亚基组成的蛋白质，所述亚基由多于一个基因编码。例如，蛋白质可以是异二聚体，其中蛋白质的每个链或亚基由单独基因编码。有可能在转移媒介物中递送多于一个circRNA分子，并且每个circRNA编码蛋白质的单独亚基。可替代地，单一circRNA可被工程化以编码多于一个亚基(例如在单链Fv抗体的情况下)。在某些实施方案中，可在单独转移媒介物中施用编码单独亚基的单独circRNA分子。
本发明还考虑通过被动和主动靶向手段对靶细胞和组织的区别性靶向。被动靶向现象利用体内转移媒介物的自然分布模式，而不依赖于使用额外的赋形剂或手段来增强靶细胞对转移媒介物的识别。例如，经受网状内皮系统的细胞的吞噬作用的转移媒介物可能在肝或脾中累积，并且因此，可提供被动地将组合物递送至此类靶细胞的手段。
可替代地，本发明考虑主动靶向，其涉及使用可与转移媒介物键合(共价或非共价)的靶向部分以促进此类转移媒介物在某些靶细胞或靶组织的定位。例如，靶向可通过在转移媒介物中或转移媒介物上包含一个或多个内源性靶向部分以促进分布至靶细胞或组织来介导。靶组织对靶向部分的识别积极促进转移媒介物和/或其内容物在靶细胞和组织中的组织分布和细胞摄取(例如，在转移媒介物中或转移媒介物上包含载脂蛋白-E靶向配体促进转移媒介物的识别和与肝细胞表达的内源性低密度脂蛋白受体的结合)。如本文所提供，组合物可包含能够增强组合物对靶细胞的亲和力的部分。靶向部分可在配制期间或配制后连接至脂质颗粒的外双层。这些方法是本领域熟知的。此外，一些脂质颗粒制剂可采用融合聚合物，如PEAA、血凝素、其他脂肽(参见美国专利申请序列号08/835,281和60/083,294，所述专利以引用的方式并入本文)和其他可用于体内和/或细胞内递送的特征。在一些实施方案中，本发明的组合物表现出提高的转染功效，和/或表现出对目标靶细胞或组织的增强的选择性。因此，所考虑的是包含一个或多个部分(例如，肽、适体、寡核苷酸、小分子、维生素或其他分子)的组合物，所述一个或多个部分能够增强组合物以及其核酸内容物对于靶细胞或组织的亲和力。合适的部分可任选地结合或连接至转移媒介物的表面。在一些实施方案中，靶向部分可跨越转移媒介物的表面或被包封在转移媒介物内。合适的部分是基于它们的物理、化学或生物性质(例如，选择性亲和力和/或对靶细胞表面标志物或特征的识别)来选择的。细胞特异性靶位点及其相应的靶向配体可广泛不同。选择合适的靶向部分使得可以利用靶细胞的独特特征，从而允许组合物区分靶细胞和非靶细胞。例如，本发明的组合物可包含选择性地增强对肝细胞的识别或与肝细胞的亲和力(例如，通过受体介导的对此类表面标记物的识别和结合)的表面标记物(例如，载脂蛋白-B或载脂蛋白-E)。作为实例，使用半乳糖作为靶向部分将预期将本发明的组合物引导至实质肝细胞，或者可替代地使用含有甘露糖的糖残基作为靶向配体将预期将本发明的组合物引导至肝内皮细胞(例如，可优先结合至肝细胞中存在的无唾液酸糖蛋白受体的含甘露糖的糖残基)。(参见Hillery A M等人,“Drug Delivery and Targeting:For Pharmacists andPharmaceutical Scientists”(2002)Taylor&Francis,Inc.)与转移媒介物(例如脂质纳米颗粒)中存在的部分缀合的此类靶向部分的呈现因此有助于本发明的组合物在靶细胞和组织中的识别和吸收。合适的靶向部分的实例包括一种或多种肽、蛋白质、小分子、适体、维生素和寡核苷酸。
在一些实施方案中，靶向部分选择性地介导经受体介导的胞吞作用进入特定细胞群。在一些实施方案中，靶向部分能够结合至肝细胞抗原。在一些实施方案中，靶向部分是单链可变片段(scFv)、纳米抗体、肽、基于肽的大环、微型抗体、重链可变区、轻链可变区或其片段。
在一些实施方案中，根据美国专利申请号15/809,680中描述的方法配制环状RNA。在一些实施方案中，本发明提供了将环状RNA包封在脂质纳米颗粒中的方法，所述方法包括将脂质成形为预先形成的脂质纳米颗粒(即，在不存在RNA的情况下形成)、然后将预先形成的脂质纳米颗粒与RNA合并的步骤。在一些实施方案中，与在没有预先形成脂质纳米颗粒的步骤的情况下(例如，将脂质直接与RNA合并)制备的相同RNA制剂相比，新的配制方法产生在体外和体内具有更高效力(肽或蛋白质表达)和更高功效(生物学相关终点的改善)与潜在更好的耐受性的RNA制剂。
对于RNA的某些阳离子脂质纳米颗粒制剂，为了实现RNA的高包封，必须加热缓冲液(例如柠檬酸盐缓冲液)中的RNA。在那些过程或方法中，加热需要在配制过程之前进行(即加热单独的组分)，因为配制后加热(纳米颗粒的形成后)不会提高脂质纳米颗粒中RNA的包封效率。相比之下，在本发明方法的一些实施方案中，RNA的加热顺序似乎不影响RNA包封百分比。在一些实施方案中，在配制过程之前或之后不需要加热(即，保持在环境温度)包含预先形成的脂质纳米颗粒的溶液、包含RNA的溶液和包含脂质纳米颗粒包封的RNA的混合溶液中的一者或多者。
RNA可提供在溶液中以与脂质溶液混合，使得RNA可被包封在脂质纳米颗粒中。合适的RNA溶液可以是含有各种浓度的待包封RNA的任何水溶液。例如，合适的RNA溶液可含有浓度等于或大于约0.01mg/ml、0.05mg/ml、0.06mg/ml、0.07mg/ml、0.08mg/ml、0.09mg/ml、0.1mg/ml、0.15mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml或1.0mg/ml的RNA。在一些实施方案中，合适的RNA溶液可含有浓度在约0.01-1.0mg/ml、0.01-0.9mg/ml、0.01-0.8mg/ml、0.01-0.7mg/ml、0.01-0.6mg/ml、0.01-0.5mg/ml、0.01-0.4mg/ml、0.01-0.3mg/ml、0.01-0.2mg/ml、0.01-0.1mg/ml、0.05-1.0mg/ml、0.05-0.9mg/ml、0.05-0.8mg/ml、0.05-0.7mg/ml、0.05-0.6mg/ml、0.05-0.5mg/ml、0.05-0.4mg/ml、0.05-0.3mg/ml、0.05-0.2mg/ml、0.05-0.1mg/ml、0.1-1.0mg/ml、0.2-0.9mg/ml、0.3-0.8mg/ml、0.4-0.7mg/ml或0.5-0.6mg/ml范围内的RNA。
通常，合适的RNA溶液还可含有缓冲剂和/或盐。一般而言，缓冲剂可包括Tris、HEPES、硫酸铵、碳酸氢钠、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钾或磷酸钠。在一些实施方案中，缓冲剂的合适浓度可在约0.1mM至100mM、0.5mM至90mM、1.0mM至80mM、2mM至70mM、3mM至60mM、4mM至50mM、5mM至40mM、6mM至30mM、7mM至20mM、8mM至15mM或9至12mM的范围内。
示例性盐可包括氯化钠、氯化镁和氯化钾。在一些实施方案中，RNA溶液中盐的合适浓度可在约1mM至500mM、5mM至400mM、10mM至350mM、15mM至300mM、20mM至250mM、30mM至200mM、40mM至190mM、50mM至180mM、50mM至170mM、50mM至160mM、50mM至150mM或50mM至100mM的范围内。
在一些实施方案中，合适的RNA溶液可具有在约3.5-6.5、3.5-6.0、3.5-5.5、3.5-5.0、3.5-4.5、4.0-5.5、4.0-5.0、4.0-4.9、4.0-4.8、4.0-4.7、4.0-4.6或4.0-4.5范围内的pH。
可使用多种方法来制备适用于本发明的RNA溶液。在一些实施方案中，RNA可直接溶解于本文所述的缓冲溶液中。在一些实施方案中，可在与脂质溶液混合用于包封之前通过将RNA储备溶液与缓冲溶液混合来产生RNA溶液。在一些实施方案中，可在与脂质溶液混合用于包封之前立即通过将RNA储备溶液与缓冲溶液混合来产生RNA溶液。
根据本发明，脂质溶液含有适于形成用于包封RNA的脂质纳米颗粒的脂质混合物。在一些实施方案中，合适的脂质溶液是基于乙醇的。例如，合适的脂质溶液可含有溶解于纯乙醇(即100％乙醇)中的所需脂质的混合物。在另一个实施方案中，合适的脂质溶液是基于异丙醇的。在另一个实施方案中，合适的脂质溶液是基于二甲亚砜的。在另一个实施方案中，合适的脂质溶液是合适溶剂(包括但不限于乙醇、异丙醇和二甲亚砜)的混合物。
合适的脂质溶液可含有各种浓度的所需脂质的混合物。在一些实施方案中，合适的脂质溶液可含有总浓度在约0.1-100mg/ml、0.5-90mg/ml、1.0-80mg/ml、1.0-70mg/ml、1.0-60mg/ml、1.0-50mg/ml、1.0-40mg/ml、1.0-30mg/ml、1.0-20mg/ml、1.0-15mg/ml、1.0-10mg/ml、1.0-9mg/ml、1.0-8mg/ml、1.0-7mg/ml、1.0-6mg/ml或1.0-5mg/ml范围内的所需脂质的混合物。
任何所需的脂质可以适合于包封RNA的任何比例混合。在一些实施方案中，合适的脂质溶液含有所需脂质的混合物，所述脂质包括阳离子脂质、辅助脂质(例如，非阳离子脂质和/或胆固醇脂质)和/或聚乙二醇化脂质。在一些实施方案中，合适的脂质溶液含有所需脂质的混合物，所述脂质包括一种或多种阳离子脂质、一种或多种辅助脂质(例如，非阳离子脂质和/或胆固醇脂质)和一种或多种聚乙二醇化脂质。
在一些实施方案中，本发明的组合物在区别性基础上转染或分布至靶细胞(即，不转染非靶细胞)。本发明的组合物还可被制备成优先靶向多种靶细胞，所述靶细胞包括但不限于肝细胞、上皮细胞、造血细胞、上皮细胞、内皮细胞、肺细胞、骨细胞、干细胞、间充质细胞、神经细胞(例如脑膜、星形胶质细胞、运动神经元、背根神经节细胞和前角运动神经元)、感光细胞(例如视杆细胞和视锥细胞)、视网膜色素上皮细胞、分泌细胞、心脏细胞、脂肪细胞、血管平滑肌细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、β细胞、垂体细胞、滑膜衬里细胞、卵巢细胞、睾丸细胞、成纤维细胞、B细胞、T细胞、抗原呈递细胞(例如，树突细胞)、网织红细胞、白细胞、粒细胞和肿瘤细胞。
药物组合物
在某些实施方案中，本文提供了包含本文提供的治疗剂的组合物(例如药物组合物)。在某些实施方案中，治疗剂是本文提供的RNA多核苷酸。在一些实施方案中，治疗剂是本文提供的环状RNA多核苷酸。在一些实施方案中，治疗剂是本文提供的载体。在一些实施方案中，治疗剂是包含本文提供的RNA多核苷酸、环状RNA或载体的细胞(例如，人细胞，如人抗原呈递细胞)。在某些实施方案中，组合物还包含药学上可接受的载剂。在一些实施方案中，本文提供的组合物包含本文提供的治疗剂与其他药物活性剂或药物，如抗炎药物或能够靶向B细胞抗原的抗体，例如抗CD20抗体，例如利妥昔单抗的组合。
关于药物组合物，药学上可接受的载剂可以是任何常规使用的那些，并且仅受化学-物理考量(如溶解度和缺乏与活性剂的反应性)和施用途径限制。本文所述的药学上可接受的载剂(例如媒介物、佐剂、赋形剂和稀释剂)是本领域技术人员熟知的，并且公众容易获得。优选药学上可接受的载剂是对治疗剂呈化学惰性且在使用条件下没有有害副作用或毒性的一种载剂。
载剂的选择将部分取决于特定的治疗剂以及用于施用所述治疗剂的特定方法。因此，本文提供的药物组合物有多种合适的制剂。
在某些实施方案中，药物组合物包含防腐剂。在某些实施方案中，合适的防腐剂可包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。任选地，可使用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以总组合物的约0.0001重量％至约2重量％的量存在。
在一些实施方案中，药物组合物包含缓冲剂。在一些实施方案中，合适的缓冲剂可包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和各种其他酸和盐。可任选地使用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物通常以总组合物的约0.001重量％至约4重量％的量存在。
在一些实施方案中，药物组合物中治疗剂的浓度可变化，例如按重量计小于约1％，或至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或约50％或更高，并且根据所选择的特定施用模式可主要通过流体体积和粘度进行选择。
用于口服、气雾剂、胃肠外(例如，皮下、静脉内、动脉内、肌肉内、皮内、腹膜内和鞘内)和局部施用的以下制剂仅仅是示例性的并且绝不是限制性的。可使用多于一种途径来施用本文提供的治疗剂，并且在某些情况下，特定途径可提供比另一种途径更直接且更有效的反应。
适用于口服施用的制剂可包含以下或由以下组成：(a)液体溶液，如溶解在稀释剂(如水、盐水或橙汁)中的有效量的治疗剂；(b)胶囊、小药囊、片剂、锭剂和糖锭剂，各自含有预定量的固体或颗粒形式的活性成分；(c)粉末；(d)在适当液体中的悬浮液；以及(e)合适的乳液。液体制剂可包含稀释剂，如水和醇，例如乙醇、苄基醇和聚乙烯醇，其中添加或不添加药学上可接受的表面活性剂。胶囊形式可以是普通的硬壳或软壳明胶类型，其含有例如表面活性剂、润滑剂和惰性填充剂(如乳糖、蔗糖、磷酸钙和玉米淀粉)。片剂形式可包含乳糖、蔗糖、甘露糖醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸、微晶纤维素、阿拉伯树胶、明胶、瓜尔胶、胶体二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酸和其他赋形剂、着色剂、稀释剂、缓冲剂、崩解剂、润湿剂、防腐剂、调味剂以及其他药理学上相容的赋形剂中的一种或多种。锭剂形式可包含具有调味剂(通常为蔗糖、阿拉伯胶或黄蓍胶)的治疗剂。锭剂(pastille)可包含具有惰性基质的治疗剂，所述惰性基质如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯胶、乳剂、凝胶等，此外还含有本领域已知的此类赋形剂。
适用于胃肠外施用的制剂包括水性和非水性等张无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和致使制剂与预期接受者的血液等张的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。在一些实施方案中，本文提供的治疗剂可在药物载剂(诸如无菌液体或液体混合物)中在生理学上可接受的稀释剂中施用，所述无菌液体或液体混合物包括水、盐水、水性右旋糖以及相关糖溶液、醇(诸如乙醇或十六烷醇)、二醇(诸如丙二醇或聚乙二醇)、二甲亚砜、甘油、缩酮如2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-甲醇、醚、聚(乙二醇)400、油、脂肪酸、脂肪酸酯或甘油酯或乙酰化脂肪酸甘油酯，其中添加或不添加药学上可接受的表面活性剂(如皂或洗涤剂)、悬浮剂(如果胶、卡波姆、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素)或乳化剂和其他药物佐剂。
在一些实施方案中可用于胃肠外制剂中的油包括石油、动物油、植物油或合成油。油的具体实例包括花生、大豆、芝麻、棉籽、玉米、橄榄、凡士林和矿物油。用于胃肠外制剂的合适的脂肪酸包括油酸、硬脂酸和异硬脂酸。油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯是合适的脂肪酸酯的实例。
用于胃肠外制剂的某些实施方案中的合适的皂包括脂肪碱金属、铵和三乙醇胺盐，并且合适的洗涤剂包括(a)阳离子洗涤剂，诸如例如二甲基二烷基卤化铵和烷基吡啶鎓卤化物，(b)阴离子洗涤剂，例如像烷基、芳基和烯烃磺酸酯、烷基、烯烃、醚以及单酸甘油酯硫酸酯和磺基琥珀酸盐，(c)非离子洗涤剂，例如像脂肪胺氧化物、脂肪酸链烷醇酰胺和聚氧乙烯-聚丙烯共聚物，(d)两性洗涤剂，例如像烷基-β-氨基丙酸盐和2-烷基-咪唑啉季铵盐以及(e)它们的混合物。
在一些实施方案中，胃肠外制剂含有溶液中例如约0.5重量％至约25重量％的治疗剂。可使用防腐剂和缓冲剂。为了最小化或消除注射部位的刺激，此类组合物可含有具有例如约12至约17的亲水-亲油平衡(HLB)的一种或多种非离子表面活性剂。此类制剂中表面活性剂的量通常将在例如约5重量％至约15重量％的范围内。合适的表面活性剂包括聚乙二醇、脱水山梨糖醇脂肪酸酯诸如脱水山梨醇单油酸酯、以及环氧乙烷与疏水基质的高分子量加合物(通过环氧丙烷与丙二醇的缩合形成)。胃肠外制剂可以单位剂量或多剂量密封容器如安瓿或小瓶形式呈现，并且可储存于冷冻干燥(冻干)条件下，仅需在使用前即刻添加无菌液体赋形剂(例如水)以供注射。即时注射溶液和悬浮液可从先前所述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备。
在某些实施方案中，本文提供了可注射制剂。可注射组合物对有效药物载剂的要求是本领域普通技术人员众所周知的(参见例如，Pharmaceutics and PharmacyPractice,J.B.Lippincott Company,Philadelphia,PA,Banker和Chalmers,编,第238-250页(1982)；以及ASHP Handbook on Injectable Drugs,Toissel,第4版,第622-630页(1986))。
在一些实施方案中，本文提供了局部制剂。局部制剂(包括可用于经皮药物释放的那些)在本文提供的某些实施方案的上下文中适合施加至皮肤。在一些实施方案中，治疗剂单独或与其他合适的组分组合可制成气雾剂制剂以通过吸入施用。这些气雾剂制剂可被置于加压可接受的推进剂中，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等。它们也可被配制成药物用于非加压制备，诸如在喷雾器或雾化器中。此类喷雾制剂也可用于喷雾粘膜。
在某些实施方案中，本文提供的治疗剂可配制成包合复合物，如环糊精包合复合物或脂质体。脂质体可用于使治疗剂靶向特定组织。脂质体也可用于增加治疗剂的半衰期。许多方法可用于制备脂质体，如在例如Szoka等人,Ann.Rev.Biophys.Bioeng.,9,467(1980)以及美国专利4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369中所描述。
在一些实施方案中，本文提供的治疗剂被配制在定时释放、延迟释放或持续释放递送系统中，使得组合物的递送在待治疗部位的致敏之前发生并且有足够的时间引起待治疗部位的致敏。此类系统可避免治疗剂的重复施用，从而增加受试者和医生的便利，并且可能特别适用于本文提供的某些组合物实施方案。在一个实施方案中，本发明的组合物被配制为使得它们适合于其中所含的circRNA的延长释放。这种延长释放组合物可以延长的给药间隔方便地施用于受试者。例如，在一个实施方案中，本发明的组合物每天两次、每天或每隔一天施用至受试者。在一个实施方案中，本发明的组合物每周两次、每周一次、每十天、每两周、每三周、每四周、每月一次、每六周、每八周、每三个月、每四个月、每六个月、每八个月、每九个月或每年一次施用至受试者。
在一些实施方案中，由本发明的多核苷酸编码的蛋白质由靶细胞产生持续量的时间。例如，蛋白质可在施用后产生持续超过一小时、超过四小时、超过六小时、超过12小时、超过24小时、超过48小时或超过72小时。在一些实施方案中，多肽在施用后约六小时以峰值水平表达。在一些实施方案中，多肽的表达至少维持在治疗水平。在一些实施方案中，多肽在施用后至少以治疗水平表达超过1小时、超过4小时、超过6小时、超过12小时、超过24小时、超过48小时或超过72小时。在一些实施方案中，多肽在患者组织(例如肝或肺)中以治疗水平可检测到。在一些实施方案中，可检测多肽的水平来自circRNA组合物在施用后超过1小时、超过4小时、超过6小时、超过12小时、超过24小时、超过48小时或超过72小时的时间段内的连续表达。
在某些实施方案中，由本发明的多核苷酸编码的蛋白质以高于正常生理水平的水平产生。与对照相比，蛋白质水平可增加。在一些实施方案中，对照是正常个体或正常个体群中多肽的基线生理水平。在其他实施方案中，对照是相关蛋白质或多肽缺乏的个体或相关蛋白质或多肽缺乏的个体群中多肽的基线生理水平。在一些实施方案中，对照可以是向其施用组合物的个体中相关蛋白质或多肽的正常水平。在其他实施方案中，对照是在其他治疗干预后，例如在直接注射相应多肽后，在一个或多个相当的时间点时多肽的表达水平。
在某些实施方案中，在施用后3天、4天、5天或1周或更长时间可检测到由本发明的多核苷酸编码的蛋白质的水平。可在组织(例如肝或肺)中观察到蛋白的水平增加。
在一些实施方案中，方法产生由本发明的多核苷酸编码的蛋白质的持续循环半衰期。例如，可检测到蛋白质持续比通过皮下注射蛋白质或编码蛋白质的mRNA观察到的半衰期长数小时或数天。在一些实施方案中，蛋白质的半衰期是1天、2天、3天、4天、5天或1周或更长时间。
许多类型的释放递送系统是可用的并且是本领域普通技术人员已知的。它们包括基于聚合物的系统，如聚(丙交酯-乙交酯)、共聚草酸酯、聚己内酯、聚酯酰胺、聚原酸酯、聚羟基丁酸和聚酐。含有药物的前述聚合物的微胶囊描述于例如美国专利5,075,109中。递送系统还包括非聚合物系统，其是脂质，包括固醇如胆固醇、胆固醇酯和脂肪酸或中性脂肪如甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯；水凝胶释放系统；弹性系统(sylastic system)；基于肽的系统：蜡包衣；使用常规粘合剂和赋形剂的压制片剂；部分融合的植入物等。具体实例包括但不限于：(a)侵蚀系统，其中活性组合物以某种形式包含在基质内，如美国专利4,452,775、4,667,014、4,748,034和5,239,660中描述的那些；以及(b)扩散系统，其中活性组分以受控速率从聚合物中渗透，如美国专利3,832,253和3,854,480中所描述。此外，可使用基于泵的硬件递送系统，其中一些适用于植入。
在一些实施方案中，治疗剂可通过连接部分与靶向部分直接或间接缀合。用于治疗剂缀合至靶向部分的方法在本领域中是已知的。参见例如，Wadwa等人,J,DrugTargeting 3:111(1995)和美国专利5,087,616。
在一些实施方案中，本文提供的治疗剂被配制成贮库形式，使得治疗剂释放到其被施用的身体中的方式关于时间和体内的位置进行控制(参见例如，美国专利4,450,150)。治疗剂的贮库形式可以是例如包含治疗剂和多孔或无孔材料(如聚合物)的可植入组合物，其中治疗剂被材料包封或扩散到材料中和/或降解无孔材料。然后将贮库植入体内所需的位置，并且治疗剂以预定速率从植入物中释放。
治疗方法
在某些方面，本文提供了一种治疗和/或预防疾患，例如病毒感染的方法。
在某些实施方案中，将本文提供的治疗剂与一种或多种另外的治疗剂(例如，在同一药物组合物中或在单独的药物组合物中)共同施用。在一些实施方案中，可首先施用本文提供的治疗剂，然后可施用一种或多种另外的治疗剂，或反之亦然。可替代地，本文提供的治疗剂和一种或多种另外的治疗剂可同时施用。
在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，本文所指的哺乳动物可以是任何哺乳动物，包括但不限于啮齿目哺乳动物，如小鼠和仓鼠，或兔形目哺乳动物，如兔。哺乳动物可来自食肉目，包括猫科动物(猫)和犬科动物(狗)。哺乳动物可来自偶蹄目，包括牛科动物(牛)和猪科动物(猪)；或奇蹄目哺乳动物，包括马科动物(马)。哺乳动物可属于灵长目、直翅目或类猴目(猴)或类人猿目(人和猿)。优选地，哺乳动物是人。
序列
表1.IRES序列。
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在一些实施方案中，本发明的IRES是具有如表1(SEQ ID NO:1-72)所列的序列的IRES。在一些实施方案中，IRES是萨力病毒IRES。在一些实施方案中，IRES是萨力病毒SZ1IRES。
表2.鱼腥藻属置换位点5'内含子片段序列。
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在一些实施方案中，5'内含子片段是具有表2中所列序列的片段。通常，含有表2中列出的5'内含子片段的构建体将含有如表3中列出的相应3'内含子片段(例如，两者均表示具有L9a-8置换位点的片段)。
表3.鱼腥藻属置换位点3'内含子片段序列。
Figure GDA0004216226410001171
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在一些实施方案中，3'内含子片段是具有表3中所列序列的片段。在一些实施方案中，含有表3中列出的3'内含子片段的构建体将含有如表2中列出的相应5'内含子片段(例如，两者均表示具有L9a-8置换位点的片段)。
表4.非鱼腥藻属置换位点5'内含子片段序列。
Figure GDA0004216226410001202
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在一些实施方案中，5'内含子片段是具有表4中所列序列的片段。含有表4中列出的5'内含子片段的构建体将含有如表5中列出的相应3'内含子片段(例如，两者均表示具有Azop1内含子的片段)。
表5.非鱼腥藻属置换位点3'内含子片段序列。
Figure GDA0004216226410001212
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Figure GDA0004216226410001221
在一些实施方案中，3'内含子片段是具有表5中所列序列的片段。含有表5中列出的3'内含子片段的构建体将含有如表4中列出的相应5'内含子片段(例如，两者均表示具有Azop1内含子的片段)。
表6.间隔区和鱼腥藻属5'内含子片段序列。
Figure GDA0004216226410001222
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在一些实施方案中，间隔区和5'内含子片段是具有如表6中所列序列的间隔区和片段。
表7.间隔区和鱼腥藻属3'内含子片段序列。
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在一些实施方案中，间隔区和3'内含子片段是具有如表7中所列的序列的间隔区和内含子片段。
表8.裂解位点序列.
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表9.SARS-CoV-2蛋白质序列
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Figure GDA0004216226410001421
在一些实施方案中，抗原多肽是SARS-CoV-2蛋白或SARS-CoV-2蛋白的片段，或源自SARS-CoV-2蛋白或其片段。在一些实施方案中，抗原多肽可由以下(包括但不限于)组成：SARS-CoV2刺突蛋白、Nsp1–Nsp16、ORF3a、ORF6、ORF7a、ORFb、ORF8、ORF10、SARS-CoV2包膜蛋白、SARS-CoV2膜蛋白、SARS-CoV2核衣壳蛋白或SARS-CoV2刺突蛋白的片段。
在一些实施方案中，抗原含有表9上的序列的全部或部分。在一些实施方案中，肽含有与表9上的序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相似性的序列。在一些实施方案中，环状RNA疫苗含有编码多于一种抗原的RNA。在一些实施方案中，环状RNA疫苗含有编码至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15种抗原的RNA。在一些实施方案中，环状RNA多核苷酸编码多于一种抗原。在一些实施方案中，环状RNA多核苷酸编码至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15种抗原。
表10.佐剂多肽
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在一些实施方案中，多核苷酸或由多核苷酸编码的蛋白质含有与本文公开的一个或多个序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相似性的序列。在一些实施方案中，多核苷酸或由多核苷酸编码的蛋白质含有与本文公开的一个或多个序列同一的序列。在一些实施方案中，表达序列编码蛋白质，所述蛋白质包含与表8中的序列具有70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相似性或与表8中的序列同一的序列或由其组成。在一些实施方案中，表达序列编码蛋白质，所述蛋白质包含与表8中的序列具有70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相似性或与表8中的序列同一的序列或由其组成；以及IRES，所述IRES包含与表1中的序列具有70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相似性或与表1中的序列同一的序列或由其组成。在一些实施方案中，表达序列编码蛋白质，所述蛋白质包含与表8中的序列具有70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相似性或与表8中的序列同一的序列或由其组成；以及3'和5'I组内含子片段，所述3'和5'I组内含子片段包含与表2和3、4和5或6和7中的序列具有70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相似性或与表2和3、4和5或6和7中的序列同一的序列或由其组成。
本文描述了优选实施方案。阅读上述说明书后那些优选实施方案的变型对于本领域普通技术人员可变得明显。发明人希望技术人员适当地采用此类变型，并且发明人意图以其它方式而不是如本文所特别描述的来实施本发明。因此，本发明包括在适用法律允许的本发明随附的权利要求中叙述的主题的所有修改和等效物。此外，除非本文另外指示或明显地与上下文矛盾，否则本发明涵盖其所有可能变型中的上述要素的任何组合。
实施例
Wesselhoeft等人(2019)RNA Circularization Diminishes Immunogenicityand Can Extend Translation Duration In Vivo.Molecular Cell.74(3),508-520和Wesselhoeft等人(2018)Engineering circular RNA for Potent and StableTranslation in Eukaryotic Cells.Nature Communications.9,2629以引用的方式整体并入。
本发明将参考以下实施例进一步详细地描述，但不限于以下实施例。这些实施例涵盖说明的任何和所有变型，旨在向本领域普通技术人员提供关于如何制备和使用本发明的完整公开和描述，并且不意图限制被视为本发明的事物的范围。
实施例1
实施例1A：外部双链体形成区允许使用置换内含子外显子(PIE)环化策略环化长前体RNA。
将含有全长脑心肌炎病毒(EMCV)IRES、高斯荧光素酶(GLuc)表达序列和置换内含子-外显子(PIE)构建体的两个短外显子片段的1.1kb序列插入T4噬菌体的胸苷酸合酶(Td)基因中置换的I组催化内含子的3'内含子与5'内含子之间。前体RNA是通过失控转录合成的。通过在镁离子和GTP存在下加热前体RNA来尝试环化，但没有获得剪接产物。
设计完美互补的9个核苷酸和19个核苷酸长的双链体形成区并添加在前体RNA的5'和3'端。这些同源臂的添加将9个核苷酸双链体形成区的剪接效率从0％增加至16％，并将19个核苷酸双链体形成区的剪接效率提高到48％，如通过前体RNA条带的消失所评估。
将剪接产物用RNA酶R处理。跨RNA酶R处理的剪接反应的推定剪接接点的测序揭示连接的外显子，并且用寡核苷酸靶向的RNA酶H消化RNA酶R处理的剪接反应产生单一条带，相比之下由RNA酶H消化的线性前体产生两个条带。这表明环状RNA是含有9或19个核苷酸长的外部双链体形成区的前体RNA的剪接反应的主要产物。
实施例1B：保护IRES和PIE剪接位点的二级结构的间隔区提高环化效率。
设计一系列间隔区并插入3'PIE剪接位点与IRES之间。这些间隔区旨在保护或破坏IRES、3'PIE剪接位点和/或5'剪接位点中内含子序列内的二级结构。添加旨在保护二级结构的间隔区序列产生87％的剪接效率，而添加破坏性间隔区序列导致没有可检测的剪接。
实施例2
实施例2A：除了外部双链体形成区之外，内部双链体形成区产生剪接泡并允许翻译若干表达序列。
间隔区被设计为非结构化的，与内含子和IRES序列非同源，并且含有间隔区-间隔区双链体形成区。将这些插入构建体中的5'外显子与IRES之间以及3'外显子与表达序列之间，所述构建体含有外部双链体形成区、EMCV IRES以及高斯荧光素酶(总长度：1289nt)、萤火虫荧光素酶(2384nt)、eGFP(1451nt)、人促红细胞生成素(1313nt)和Cas9核酸内切酶(4934nt)的表达序列。实现了所有5个构建体的环化。利用T4噬菌体和鱼腥藻属内含子的构建体的环化大致相等。对于较短的序列，环化效率更高。为了测量翻译，将每个构建体转染到HEK293细胞中。高斯和萤火虫荧光素酶转染的细胞产生稳健反应，如通过发光所测量，在用促红细胞生成素circRNA转染的细胞培养基中可检测到人促红细胞生成素，并且从用EGFP circRNA转染的细胞中观察到EGFP荧光。与仅sgRNA对照相比，将Cas9 circRNA与针对GFP的sgRNA共转染到组成性表达GFP的细胞中导致高达97％的细胞的荧光消融。
实施例2B：使用CVB3 IRES增加蛋白质产生。
制备了具有内部和外部双链体形成区和不同IRES的构建体，所述IRES含有高斯荧光素酶或萤火虫荧光素酶表达序列。转染后24小时，通过HEK293细胞上清液中的发光测量蛋白质产生。在两种情况下，柯萨奇病毒B3(CVB3)IRES构建体产生的蛋白质最多。
实施例2C使用多聚A或多聚AC间隔区增加蛋白质产生。
将30个核苷酸长的多聚A或多聚AC间隔区添加构建体中的IRES与剪接接点之间，每个IRES产生实施例2B中的蛋白质。转染后24小时，通过HEK293细胞上清液中的发光测量高斯荧光素酶活性。与没有间隔区的对照构建体相比，两种间隔区均改善了每个构建体中的表达。
实施例3
与用相当的未经修饰的或经修饰的线性RNA转染的细胞相比，用环状RNA转染的HEK293或HeLa细胞产生更多的蛋白质。
将HPLC纯化的高斯荧光素酶编码circRNA(CVB3-GLuc-pAC)与规范的未经修饰的5'甲基鸟苷加帽和3'多聚A加尾的线性GLuc mRNA和市售核苷修饰(假尿苷，5-甲基胞嘧啶)的线性GLuc mRNA(来自Trilink)进行比较。转染后24小时测量发光，揭示circRNA在HEK293细胞中产生比未经修饰的线性mRNA多811.2％的蛋白质，并且比经修饰的mRNA多54.5％的蛋白质。在HeLa细胞中获得了类似的结果，并且将编码人促红细胞生成素的优化的circRNA与用5-甲氧基尿苷修饰的线性mRNA进行了比较。
在6天内收集发光数据。在HEK293细胞中，circRNA转染导致蛋白质产生半衰期为80小时，相比之下未经修饰的线性mRNA为43小时，并且经修饰的线性mRNA为45小时。在HeLa细胞中，circRNA转染导致蛋白质产生半衰期为116小时，相比之下未经修饰的线性mRNA为44小时，并且经修饰的线性mRNA为49小时。在两种细胞类型中，CircRNA在其整个生命周期中产生的蛋白质显著多于未经修饰的和经修饰的线性mRNA两者。
实施例4
实施例4A：通过RNA酶消化、HPLC纯化和磷酸酶处理纯化circRNA降低免疫原性。完全纯化的环状RNA的免疫原性显著低于未纯化或部分纯化的环状RNA。蛋白质表达稳定性和细胞活力取决于细胞类型和环状RNA纯度。
将人胚肾293(HEK293)和人肺癌A549细胞用以下转染：
a.未纯化的GLuc环状RNA剪接反应的产物，
b.剪接反应的RNA酶R消化的产物，
c.剪接反应的RNA酶R消化和HPLC纯化的产物，或
d.剪接反应的RNA酶消化、HPLC纯化和磷酸酶处理的产物。
与未转染的对照相比，剪接反应的RNA酶R消化不足以阻止A549细胞中的细胞因子释放。
添加HPLC纯化也不足以阻止细胞因子释放，尽管与未纯化的剪接反应相比，存在白细胞介素-6(IL-6)的显著减少和干扰素-α1(IFNα1)的显著增加。
在HPLC纯化之后和RNA酶R消化之前添加磷酸酶处理显著降低了A549细胞中评估的所有上调细胞因子的表达。分泌的单核细胞趋化蛋白1(MCP1)、IL-6、IFNα1、肿瘤坏死因子α(TNFα)和IFNγ诱导蛋白-10(IP-10)降至不可检测或未转染的基线水平。
HEK293细胞中没有大量细胞因子释放。当用更高纯度的环状RNA转染时，A549细胞具有提高的GLuc表达稳定性和细胞活力。完全纯化的环状RNA具有与转染的293细胞相似的稳定性表型。
实施例4B：环状RNA不会引起显著免疫原性并且不是RIG-I配体。
将A549细胞用以下转染：
a.未纯化的环状RNA，
b.高分子量(线性和环状拼接)RNA，
c.环状(切口)RNA，
d.纯化的环状RNA的早期级分(与切口RNA峰重叠较多)，
e.纯化的环状RNA的后期级分(与切口RNA峰重叠较少)，
f.在环化过程中切除的内含子，或
g.媒介物(即未转染的对照)。
由于难以从剪接反应中获得适当纯的线性前体RNA，将前体RNA以剪接位点缺失突变体(DS)的形式单独合成和纯化。在每种情况下测量细胞因子释放和细胞活力。
观察到响应于剪接反应中存在的大多数物质以及前体RNA的稳健IL-6、RANTES和IP-10释放。早期circRNA级分引发了与其他非circRNA级分相当的细胞因子反应，从而表明即使相对少量的线性RNA污染物也能够在A549细胞中诱导显著细胞免疫应答。后期circRNA级分没有引发超过来自未转染对照的细胞因子反应。与所有其他级分相比，对于后期circRNA级分在转染后36小时的A549细胞活力显著更高。
分析了用后期circRNA HPLC级分、前体RNA或未纯化的剪接反应转染A549细胞后的RIG-I和IFN-β1转录物诱导。与前体RNA和未纯化的剪接反应相比，后期circRNA级分的RIG-I和IFN-β1转录物的诱导较弱。单独RNA酶R处理剪接反应不足以消除这种效应。将极少量的RIG-I配体3p-hpRNA添加至环状RNA诱导显著RIG-I转录。在HeLa细胞中，RNA酶R消化的剪接反应的转染诱导RIG-I和IFN-β1，但纯化的circRNA则不。总体而言，与A549细胞相比，HeLa细胞对污染RNA种类不那么敏感。
在用剪接反应或完全纯化的circRNA转染A549细胞后的前8小时内，监测RIG-I、IFN-β1、IL-6和RANTES转录物诱导的时程实验并未揭示针对circRNA的瞬时应答。纯化的circRNA同样未能在RAW264.7鼠巨噬细胞中诱导促炎性转录物。
用含有EMCV IRES和EGFP表达序列的纯化circRNA转染A549细胞。这未能产生对促炎性转录物的实质性诱导。这些数据表明，剪接反应的非环状组分是造成先前研究中观察到的免疫原性的原因，并且circRNA不是RIG-I的天然配体。
实施例5
环状RNA避免TLR的检测。
用多个线性或环状RNA构建体转染TLR 3、7和8报告细胞系，并测量分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)。
通过缺失内含子和同源臂序列构建线性化RNA。然后用磷酸酶处理线性RNA构建体(在加帽RNA的情况下，在加帽后)并通过HPLC纯化。
尝试的转染均未在TLR7报告细胞中产生应答。TLR3和TLR8报告细胞被加帽的线性化RNA、聚腺苷酸化的线性化RNA、切口circRNA HPLC级分和早期circRNA级分激活。后期circRNA级分和m1ψ-mRNA不会在任何细胞系中引起TLR介导的应答。
在第二实验中，将circRNA使用两种方法线性化：在镁离子存在下用加热处理circRNA和DNA寡核苷酸引导的RNA酶H消化。两种方法均产生了大部分全长线性RNA和少量完整circRNA。将TLR3、7和8报告细胞用环状RNA、通过加热降解的环状RNA或通过RNA酶H降解的环状RNA转染，并在转染后36小时测量SEAP分泌。TLR8报告细胞响应于两种形式的降解的环状RNA分泌SEAP，但对环状RNA转染的反应并不比模拟转染更大。尽管体外转录的线性化RNA激活TLR3，但在TLR3和TLR7报告细胞中未观察到在降解或完整条件下的激活。
实施例6
与线性RNA相比，未经修饰的环状RNA产生增加的持续体内蛋白质表达。
对小鼠注射并用未经修饰和m1ψ经修饰的人促红细胞生成素(hEpo)线性mRNA和circRNA转染HEK293细胞。m1ψ-mRNA和未经修饰的circRNA的等摩尔转染在HEK293细胞中产生稳健蛋白质表达。在HEK293和A549细胞的等重量转染后，hEpo线性mRNA和circRNA显示出与GLuc线性mRNA和circRNA相比相似的相对蛋白质表达模式和细胞活力。
在小鼠中，将hEpo circRNA或线性mRNA注射进内脏脂肪后，在血清中检测到hEpo。注射未经修饰的circRNA后检测到的hEpo比来自未修饰或m1ψ-mRNA的衰减更慢，并且在注射后42小时仍然存在。注射未纯化的circRNA剪接反应物或未经修饰的线性mRNA后，血清hEpo迅速下降。注射未纯化的剪接反应产生了在血清中可检测到的细胞因子反应，而对于其他RNA(包括纯化的circRNA)未观察到。
实施例7
环状RNA可通过脂质纳米颗粒在体内或体外有效递送。
纯化的环状RNA被配制成具有可电离类脂质cKK-E12的脂质纳米颗粒(LNP)(Dong等人,2014；Kauffman等人,2015)。颗粒形成均匀的多层结构，其平均大小、多分散性指数和包封效率与含有用5moU修饰的市售对照线性mRNA的颗粒相似。
当包封在LNP中并添加至HEK293细胞中时，纯化的hEpo circRNA显示出比5moU-mRNA更高的表达。LNP-RNA在HEK293细胞中的表达稳定性与通过转染试剂递送的RNA的表达稳定性相似，除了5moU-mRNA和circRNA的衰减略有延迟。未经修饰的circRNA和5moU-mRNA均未能在体外激活RIG-I/IFN-β1。
在小鼠中，LNP-RNA通过局部注射到内脏脂肪组织中递送或静脉内递送至肝。在两种情况下，来自circRNA的血清hEpo表达较低，但与递送后6小时来自5moU-mRNA的表达相当。脂肪注射未经修饰的LNP-circRNA后检测到的血清hEpo比LNP-5moU-mRNA的衰减得更慢，其中血清中存在的表达衰减延迟与体外观察到的相似，但静脉内注射LNP-circRNA或LNP-5moU-mRNA后的血清hEpo以大致相同的速率衰减。在这些情况中的任一者下，血清细胞因子或局部RIG-I、TNFα或IL-6转录物诱导均没有增加。
实施例8
IRES在HEK293、HepG2和1C1C7细胞中的表达和功能稳定性。
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、高斯荧光素酶表达序列和不同IRES的构建体环化。使用Lipofectamine MessengerMax将100ng的每种环化反应分别转染到20,000个HEK293细胞、HepG2细胞和1C1C7细胞中。24小时后评估每种上清液中的发光作为蛋白质表达的量度。在HEK293细胞中，包含Crohivirus B、萨力病毒FHB、爱知病毒、萨力病毒HG-J1和肠道病毒J IRES的构建体在24小时时产生最多的发光(图1A)。在HepG2细胞中，包含爱知病毒、萨力病毒FHB、EMCV-Cf和CVA3 IRES的构建体在24小时时产生高发光(图1B)。在1C1C7细胞中，包含萨力病毒FHB、爱知病毒、萨力病毒NG-J1和萨力病毒A SZ-1IRES的构建体在24小时时产生高发光(图1C)。
观察到较大的IRES在24小时时产生较大的发光的趋势。较短的总序列长度往往提高环化效率，因此选择高表达和相对短的IRES可产生改进的构建体。在HEK293细胞中，使用Crohivirus B IRES的构建体产生最高的发光，尤其是与其他类似长度的IRES相比(图2A)。针对IRES大小绘制的来自HepG2和1C1C7细胞中IRES构建体的表达在图2B和2C中。
在3天内测量了HepG2和1C1C7细胞中选定IRES构建体的功能稳定性。在用100ng的每种环化反应转染20,000个细胞后，每24小时测量来自上清液中分泌的高斯荧光素酶的发光，然后完全更换培养基。萨力病毒A GUT和萨力病毒FHB在HepG2细胞中表现出最高的功能稳定性，并且萨力病毒N-J1和萨力病毒FHB在1C1C7细胞中产生最稳定的表达(图3A和3B)。
实施例9
IRES在JurkaT细胞中的表达和功能稳定性。
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、高斯荧光素酶表达序列和先前测试的IRES子组的2组构建体环化。将60,000个Jurkat细胞用1μg的每种环化反应进行电穿孔。在电穿孔后24小时测量来自上清液中分泌的高斯荧光素酶的发光。CVB3 IRES构建体均包含于两组中，以用于组之间以及与先前定义的IRES功效的比较。CVB1和萨力病毒A SZ1 IRES构建体在24小时时产生最多的表达。数据可在图4A和4B中找到。
在3天内测量每轮电穿孔JurkaT细胞中IRES构建体的功能稳定性。在用1μg的每种环化反应对60,000个细胞进行电穿孔后，每24小时测量来自上清液中分泌的高斯荧光素酶的发光，然后完全更换培养基(图5A和5B)。
与其他构建体相比，萨力病毒A SZ1和萨力病毒A BN2 IRES构建体具有高功能稳定性。
实施例10
JurkaT细胞中环状和线性RNA的表达、功能稳定性和细胞因子释放。
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、高斯荧光素酶表达序列和萨力病毒FHBIRES的构建体环化。包含高斯荧光素酶表达序列和约150nt多聚A尾且经修饰以用5-甲氧基尿苷(5moU)置换100％的尿苷的mRNA可商购获得，并且购自Trilink。5moU核苷酸修饰已被证明提高mRNA的稳定性和表达(Bioconjug Chem.2016Mar16；27(3):849-53)。测量并比较了JurkaT细胞中经修饰的mRNA、环化反应(不纯)和通过尺寸排阻HPLC纯化的circRNA(纯)的表达(图6A)。用1μg的每种RNA种类对60,000个细胞进行电穿孔后24小时，测量来自上清液中分泌的高斯荧光素酶的发光。
在用1ug的每种RNA种类对60,000个细胞进行电穿孔后，每24小时测量来自上清液中分泌的高斯荧光素酶的发光，然后完全更换培养基。图6B是Jurkat细胞中经修饰mRNA和circRNA在3天内的功能稳定性数据的比较。
用1μg的上述每种RNA种类和3p-hpRNA(5'三磷酸发夹RNA，其是已知的RIG-I激动剂)对60,000个Jurkat细胞进行电穿孔后18小时测量IFNγ(图7A)、IL-6(图7B)、IL-2(图7C)、RIG-I(图7D)、IFN-β1(图7E)和TNFα(图7F)转录物诱导。
实施例11
环状和线性RNA在单核细胞和巨噬细胞中的表达。
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、高斯荧光素酶表达序列和萨力病毒FHBIRES的构建体环化。包含高斯荧光素酶表达序列和约150nt多聚A尾且经修饰以用5-甲氧基尿苷(5moU)置换100％的尿苷的mRNA购自Trilink。在人原代单核细胞(图8A)和人原代巨噬细胞(图8B)中测量了环状和经修饰的mRNA的表达。用1μg的每种RNA种类对60,000个细胞进行电穿孔后24小时，测量来自上清液中分泌的高斯荧光素酶的发光。还在人原代巨噬细胞电穿孔后4天测量了发光，每24小时更换培养基(图8C)。在每种情况下，发光的差异在统计学上是显著的(p<0.05)。
实施例12
IRES在原代T细胞中的表达和功能稳定性。
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、高斯荧光素酶表达序列和先前测试的IRES子组的构建体环化，并将反应产物通过尺寸排阻HPLC纯化。将150,000个原代人CD3+T细胞用1μg的每种circRNA进行电穿孔。在电穿孔后24小时测量来自上清液中分泌的高斯荧光素酶的发光(图9A)。爱知病毒和CVB3 IRES构建体在24小时时具有最多表达。
还在电穿孔后每24小时测量发光持续3天，以比较每种个构建体的功能稳定性(图9B)。具有萨力病毒A SZ1 IRES的构建体是最稳定的。
实施例13
环状和线性RNA在原代T细胞和PBMC中的表达和功能稳定性。
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、高斯荧光素酶表达序列和萨力病毒A SZ1IRES或萨力病毒FHB IRES的构建体环化。包含高斯荧光素酶表达序列和约150nt多聚A尾且经修饰以用5-甲氧基尿苷(5moU)置换100％的尿苷的mRNA购自Trilink。测量萨力病毒ASZ1IRES HPLC纯化的环状和经修饰的mRNA在人原代CD3+T细胞中的表达。测量萨力病毒FHBHPLC纯化的环状、未纯化的环状和经修饰的mRNA在人PBMC中的表达。用1μg的每种RNA种类对150,000个细胞进行电穿孔后24小时，测量来自上清液中分泌的高斯荧光素酶的发光。原代人T细胞的数据在图10A和10B中，并且PBMC的数据显示在图10C中。在每种情况下，纯化的环状RNA与未纯化的环状RNA或线性RNA之间的表达差异是显著的(p<0.05)。
在电穿孔后在3天内每24小时测量来自原代T细胞上清液中分泌的高斯荧光素酶的发光，以比较构建体功能稳定性。这在图10B中示出。对于原代T细胞，来自纯化的环状RNA与线性RNA之间第1天测量的相对发光的差异在第2天和第3天是显著的
实施例14
根据鱼腥藻属内含子中的置换位点的环化效率。
产生了包含CVB3 IRES、高斯荧光素酶表达序列、鱼腥藻属内含子/外显子区域、间隔区、内部双链体形成区和同源臂的RNA构建体。通过HPLC测量使用传统鱼腥藻属内含子置换位点和P9中5个连续置换位点的构建体的环化效率。P9中5个连续置换位点的HPLC色谱图如图11A所示。
在各种置换位点测量环化效率。环化效率被定义为以下各项的HPLC色谱图曲线下面积：circRNA/(circRNA+前体RNA)。每个置换位点的环化效率的分级量化在图11B中。选择了3个置换位点(如图11B所示)进行进一步研究。
此实施例中的环状RNA通过体外转录(IVT)，然后通过旋转柱进行纯化来进行环化。如果包括与Mg2+和鸟苷核苷酸孵育的额外步骤，则所有构建体的环化效率将可能更高；然而，除去这一步骤允许环状RNA构建体之间的比较和优化。这种优化水平对于保持大RNA构建体(如编码嵌合抗原受体的那些构建体)的高环化效率特别有用。
实施例15
选择性内含子的环化效率。
创建了含有可变物种起源或置换位点的置换1组内含子和若干恒定元件的前体RNA，所述若干恒定元件包括：CVB3 IRES、高斯荧光素酶表达序列、间隔区、内部双链体形成区和同源臂。环化数据可见于图12中。图12A示出解析前体、CircRNA和内含子的色谱图。图12B基于图12A中所示的色谱图提供环化效率的分级量化，作为内含子构建体的函数。
此实施例中的环状RNA通过体外转录(IVT)，然后旋转柱纯化来进行环化。如果包括与Mg2+和鸟苷核苷酸孵育的额外步骤，则所有构建体的环化效率将可能更高；然而，除去这一步骤允许环状RNA构建体之间的比较和优化。这种优化水平对于保持大RNA构建体(如编码嵌合抗原受体的那些构建体)的高环化效率特别有用。
实施例16
根据同源臂存在或长度的环化效率。
产生了包含CVB3 IRES、高斯荧光素酶表达序列、鱼腥藻属内含子/外显子区域、间隔区和内部双链体形成区的RNA构建体。用30nt、25％GC同源臂或无同源臂(“NA”)测试代表3个鱼腥藻属内含子置换位点的构建体。使这些构建体环化，无需与Mg2+一起孵育的步骤。测量并比较环化效率。数据可见于图13中。对于缺乏同源臂的每个构建体，环化效率更高。图13A提供环化效率的分级量化；图13B提供解析前体、circRNA和内含子的色谱图。
对于3个置换位点中的每一个，产生了具有10nt、20nt和30nt臂长以及25％、50％和75％GC的构建体。测量这些构建体的剪接效率并且与没有同源臂的构建体进行比较(图14)。剪接效率被定义为剪接反应中游离内含子相对于总RNA的比例。
图15A(左)含有HPLC色谱图，从而表明强同源臂对提高剪接效率的贡献。左上：75％GC含量，10nt同源臂。左中：75％GC含量，20nt同源臂。左下：75％GC含量，30nt同源臂。
图15A(右)示出HPLC色谱图，其显示与切口增加配对的剪接效率增加，在circRNA峰上显示为肩峰。右上：75％GC含量，10nt同源臂。右中：75％GC含量，20nt同源臂。右下：75％GC含量，30nt同源臂。
图15B(左)示出假设证明提高的环化效率的置换位点和同源臂的选定组合。
图15B(右)示出假设证明提高的环化效率的置换位点和同源臂的选定组合，用大肠杆菌多聚A聚合酶处理。
此实施例中的环状RNA通过体外转录(IVT)，然后旋转柱纯化来进行环化。如果包括与鸟苷核苷酸的额外Mg2+孵育步骤，则所有构建体的环化效率将可能更高；然而，除去这一步骤允许环状RNA构建体之间的比较和优化。这种优化水平对于保持大RNA构建体(如编码嵌合抗原受体的那些构建体)的高环化效率特别有用。
实施例17
编码嵌合抗原受体的环状RNA
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、Kymriah嵌合抗原受体(CAR)表达序列和CVB3 IRES的构建体环化。将100,000个人原代CD3+T细胞用500ng的circRNA电穿孔，并与稳定表达GFP和荧火虫荧光素酶的Raji细胞共培养24小时。效应物与靶标比率(E:T比率)0.75:1。将100,000个人原代CD3+T细胞模拟电穿孔并共培养作为对照(图16)。
将一组100,000个人原代CD3+T细胞模拟电穿孔或用1μg的circRNA电穿孔，然后与稳定表达GFP和萤火虫荧光素酶的Raji细胞以E:T比率10:1共培养48小时(图17)。
Raji靶细胞的特异性裂解的定量通过检测萤火虫发光来确定(图18)。将100,000个模拟电穿孔或用编码不同CAR序列的circRNA电穿孔的人原代CD3+T细胞与稳定表达GFP和萤火虫荧光素酶的Raji细胞共培养48小时。特异性裂解％定义为1-[CAR条件发光]/[模拟条件发光]。E:T比率10:1。
实施例18
环状和线性RNA在JurkaT细胞和静息人T细胞中的表达和功能稳定性。
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、高斯荧光素酶表达序列和先前测试的IRES子组的构建体环化，并将反应产物通过尺寸排阻HPLC纯化。将150,000个Jurkat细胞用1μg的环状RNA或5moU-mRNA进行电穿孔。电穿孔后24小时测量来自上清液中分泌的高斯荧光素酶的发光(图19A左)。用1μg环状RNA或5moU-mRNA对150,000个静息原代人CD3+T细胞(刺激后10天)进行电穿孔。在电穿孔后24小时测量来自上清液中分泌的高斯荧光素酶的发光(图19A右)。
在电穿孔后每24小时测量来自上清液中分泌的高斯荧光素酶的发光，然后完全更换培养基。功能稳定性数据显示在图19B中。在每种情况下，环状RNA比线性RNA具有更高的功能稳定性，在Jurkat细胞中差异更明显。
实施例19
用线性RNA或不同环状RNA构建体电穿孔的细胞的IFN-β1、RIG-I、IL-2、IL-6、IFNγ和TNFα转录物诱导。
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、高斯荧光素酶表达序列和先前测试的IRES子组的构建体环化，并将反应产物通过尺寸排阻HPLC纯化。将150,000个CD3+人T细胞用1μg的环状RNA、5moU-mRNA或免疫刺激阳性对照聚肌苷:胞嘧啶进行电穿孔。在电穿孔后18小时测量IFN-β1(图20A)、RIG-I(图20B)、IL-2(图20C)、IL-6(图20D)、IFN-γ(图20E)和TNF-α(图20F)转录物诱导。
实施例20
用不同量的环状或线性RNA电穿孔的CAR表达细胞特异性裂解靶细胞和IFNγ转录物诱导；CAR表达细胞以不同E:T比率对靶细胞和非靶细胞的特异性裂解。
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、抗CD19 CAR表达序列和CVB3 IRES的构建体环化，并将反应产物通过尺寸排阻HPLC纯化。将150,000个模拟电穿孔或用不同数量的编码抗CD19 CAR序列的circRNA电穿孔的人原代CD3+T细胞与稳定表达GFP和萤火虫荧光素酶的Raji细胞以2:1的E:T比率共培养12小时。Raji靶细胞的特异性裂解通过检测萤火虫发光来确定(图21A)。特异性裂解％定义为1-[CAR条件发光]/[模拟条件发光]。在电穿孔后24小时测量IFNγ转录物诱导(图21B)。
将150,000个人原代CD3+T细胞模拟电穿孔或用500ng编码抗CD19 CAR序列的circRNA或m1ψ-mRNA电穿孔，然后与稳定表达萤火虫荧光素酶的Raji细胞以不同E:T比率共培养24小时。Raji靶细胞的特异性裂解通过检测萤火虫发光来确定(图22A)。特异性裂解定义为1-[CAR条件发光]/[模拟条件发光]。
将表达CAR的T细胞也与稳定表达萤火虫荧光素酶的Raji或K562细胞以不同E:T比率共培养24小时。Raji靶细胞或K562非靶细胞的特异性裂解通过检测萤火虫发光来确定(图22B)。特异性裂解％被定义为1-[CAR条件发光]/[模拟条件发光]。
实施例21
用编码CAR的环状RNA或线性RNA电穿孔的T细胞对靶细胞的特异性裂解。
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、抗CD19 CAR表达序列和CVB3 IRES的构建体环化，并将反应产物通过尺寸排阻HPLC纯化。用500ng环状RNA或等摩尔量的m1ψ-mRNA(各自编码CD19靶向CAR)对人原代CD3+T细胞进行电穿孔。将Raji细胞在7天内以10:1的E:T比例添加至CAR-T细胞培养物中。在第1、3、5和7天测量两种构建体的特异性裂解％(图23)。
实施例22
表达抗CD19 CAR或抗BCMA CAR的T细胞对Raji细胞的特异性裂解。
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、抗CD19或抗BCMA CAR表达序列和CVB3 IRES的构建体环化，并将反应产物通过尺寸排阻HPLC纯化。将150,000个原代人CD3+T细胞用500ng的circRNA电穿孔，然后与Raji细胞以2:1的E:T比例共培养。在电穿孔后12小时测量特异性裂解％(图24)。
实施例23
表达抗原的环状和线性RNA的表达、功能稳定性和细胞因子转录物诱导。
将包含一个或多个抗原表达序列的构建体环化，并且将反应产物通过尺寸排阻HPLC进行纯化。将抗原呈递细胞用环状RNA或mRNA电穿孔。
通过ELISA测量体外抗原产生。任选地，在电穿孔后每24小时测量抗原产生。在用编码抗原的环状或线性RNA电穿孔抗原呈递细胞后18小时测量细胞因子转录物诱导或释放。所测试的细胞因子可包括IFN-β1、RIG-I、IL-2、IL-6、IFNγ、RANTES和TNFα。
使用纯化的circRNA、纯化的circRNA加上反义circRNA和未纯化的circRNA来测量体外抗原产生和细胞因子诱导，以找到最佳保留表达和免疫刺激的比率。
实施例24
动物模型中的体内抗原和抗体表达。
为了评估编码抗原的circRNA在体内促进抗原表达和抗体产生的能力，通过肌内注射将递增剂量的编码一种或多种抗原的RNA引入小鼠中。
向小鼠注射一次，在28天后采血，然后再次注射，在其后14天后采血。通过ELISA测量针对目标抗原的中和抗体。
实施例25
防止感染。
为了评估编码抗原的circRNA防止或治疗感染的能力，通过肌内注射将编码一种或多种病毒抗原(如流感病毒)的RNA引入小鼠中。
小鼠接受编码一种或多种抗原的circRNA的初始注射和加强注射。对诸如流感的病毒的预防通过超过2周内的体重减轻和死亡率确定。
实施例26
实施例26A：化合物的合成
本发明的代表性可电离脂质的合成描述于PCT申请PCT/US2016/052352、PCT/US2016/068300、PCT/US2010/061058、PCT/US2018/058555、PCT/US2018/053569、PCT/US2017/028981、PCT/US2019/025246、PCT/US2018/035419、PCT/US2019/015913以及公布号为20190314524、20190321489和20190314284的美国申请，所述申请各自的内容以引用的方式整体并入本文。
实施例26B：化合物的合成
本发明的代表性可电离脂质的合成描述于美国专利公布号US20170210697A1中，所述专利公布的内容以引用的方式整体并入本文。
实施例27
器官的蛋白质表达
产生编码FLuc的环状或线性RNA，并使用以下配方负载到转移媒介物中：50％由
Figure GDA0004216226410001651
表示的可电离脂质10b-15、10％DSPC、1.5％PEG-DMG、38.5％胆固醇。将CD-1小鼠以0.2mg/kg的剂量给药，并在6小时(活体IVIS)和24小时(活体IVIS和离体IVIS)测量发光。测量了肝、脾、肾、肺和心脏的总通量(目标区域上的光子/秒)(图25和26)。
实施例28
脾中的表达分布
产生编码GFP的环状或线性RNA，并使用以下配方负载到转移媒介物中：50％由
Figure GDA0004216226410001652
表示的可电离脂质10b-15、10％DSPC、1.5％PEG-DMG、38.5％胆固醇。将所述制剂施用于CD-1小鼠。流式细胞术在脾细胞上运行以确定跨细胞类型的表达分布。/>
实施例29
实施例29A：纳米颗粒组合物的产生
为了研究用于将环状RNA递送至细胞的安全且有效的纳米颗粒组合物，制备并测试了一系列制剂。具体地，对纳米颗粒组合物的脂质组分中的特定要素及其比例进行了优化。
纳米颗粒可在1种流体流中或用混合方法如两种流体流的微流体和T型接合混合来制备，其中一种流体流含有环状RNA，并且另一种流体流具有脂质组分。
通过将可电离脂质、任选的辅助脂质(如可从Avanti Polar Lipids,Alabaster,AL获得的DOPE、DSPC或油酸)、PEG脂质(例如1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇，也称为PEG-DMG，可从Avanti Polar Lipids,Alabaster,AL获得)和结构脂质如胆固醇在溶剂(例如乙醇)中以约例如40或50mM的浓度合并来制备脂质组合物。应将溶液冷藏以在例如-20℃下储存。将脂质合并以产生所需的摩尔比(参见例如下表11a和11b)并用水和乙醇稀释至例如介于约5.5mM与约25mM之间的最终脂质浓度。
表11a
Figure GDA0004216226410001661
/>
Figure GDA0004216226410001671
在一些实施例中，转移媒介物具有如表11a中所述的配方。
表11b
Figure GDA0004216226410001681
在一些实施方案中，转移媒介物具有如表11b中所述的配方。
对于包含circRNA的纳米颗粒组合物，将在去离子水中浓度为0.1mg/ml的circRNA的溶液在pH介于3与4之间的缓冲液，例如50mM柠檬酸钠缓冲液中稀释以形成储备溶液。可替代地，将在去离子水中浓度为0.15mg/ml的circRNA的溶液在pH介于3与4.5之间的缓冲液，例如6.25mM乙酸钠缓冲液中稀释以形成储备溶液。
通过将脂质溶液与包含环状RNA的溶液以介于约5:1至约50:1之间的脂质组分与circRNA wt:wt比率合并来制备包含环状RNA和脂质组分的纳米颗粒组合物。使用例如基于NanoAssemblr微流体的系统以介于约10ml/min与约18ml/min之间或介于约5ml/min与约18ml/min之间的流速将脂质溶液快速注射到circRNA溶液中，以产生水与乙醇比率介于约1:1与约4:1之间的悬浮液。
可通过渗析来加工纳米颗粒组合物以除去乙醇并实现缓冲液交换。使用Slide-A-Lyzer盒(Thermo Fisher Scientific Inc.Rockford,IL)将制剂针对pH 7.4、体积为初产物200倍的磷酸盐缓冲盐水(PBS)透析两次，其中分子量截断是10kDa或20kDa。然后将制剂在4℃下透析过夜。将所得纳米颗粒悬浮液通过0.2μm无菌过滤器(Sarstedt,Nümbrecht,Germany)过滤到玻璃小瓶中并用卷边封闭物密封。通常获得0.01mg/ml至0.15mg/ml的纳米颗粒组合物溶液。
上述方法诱导纳米沉淀和颗粒形成。
替代方法(包括但不限于T-接合和直接注入)可用于实现相同的纳米沉淀。B.纳米颗粒组合物的表征
Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd,Malvern,Worcestershire,UK)可用于测定纳米颗粒组合物的粒度、多分散性指数(PDI)和ζ电位，在1×PBS中测定粒度并且在15mM PBS中测定ζ电位。
紫外-可见光谱可用于测定纳米颗粒组合物中circRNA的浓度。将100μL在1×PBS中的稀释制剂添加至900μL的甲醇与氯仿的4:1(v/v)混合物中。在混合后，例如在DU 800分光光度计(Beckman Coulter,Beckman Coulter,Inc.,Brea,CA)上在230nm与330nm之间记录溶液的吸收光谱。可基于纳米颗粒组合物中使用的circRNA的消光系数以及在例如260nm波长处的吸光度与在例如330nm波长处的基线值之间的差异来计算所述组合物中的circRNA的浓度。
可使用QUANT-ITTM
Figure GDA0004216226410001701
RNA测定(Invitrogen CorporationCarlsbad,CA)来评价纳米颗粒组合物对circRNA的包封。将样品在TE缓冲溶液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 7.5)中稀释至大约5μg/mL或1μg/mL的浓度。将50μL的稀释样品转移至聚苯乙烯96孔板，并且将50μL的TE缓冲液或50μL的2％-4％Triton X-100溶液添加至孔中。将板在37℃的温度下孵育15分钟。将/>
Figure GDA0004216226410001702
试剂在TE缓冲液中1:100或1:200稀释，并且将100μL的此溶液添加至每个孔中。可使用荧光板读取器(Wallac Victor 1420Multilabel Counter；Perkin Elmer,Waltham,MA)在例如约480nm的激发波长和例如约520nm的发射波长下测量荧光强度。从每个样品的荧光值中减去试剂空白的荧光值，并且通过用完整样品(没有添加Triton X-100)的荧光强度除以分解样品(通过添加Triton X-100造成)的荧光值来确定游离circRNA的百分比。C.
实施例29B：体内制剂研究
为了监测各种纳米颗粒组合物将circRNA递送至靶细胞的效率，制备了包含circRNA的不同纳米颗粒组合物并将其施用于啮齿动物群。向小鼠静脉内、肌肉内、动脉内或肿瘤内施用包括具有脂质纳米颗粒配方的纳米颗粒组合物的单一剂量。在一些情况下，可使小鼠吸入剂量。剂量大小可在0.001mg/kg至10mg/kg的范围内，其中10mg/kg描述对于每1kg小鼠体重在纳米颗粒组合物中包含10mg circRNA的剂量。也可使用包含PBS的对照组合物。
将纳米颗粒组合物施用于小鼠后，可通过酶联免疫吸附测定(ELISA)、生物发光成像或其他方法来测量特定制剂及其剂量的剂量递送曲线、剂量响应和毒性。还可评价蛋白质表达的时程。从啮齿动物中收集的用于评价的样品可包括血液和组织(例如，来自肌肉内注射部位的肌肉组织和内部组织)；样品采集可涉及动物的处死。
通过施用包含circRNA的组合物诱导的更高的蛋白质表达水平将指示更高的circRNA翻译和/或纳米颗粒组合物circRNA递送效率。由于认为非RNA组分本身不会影响翻译机制，因此较高的蛋白质表达水平可能指示相对于其他纳米颗粒组合物或所述纳米颗粒组合物不存在的情况，给定纳米颗粒组合物对circRNA的递送效率更高。
实施例30
纳米颗粒组合物的表征
Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd,Malvern,Worcestershire,UK)可用于测定转移媒介物组合物的粒度、多分散性指数(PDI)和ζ电位，在1×PBS中测定粒度并且在15mM PBS中测定ζ电位。
紫外-可见光谱法可用于测定转移媒介物组合物中治疗剂和/或预防剂(例如RNA)的浓度。将100μL在1×PBS中的稀释制剂添加至900μL的甲醇与氯仿的4:1(v/v)混合物中。在混合后，例如在DU 800分光光度计(Beckman Coulter,Beckman Coulter,Inc.,Brea,CA)上在230nm与330nm之间记录溶液的吸收光谱。可基于转移媒介物组合物中使用的治疗剂和/或预防剂的消光系数以及在例如260nm波长处的吸光度与在例如330nm波长处的基线值之间的差异来计算所述组合物中的治疗剂和/或预防剂的浓度。
对于包含RNA的转移媒介物组合物，可使用QUANT-ITTM
Figure GDA0004216226410001711
RNA测定(Invitrogen Corporation Carlsbad,CA)来评价转移媒介物组合物对RNA的包封。将样品在TE缓冲溶液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 7.5)中稀释至大约5μg/mL或1μg/mL的浓度。将50μL的稀释样品转移至聚苯乙烯96孔板，并且将50μL的TE缓冲液或50μL的2％-4％Triton X-100溶液添加至孔中。将板在37℃的温度下孵育15分钟。将/>
Figure GDA0004216226410001721
试剂在TE缓冲液中1:100或1:200稀释，并且将100μL的此溶液添加至每个孔中。可使用荧光平板读取器(Wallac Victor 1420Multilablel Counter；Perkin Elmer,Waltham,MA)在例如约480nm的激发波长和例如约520nm的发射波长下测量荧光强度。从每个样品的荧光值中减去试剂空白的荧光值，并且通过用完整样品(没有添加Triton X-100)的荧光强度除以分解样品(通过添加Triton X-100造成)的荧光值来确定游离RNA的百分比。
实施例31
T细胞靶向
为了使转移媒介物靶向T细胞，将T细胞抗原结合剂(例如抗CD8抗体)偶联至转移媒介物的表面。将抗T细胞抗原抗体在PBS中的EDTA存在下用过量的DTT轻度还原，以暴露游离铰链区硫醇。为了除去DTT，使抗体通过脱盐柱。异双功能交联剂SM(PEG)24用于将抗体锚定至负载circRNA的转移媒介物的表面(胺基存在于PEG脂质的头基中，抗体上的游离硫醇基团由DTT产生，SM(PEG)24使胺与硫醇基团之间交联)。将转移媒介物首先与过量的SM(PEG)24一起孵育并离心以除去未反应的交联剂。然后将激活的转移媒介物与过量的还原性抗T细胞抗原抗体一起孵育。使用离心过滤装置除去未结合的抗体。
实施例32
使用RV88的含RNA的转移媒介物。
在此实施例中，使用带有阳离子脂质RV88的2-D涡旋微流体芯片合成含有RNA的转移媒介物，以用于递送circRNA。
Figure GDA0004216226410001731
表12a
Figure GDA0004216226410001732
RV88、DSPC和胆固醇均在乙醇中以10mg/ml的浓度在硼硅小瓶中制备。脂质14:0-PEG2K PE也在硼硅玻璃小瓶中以4mg/ml的浓度制备。通过在乙醇中对脂质进行超声处理2分钟来使脂质在储备液浓度下溶解。然后将溶液在设置为170rpm的轨道倾斜振荡器上在37℃下加热10分钟。然后将小瓶在26℃下平衡至少45分钟。然后通过添加如表12b中所示体积的储备脂质来混合脂质。然后用乙醇调节溶液，使得最终脂质浓度是7.92mg/ml。
表12b
Figure GDA0004216226410001741
RNA被制备为含有75mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)和RNA浓度为1.250mg/ml的储备溶液。然后用pH 6.0的75mM柠檬酸盐缓冲液将RNA的浓度调节至0.1037mg/ml，平衡至26℃。然后将溶液在26℃下孵育至少25分钟。
将微流体室用乙醇清洗，并通过将注射器负载RNA溶液和另一个注射器负载乙醇脂质来制备neMYSIS注射泵。将两个注射器都在neMESYS软件的控制下负载。然后将溶液以2的水相与有机相比率和22ml/min的总流速(对于RNA 14.67ml/min，且对于脂质溶液7.33ml/min)施加至混合芯片上。两个泵同步启动。将从微流体芯片流动的混合器溶液以4x1 ml级分收集，其中第一级分作为废物丢弃。通过使用G-25微型脱盐柱将含有RNA脂质体的剩余溶液交换为pH 7.5的10mM Tris-HCl、1mM EDTA。缓冲液交换后，分别通过DLS分析和Ribogreen测定对材料的大小和RNA截留进行表征。
实施例33
使用RV94的含RNA的转移媒介物。
在此实施例中，使用带有阳离子脂质RV94的2-D涡旋微流体芯片合成含有RNA的脂质体，以用于递送circRNA。
Figure GDA0004216226410001751
表13
Figure GDA0004216226410001752
脂质如实施例29中使用表14中指定的材料量制备至7.92mg/ml的最终脂质浓度。
表14
Figure GDA0004216226410001753
circRNA的水溶液被制备为含有75mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)和circRNA浓度为1.250mg/ml的储备溶液。然后用pH 6.0的75mM柠檬酸盐缓冲液将RNA的浓度调节至0.1037mg/ml，平衡至26℃。然后将溶液在26℃下孵育至少25分钟。
将微流体室用乙醇清洗，并通过将注射器负载RNA溶液和另一个注射器负载乙醇脂质来制备neMYSIS注射泵。将两个注射器都在neMESYS软件的控制下负载。然后将溶液以2的水相与有机相比率和22ml/min的总流速(对于RNA 14.67ml/min，且对于脂质溶液7.33ml/min)施加至混合芯片上。两个泵同步启动。将从微流体芯片流动的混合器溶液以4x1ml级分收集，其中第一级分作为废物丢弃。如上所述，通过使用G-25微型脱盐柱将含有circRNA转移媒介物的剩余溶液交换为pH 7.5的10mM Tris-HCl、1mM EDTA。缓冲液交换后，分别通过DLS分析和Ribogreen测定对材料的大小和RNA截留进行表征。脂质体的生物物理分析示于表15中。
表15
Figure GDA0004216226410001761
实施例34
用于在线混合的通用方案。
制备单独的且分开的储备溶液-一种含有脂质，并且另一种含有circRNA。通过溶解在90％乙醇中来制备含有所需脂质或脂质混合物、DSPC、胆固醇和PEG脂质的脂质储备液。剩余的10％是低pH柠檬酸盐缓冲液。脂质储备液的浓度是4mg/mL。这种柠檬酸盐缓冲液的pH可在介于pH 3与pH 5之间的范围内，取决于所使用的脂质的类型。circRNA也以4mg/mL浓度溶解在柠檬酸盐缓冲液中。制备5mL的每种储备溶液。
储备溶液是完全透明的，并且确保脂质在与circRNA合并之前完全溶解。可加热储备溶液以完全溶解脂质。所述过程中使用的circRNA可以是未经修饰的或经修饰的寡核苷酸，并且可与亲脂性部分如胆固醇缀合。
通过将每种溶液泵送至T形接头来将单独储备液合并。双头Watson-Marlow泵用于同时控制两个流的开始和停止。将1.6mm聚丙烯管进一步缩小至0.8mm管以增加线性流速。将聚丙烯线(ID＝0.8mm)连接至T型接头的任一侧。聚丙烯T的线性边缘为1.6mm，最终体积为4.1mm3。将聚丙烯线的每个大端(1.6mm)放入含有溶解的脂质储备液或溶解的circRNA的试管中。在T形接头之后，在合并流的出口处放置单根管。然后将管延伸至具有2x体积PBS的容器中，并快速搅拌。泵的流速设置为300rpm或110mL/min。通过透析除去乙醇并交换为PBS。然后使用离心或渗滤将脂质制剂浓缩至适当的工作浓度。
C57BL/6小鼠(Charles River Labs,MA)通过尾静脉注射接受盐水或配制的circRNA。在施用后的不同时间点，通过眶后取血收集血清样品。使用显色测定(BiophenFVTI,Aniara Corporation,OH)来测定样品中因子VII蛋白的血清水平。为了确定因子VII的肝RNA水平，将动物处死并收获肝，并在液氮中速冻。从冷冻组织制备组织裂解物，并使用分支DNA测定(QuantiGene Assay,Panomics,CA)对因子VII的肝RNA水平进行定量。
在C57BL/6小鼠中静脉内(推注)注射后48小时，在FVTI siRNA处理的动物中评价FVII活性。按照制造商的说明书在微孔板规模下，使用市售试剂盒测量FVII以用于确定血清或组织中的蛋白质水平。针对未处理的对照小鼠测定FVII减少，并且结果表示为残留FVII％。两种剂量水平(0.05和0.005mg/kg FVII siRNA)用于筛选每种新型脂质体组合物。
实施例36
使用预先形成的囊泡的circRNA制剂。
使用预先形成的囊泡法制备含有阳离子脂质的转移媒介物。将阳离子脂质、DSPC、胆固醇和PEG-脂质分别以40/10/40/10的摩尔比溶解于乙醇中。将脂质混合物添加至水性缓冲液(50mM柠檬酸盐，pH 4)中，混合至分别30％(体积/体积)和6.1mg/mL的最终乙醇和脂质浓度，并在挤出前在室温下平衡2分钟。在22℃下，使用Lipex挤出机(Northern Lipids,Vancouver,BC)将水合脂质通过两个堆叠的80nm孔径过滤器(Nuclepore)挤出，直到获得通过Nicomp分析确定的70-90nm的囊泡直径。对于不形成小囊泡的阳离子脂质混合物，用较低pH的缓冲液(50mM柠檬酸盐，pH 3)使脂质混合物水合以质子化DSPC头基上的磷酸基团有助于形成稳定的70-90nm囊泡。
将FVII circRNA(溶解在含有30％乙醇的50mM柠檬酸盐pH 4水溶液中)添加至囊泡中，在混合下以约5mL/min的速率预平衡至35℃。在达到0.06(wt wt)的最终目标circRNA/脂质比率后，将混合物在35℃下再孵育30分钟，以允许囊泡重组和FVIIRNA的包封。然后除去乙醇并通过透析或切向流渗滤用PBS(155mM NaCl、3mM Na2HP04、ImM KH2P04，pH 7.5)置换外部缓冲液。在使用尺寸排阻旋转柱或离子交换旋转柱除去未包封的RNA后，确定最终包封的circRNA与脂质比率。
实施例37
实施例37A：由工程化的环状RNA表达三特异性抗原结合蛋白
环状RNA被设计为包含：(1)3'剪接后I组内含子片段；(2)内部核糖体进入位点(IRES)；(3)三特异性抗原结合蛋白编码区；和(4)3'同源区。构建三特异性抗原结合蛋白区以产生示例性三特异性抗原结合蛋白，其将结合至靶抗原，例如GPC3。
实施例37B：scFv CD3结合结构域的产生
人CD3ε链规范序列是Uniprot登录号P07766。人CD3γ链规范序列是Uniprot登录号P09693。人CD3δ链规范序列是Uniprot登录号P043234。针对CD3ε、CD3γ或CD3δ的抗体是通过诸如亲和力成熟的已知技术产生的。在使用鼠抗CD3抗体作为起始材料的情况下，鼠抗CD3抗体的人源化在临床环境中是所需的，其中小鼠特异性残基可在接受本文所述的三特异性抗原结合蛋白的治疗的受试者中诱导人抗小鼠抗原(HAMA)应答。人源化是通过将来自鼠抗CD3抗体的CDR区移植到适当的人种系受体框架上来实现的，任选地包括对CDR和/或框架区的其他修饰。
因此，人或人源化抗CD3抗体用于产生三特异性抗原结合蛋白的CD3结合结构域的scFv序列。获得编码人或人源化VL和VH结构域的DNA序列，并且任选地针对在来自智人的细胞中的表达优化构建体的密码子。改变VL和VH结构域在scFv中出现的顺序(即VL-VH或VH-VL取向)，并且“G4S”或“G4S”亚基(G4S)3的三个拷贝连接可变结构域以产生scFv结构域。抗CD3 scFv质粒构建体可具有任选的Flag、His或其他亲和标签，并被电穿孔到HEK293或其他合适的人或哺乳动物细胞系中并进行纯化。验证测定包括通过FACS进行的结合分析、使用Proteon的动力学分析以及对表达CD3的细胞进行染色。
实施例37C：scFv磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)结合结构域的产生
磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)是存在于肝细胞癌但不存在于健康正常肝组织上的细胞表面蛋白之一。经常观察到它在肝细胞癌中升高，并且与HCC患者的预后不良相关。已知激活Wnt信号传导。已经产生了GPC3抗体，包括MDX-1414、HN3、GC33和YP7。
与上述产生与CD3的scFv结合结构域的方法类似，产生与GPC-3或另一靶抗原结合的scFv。
实施例37D：三特异性抗原结合蛋白的体外表达
使用CHO细胞表达系统(
Figure GDA0004216226410001801
Life Technologies)，其是CHO-K1中国仓鼠卵巢细胞(ATCC，CCL-61)的衍生物(Kao和Puck,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1968；60(4):1275-81)。根据由Life Technologies提供的标准细胞培养方案对贴壁细胞进行继代培养。
为了适应悬浮生长，使细胞从组织培养烧瓶脱离并置于无血清培养基中。将悬浮适应的细胞冷冻保存在含有10％DMSO的培养基中。
稳定表达分泌的三特异性抗原结合蛋白的重组CHO细胞系是通过悬浮适应细胞的转染产生的。在使用抗生素潮霉素B进行选择期间，每周测量两次活细胞密度，并将细胞离心并以0.1×106个活细胞/mL的最大密度重新悬浮于新鲜选择培养基中。在选择2-3周后，此时将细胞转移至振荡烧瓶中的标准培养基，回收稳定表达三特异性抗原结合蛋白的细胞池。通过进行蛋白质凝胶电泳或流式细胞术来确认重组分泌蛋白的表达。将稳定细胞池冷冻保存在含有DMSO的培养基中。
三特异性抗原结合蛋白通过分泌到细胞培养上清液中，在稳定转染的CHO细胞系的10天补料分批培养物中产生。10天后，在培养活力通常>75％的情况下收获细胞培养上清液。每隔一天从生产培养物中收集样品并评估细胞密度和活力。在收获当天，在进一步使用前通过离心和真空过滤澄清细胞培养上清液。
通过SDS-PAGE分析细胞培养上清液中的蛋白质表达滴度和产物完整性。
实施例37E：三特异性抗原结合蛋白的纯化
以两步程序从CHO细胞培养上清液中纯化三特异性抗原结合蛋白。在第一步骤中对构建体进行亲和色谱，然后在第二步骤中在Superdex 200上进行制备型尺寸排阻色谱(SEC)。将样品进行缓冲液交换并通过超滤浓缩至>1mg/mL的典型浓度。在还原和非还原条件下通过SDS PAGE评估最终样品的纯度和同质性(通常>90％)，然后分别进行使用抗HSA或抗独特型抗体的免疫印迹以及分析型SEC。将纯化的蛋白质等分储存在-80℃直至使用。
实施例38
与没有半衰期延长结构相比，具有半衰期延长结构域的工程化环状RNA的表达改善了药代动力学参数
将实施例23的circRNA分子上编码的三特异性抗原结合蛋白以0.5mg/kg推注注射肌肉内施用于食蟹猴。另一个食蟹猴组接受在circRNA分子上编码的可比蛋白质，所述circRNA分子在大小上具有与CD3和GPC-3的结合结构域，但缺乏半衰期延长结构域。第三组和第四组分别接受编码在具有CD3和半衰期延长结构域结合结构域的circRNA分子上的蛋白质和具有GPC-3和半衰期延长结构域的蛋白质。由circRNA编码的两种蛋白质在大小上与三特异性抗原结合蛋白相当。每个测试组由5只猴子组成。在所指示的时间点采集血清样品，连续稀释，并使用与CD3和/或GPC-3的结合ELISA确定蛋白质的浓度。
使用测试物品血浆浓度进行药代动力学分析。当针对给药后时间作图时，每种测试物品的组平均血浆数据符合多指数曲线。数据通过标准两室模型拟合，所述模型具有用于分布和消除阶段的推注输入和一阶速率常数。用于静脉内施用的数据的最佳拟合的一般方程是：c(t)＝Ae～at+Be～pt，其中c(t)是时间t的血浆浓度，A和B是Y轴上的截距，并且a和β是分别为分布和消除阶段的表观一级速率常数。a阶段是清除的初始阶段，并且反映蛋白质在动物所有细胞外液中的分布，而衰减曲线的第二或β相部分代表真正的血浆清除。用于拟合此类方程的方法是本领域众所周知的。例如，A＝D/V(a-k21)/(a-p)，B＝D/V(p-k21)/(a-p)，并且a和β(对于α>β)是二次方程的根：r2+(k12+k21+k10)r+k21k10＝0，使用估计参数V＝分布容积，k10＝消除速率，k12＝从区室1至区室2的转移速率，k21＝从区室2至区室1的转移速率，并且D＝施用剂量。
数据分析：使用KaleidaGraph制成浓度对时间曲线的图(KaleidaGraphTMV.3.09Copyright 1986-1997.Synergy Software.Reading,Pa.)。报告为小于可报告(LTR)的值不包括在PK分析中，并且未以图形表示。药代动力学参数使用WinNonlin软件通过区室分析确定(
Figure GDA0004216226410001821
ProfessionalV.3.1WinNonlinTMCopyright 1998-1999.Pharsight Corporation.Mountain View,Calif)。如Ritschel W A和Kearns G L,1999,EST:Handbook Of Basic PharmacokineticsIncluding Clinical Applications,第5版,American Pharmaceutical Assoc.,Washington,D C.所描述计算药代动力学参数。
预期实施例23的circRNA分子上编码的三特异性抗原结合蛋白与缺乏半衰期延长结构域的蛋白质相比具有改善的药代动力学参数，如消除半衰期增加。
实施例39
三特异性抗原结合蛋白的细胞毒性
在体外评价在实施例23的circRNA分子上编码的三特异性抗原结合蛋白对针对GPC-3+靶细胞的T细胞依赖性细胞毒性的介导。
在实施例23的三特异性抗原结合蛋白存在下，将荧光标记的GPC3靶细胞与作为效应细胞的随机供体的分离的PBMC或T细胞一起孵育。在37℃下在湿润孵育箱中孵育4小时后，荧光染料从靶细胞释放到上清液中在分光荧光计中测定。在没有实施例23的三特异性抗原结合蛋白的情况下孵育的靶细胞和在孵育结束时通过添加皂苷完全裂解的靶细胞分别充当阴性对照和阳性对照。
基于测量的剩余活靶细胞，根据以下公式计算特异性细胞裂解的百分比：[1-(活靶标(样品)的数量/活靶标(自发)的数量)]×100％。S形剂量反应曲线和EC50值使用GraphPad软件通过非线性回归/4参数逻辑拟合计算。对于给定抗体浓度获得的裂解值用于通过使用Prism软件的4参数逻辑拟合分析计算S形剂量反应曲线。
实施例40
可电离脂质的合成
40.1((3-(2-甲基-1H-咪唑-1-基)丙基)氮烷二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(脂质10a-27)和((3-(1H-咪唑-1-基)丙基)氮烷二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯))(脂质10a-26)的合成
在与冷凝器连接的100mL圆底烧瓶中，将3-(1H-咪唑-1-基)丙-1-胺(100mg，0.799mmol)或3-(2-甲基-1H-咪唑-1-基)丙-1-胺(0.799mmol)、2-己基癸酸6-溴己基酯(737.2mg，1.757mmol)、碳酸钾(485mg，3.515mmol)和碘化钾(13mg，0.08mmol)在乙腈(30mL)中混合，并将反应混合物加热至80℃持续48小时。将混合物冷却至室温并通过硅藻土垫过滤。将滤液用乙酸乙酯稀释。在用水、盐水洗涤并经无水硫酸钠干燥后。蒸发溶剂并通过快速色谱法(SiO2:CH2Cl2＝100％至10％的于CH2Cl2中的甲醇)纯化粗残余物，得到无色油状产物(92mg，15％)。((3-(1H-咪唑-1-基)丙基)氮烷二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯))的分子式是C50H95N3O4，并且分子量(Mw)是801.7。
((3-(1H-咪唑-1-基)丙基)氮烷二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯))(脂质10a-26)的反应方案。
Figure GDA0004216226410001841
脂质10a-26的表征通过LC-MS进行。图27A-C示出脂质10a-26的表征。图27A示出对于脂质10a-26观察到的质子NMR。图27B是脂质10a-26的代表性LC/MS曲线，示出总离子和UV色谱图。
40.2脂质22-S14的合成
40.2.1 2-(十四烷基硫代)乙-1-醇的合成
在25℃下向2-硫烷基乙醇(5.40g，69.11mmol，4.82mL，0.871当量)于乙腈(200mL)中的混合物添加1-溴十四烷(22g，79.34mmol，23.66mL，1当量)和碳酸钾(17.55g，126.95mmol，1.6当量)。将反应混合物温至40℃并搅拌12小时。TLC(乙酸乙酯/石油醚＝25/1，Rf＝0.3，通过I2染色)显示起始材料完全消耗，并产生了新的主要斑点。将反应混合物过滤，并将滤饼用乙腈(50mL)洗涤，然后将滤液在真空下浓缩，得到残余物，将所述残余物通过硅胶柱(乙酸乙酯/石油醚＝1/100至1/25)纯化，得到呈白色固体的2-(十四烷基硫代)乙-1-醇(14g，产率64.28％)。
1H NMR(ET36387-45-P1A,400MHz,氯仿-d)δ0.87-0.91(m,3H)1.27(s,20H)1.35-1.43(m,2H)1.53-1.64(m,2H)2.16(br s,1H)2.49-2.56(m,2H)2.74(t,J＝5.93Hz,2H)3.72(br d,J＝4.89Hz,2H)。图28示出相应的核磁共振(NMR)光谱。
40.2.2丙烯酸2-(十四烷基硫代)乙酯的合成
在0℃下在氮气下向2-(十四烷基硫代)乙-1-醇(14g，51.00mmol，1当量)于二氯甲烷(240mL)中的溶液逐滴添加三乙胺(7.74g，76.50mmol，10.65mL，1.5当量q)和丙-2-烯酰氯(5.54g，61.20mmol，4.99mL，1.2当量)。将反应混合物温至25℃并搅拌12小时。TLC(乙酸乙酯/石油醚＝25/1，Rf＝0.5，通过I2染色)显示起始材料完全消耗，并产生了新的主要斑点。将反应溶液在真空下浓缩，得到粗品，将所述粗品通过硅胶柱(乙酸乙酯/石油醚＝1/100至1/25)纯化，得到呈无色油状物的丙烯酸2-(十四烷基硫代)乙酯(12g，产率71.61％)。
1H NMR(ET36387-49-P1A,400MHz,氯仿-d)δ0.85-0.93(m,3H)1.26(s,19H)1.35-1.43(m,2H)1.53-1.65(m,2H)2.53-2.62(m,2H)2.79(t,J＝7.03Hz,2H)4.32(t,J＝7.03Hz,2H)5.86(dd,J＝10.39,1.47Hz,1H)6.09-6.19(m,1H)6.43(dd,J＝17.30,1.41Hz,1H)。图29示出相应的核磁共振(NMR)光谱。
40.2.3双(2-(十四烷基硫代)乙基)3,3'-((3-(2-甲基-1H-咪唑-1-基)丙基)氮烷二基)二丙酸酯(脂质22-S14)的合成
向烧瓶中装入3-(2-甲基-1H-咪唑-1-基)丙-1-胺(300mg，2.16mmol)和丙烯酸2-(十四烷基硫代)乙酯(1.70g，5.17mmol)。将纯净的反应混合物加热至80℃并搅拌48小时。TLC(乙酸乙酯，Rf＝0.3，通过I2染色，添加一滴氢氧化铵)显示起始材料完全消耗，并且形成了新的主要斑点。将反应混合物用二氯甲烷(4mL)稀释并通过硅胶柱(石油醚/乙酸乙酯＝3/1至0/1，添加0.1％氢氧化铵)纯化，得到呈无色油状物的双(2-(十四烷基硫代)乙基)3,3'-((3-(2-甲基-1H-咪唑-1-基)丙基)氮烷二基)二丙酸酯(501mg，产率29.1％)。
1H NMR(ET36387-51-P1A,400MHz,氯仿-d)δ0.87(t,J＝6.73Hz,6H)1.25(s,40H)1.33-1.40(m,4H)1.52-1.61(m,4H)1.81-1.90(m,2H)2.36(s,3H)2.39-2.46(m,6H)2.53(t,J＝7.39Hz,4H)2.70-2.78(m,8H)3.84(t,J＝7.17Hz,2H)4.21(t,J＝6.95Hz,4H)6.85(s,1H)6.89(s,1H)。图30示出相应的核磁共振(NMR)光谱。
40.3双(2-(十四烷基硫代)乙基)3,3'-((3-(1H-咪唑-1-基)丙基)氮烷二基)二丙酸酯(脂质93-S14)的合成
向烧瓶中装入3-(1H-咪唑-1-基)丙-1-胺(300mg，2.40mmol，1当量)和丙烯酸2-(十四烷基硫代)乙酯(1.89g，5.75mmol，2.4当量)。将纯净的反应混合物加热至80℃并搅拌48小时。TLC(乙酸乙酯，Rf＝0.3，通过I2染色，添加一滴氢氧化铵)显示起始材料完全消耗，并且形成了新的主要斑点。将反应混合物用二氯甲烷(4mL)稀释并通过硅胶柱(石油醚/乙酸乙酯＝1/20-0/100，添加0.1％氢氧化铵)纯化，得到呈无色油状物的双(2-(十四烷基硫代)乙基)3,3'-((3-(1H-咪唑-1-基)丙基)氮烷二基)二丙酸酯(512mg，产率27.22％)。
1H NMR(ET36387-54-P1A,400MHz,氯仿-d)δ0.89(t,J＝6.84Hz,6H)1.26(s,40H)1.34-1.41(m,4H)1.58(br t,J＝7.50Hz,4H)1.92(t,J＝6.62Hz,2H)2.36-2.46(m,6H)2.55(t,J＝7.50Hz,4H)2.75(q,J＝6.84Hz,8H)3.97(t,J＝6.95Hz,2H)4.23(t,J＝6.95Hz,4H)6.95(s,1H)7.06(s,1H)7.51(s,1H)。图31示出相应的核磁共振(NMR)光谱。
40.4 8-((3-(2-甲基-1H-咪唑-1-基)丙基)(8-(壬基氧基)-8-氧代辛基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(脂质10a-54)的合成
40.4.1 8-溴辛酸壬酯(3)的合成
Figure GDA0004216226410001871
向8-溴辛酸(2)(18.6g，83.18mmol)和壬-1-醇(1)(10g，69.32mmol)于CH2Cl2(500mL)中的混合物添加DMAP(1.7g，13.86mmol)、DIPEA(48mL，277.3mmol)和EDC(16g，83.18mmol)。将反应物在室温下搅拌过夜。在浓缩反应混合物后，将粗残余物溶解在乙酸乙酯(500mL)中，用1N HCl、饱和NaHCO3、水和盐水洗涤。将有机层经无水Na2SO4干燥。蒸发溶剂，并将粗残余物通过快速色谱法(SiO2:己烷＝100％至30％的于己烷中的EtOAc)纯化，得到无色油状产物3(9g，37％)。
40.4.2 8-溴辛酸十七烷-9-基酯(5)的合成
Figure GDA0004216226410001872
向8-溴辛酸(2)(10g，44.82mmol)和十七烷-9-醇(4)(9.6g，37.35mmol)于CH2Cl2(300mL)中的混合物添加DMAP(900mg，7.48mmol)、DIPEA(26mL，149.7mmol)和EDC(10.7g，56.03mmol)。将反应物在室温下搅拌过夜。在浓缩反应混合物后，将粗残余物溶解在乙酸乙酯(300mL)中，用1N HCl、饱和NaHCO3、水和盐水洗涤。将有机层经无水Na2SO4干燥。蒸发溶剂，并将粗残余物通过快速色谱法(SiO2:己烷＝100％至30％的于己烷中的EtOAc)纯化，得到无色油状产物5(5g，29％)。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δppm 4.86(m,1H),3.39(t,J＝7.0Hz,2H),2.27(t,J＝7.6Hz,2H),1.84(m,2H),1.62(m,2H),1.5-1.4(m,8H),1.35-1.2(m,26H)0.87(t,J＝6.7Hz,6H)。
40.4.3 8-((3-(2-甲基-1H-咪唑-1-基)丙基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(7)的合成
Figure GDA0004216226410001881
在与冷凝器连接的100mL圆底烧瓶中，将8-溴辛酸十七烷-9-基酯(5)(860mg，1.868mmol)和3-(2-甲基-1H-咪唑-1-基)丙-1-胺(6)(1.3g，9.339mmol)在乙醇(10mL)中混合。将反应混合物加热至回流过夜。MS(APCI)显示预期产物。将混合物冷却至室温并浓缩。将粗残余物通过快速色谱法(SiO2:CH2Cl2＝100％至10％的甲醇+1％NH4OH于CH2Cl2中)纯化，得到无色油状产物7(665mg，69％)。
40.4.4 8-((3-(2-甲基-1H-咪唑-1-基)丙基)(8-(壬基氧基)-8-氧代辛基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(脂质10a-54)的合成
Figure GDA0004216226410001891
在与冷凝器连接的100mL圆底烧瓶中，将8-((3-(2-甲基-1H-咪唑-1-基)丙基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(7)(665mg，1.279mmol)和8-溴辛酸壬酯(3)(536mg，1.535mmol)在乙醇(10mL)中混合，然后添加DIPEA(0.55mL，3.198mmol)。将反应混合物加热至回流过夜。MS(APCI)和TLC(10％MeOH+1％NH4OH于CH2Cl2中)两者均显示产物和一些未反应的起始材料。将混合物冷却至室温并浓缩。将粗残余物通过快速色谱法(SiO2:CH2Cl2＝100％至10％的甲醇+1％NH4OH于CH2Cl2中)纯化，得到无色油状物(170mg，17％)。
40.5 8-((3-(1H-咪唑-1-基)丙基)(8-(壬基氧基)-8-氧代辛基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(脂质10a-53)的合成
Figure GDA0004216226410001901
脂质10a-53根据上述方案合成。除了3-(1H-咪唑-1-基)丙-1-胺作为咪唑胺之外，反应条件与脂质10a-54相同。
40.6 8-((3-(1H-咪唑-1-基)丙基)(8-(壬基氧基)-8-氧代辛基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(脂质10a-45)的合成
40.6.1 8-溴辛酸十七烷-9-基酯(3)的合成
Figure GDA0004216226410001902
向8-溴辛酸(2)(10g，44.82mmol)和十七烷-9-醇(1)(9.6g，37.35mmol)于CH2Cl2(300mL)中的混合物添加DMAP(900mg，7.48mmol)、DIPEA(26mL，149.7mmol)和EDC(10.7g，56.03mmol)。将反应物在室温下搅拌过夜。在浓缩反应混合物后，将粗残余物溶解在乙酸乙酯(300mL)中，用1N HCl、饱和NaHCO3、水和盐水洗涤。将有机层经无水Na2SO4干燥。蒸发溶剂，并将粗残余物通过快速色谱法(SiO2:己烷＝100％至30％的于己烷中的EtOAc)纯化，得到无色油状产物3(5g，29％)。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δppm 4.86(m,1H),3.39(t,J＝7.0Hz,2H),2.27(t,J＝7.6Hz,2H),1.84(m,2H),1.62(m,2H),1.5-1.4(m,8H),1.35-1.2(m,26H)0.87(t,J＝6.7Hz,6H)。
40.6.2 8-((3-(1H-咪唑-1-基)丙基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(6)的合成
Figure GDA0004216226410001911
在与冷凝器连接的100mL圆底烧瓶中，将8-溴辛酸十七烷-9-基酯(3)(1g，2.167mmol)和3-(1H-咪唑-1-基)丙-1-胺(4)(1.3mL，10.83mmol)在乙醇(10mL)中混合。将反应混合物加热至回流过夜。MS(APCI)显示预期产物。将混合物冷却至室温并浓缩。将粗残余物通过快速色谱法(SiO2:CH2Cl2＝100％至10％的甲醇+1％NH4OH于CH2Cl2中)纯化，得到无色油状产物6(498mg，45％)。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δppm 7.47(s,1H),7.04(s,1H),6.91(s,1H),4.85(m,1H),4.03(t,J＝7.0Hz,2H),2.56(dd,J＝14.5,7.4Hz,4H),2.27(t,J＝7.4Hz,2H),1.92(m,2H),1.60(m,2H),1.48(m,6H),1.30-1.20(m,31H),0.86(t,J＝6.6Hz,6H)。MS(APCI+):506.4(M+1)。
40.6.3 8-溴辛酸壬酯(9)的合成
Figure GDA0004216226410001921
向8-溴辛酸(2)(18.6g，83.18mmol)和壬-1-醇(8)(10g，69.32mmol)于CH2Cl2(500mL)中的混合物添加DMAP(1.7g，13.86mmol)、DIPEA(48mL，277.3mmol)和EDC(16g，83.18mmol)。将反应物在室温下搅拌过夜。在浓缩反应混合物后，将粗残余物溶解在乙酸乙酯(500mL)中，用1N HCl、饱和NaHCO3、水和盐水洗涤。将有机层经无水Na2SO4干燥。蒸发溶剂，并将粗残余物通过快速色谱法(SiO2:己烷＝100％至30％的于己烷中的EtOAc)纯化，得到无色油状产物9(9g，37％)。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δppm 4.05(t,J＝7.0Hz,2H),3.39(t,J＝7.0Hz,2H),2.29(t,J＝7.6Hz,2H),1.84(m,2H),1.62-1.56(m,6H),1.40-1.20(m,16H),0.87(t,J＝6.7Hz,3H)。
40.6.4 8-((3-(1H-咪唑-1-基)丙基)(8-(壬基氧基)-8-氧代辛基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯的合成
Figure GDA0004216226410001922
在与冷凝器连接的100mL圆底烧瓶中，将8-((3-(1H-咪唑-1-基)丙基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(6)(242mg，0.478mmol)和8-溴辛酸壬酯9(200mg，0.574mmol)在乙醇(10mL)中混合，然后添加DIPEA(0.2mL，1.196mmol)。将反应混合物加热至回流过夜。MS(APCI)和TLC(10％MeOH+1％NH4OH于CH2Cl2中)两者均显示产物和一些未反应的起始材料。将混合物冷却至室温并浓缩。将粗残余物通过快速色谱法(SiO2:CH2Cl2＝100％至10％的甲醇+1％NH4OH于CH2Cl2中)纯化，得到无色油状物(35mg，10％)。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δppm 7.46(s,1H),7.05(s,1H),6.90(s,1H),4.85(m,1H),4.04(t,J＝6.6Hz,2H),4.01(t,J＝6.6Hz,2H),2.38(m,6H),2.27(t,J＝3.8Hz,4H),1.89(m,2H),1.60-1.58(m,12H),1.48(m,6H),1.30-1.20(m,47H),0.87(t,J＝7.1Hz,9H)。MS(APCI+):774.6(M+1)。
40.7 8-((3-(2-甲基-1H-咪唑-1-基)丙基)(8-(壬基氧基)-8-氧代辛基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(脂质10a-46)的合成
Figure GDA0004216226410001931
Figure GDA0004216226410001941
脂质10a-46根据上述方案合成。除了3-(2-甲基-1H-咪唑-1-基)丙-1-胺作为咪唑胺之外，反应条件与脂质10a-45相同。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δppm 6.89(s,1H),6.81(s,1H),4.86(m,1H),4.04(t,J＝6.8Hz,2H),3.85(t,J＝7.4Hz,2H),2.38-2.36(m,9H),2.28(m,4H),1.82(m,2H),1.72-1.56(m,12H),1.48(m,4H),1.30-1.20(m,46H),0.86(t,J＝6.6Hz,9H)。MS(APCI+):789.7(M+1)。
40.8 8-((3-(1H-咪唑-1-基)丙基)(8-氧代-8-(十一烷-3-基氧基)辛基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(脂质10a-137)的合成
40.8.1 8-溴辛酸十七烷-9-基酯(3)的合成
Figure GDA0004216226410001942
向8-溴辛酸(2)(10g，44.82mmol)和十七烷-9-醇(1)(9.6g，37.35mmol)于CH2Cl2(300mL)中的混合物添加DMAP(900mg，7.48mmol)、DIPEA(26mL，149.7mmol)和EDC(10.7g，56.03mmol)。将反应物在室温下搅拌过夜。在浓缩反应混合物后，将粗残余物溶解在乙酸乙酯(300mL)中，用1N HCl、饱和NaHCO3、水和盐水洗涤。将有机层经无水Na2SO4干燥。蒸发溶剂，并将粗残余物通过快速色谱法(SiO2:己烷＝100％至30％的于己烷中的EtOAc)纯化，得到无色油状产物3(5g，29％)。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δppm 4.86(m,1H),3.39(t,J＝7.0Hz,2H),2.27(t,J＝7.6Hz,2H),1.84(m,2H),1.62(m,2H),1.5-1.4(m,8H),1.35-1.2(m,26H)0.87(t,J＝6.7Hz,6H)。
40.8.2 8-((3-(1H-咪唑-1-基)丙基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(6)的合成
Figure GDA0004216226410001951
在与冷凝器连接的100mL圆底烧瓶中，将8-溴辛酸十七烷-9-基酯(3)(1g，2.167mmol)和3-(1H-咪唑-1-基)丙-1-胺(4)(1.3mL，10.83mmol)在乙醇(10mL)中混合。将反应混合物加热至回流过夜。MS(APCI)显示预期产物。将混合物冷却至室温并浓缩。将粗残余物通过快速色谱法(SiO2:CH2Cl2＝100％至10％的甲醇+1％NH4OH于CH2Cl2中)纯化，得到无色油状产物6(498mg，45％)。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δppm 7.47(s,1H),7.04(s,1H),6.91(s,1H),4.85(m,1H),4.03(t,J＝7.0Hz,2H),2.56(dd,J＝14.5,7.4Hz,4H),2.27(t,J＝7.4Hz,2H),1.92(m,2H),1.60(m,2H),1.48(m,6H),1.30-1.20(m,31H),0.86(t,J＝6.6Hz,6H)。MS(APCI+):506.4(M+1)。
40.8.3十一烷-3-醇(11)的合成
Figure GDA0004216226410001952
在0℃冰-水浴下向壬醛(10)(5g，35.2mmol)于无水THF(100mL)中的混合物逐滴添加溴化乙镁(47mL，42.2mmol，0.9M于THF中)。将反应物在室温下搅拌过夜。将反应物用冰淬灭，并用乙酸乙酯(500mL)稀释，用1N HCl、饱和NaHCO3、水和盐水洗涤。将有机层经无水Na2SO4干燥。蒸发溶剂，并将粗残余物通过快速色谱法(SiO2:己烷＝100％至50％的于己烷中的EtOAc)纯化，得到无色油状产物11(4g，66％)。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δppm 3.52(m,1H),1.56-1.3(m,4H),1.3-1.20(m,12H),0.93(t,J＝7.4Hz,3H),0.87(t,J＝7.4Hz,3H)。
40.8.4 8-溴辛酸十一烷-3-基酯(12)的合成
Figure GDA0004216226410001961
向8-溴辛酸(2)(6.2g，27.9mmol)和十一烷-3-醇(11)(4g，23.2mmol)于CH2Cl2(100mL)中的混合物添加DMAP(567.2mg，4.64mmol)、DIPEA(16.2mL，92.9mmol)和EDC(6.7g，34.8mmol)。将反应物在室温下搅拌过夜。在浓缩反应混合物后，将粗残余物溶解在乙酸乙酯(500mL)中，用1N HCl、饱和NaHCO3、水和盐水洗涤。将有机层经无水Na2SO4干燥。蒸发溶剂，并将粗残余物通过快速色谱法(SiO2:己烷＝100％至30％的于己烷中的EtOAc)纯化，得到无色油状产物12(7.3g，83％)。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δppm 4.80(m,1H),3.39(t,J＝6.8Hz,2H),2.28(t,J＝7.7Hz,2H),1.84(m,2H),1.6-1.35(m,8H),1.35-1.2(m,16H),0.87(t,J＝7.4Hz,6H)。
40.8.4 8-((3-(1H-咪唑-1-基)丙基)(8-(壬基氧基)-8-氧代辛基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯的合成
Figure GDA0004216226410001971
在与冷凝器连接的100mL圆底烧瓶中，将8-((3-(1H-咪唑-1-基)丙基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(6)(242mg，0.478mmol)和8-溴辛酸十一烷-3-基酯(12)(200mg，0.574mmol)在乙醇(10mL)中混合，然后添加DIPEA(0.2mL，1.196mmol)。将反应混合物加热至回流过夜。MS(APCI)和TLC(10％MeOH+1％NH4OH于CH2Cl2中)两者均显示产物和一些未反应的起始材料。将混合物冷却至室温并浓缩。将粗残余物通过快速色谱法(SiO2:CH2Cl2＝100％至10％的甲醇+1％NH4OH于CH2Cl2中)纯化，得到无色油状物(35mg，10％)。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δppm 7.45(s,1H),7.04(s,1H),6.90(s,1H),4.82(m,2H),3.97(t,J＝6.8Hz,2H),2.35(m,6H),2.27(t,J＝3.8Hz,4H),1.89(m,2H),1.60-1.48(m,14H),1.30-1.20(m,50H),0.87(m,12H)。MS(APCI+):802.8
40.9 8-((3-(2-甲基-1H-咪唑-1-基)丙基)(8-(壬基氧基)-8-氧代辛基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(脂质10a-138)的合成
Figure GDA0004216226410001981
脂质10a-138根据上述方案合成。除了3-(2-甲基-1H-咪唑-1-基)丙-1-胺作为咪唑胺之外，反应条件与脂质10a-137相同。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δppm 6.89(s,1H),6.81(s,1H),4.82(m,2H),3.86(t,J＝7.1Hz,2H),2.38-2.3(m,9H),2.27(t,J＝3.8Hz,4H),1.84(m,2H),1.60-1.37(m,14H),1.30-1.20(m,50H),0.87(m,12H)。MS(APCI+):816.8(M+1)。
40.10(((2-(2-甲基-1H-咪唑-1-基)乙基)氮烷二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯(脂质10a-139)的合成
40.10.1 2-己基癸酸6-溴己基酯(3)的合成
Figure GDA0004216226410001991
向2-己基癸酸(1)(102g，0.398mol)和6-溴-1-己醇(2)(60g，0.331mol)于CH2Cl2(1L)中的混合物添加DMAP(8.1g，66mmol)、DIPEA(230mL，1.325mol)和EDC(76g，0.398mol)。将反应物在室温下搅拌过夜。在浓缩反应混合物后，将粗残余物溶解在乙酸乙酯(1L)中，用1N HCl、饱和NaHCO3、水和盐水洗涤。将有机层经无水Na2SO4干燥。蒸发溶剂，并将粗残余物通过快速色谱法(SiO2:己烷＝100％至30％的于己烷中的EtOAc)纯化，得到无色油状产物3(67g，48％)。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δppm 4.06(t,J＝6.6Hz,2H),3.4(t,J＝6.8Hz,2H),2.3(m,1H),1.86(m,2H),1.64(m,2H),1.5-1.4(m,2H),1.35-1.2(m,26H)0.87(t,J＝6.7Hz,6H)。
40.10.2 2-己基癸酸6-((3-(1H-咪唑-1-基)丁基)氨基)己基酯(7a)的合成
Figure GDA0004216226410001992
在与冷凝器连接的100mL圆底烧瓶中，将2-己基癸酸6-溴己基酯(3)(1.2g，2.87mmol)和3-(1H-咪唑-1-基)丁-1-胺(7)(2g，14.37mmol)在乙醇(20mL)中混合。将反应混合物加热至回流过夜。MS(APCI)显示预期产物。将混合物冷却至室温并浓缩。将粗残余物通过快速色谱法(SiO2:CH2Cl2＝100％至10％的甲醇+1％NH4OH于CH2Cl2中)纯化，得到无色油状产物7a(626mg，46％)。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δppm 7.51(s,1H),7.05(s,1H),6.93(s,1H),4.35(m,1H),4.04(t,J＝6.6Hz,2H),2.6-2.4(m,4H),2.29(m,1H),1.94(td,J＝14,6.8Hz,2H),1.64-1.56(m,4H),1.47(s,3H),1.42-1.20(m,29H),0.86(m,6H)。MS(APCI+):478.8(M+1)
40.10.2((2-(2-甲基-1H-咪唑-1-基)乙基)氮烷二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯的合成
Figure GDA0004216226410002001
在与冷凝器连接的100mL圆底烧瓶中，将2-己基癸酸6-((3-(1H-咪唑-1-基)丁基)氨基)己基酯(7a)(626mg，1.31mmol)和2-己基癸酸6-溴己基酯(3)(550mg，1.31mmol)在乙醇(20mL)中混合，然后添加DIPEA(0.6mL，3.276mmol)。将反应混合物加热至回流过夜。MS(APCI)和TLC(10％MeOH+1％NH4OH于CH2Cl2中)两者均显示产物和未反应的起始材料7a。将混合物冷却至室温并浓缩。将粗残余物通过快速色谱法(SiO2:CH2Cl2＝100％至10％的甲醇+1％NH4OH于CH2Cl2中)纯化，并将所获得的产物通过C18反相色谱法(H2O＝95％至0.1％的TFA于CH3CN＝100％中)进一步纯化，得到无色油状物(TFA盐)(140mg，13％)。
1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ6.87(s,1H),6.83(s,1H),4,05(t,J＝6.7Hz,4H),3.84(t,J＝6.9Hz,2H),2.66(t,J＝6.9Hz,2H),2.45-2.20(m,6H),2.37(s,3H),1.65-1.50(m,8H),1.5-1.1(m,56H),0.86(t,J＝6.5Hz,12H)。MS(APCI+):802.6(M+1)。
40.11(((1-甲基-1H-咪唑-2-基)甲基)氮烷二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(脂质10a-130)的合成
Figure GDA0004216226410002011
脂质10a-130根据上述方案合成。除了3-(1H-咪唑-1-基)丁胺作为咪唑胺之外，反应条件与脂质10a-139相同。
40.12(((1-甲基-1H-咪唑-2-基)甲基)氮烷二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(脂质10a-128)的合成
Figure GDA0004216226410002021
脂质10a-128根据上述方案合成。除了1-甲基-1H-咪唑-2-基)甲胺作为咪唑胺之外，反应条件与脂质10a-139相同。
1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ6.89(d,J＝1.4Hz,1H),6.81(d,J＝1.4Hz,1H),4,03(t,J＝6.7Hz,4H),3.68(s,3H),3.62(s,2H),2.45-2.20(m,6H),1.65-1.50(m,8H),1.5-1.35(m,8H),1.35-1.10(m,48H),0.86(t,J＝6.5Hz,12H)。MS(APCI+):787.6(M+1)。
实施例41
含有环状RNA的脂质纳米颗粒制剂
脂质纳米颗粒(LNP)是使用带有“NextGen”混合室的Precision NanosystemsIgnite仪器形成的。将含有16:1:4:1重量比或62:4:33:1摩尔比的可电离脂质10a-26、DSPC、胆固醇和DSPE-PEG 2000(Avanti Polar Lipids Inc.)的乙醇相与含有环状RNA和25mM乙酸钠缓冲液(pH 5.2)的水相合并。使用3:1的水性与乙醇混合比。然后将配制的LNP在1L水中透析，并在18小时内交换2次。使用0.2μm过滤器过滤透析的LNP。在体内给药之前，将LNP在PBS中稀释。LNP大小通过动态光散射确定。使用Malvern Panalytical ZetasizerPro测量在PBS(pH 7.4)中含有1mL的20μg/mL LNP的比色皿的Z平均值。记录Z平均值和多分散性指数。
41.1脂质10a-26和10a-27的配制
脂质纳米颗粒(LNP)是使用带有“NextGen”混合室的Precision NanosystemsIgnite仪器形成的。将含有16:1:4:1重量比或62:4:33:1摩尔比的可电离脂质10a-26或脂质10a-27、DOPE、胆固醇和DSPE-PEG 2000(Avanti Polar Lipids Inc.)的乙醇相与含有环状RNA和25mM乙酸钠缓冲液(pH 5.2)的水相合并。使用3:1的水性与乙醇混合比。然后将配制的LNP在1L水中透析，并在18小时内交换2次。使用0.2μm过滤器过滤透析的LNP。在体内给药之前，将LNP在PBS中稀释。LNP大小通过动态光散射确定。使用Malvern PanalyticalZetasizer Pro测量在PBS(pH 7.4)中含有1mL的20μg/mL LNP的比色皿的Z平均值。记录Z平均值和多分散性指数。
39.2脂质10a-53和10a-54的配制
脂质纳米颗粒(LNP)是使用带有“NextGen”混合室的Precision NanosystemsIgnite仪器形成的。将含有50:10:38.5:1.5摩尔比的可电离脂质10a-53或10a-54、DOPE、胆固醇和DSPE-PEG 2000(Avanti Polar Lipids Inc.)的乙醇相与含有环状RNA和25mM乙酸钠缓冲液(pH 5.2)的水相合并。使用3:1的水性与乙醇混合比。然后将配制的LNP在1L的1xPBS中透析，并在18小时内交换2次。使用0.2μm过滤器过滤透析的LNP。在体内给药之前，将LNP在PBS中稀释。LNP大小通过动态光散射确定。使用Malvern Panalytical ZetasizerPro测量在PBS(pH 7.4)中含有1mL的20μg/mL LNP的比色皿的Z平均值。记录Z平均值和多分散性指数。
使用Malvern Panalytical Zetasizer Pro测量LNPζ电位。将含有200μL颗粒水溶液和800μL不含RNA酶的蒸馏水(最终颗粒浓度为400μg/mL)的混合物负载至zetasizer毛细管单元中进行分析。
使用Ribogreen测定确定RNA包封。将纳米颗粒溶液在三乙二胺四乙酸(TE)缓冲液中稀释，理论circRNA浓度为2μg/mL。制备范围为2μg/mL至0.125μg/mL的在TE缓冲液中稀释的标准circRNA溶液。将颗粒和标准品添加至所有孔中，并进行第二次孵育(37℃以350rpm持续3分钟)。使用
Figure GDA0004216226410002041
GEMINI XS微板荧光光谱仪测量荧光。使用标准曲线计算每种颗粒溶液中环状RNA的浓度。从在裂解的与未裂解的颗粒之间检测到的circRNA的比率计算包封效率。
表16a.LNP的表征
Figure GDA0004216226410002042
表16b.LNP的表征
可电离脂质 Z平均值(nm) PDI RNA截留(％)
22-S14 64 0.05 97
93-S14 74 0.04 95
脂质10a-26 84 0.04 96
实施例42
体内分析
将22-25g范围内的雌性CD-1或雌性c57BL/6J小鼠以0.5mg/kg RNA静脉内给药。注射后6小时，向小鼠腹膜内注射200μL浓度为15mg/mL的D-荧光素。注射后5分钟，使用异氟烷麻醉小鼠，并将小鼠背侧朝上置于IVIS谱体内成像系统(Perkin Elmer)内。脂质22-S14、93-S14、脂质10a-26的全身总IVIS通量呈现于图32A中。注射10分钟后，扫描小鼠的发光。将小鼠安乐死，并在注射荧光素后25分钟内取出器官，以扫描肝、脾、肾、肺和心脏中的发光。使用Living Images(Perkin Elmer)软件分析图像(图33A-B、34A-B、35A-B)。绘制目标区域以获得通量和平均辐射度并分析蛋白质表达的生物分布(图32A-B)。
图32A示出与用脂质22-S14和93-S14制成的LNP相比，从具有脂质10a-26LNP的荧光素酶circRNA观察到的全身总通量增加。图32B示出组织的离体IVIS分析进一步突出显示在脂质10a-26情况下总体表达增加，同时保持在脂质22-S14和93-S14情况下观察到的所需脾肝比，尽管具有被设计用于改善表达的显著结构变化。与先前报告的脂质相比，这些数据突出显示由脂质10a-26提供的改进。
如上所述的类似分析也用包封在用脂质10b-15或脂质10a-53或10a-54形成的LNP中的circRNA进行。图36A-C示出组织的离体IVIS分析，分别突出显示在脂质10b-15、10a-53和10a-54情况下的总体表达，同时保持所需的脾肝比，尽管具有被设计用于改善表达的显著结构变化。图36D示出PBS对照的结果。这些数据证明与先前报告的脂质如93-S14和22-S14相比，由脂质10b-15、10a-53和10a-54提供的改进。
实施例43
荧光素酶的递送
用包封萤火虫荧光素酶(f.luc)环状RNA的脂质纳米颗粒(LNP)转染人外周血单核细胞(PBMC)(Stemcell Technologies)，并检查荧光素酶表达。将来自两个不同供体的PBMC与五种不同的LNP组合物在体外在37℃下在RPMI、2％人血清、IL-2(10ng/mL)和50uM BME中孵育，所述组合物含有编码萤火虫荧光素酶的环状RNA(200ng)。在没有LNP的情况下孵育的PBMC用作阴性对照。24小时后，裂解细胞并基于生物发光(Promega BrightGlo)分析萤火虫荧光素酶表达。
代表性数据呈现于图37A和37B中，表明所测试的LNP能够将环状RNA递送至原代人类免疫细胞中，从而产生蛋白质表达。
实施例44
绿色荧光蛋白(GFP)或嵌合抗原受体(CAR)的体外递送
用包封GFP的LNP转染人PBMC(Stemcell Technologies)并通过流式细胞术进行检查。将来自五个不同供体的PBMC(PBMC A-E)与一种LNP组合物在体外在37℃下在RPMI、2％人血清、IL-2(10ng/mL)和50uM BME中孵育，所述组合物含有编码GFP或CD19-CAR的环状RNA(200ng)。在没有LNP的情况下孵育的PBMC用作阴性对照。在LNP孵育24、48或72小时后，分析细胞的CD3、CD19、CD56、CD14、CD11b、CD45、可固定活死和有效负载(GFP或CD19-CAR)。
代表性数据呈现于图38A和38B中，表明所测试的LNP能够将环状RNA递送至原代人类免疫细胞中，从而产生蛋白质表达。
实施例45
多种IRES变体可在体外介导鼠CD19 CAR的表达
编码抗鼠CD19 CAR的多种环状RNA构建体含有独特的IRES序列，并被脂转染到1C1C7细胞系中。在脂转染之前，将1C1C7细胞在完全RPMI中扩增数天。一旦细胞扩增至合适的数量，就用四种不同的环状RNA构建体对1C1C7细胞进行脂转染(Invitrogen RNAiMAX)。24小时后，将1C1C7细胞与His标记的重组鼠CD19(Sino Biological)蛋白一起孵育，然后用第二抗His抗体染色。之后，通过流式细胞仪对细胞进行分析。
代表性数据呈现于图39中，表明源自所指示病毒(黑线姬鼠小核糖核酸病毒、山羊嵴病毒、parabovirus和萨力病毒)的IRES能够驱动抗小鼠CD19 CAR在鼠T细胞中的表达。
实施例46
小鼠CD19 CAR在体外介导肿瘤细胞杀伤
将编码抗小鼠CD19 CAR的环状RNA电穿孔到鼠T细胞中以评估CAR介导的细胞毒性。对于电穿孔，使用ThermoFisher的Neon转染系统用编码抗小鼠CD19 CAR的环状RNA对T细胞进行电穿孔，然后静置过夜。对于细胞毒性测定，将电穿孔的T细胞与Fluc+靶细胞和非靶细胞以1:1的比例在含有10％ FBS、IL-2(10ng/mL)和50uMBME的完全RPMI中共培养，并在37℃下孵育过夜。在共培养后24小时使用荧光素酶测定系统(Promega Brightglo荧光素酶系统)测量细胞毒性，以检测Fluc+靶细胞和非靶细胞的裂解。所示的值是相对于未转染的模拟信号计算的。
代表性数据呈现于图40中，表明从环状RNA表达的抗小鼠CD19 CAR在体外在鼠T细胞中是功能性的。
实施例47
用脂质包封的编码鼠CD19 CAR的环状RNA对B细胞的功能耗减
向C57BL/6J小鼠注射由脂质10b-15形成的LNP，所述LNP包封编码抗鼠CD19 CAR的环状RNA。作为对照，将包封编码萤火虫荧光素酶(f.Luc)的环状RNA的脂质10b-15注射到不同组的小鼠中。每隔一天向20-25g范围内的雌性C57BL.6J静脉内注射5个剂量的0.5mg/kgLNP。在注射之间，通过流式细胞术分析抽血的可固定活/死、CD45、TCRvb、B220、CD11b和抗鼠CAR。最后一次注射后两天，收集脾并进行流式细胞术分析。将脾细胞用可固定活/死、CD45、TCRvb、B220、CD11b、NK1.1、F4/80、CD11c和抗鼠CAR染色。将来自注射抗鼠CD19 CARLNP的小鼠的数据针对接受f.Luc LNP的小鼠归一化。
代表性数据呈现于图41A、41B和41C中，表明由用LNP体内递送的环状circRNA表达的抗小鼠CD19 CAR在体内鼠T细胞中是功能性的。
实施例48
与由mRNA表达相比，由环状RNA表达的CD19 CAR具有更高产率和更大细胞毒作用
将编码抗CD19嵌合抗原抗原受体的环状RNA电穿孔到人外周T细胞中以评估表面表达和CAR介导的细胞毒性，所述环状RNA从N末端至C末端包含FMC63来源的scFv、CD8跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ细胞内结构域。为了比较，在此实验中将环状RNA电穿孔的T细胞与mRNA电穿孔的T细胞进行了比较。对于电穿孔，使用来自供体人PBMC的市售T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)从人PBMC中分离CD3+T细胞。分离后，将T细胞用抗CD3/抗CD28(Stemcell Technologies)刺激，并在5天内在37℃下在含有10％FBS、IL-2(10ng/mL)和50uM BME的完全RPMI中扩增。刺激后五天，使用ThermoFisher的Neon转染系统用编码抗人CD19 CAR的环状RNA对T细胞进行电穿孔，然后静置过夜。对于细胞毒性测定，将电穿孔的T细胞与Fluc+靶细胞和非靶细胞以1:1的比例在含有10％FBS、IL-2(10ng/mL)和50uMBME的完全RPMI中共培养，并在37℃下孵育过夜。在共培养后24小时使用荧光素酶测定系统(Promega Brightglo荧光素酶系统)测量细胞毒性，以检测Fluc+靶细胞和非靶细胞的裂解。此外，取得电穿孔的T细胞的等分试样并在分析当天针对活死可固定染色、CD3、CD45和嵌合抗原受体(FMC63)进行染色。
代表性数据呈现于图42和43中。图42A和42B示出与由线性mRNA表达的抗人CD19CAR相比，由环状RNA表达的抗人CD19 CAR以更高水平和更长时间表达。图43A和43B示出相对于由线性mRNA表达的抗人CD19 CAR，由环状RNA表达的抗人CD19 CAR发挥更大的细胞毒性作用。
实施例49
来自单个环状RNA的两个CAR的功能表达
将编码嵌合抗原受体的环状RNA电穿孔到人外周T细胞中，以评估表面表达和CAR介导的细胞毒性。此研究的目的是评估编码两个CAR的环状RNA是否能够用2A(P2A)或IRES序列随机表达。对于电穿孔，CD3+T细胞是商购的(Cellero)并用抗CD3/抗CD28(StemcellTechnologies)刺激，并在5天内在37℃下在含有10％FBS、IL-2(10ng/mL)和50uM BME的完全RPMI中扩增。刺激后4天，使用ThermoFisher的Neon转染系统用编码抗人CD19 CAR、抗人CD19 CAR-2A-抗人BCMA CAR和抗人CD19 CAR-IRES-抗人BCMA CAR的环状RNA对T细胞进行电穿孔，然后静置过夜。对于细胞毒性测定，将电穿孔的T细胞与表达人CD19或BCMA抗原的Fluc+K562细胞以1:1的比例在含有10％FBS、IL-2(10ng/mL)和50uMBME的完全RPMI中共培养，并在37℃下孵育过夜。在共培养24小时后使用荧光素酶测定系统(Promega BrightGlo荧光素酶系统)测量细胞毒性，以检测Fluc+靶细胞的裂解。
代表性数据呈现于图44中，表明两个CAR可由同一环状RNA构建体功能性表达并发挥细胞毒性效应子功能。
实施例50
使用Cre报告小鼠进行体内环状RNA转染
如前所述，将编码Cre重组酶(Cre)的环状RNA包封到脂质纳米颗粒中。向雌性6-8周龄B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J(Ai9)小鼠静脉内给予0.5mg/kg RNA的脂质纳米颗粒。在Cre重组后，荧光tdTomato蛋白在Ai9小鼠中转录和翻译，这意味着环状RNA已被递送至tdTomato+细胞并在其中翻译。48小时后，将小鼠安乐死并收获脾，加工成单细胞悬液，并用各种荧光团缀合的抗体染色，以通过流式细胞术进行免疫表型分析。
图45A示出在用脂质10a-27或10a-26或脂质10b-15形成的LNP处理后，在各种脾免疫细胞(CD45+，活)亚群，包括总骨髓细胞(CD11b+)、B细胞(CD19+)和T细胞(TCR-B+)中tdTomato表达的频率的代表性FACS图。注射PBS的Ai9小鼠代表背景tdTomato荧光。图45B定量表达tdTomato的骨髓细胞、B细胞和T细胞的比例(平均值+标准偏差，n＝3)，这相当于已用Cre环状RNA成功转染的每个细胞群的比例。与脂质93-S14相比，用脂质10a-27和10a-26制成的LNP表现出显著更高的骨髓细胞和T细胞转染，从而突出显示由脂质结构修饰赋予的改进。
图45C示出在脂质10a-27和10a-26情况下表达tdTomato的另外脾免疫细胞群的比例(平均值+标准偏差，n＝3)，所述脾免疫细胞群还包括NK细胞(NKp46+，TCR-B-)、经典单核细胞(CD11b+、Ly-6G-、Ly-6C_hi)、非经典单核细胞(CD11b+、Ly-6G-、Ly-6C_lo)、嗜中性粒细胞(CD11b+、Ly-6G+)和树突细胞(CD11c+、MHC-II+)。这些实验证明，用脂质10a-27和10a-26以及脂质10b-15制成的LNP可有效地将环状RNA递送至小鼠中的许多脾免疫细胞亚群，并在这些细胞中产生来自环状RNA的成功蛋白质表达。
实施例51
实施例51A：内置多聚A序列和亲和纯化以产生免疫沉默环状RNA
将多聚A序列(20-30nt)插入RNA构建体(内含子中具有内置多聚A序列的前体RNA)的5'和3'端。前体RNA和内含子能够可替代地使用例如大肠杆菌多聚A聚合酶或酵母多聚A聚合酶进行转录后多腺苷酸化，其需要使用额外的酶。
将此实施例中的环状RNA通过体外转录(IVT)进行环化，并通过在市售oligo-dT树脂上洗涤进行亲和纯化，以从剪接反应中选择性地除去多聚A标记的序列(包括游离内含子和前体RNA)。IVT使用商业IVT试剂盒(New England Biolabs)或定制IVT混合物(OrnaTherapeutics)进行，含有不同比例的单磷酸鸟苷(GMP)和三磷酸鸟苷(GTP)(GMP:GTP＝8、12.5或13.75)。在一些实施例中，高GMP:GTP比率下的GMP可优选作为第一核苷酸包括在内，从而产生大部分单磷酸加帽的前体RNA。作为比较，环状RNA产物可替代地通过用Xrn1、Rna酶R和Dna酶I处理进行纯化(酶纯化)。
然后评估使用亲和纯化或酶纯化过程制备的环状RNA的免疫原性。简言之，将制备的环状RNA转染到A549细胞中。24小时后，裂解细胞并通过qPCR测量相对于模拟样品的干扰素β-1诱导。3p-hpRNA(一种三磷酸化的RNA)用作阳性对照。
图46B和46C示出，当多聚A序列包含于在剪接过程中被除去并存在于未剪接的前体分子中的元件上时，阴性选择亲和纯化从剪接反应中除去非环状产物。图46D示出用所测试的IVT条件和纯化方法制备的环状RNA都是免疫静止的。这些结果表明阴性选择亲和纯化等效于或优于用于环状RNA纯化的酶纯化，并且定制环状RNA合成条件(IVT条件)可减少对GMP过量的依赖以实现最大免疫静止。
实施例51B：用于环状RNA产生的专用结合位点和亲和纯化代替多聚A标签，可包括专门设计序列(DBS，专用结合位点)。
代替多聚A标签，专用结合位点(DBS)，如专门设计的可与树脂结合的互补寡核苷酸，可用于选择性地耗减前体RNA和游离内含子。在此实施例中，将DBS序列(30nt)插入前体RNA的5'和3'端。将RNA转录，并将转录产物在与树脂连接的定制互补寡核苷酸上洗涤。
图47B和47C证明，通过阴性亲和纯化，将设计的DBS序列包含于在剪接过程中除去的元件中能够在剪接反应中除去未剪接的前体RNA和游离内含子组分。
实施例51C：编码肌营养不良蛋白的环状RNA的产生
通过RNA前体的体外转录产生编码肌营养不良蛋白的12kb12,000nt环状RNA，然后使用Xrn1、DNA酶1和RNA酶R的混合物进行酶纯化，以降解剩余的线性组分。图48示出成功地产生了编码肌营养不良蛋白的环状RNA。
实施例52
3'内含子片段与IRES之间的5'间隔区改善环状RNA表达
比较了Jurkat细胞中在3'内含子片段与IRES之间具有不同5'间隔区的纯化circRNA的表达水平。简言之，在用250ng的每种RNA对60,000个细胞进行电穿孔后24小时测量来自上清液中分泌的高斯荧光素酶的发光。
此外，比较了Jurkat细胞中在3'内含子片段与IRES之间具有不同5'间隔区的纯化circRNA的稳定性。简言之，在用250ng的每种RNA对60,000个细胞进行电穿孔后2天内测量来自上清液中分泌的高斯荧光素酶的发光，并针对第1天表达归一化。
结果显示在图49A和49B中，表明添加间隔区可增强IRES功能以及添加的间隔区的序列同一性和长度的重要性。一种可能的解释是，间隔区是在IRES之前添加的，并且可能通过允许IRES与其他结构化元件(如内含子片段)隔离折叠来发挥作用。
实施例53
此实施例描述来自山羊嵴病毒IRES的5'或3'端的缺失扫描。IRES边界通常较差表征并且需要经验分析，并且此实施例可用于定位驱动翻译所需的核心功能序列。简言之，用可操作地连接至高斯荧光素酶编码序列的截短IRES元件产生环状RNA构建体。截短的IRES元件从5'或3'端除去指定长度的核苷酸序列。在用RNA对原代人T细胞进行电穿孔后24和48小时测量上清液中分泌的高斯荧光素酶的发光。表达稳定性被计算为48小时时间点的表达水平相对于24小时时间点的表达水平的比率。
如图50所示，从IRES的5'端缺失超过40个核苷酸降低了表达并破坏了IRES功能。表达的稳定性相对不受IRES元件截短的影响，但表达水平因从IRES的3'端缺失141个核苷酸的而显著降低，而从3'端缺失57或122个核苷酸对表达水平具有积极影响。
还观察到起始序列前6核苷酸的缺失降低了荧光素酶报告基因的表达水平。用经典kozak序列(GCCACC)替代6核苷酸序列没有显著影响，但至少维持了表达。
实施例54
此实施例描述选定IRES序列，包括山羊嵴病毒(CKV)IRES、Parabovirus IRES、姬鼠小核糖核酸病毒(AP)IRES、嵴病毒SZAL6IRES、Crohivirus B(CrVB)IRES、CVB3 IRES和SAFV IRES的修饰(例如，截短)。IRES元件的序列提供在SEQ ID NO:348-389中。简言之，用可操作地连接至高斯荧光素酶编码序列的截短IRES元件产生环状RNA构建体。用环状RNA转染HepG2细胞。在转染后24和48小时评估上清液中的发光。表达稳定性被计算为48小时时间点的表达水平相对于24小时时间点的表达水平的比率。
如图51所示，截短取决于IRES的身份具有可变影响，这可能取决于起始机制和用于翻译的蛋白质因子，这在IRES之间通常不同。例如，在CKV IRES的背景下，可有效地组合5'和3'缺失。在一些情况下添加规范Kozak序列显著改善了表达(如在SAFV中，Full对比Full+K)或减少了表达(如在CKV中，5d40/3d122对比5d40/3d122+K)。
实施例55
此实施例描述CK-739、AP-748和PV-743IRES序列的修饰，包括突变替代翻译起始位点。简言之，用可操作地连接至高斯荧光素酶编码序列的经修饰的IRES元件产生环状RNA构建体。在用RNA转染1C1C7细胞后24和48小时测量上清液中分泌的高斯荧光素酶的发光。
CUG是最常见的替代起始位点，但也表征了许多其他替代起始位点。这些三联体可存在于起始密码子之前的IRES扫描束中，并且可影响正确多肽的翻译。产生了四个替代起始位点突变，IRES序列提供于SEQ ID NO:378-380中。如图52所示，CK-739IRES中替代翻译起始位点的突变影响正确多肽的翻译，在一些情况下是积极的，并且在其他情况下是消极的。所有替代翻译起始位点的突变降低了翻译水平。
起始密码子之前6个核苷酸的替代Kozak序列也可影响表达水平。在CK-739IRES和“6nt起始前”组的样品编号1-5中，起始密码子上游的6个核苷酸的序列分别是gTcacG、aaagtc、gTcacG、gtcatg、gcaaac和acaacc。如图52所示，取代起始密码子之前的某些6核苷酸序列影响翻译。
还观察到AP-748和PV-743IRES序列中的5'和3'末端缺失降低了表达。然而，在具有长扫描束的CK-739IRES中，翻译相对不受扫描束中的缺失影响。
实施例56
此实施例描述通过插入5'和/或3'非翻译区(UTR)并产生IRES杂合体来修饰选定IRES序列。简言之，用可操作地连接至高斯荧光素酶编码序列的经修饰的IRES元件产生环状RNA构建体。在用RNA转染HepG2细胞后24和48小时测量上清液中分泌的高斯荧光素酶的发光。
具有插入的UTR的IRES序列提供于SEQ ID NO:390-401中。如图53所示，在IRES的3'端之后和起始密码子之前插入5'UTR略微增加了山羊嵴病毒(CK)IRES的翻译，但在一些情况下消除了萨力病毒SZ1 IRES的翻译。在终止盒之后插入3'UTR对两个IRES序列没有影响。
杂合CK IRES序列提供于SEQ ID NO:390-401中。CK IRES用作碱基，并且CK IRES的特定区域被来自其他IRES序列的相似结构，例如SZ1和AV(爱知病毒)替代。如图53所示，某些杂合合成IRES序列是功能性的，表明可使用来自不同IRES序列的部分构建杂合IRES，所述IRES序列显示相似的预测结构，而缺失除这些结构会完全消除IRES功能。
实施例57
此实施例描述通过引入终止密码子或盒变体来修饰环状RNA。简言之，产生了具有可操作地连接至高斯荧光素酶编码序列、随后可变终止密码子盒的IRES元件的环状RNA构建体，其包括每个框架中的终止密码子和高斯荧光素酶编码序列的阅读框架中的两个终止密码子。用环状RNA转染1C1C7细胞。在转染后24和48小时评估上清液中的发光。
终止密码子盒的序列列于SEQ ID NO:406-412中。如图54所示，某些终止密码子盒提高了表达水平，尽管它们对表达稳定性几乎没有影响。特别地，具有两个框架1(高斯荧光素酶编码序列的阅读框)终止密码子，第一个是TAA、随后是框架2终止密码子和框架3终止密码子的终止盒对于促进功能性翻译是有效的。
实施例58
此实施例描述通过插入5'UTR变体对环状RNA的修饰。简言之，产生了具有在IRES的3'端与起始密码子之间插入了5'UTR变体的IRES元件的环状RNA构建体，IRES可操作地连接至高斯荧光素酶编码序列。用环状RNA转染1C1C7细胞。在转染后24和48小时评估上清液中的发光。
5’UTR变体的序列列于SEQ ID NO:402-405中。如图55所示，当添加36个核苷酸的非结构化/低GC间隔区序列(UTR2)时，具有规范Kozak序列(UTR4)的CK IRES更有效，表明富含GC的Kozak序列可干扰核心IRES折叠。使用具有kozak序列的更高GC/结构化间隔区未显示出相同的益处(UTR3)，可能是由于间隔区本身对IRES折叠的干扰。将kozak序列突变为gTcacG(UTR1)使翻译增强至与Kozak+spacer替代方案相同的水平，而无需间隔区。
实施例59
此实施例描述环状RNA中的miRNA靶位点对表达水平的影响。简言之，产生了具有与人促红细胞生成素(hEPO)编码序列可操作地连接的IRES元件的环状RNA构建体，其中将2个串联miR-122靶位点插入所述构建体中。用环状RNA转染表达miR-122的Huh7细胞。在转染后24和48小时通过夹心ELISA评估上清液中的hEPO表达。
如图56所示，当miR-122靶位点插入环状RNA时，hEPO表达水平被消除。此结果表明可通过miRNA调控来自环状RNA的表达。因此，细胞类型或组织特异性表达可通过并入在重组蛋白表达不合乎需要的细胞类型中表达的miRNA的靶位点来实现。
实施例60
此实施例显示在体外通过LNP转染人肿瘤细胞。SupT1细胞(人T细胞肿瘤系)和MV4-11细胞(人巨噬细胞肿瘤系)分别以100,000个细胞/孔和100,000个细胞/孔涂铺于96孔板中过夜。然后，以200ng RNA/孔将含有编码萤火虫荧光素酶(FLuc)的circRNA的LNP添加至细胞中。24小时孵育后，根据制造商的说明，使用Bright-Glo荧光素酶测定系统(Promega)定量发光，并减去来自未用LNP处理的细胞的背景发光。图57定量测量到的萤火虫发光，表明包含脂质10a-27(10a-27(4.5D)LNP，参见实施例70)或脂质10a-26(10a-26(4.5D)LNP，参见实施例70)的LNP可在体外在人T细胞和巨噬细胞肿瘤系两者中转染和表达circRNA。与10a-26(4.5D)LNP相比，10a-27(4.5D)LNP产生更高发光，从而表明LNP转染人肿瘤细胞的水平可受制剂的影响。
实施例61
此实施例显示在体外转染原代人激活的T细胞。用aCD3/aCD28刺激来自独立供体的原代人T细胞，并允许在人血清和IL-2存在下增殖6天。然后，将100,000个细胞涂铺于96孔板中，并以200ng RNA/孔向细胞中添加含有编码萤火虫荧光素酶(FLuc)的circRNA的LNP，含或不含载脂蛋白E3(ApoE3)。24小时孵育后，根据制造商的说明，使用Bright-Glo荧光素酶测定系统(Promega)定量发光，并减去来自未用LNP处理的细胞的背景发光。图58示出在4个独立供体之中测量到的萤火虫发光，从而表明所有测试的LNP都在体外转染原代人T细胞。含有脂质10a-27的LNP通常比含有脂质10a-26的LNP产生更高的发光。此外，与10a-27(4.5D)和10a-26(4.5D)(分别3.1倍和2.6倍)相比，添加ApoE3通常使10a-27(5.7A)和10a-26(5.7A)的荧光素酶表达增加更多(在4个供体之中分别平均4.4倍和9.3倍)。这表明辅助脂质、PEG脂质和可电离脂质:磷酸酯比率都有助于用相同的可电离脂质制成的不同制剂的ApoE依赖性。(关于LNP配制程序，例如对于10a-27(5.7A)、10a-26(5.7A)、10a-27(4.5D)和10a-26(4.5D)LNP，参见实施例70)
实施例62
此实施例表明LNP的不同尾部化学导致不同的进入T细胞的摄取机制。为了定量表达circRNA的人T细胞的百分比，在有或没有ApoE3的情况下将含有eGFP circRNA的LNP以200ng RNA/孔添加至激活的人原代T细胞(如以上实施例61中所述)中。24小时孵育后，通过流式细胞术分析细胞，并定量活的GFP+T细胞的百分比。图59图示2个独立供体的GFP+T细胞百分比，其中对于含有脂质10a-27的LNP(10a-27(4.5D)LNP，参见实施例70)和对于含有来自脂质10a-46的LNP(10a-46(5.7A)LNP，参见实施例70)，5％-10％的细胞为GFP+。虽然ApoE3添加导致10a-27(4.5D)LNP的转染增加，但它似乎没有增加10a-46(5.7A)LNP的转染，从而表明脂质10a-27与10a-46之间的不同尾部化学可能介导不同的进入T细胞的摄取机制。
实施例63
此实施例描述Cre报告基因小鼠模型中Cre的免疫细胞表达。
将Ai9小鼠(B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J，雌性，6-8周龄，n＝3只/组)静脉内注射0.5mg/kg Cre circRNA LNP或PBS。在Cre重组后，Ai9小鼠转录和翻译荧光报告基因tdTomato；这意味着为tdTomato+的细胞已经用Cre circRNA成功转染。48小时后，将小鼠安乐死，并收集它们的脾脏且人工加工成单细胞悬浮液。将脾细胞针对死亡细胞(LiveDead Fixable Aqua,Thermo)和用抗小鼠抗体(TCR-B链，BV421，H57-597；CD45，BV711，30-F11；CD11b，BV785，ICRF44；NKp46，AF647，29A1.4；CD19，APC/750，6D5；TruStainFcX，93；所有抗体都来自Biolegend)以1:200比率染色。使用Attune Nxt流式细胞仪(Thermo)进行流式细胞术。
tdTomato+细胞在脾骨髓细胞(CD11b+)、B细胞(CD19+)和T细胞(TCR-B+)中的百分比呈现于图60中。脂质10a-27和脂质10a-46的区别仅在于它们的尾部化学，并且与用脂质10a-46制成的制剂相比，用脂质10a-27制成的制剂转染显著更多的脾免疫细胞。此外，与用Cre线性mRNA配制的那些相比，用Cre circRNA配制的10a-27(4.5D)LNP(参见实施例70)转染的T细胞数量大约两倍多的T细胞，从而表明与线性mRNA相比，circRNA可导致脾T细胞中改善的蛋白表达。
表17.LNP的表征
制剂 Z平均值(nm) PDI RNA包封效率(％)
10a-27(4.5D)，研究1 65 0.07 96
10a-26(4.5D)，研究1 74 0.06 94
10a-27(4.5D)，使用mCre，研究1 75 0.05 93
10a-46(5.7A)，研究2 86 0.01 94
实施例64
此实施例显示野生型小鼠中mOX40L circRNA的免疫细胞表达。
将C57BL/6小鼠(雌性，6-8周龄，n＝3或4只/组)静脉内注射0.5mg/kg mOX40LcircRNA LNP或PBS。24小时后，将小鼠安乐死，并收集它们的脾脏且人工加工成单细胞悬浮液。将脾细胞针对死亡细胞(LiveDead Fixable Aqua,Thermo)和用抗小鼠抗体(TCR-B链，PacBlue，H57-597；CD11b，FITC，ICRF44；B220，PE，RA3-6B2；CD45，PerCP，30-F11；mOX40L，AF647，RM134L；NK1.1，APC/750，PK136；TruStain FcX，93；所有抗体都来自Biolegend)以1:200染色。使用Attune NxT流式细胞仪(Thermo)进行流式细胞术。
mOX40L+细胞在脾骨髓细胞(CD11b+)、T细胞(TCR-B+)和NK细胞(NK1.1+)中的百分比呈现于图61中。值得注意的是，在不同缓冲液(低渗PBS、等渗PBS和等渗TBS)中静脉内注射的相同制剂之间观察到显著不同的转染效率。低渗PBS中的10a-27 4.5D LNP导致脾脏中大约14％骨髓细胞转染，6％T细胞转染和21％ NK细胞转染。在等渗缓冲液中注射的制剂中，10a-27DSPC 5.7A LNP显示脾脏中骨髓细胞、T细胞和NK细胞转染(分别为9％、3％和8％)。(关于LNP配制程序，例如对于10a-27(4.5D)LNP和10a-27DSPC(5.7A)LNP，参见实施例70)
表18.LNP的表征
制剂 Z平均值(nm) PDI RNA包封效率(％)
10a-27(4.5D) 63 0.02 93
10a-26(4.5D) 67 0.07 94
10a-27DSPC(5.7A) 82 0.05 96
实施例65
此实施例显示野生型小鼠中mOX40L circRNA-LNP的单剂量递增。
将57BL/6小鼠(雌性，6-8周龄，n＝3只/组)静脉内注射1mg/kg或3mg/kg mOX40LcircRNA LNP或缓冲液对照。24小时后，将小鼠安乐死，并收集它们的脾脏且人工加工成单细胞悬浮液。将脾细胞针对死亡细胞(LiveDead Fixable Blue,Thermo)染色并用抗小鼠抗体(TCR-B链，BV421，H57-597；CD19，BV605，6D5；CD45，BV711，30-F11；CD11b，BV785，ICRF44；CD11c，FITC，N418；CD8a，PerCP，53-6.7；mOX40L，PE，RM134L；NKp46，AF647，29A1.4；CD4，APC/750，GK1.5；TruStain FcX，93；所有抗体都来自Biolegend)以1:200染色。使用BDFACSSymphony流式细胞仪(cytometer)进行流式细胞术。
脾T细胞(所有TCR-B+)、CD4+T细胞(TCR-B+，CD4+)、CD8+T细胞(TCR-B+，CD8a+)、B细胞(CD19+)、NK细胞(NKp46+)、树突细胞(CD11c+)和其它骨髓细胞(CD11b+，CD11c-)中mOX40L+细胞的百分比示于图62A和图62B中，其中24小时后的相应小鼠重量变化示于图62C中。对于所有组在1mg/kg和3mg/kg中观察到免疫细胞亚群转染的剂量依赖性增加，10a-27(4.5D)LNP 1x PBS组除外。在3mg/kg剂量下，三种不同的LNP(TBS中的10a-27(4.5D)、PBS中的10a-26(4.5D)和TBS中的10a-27DSPC(5.7A)；关于配制程序，参见实施例70)在脾T细胞中实现10％-20％mOX40L转染，在CD4+和CD8+亚群中观察到相似的转染率。这三种制剂还在3mg/kg下在脾脏中产生大约20％B细胞、60％-70％树突细胞、60％-70％NK细胞和30％-40％其它骨髓细胞mOX40L转染。这三种制剂在3mg/kg单剂量下在24小时仅导致轻微(0％-3％)小鼠体重减轻，没有报告的临床观察结果
表19 LNP的表征
制剂 Z平均值(nm) PDI RNA包封效率(％)
10a-27(4.5D) 76 0.06 91
10a-26(4.5D) 67 0.01 88
10a-27DSPC(5.7A) 77 0.01 93
实施例66
此实施例显示小鼠中circRNA-LNP CAR介导的B细胞耗减。
将C57BL/6小鼠(雌性，6-8周龄，n＝5只/组)在第0、2、5、7和9天静脉内注射0.5mg/kg aCD19-CAR circRNA LNP或对照FLuc circRNA LNP。在第-1、1、8和12天，进行下颌下放血以收集血液。将30uL的血液用ACK裂解缓冲液裂解，并用MACS缓冲液洗涤以分离免疫细胞。在第12天，将小鼠安乐死，并收集它们的脾脏且人工加工成单细胞悬浮液。为了评估B细胞在血液和脾脏中的频率，将这些单细胞悬浮液针对死亡细胞(LiveDead Fixable Aqua,Thermo)染色，并用抗小鼠抗体(TCR-B链，PacBlue，H57-597；CD11b，FITC，ICRF44；B220，PE，RA3-6B2；CD45，PerCP，30-F11；TruStain FcX，93；所有抗体都来自Biolegend)以1:200染色。使用Attune NxT流式细胞仪(Thermo)进行流式细胞术。
图63A定量此研究中观察到的B细胞耗减，如由活的CD45+免疫细胞中B220+B细胞的百分比所定义。在第8天和第12天(对于血液)和第12天(对于脾脏)将aCD19-CAR circRNALNP组中的B细胞耗减与其对应FLuc circRNA LNP对照组进行比较。在血液中，与FLuc对照相比，aCD19-CAR 10a-27(4.5D)和10a-26(4.5D)LNP在第8天分别导致活CD45+中B220+％的大约28％和17％下降。在脾脏中，与FLuc对照相比，aCD19-CAR 10a-27(4.5D)和10a-26(4.5D)LNP在第12天导致活CD45+的B220+％的大约5％和9％下降，如图63B所示。总之，这些结果表明，CAR介导的B细胞耗减发生在用脂质10a-27(4.5D)和脂质10a-26(4.5D)的aCD19-CAR circRNA LNP处理的小鼠中。
此外，图63C示出此研究中小鼠的体重增加百分比。10a-27 4.5D或10a-26 4.5DLNP处理的小鼠(9天内5x0.5mg/kg)不存在显著平均体重减轻，从而表明在此剂量和时间表下，这些LNP在小鼠中可具有良好耐受性。
表20 LNP的表征
制剂 Z平均值(nm) PDI RNA包封效率(％)
10a-27(4.5D)，oLuc 65 0.03 93
10a-27(4.5D)，oaCD19-CAR 74 0.02 96
10a-26(4.5D)，oLuc 71 0.04 91
10a-26,(4.5D)，oaCD19-CAR 71 0.04 93
实施例67
含有抗CD19 CAR的LNP和环状RNA构建体减少体内血液和脾脏中的B细胞。
如上所述，将编码抗CD19 CAR表达的环状RNA包封在脂质纳米颗粒中。作为比较，将编码荧光素酶表达的环状RNA包封在单独脂质纳米颗粒中。
将6至8周龄的C57BL/6小鼠每隔一天注射任一LNP溶液，每只小鼠共计4次LNP注射。最后一次LNP注射后24小时，收获小鼠脾脏和血液，染色并通过流式细胞术进行分析。如图64A和图64B所示，与用编码荧光素酶的LNP-环状RNA处理的小鼠相比，含有编码抗CD19CAR的LNP-环状RNA构建体的小鼠导致外周血和脾脏中CD19+B细胞的显著减少。
实施例68
在编码CAR的环状RNA中包含的IRES序列改善CAR表达和T细胞的细胞毒性。
用200ng含有独特IRES和小鼠抗CD19 1D3ζCAR表达序列的环状RNA构建体电穿孔激活的鼠T细胞。这些构建体中包含的IRES全部或部分来源于山羊嵴病毒、姬鼠小核糖核酸病毒、Parabovirus或萨力病毒。另外对山羊嵴病毒来源的IRES进行了密码子优化。作为对照，使用含有野生型ζ小鼠CAR、但不含IRES的环状RNA用于比较。电穿孔后24小时，将T细胞针对CD-19CAR染色，以评价其表面表达，然后与A20 Fluc靶细胞共培养。然后，在T细胞与靶细胞共培养24小时后，评价所述测定的Fluc+A20细胞的细胞毒性杀伤。
如图65A、65B、65C和66中观察到，独特IRES能够增加T细胞表达CAR蛋白的频率和细胞表面上CAR表达的水平。CAR蛋白的表达频率和细胞表面上CAR表达水平的增加导致改善的抗肿瘤应答。
实施例69
在原代人T细胞中，由环状RNA构建体表达的胞质蛋白和表面蛋白。
环状RNA构建体含有编码荧光胞质报告基因或表面抗原报告基因的序列。荧光报告基因包括绿色荧光蛋白、mCitrine、mWasabi、Tsapphire。表面报告基因包括CD52和Thy1.1bio。用抗CD3/抗CD28抗体激活原代人T细胞，并在含有报告基因序列的环状RNA激活后6天电穿孔。电穿孔后24小时收获T细胞，并通过流式细胞术进行分析。将表面抗原用市售抗体(例如，Biolegend,Miltenyi和BD)进行染色。
如图67A和图67B所示，可在原代人T细胞中由编码胞质蛋白和表面蛋白的环状RNA表达所述蛋白质。
实施例70
含有独特IRES序列的环状RNA具有相对于线性mRNA改善的翻译表达。
环状RNA构建体含有独特IRES和萤火虫荧光素酶(FLuc)的表达序列。
将来自2个供体的人T细胞富集并用抗CD3/抗CD28抗体刺激。增殖数天后，收获激活的T细胞，并用等摩尔的表达FLuc有效载荷的mRNA或环状RNA电穿孔。研究了各种IRES序列，包括来自山羊嵴病毒、姬鼠小核糖核酸病毒和Parabovirus的IRES序列，以评价7天内有效载荷表达的表达水平和持久性。在7天内，用Promega Brightglo裂解T细胞以评价其生物荧光。
如图68C、68D、68E、68F和68G所示，环状RNA中IRES的存在可使胞质蛋白的翻译和表达增加多个数量级，并且与线性mRNA相比可改善表达。这在多个人T细胞供体中是一致的。
实施例71
实施例71A：编码抗CD19的LNP-环状RNA介导人T细胞对K562细胞的杀伤。
环状RNA构建体含有编码抗CD19抗体的序列。然后将环状RNA构建体包封在脂质纳米颗粒(LNP)中。
用抗CD3/抗CD28刺激人T细胞，并使其增殖至多6天。在第6天，将LNP-环状RNA和ApoE3(1μg/mL)与T细胞共培养以介导转染。24小时后，将Fluc+K562细胞用200ng编码抗CD19抗体的环状RNA电穿孔，并稍后在第7天共培养。共培养48小时后，评估所述测定的CAR表达和通过Fluc表达对K562细胞的细胞毒性杀伤。
如图69A和图69B所示，存在来自体外LNP介导的CAR递送至T细胞的抗CD19 CAR的T细胞表达，以及其在工程化的K562细胞中以特异性抗原依赖型方式裂解肿瘤细胞的能力。
实施例71B：编码抗BCMA抗体的LNP-环状RNA介导人T细胞对K562细胞的杀伤。
环状RNA构建体含有编码抗BCMA抗体的序列。然后将环状RNA构建体包封在脂质纳米颗粒(LNP)中。
用抗CD3/抗CD28刺激人T细胞，并使其增殖至多6天。在第6天，将LNP-环状RNA和ApoE3(1μg/mL)与T细胞共培养以介导转染。24小时后，将Fluc+K562细胞用200ng编码抗BCMA抗体的环状RNA电穿孔，并稍后在第7天共培养。共培养48小时后，评估所述测定的CAR表达和通过Fluc表达对K562细胞的细胞毒性杀伤。
如图69B所示，存在来自体外LNP介导的CAR递送至T细胞的BCMA CAR的T细胞表达，以及其在工程化的K562细胞中以特异性抗原依赖型方式裂解肿瘤细胞的能力。
实施例72
抗CD19 CAR T细胞在体外表现出抗肿瘤活性。
将人T细胞用抗CD3/抗CD28激活，并用200ng的表达抗CD19CAR的环状RNA电穿孔一次。将电穿孔的T细胞与FLuc+Nalm6靶细胞和非靶细胞FLuc+K562共培养，以评价CAR介导的杀伤。共培养24小时后，将T细胞裂解，并检查靶细胞和非靶细胞的剩余FLuc表达，以评价总计8天内的表达和表达的稳定性。
如图70A和70B所示，T细胞以特异性抗原依赖性方式表达环状RNA CAR构建体。结果还显示了与编码CAR的线性mRNA相比，编码CAR的环状RNA的改善的细胞毒性和功能性表面受体的递送。
实施例73
用ApoE3介导的环状RNA的有效LNP转染
用抗CD3/抗CD28刺激人T细胞，并使其增殖至多6天。在第6天，将脂质纳米颗粒(LNP)和表达绿色荧光蛋白的环状RNA溶液(含或不含ApoE3)与T细胞共培养(1μg/mL)。24小时后，将T细胞针对活/死T细胞染色，并在流式细胞仪上分析活T细胞的GFP表达。
如图71A、71B、71C、72D和71E所示，可在激活的T细胞上通过ApoE3介导有效LNP转染，然后是显著有效载荷表达。这些结果在多个供体中得到证实。
实施例74
实施例74A：脂质纳米颗粒配制程序
Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd,Malvern,Worcestershire,UK)可用于测定转移媒介物组合物的粒度、多分散性指数(PDI)和ζ电位，在1×PBS中测定粒度并且在15mM PBS中测定ζ电位。
紫外-可见光谱法可用于测定转移媒介物组合物中治疗剂和/或预防剂(例如RNA)的浓度。将100μL在1×PBS中的稀释制剂添加至900μL的甲醇与氯仿的4:1(v/v)混合物中。在混合后，例如在DU 800分光光度计(Beckman Coulter,Beckman Coulter,Inc.,Brea,CA)上在230nm与330nm之间记录溶液的吸收光谱。可基于转移媒介物组合物中使用的治疗剂和/或预防剂的消光系数以及在例如260nm波长处的吸光度与在例如330nm波长处的基线值之间的差异来计算所述组合物中的治疗剂和/或预防剂的浓度。
对于包含RNA的转移媒介物组合物，可使用QUANT-ITTM
Figure GDA0004216226410002271
RNA测定(Invitrogen Corporation Carlsbad,CA)来评价转移媒介物组合物对RNA的包封。将样品在TE缓冲溶液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 7.5)中稀释至大约5μg/mL或1μg/mL的浓度。将50μL的稀释样品转移至聚苯乙烯96孔板，并且将50μL的TE缓冲液或50μL的2％-4％Triton X-100溶液添加至孔中。将板在37℃的温度下孵育15分钟。将/>
Figure GDA0004216226410002272
试剂在TE缓冲液中1:100或1:200稀释，并且将100μL的此溶液添加至每个孔中。可使用荧光平板读取器(Wallac Victor 1420 Multilablel Counter；Perkin Elmer,Waltham,MA)在例如约480nm的激发波长和例如约520nm的发射波长下测量荧光强度。从每个样品的荧光值中减去试剂空白的荧光值，并且通过用完整样品(没有添加Triton X-100)的荧光强度除以分解样品(通过添加Triton X-100造成)的荧光值来确定游离RNA的百分比。
实施例74B：62:4:33:1的可电离脂质:DOPE:胆固醇:DSPE-PEG(2000)配制比的RNA包封、总通量和体外表达百分比。
脂质纳米颗粒使用脂质10a-27、10a-26、10a-46或10a-45以62:4:33:1mol％的可电离脂质:DOPE:胆固醇:DSPE-PEG(2000)配制比配制，并以4.5的脂质-氮与磷酸酯比率(N:P)包封RNA分子。RNA表达存在于所有制剂中。如分别图72A和72B所示，在脾脏内存在更大的总通量和表达百分比。
Figure GDA0004216226410002273
/>
Figure GDA0004216226410002281
实施例74C：50:10:38.5:1.5的可电离脂质:DOPE:胆固醇:DMG-PEG(2000)配制比的RNA包封、总通量和体外表达百分比。
脂质纳米颗粒使用脂质10a-46或10a-45以50:10:38.5:1.5mol％的可电离脂质:DOPE:胆固醇:DMG-PEG(2000)配制比配制，并以5.7的脂质-氮与磷酸酯比率(N:P)包封RNA分子。RNA表达存在于所有制剂中。如分别图72C和72D所示，在脾脏内存在更大的总通量和表达百分比。
Figure GDA0004216226410002282
实施例74D：50:10:38.5:1.5的可电离脂质:DOPE:胆固醇:DMG-PEG(2000)配制比或35:16:46.2.5的可电离脂质:DSPC:胆固醇:C14-PEG(2000)配制比的RNA包封、总通量和体外表达百分比。
脂质纳米颗粒使用脂质10a-45或10a-46以50:10:38.5:1.5mol％的可电离脂质:DOPE:胆固醇:DMG-PEG(2000)配制比或35:16:46.2.5mol％的可电离脂质:DSPC:胆固醇:C14-PEG(2000)配制比配制，并以5.7或4.5的脂质-氮与磷酸酯比率(N:P)包封RNA分子。RNA表达存在于所有制剂中。如分别图72E和72F所示，在脾脏内存在更大的总通量和表达百分比。
Figure GDA0004216226410002283
Figure GDA0004216226410002291
实施例74E：62:4:33:1的可电离脂质:DOPE:胆固醇:DSPE-PEG(2000)配制比或50:10:38.5:1.5的可电离脂质:DSPC:胆固醇:DMG-PEG(2000)配制比的RNA包封、总通量和体外表达百分比。
脂质纳米颗粒使用脂质10a-26或10a-27以62:4:33:1mol％的可电离脂质:DOPE:胆固醇:DSPE-PEG(2000)配制比(以4.5的N:P比率包封RNA分子)或50:10:38.5:1.5mol％的可电离脂质:DSPC:胆固醇:DMG-PEG(2000)配制比(以5.7的N:P比率包封RNA分子)配制。RNA表达存在于所有制剂中。如分别图72G和72H所示，在脾脏内存在更大的总通量和表达百分比。
Figure GDA0004216226410002292
实施例74F：50:10:38.5:1.5的可电离脂质:DOPE:胆固醇:DMG-PEG(2000)配制比的RNA包封、总通量和体外表达百分比。
脂质纳米颗粒使用脂质10a-26、10a-27或10a-130和/或脂质3-III-1(由
Figure GDA0004216226410002301
表示)以50:10:38.5:1.5mol％的可电离脂质:DSPC:胆固醇:DMG-PEG(2000)配制比配制，并以5.7的N:P比率包封RNA分子。RNA表达存在于所有制剂中。如分别图72I和72J所示，在肝脏内存在更大的总通量和表达百分比。
还计算了TNS和颗粒的pKa。将5μL的60μg/mL 2-(对甲苯胺基)萘-6-磺酸(TNS)和5μL的30μg RNA/mL脂质纳米颗粒添加至具有pH 2-12范围内的HEPES缓冲液的孔中。然后将混合物在室温下振荡5分钟，并使用板读取器读取荧光(激发322nm，发射431nm)。计算荧光信号的拐点以确定颗粒的pKa。
Figure GDA0004216226410002302
实施例74G：62:4:33:1的可电离脂质:DOPE:胆固醇:DSPE-PEG(2000)配制比或50:10:38.5:1.5的可电离脂质:DSPC:胆固醇:DMG-PEG(2000)配制比的RNA包封、总通量和体外表达百分比。
脂质纳米颗粒使用脂质10a-139以62:4:33:1mol％的可电离脂质:DOPE:胆固醇:DSPE-PEG(2000)配制比(以4.5的N:P比率包封RNA分子)或50:10:38.5:1.5mol％的可电离脂质:DOPE:胆固醇:DMG-PEG(2000)配制比(以5.7的N:P比率包封RNA分子)配制。RNA表达存在于所有制剂中。如分别图72K和72L所示，在肝脏内存在更大的总通量和表达百分比。
Figure GDA0004216226410002311
实施例75
此实施例说明体外SARS-CoV2刺突蛋白表达的表达。使用MessengerMax转染试剂将编码SARS-CoV2稳定刺突蛋白的环状RNA转染到293细胞中。转染24小时后，用CR3022抗刺突蛋白第一抗体和APC标记的第二抗体对293细胞进行染色。
图73A示出由体外转录反应产生的大约4.5kb的编码SARS-Cov2稳定刺突蛋白的RNA的环化效率。图73B和图73C示出用MessengerMax转染试剂进行环状RNA转染后，相对于模拟转染的细胞，293细胞上的SARS-CoV2稳定刺突蛋白表达。
图77A和图77B示出使用MessengerMax转染试剂转染一组含有可变IRES序列、密码子优化的编码区和稳定SARS-CoV2刺突蛋白的环状RNA后，293细胞上的SARS-CoV2稳定刺突蛋白表达(按细胞百分比和gMFI计)。图77C示出MFI与百分比之间的关系。
实施例76
此实施例显示在静脉内注射0.2mg/kg包封在脂质纳米颗粒中的circRNA制剂后的体内细胞因子应答。用作为前体RNA引发剂的GTP和剪接核苷酸合成的circRNA剪接反应由于在剪接反应中存在三磷酸化5'端而与纯化的circRNA和线性m1ψ-mRNA相比激发了更大的细胞因子应答。测量在静脉内注射LNP配制的circRNA制剂后6小时抽取的血液中IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12p70、RANTES、TNFα的水平。注射PBS的小鼠用作对照。
如图74中所观察到，用作为前体RNA引发剂的GTP和剪接核苷酸合成的circRNA剪接反应由于在剪接反应中存在三磷酸化5'端而与纯化的circRNA和线性m1ψ-mRNA相比激发更大的细胞因子应答。
实施例77
此实施例说明不同剂量的含有环状RNA的脂质纳米颗粒的肌内递送。向小鼠给予0.1μg、1μg或10μg的在脂质纳米颗粒中配制的circRNA。注射荧光素后6小时进行全身IVIS成像(图75A和图75B)。在24小时进行离体IVIS成像。肝脏、股四头肌和腓肠的通量值在图75C中示出。图76B和图76C示出环状RNA的表达存在于小鼠的肌肉组织中。
实施例78
此实施例说明LNP制剂中多个环状RNA的表达。编码hEPO或fLuc的环状RNA构建体以单个和混合组LNP给药。测定血清中的hEPO浓度(图76A)和IVIS成像的总通量(图76B)。结果表明，单独配制或共同配制的环状RNA hEPO或fLuc构建体有效地表达蛋白质。
以引用的方式并入
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Claims (144)

1.一种环状RNA多核苷酸，其按以下顺序包含，
a.3'I组内含子片段，
b.内部核糖体进入位点(IRES)，
c.编码一种或多种抗原、佐剂、抗原样或佐剂样多肽或其片段的表达序列，以及
d.5'I组内含子片段。
2.一种环状RNA多核苷酸，其按以下顺序包含，
a.3'I组内含子片段，
b.内部核糖体进入位点(IRES)，
c.非编码表达序列，以及
d.5'I组内含子片段。
3.一种由载体的转录产生的环状RNA多核苷酸，所述载体按以下顺序包含，
a.5'双链体形成区，
b.3'I组内含子片段，
c.内部核糖体进入位点(IRES)，
d.编码一种或多种抗原、佐剂、抗原样或佐剂样多肽或其片段的表达序列，
e.5'I组内含子片段，以及
f.3'双链体形成区。
4.一种由载体的转录产生的环状RNA多核苷酸，所述载体按以下顺序包含，
a.5'双链体形成区，
b.3'I组内含子片段，
c.内部核糖体进入位点(IRES)，
d.非编码表达序列，
e.5'I组内含子片段，以及
f.3'双链体形成区。
5.如权利要求3或4所述的环状RNA多核苷酸，其包含位于所述5'双链体形成区与所述3'I组内含子片段之间的第一间隔区，以及位于所述5'I组内含子片段与所述3'双链体形成区之间的第二间隔区。
6.如权利要求5所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一间隔区和所述第二间隔区各自具有约10至约60个核苷酸的长度。
7.如权利要求3-6中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一双链体形成区和所述第二双链体形成区各自具有约9至19个核苷酸的长度。
8.如权利要求3-6中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一双链体形成区和所述第二双链体形成区各自具有30个核苷酸的长度。
9.如权利要求1-8中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述IRES具有来自以下的IRES的序列：桃拉综合征病毒、锥蝽病毒、蒂勒脑脊髓炎病毒、猿猴病毒40、红火蚁病毒1、禾谷缢管蚜病毒、网状内皮增生病病毒、人脊髓灰质炎病毒1、斯氏珀蝽肠病毒、克什米尔蜜蜂病毒、人鼻病毒2、琉璃叶蝉病毒-1、人免疫缺陷病毒1型、琉璃叶蝉病毒-1、Himetobi P病毒、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、GB型肝炎病毒、口蹄疫病毒、人肠道病毒71、马鼻炎病毒、茶尺蠖微小RNA病毒样病毒、脑心肌炎病毒、果蝇C病毒、人柯萨奇病毒B3、十字花科植物烟草花叶病毒、蟋蟀麻痹病毒、牛病毒性腹泻病毒1、黑蜂王台病毒、蚜虫致死性麻痹病毒、禽脑脊髓炎病毒、急性蜜蜂麻痹病毒、木槿褪绿环斑病毒、猪瘟病毒、人FGF2、人SFTPA1、人AML1/RUNX1、果蝇触角足、人AQP4、人AT1R、人BAG-1、人BCL2、人BiP、人c-IAPl、人c-myc、人eIF4G、小鼠NDST4L、人LEF1、小鼠HIF1α、人n.myc、小鼠Gtx、人p27kipl、人PDGF2/c-sis、人p53、人Pim-1、小鼠Rbm3、果蝇reaper、犬Scamper、果蝇Ubx、人UNR、小鼠UtrA、人VEGF-A、人XIAP、果蝇无毛、酿酒酵母TFIID、酿酒酵母YAP1、烟草蚀纹病毒、芜菁皱缩病毒、EMCV-A、EMCV-B、EMCV-Bf、EMCV-Cf、EMCV pEC9、小双节RNA病毒、HCV QC64、人寇沙病毒E/D、人寇沙病毒F、人寇沙病毒JMY、鼻病毒NAT001、HRV14、HRV89、HRVC-02、HRV-A21、萨力病毒ASH1、萨力病毒FHB、萨力病毒NG-J1、人副肠孤病毒1、Crohivirus B、Yc-3、Rosavirus M-7、Shanbavirus A、Pasivirus A、Pasivirus A 2、艾柯病毒E14、人副肠孤病毒5、爱知病毒、甲型肝炎病毒HA16、Phopivirus、CVA10、肠道病毒C、肠道病毒D、肠道病毒J、人趋肝性病毒2、GBV-C GT110、GBV-C K1737、GBV-C Iowa、趋肝性病毒A 1220、Pasivirus A 3、萨佩洛病毒、Rosavirus B、Bakunsa病毒、震颤病毒A、猪Pasivirus1、PLV-CHN、Pasivirus A、Sicinivirus、肝炎病毒K、肝炎病毒A、BVDV1、边界病病毒、BVDV2、CSFV-PK15C、SF573双顺反子病毒、微小RNA病毒样病毒、CRPV、萨力病毒ABN5、萨力病毒A BN2、萨力病毒A 02394、萨力病毒A GUT、萨力病毒A CH、萨力病毒A SZ1、萨力病毒FHB、CVB3、CVB1、艾柯病毒7、CVB5、EVA71、CVA3、CVA12、EV24或eIF4G的适体。
10.如权利要求1-9中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其由天然核苷酸组成。
11.如权利要求1-9中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述表达序列是密码子优化的。
12.如权利要求1-11中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述环状RNA多核苷酸的长度是约100个核苷酸至约10千碱基。
13.如权利要求1-12中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其在人类中具有至少约20小时的体内治疗效果持续时间。
14.如权利要求1-13中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其具有至少约20小时的功能性半衰期。
15.如权利要求1-14中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其在人细胞中的治疗效果持续时间大于或等于包含相同表达序列的等效线性RNA多核苷酸的治疗效果持续时间。
16.如权利要求1-15中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其在人细胞中的功能性半衰期大于或等于包含相同表达序列的等效线性RNA多核苷酸的功能性半衰期。
17.如权利要求1-16中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其在人类中的体内治疗效果持续时间大于具有相同表达序列的等效线性RNA多核苷酸的体内治疗效果持续时间。
18.如权利要求1-17中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其在人类中的体内功能性半衰期大于具有相同表达序列的等效线性RNA多核苷酸的体内功能性半衰期。
19.如权利要求1、3和5-18中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述佐剂或佐剂样多肽选自包括以下的组：toll样受体配体、细胞因子、FLt3-配体、抗体、趋化因子、嵌合蛋白、从垂死肿瘤释放的内源性佐剂和检查点抑制蛋白。
20.如权利要求1、3和5-19中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述佐剂或佐剂样多肽选自包括以下的组：BCSP31、MOMP、FomA、MymA、ESAT6、PorB、PVL、孔蛋白、OmpA、PepO、OmpU、2,4-二氧四氢蝶啶合酶、Omp16、Omp19、CobT、RpfE、Rv0652、HBHA、NhhA、DnaJ、肺炎球菌溶血素、鞭毛蛋白、IFN-α、IFN-γ、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、GM-CSF、IL-1b、IL-6、TNF-a、IL-7、IL-17、IL-1β、抗CTLA4、抗PD1、抗41BB、PD-L1、Tim-3、Lag-3、TIGIT、GITR以及抗CD3。
21.如权利要求1、3和5-20中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述佐剂或佐剂样多肽选自表10。
22.一种RNA多核苷酸，其按以下顺序包含3'内含子片段和三磷酸化5'末端。
23.如权利要求22所述的RNA多核苷酸，其包含位于所述3'内含子片段上游且所述三磷酸化5'末端下游的5'间隔区。
24.一种RNA多核苷酸，其按以下顺序包含3'内含子片段和单磷酸化5'末端。
25.如权利要求24所述的RNA多核苷酸，其包含位于所述3'内含子片段上游且所述单磷酸化5'末端下游的5'间隔区。
26.一种RNA多核苷酸，其包含5'内含子片段和三磷酸化5'末端。
27.如权利要求26所述的RNA多核苷酸，其包含位于所述5'内含子片段下游的5'间隔区。
28.一种RNA多核苷酸，其包含5'内含子片段和单磷酸化5'末端。
29.如权利要求28所述的RNA多核苷酸，其包含位于所述5'内含子片段下游的5'间隔区。
30.如权利要求22-29中任一项所述的RNA多核苷酸，其还包含多聚A纯化标签。
31.如权利要求22-30中任一项所述的RNA多核苷酸，其还包含起始序列。
32.如权利要求3或4所述的环状RNA多核苷酸，其中所述载体还包含三磷酸化5'末端。
33.如权利要求3或4所述的环状RNA多核苷酸，其中所述载体还包含单磷酸化5'末端。
34.如权利要求24-25和28-29中任一项所述的RNA多核苷酸，其还包含三磷酸化5'末端。
35.如权利要求22-23和26-27中任一项所述的RNA多核苷酸，其还包含单磷酸化5'末端。
36.一种RNA制剂，其包含：
a.如权利要求1、权利要求2或两者所述的环状RNA多核苷酸；以及
b.包含以下中的至少一者的线性RNA多核苷酸：
i.包含单磷酸化5'末端和3'内含子片段的3'内含子多核苷酸；
ii.包含单磷酸化5'末端和5'内含子片段的5'内含子多核苷酸；
iii.包含三磷酸化5'末端和3'内含子片段的3'内含子多核苷酸；以及
iv.包含三磷酸化5'末端和3'内含子片段的5'内含子多核苷酸，
其中所述环状RNA多核苷酸占所述RNA制剂的至少90％。
37.如权利要求36所述的RNA制剂，其中所述3'内含子多核苷酸或所述5'内含子多核苷酸包含间隔区。
38.如权利要求36所述的RNA制剂，其中所述3'内含子多核苷酸或所述5'内含子多核苷酸包含多聚A序列。
39.如权利要求36-38中任一项所述的RNA制剂，其中所述3'内含子多核苷酸或所述5'内含子多核苷酸包含UTR。
40.如权利要求39中任一项所述的RNA制剂，其中所述3'内含子多核苷酸或所述5'内含子多核苷酸包含IRES。
41.一种药物组合物，其包含权利要求1-21中任一项所述的环状RNA多核苷酸、稀释剂和任选的盐缓冲剂。
42.一种药物组合物，其包含权利要求36-40中任一项所述的RNA制剂、稀释剂和任选的盐缓冲剂。
43.一种药物组合物，其包含权利要求1-21中任一项所述的环状RNA多核苷酸以及聚阳离子、阳离子或聚合化合物。
44.一种药物组合物，其包含权利要求36-40中任一项所述的RNA制剂以及聚阳离子、阳离子或聚合化合物。
45.如权利要求43或44所述的药物组合物，其中所述聚阳离子或阳离子化合物选自由以下组成的组：阳离子肽或蛋白质、碱性多肽、细胞穿透肽(CPP)、Tat来源的肽、穿膜肽、VP22来源的或类似物肽、瘟病毒Erns、HSV、VP22(单纯疱疹)、MAP、KALA或蛋白质转导结构域(PTD)、PpT620、富含脯氨酸的肽、富含精氨酸的肽、富含赖氨酸的肽、MPG-肽、Pep-1、L-寡聚物、降钙素肽、触角足来源的肽、pAntp、pIsl、FGF、乳铁蛋白、转运肽、蟾蜍肽抗生素-2、Bac715-24、SynB、SynB(1)、pVEC、hCT来源的肽、SAP、组蛋白、阳离子多糖、阳离子聚合物、阳离子脂质、树状聚合物、聚亚胺、聚烯丙胺、oligofectamine、或阳离子或聚阳离子聚合物、基于糖主链的聚合物、基于硅烷主链的聚合物、改性的聚氨基酸、改性的丙烯酸酯、改性的聚β氨基酯(PBAE)、改性的酰胺胺、树状聚合物、由一个或多个阳离子嵌段和一个或多个亲水性或疏水性嵌段的组合组成的嵌段聚合物。
46.如权利要求43或44所述的药物组合物，其中所述聚合化合物选自由以下组成的组：聚胺、聚醚、聚酰胺、聚酯、聚氨基甲酸酯、聚脲、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚酰亚胺、聚砜、聚氨酯、聚乙炔、聚乙烯、聚乙烯亚胺、聚异氰酸酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯腈和聚芳酯。例如，聚合物可包括聚(己内酯)(PCL)、乙烯乙酸乙烯酯聚合物(EVA)、聚(乳酸)(PLA)、聚(L-乳酸)(PLLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(L-乳酸-共-乙醇酸)(PLLGA)、聚(D,L-丙交酯)(PDLA)、聚(L丙交酯)(PLLA)、聚(D,L-丙交酯-共-己内酯)、聚(D,L-丙交酯-共-己内酯-共乙交酯)、聚(D,L-丙交酯-共-PEO-共-D,L-丙交酯)、聚(D,L-丙交酯-共-PPO-共-D,L-丙交酯)、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚氨酯、聚-L-赖氨酸(PLL)、甲基丙烯酸羟丙酯(HPMA)、聚乙二醇、聚-L-谷氨酸、聚(羟基酸)、聚酸酐、聚原酸酯、聚(酯酰胺)、聚酰胺、聚(酯醚)、聚碳酸酯、聚烯烃如聚乙烯和聚丙烯、聚亚烷基二醇如聚(乙二醇)(PEG)、聚环氧烷(PEO)、聚对苯二甲酸亚烷基酯如聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯醚、聚乙烯酯如聚(乙酸乙烯酯)、聚乙烯卤化物如聚(氯乙烯)(PVC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚硅氧烷、聚苯乙烯、聚氨酯、衍生的纤维素如烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、丙烯酸的聚合物如聚((甲基)丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚((甲基)丙烯酸乙酯)、聚((甲基)丙烯酸丁酯)、363 5 10 15 2025 30 35WO 2021/076805PCT/US2020/055844聚((甲基)丙烯酸异丁酯)、聚((甲基)丙烯酸己酯)、聚((甲基)丙烯酸异癸酯)、聚((甲基)丙烯酸月桂酯)、聚((甲基)丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸十八烷基酯)及其共聚物和混合物、聚二氧杂环己酮及其共聚物、聚羟基烷酸酯、聚丙烯富马酸酯、聚甲醛、泊洛沙姆(poloxamer)、泊洛沙胺(poloxamine)、聚(原酸)酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共-己内酯)、三亚甲基碳酸酯、聚(N-丙烯酰吗啉)(PAcM)、具(2-甲基-2-噁唑啉)(PMOX)、具(2-乙基-2-噁唑啉)(PEOZ)以及聚甘油。
47.如权利要求43或44所述的药物组合物，其中所述聚阳离子或阳离子化合物选自由以下组成的组：鱼精蛋白、核仁蛋白、精胺或亚精胺、聚L-赖氨酸(PLL)、聚精氨酸、HIV结合肽、HIV-1Tat(HIV)、聚乙烯亚胺(PEI)、DOTMA：[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵、DMRIE、二-C14-脒、DOTIM、SAINT、DC-Chol、BGTC、CTAP、DOPC、DODAP、DOPE：二油酰基磷脂酰乙醇胺、DOSPA、DODAB、DOIC、DMEPC、DOGS：双十八烷基酰胺基甘氨酰基精胺、DIMRI：二肉豆蔻氧基丙基二甲基羟乙基溴化铵、DOTAP：二油酰基氧基-3-(三甲基铵)丙烷、DC-6-14：O,O-双十四烷酰基-N-.α.-三甲基铵基乙酰基)二乙醇胺氯化物、CLIP 1：外消旋-[(2,3-双十八烷基氧基丙基)(2-羟乙基)]-二甲基氯化铵、CLIP6：外消旋-[2(2,3-双十六烷基氧基丙基氧基甲基氧基)乙基]三甲基铵、CLIP9：外消旋-[2(2,3-双十六烷基氧基丙基氧基琥珀酰基氧基)乙基]-三甲基铵、β-氨基酸-聚合物或反向聚酰胺、PVP(聚(N-乙基-4-乙烯基溴化吡啶))、pDMAEMA(聚(二甲氨基乙基甲基丙烯酸酯))、pAMAM(聚(酰胺胺))、二胺端修饰的1,4丁二醇二丙烯酸酯-co-5-氨基-1-戊醇聚合物、聚丙胺树状聚合物或基于pAMAM的树状聚合物、聚亚胺、PEI：聚(乙烯亚胺)、聚(丙烯亚胺)、聚烯丙胺、基于环糊精的聚合物、基于葡聚糖的聚合物、壳聚糖和PMOXA-PDMS共聚物。
48.一种药物组合物，其包含权利要求1-21中任一项所述的环状RNA多核苷酸、纳米颗粒和任选的与所述纳米颗粒可操作地连接的靶向部分。
49.一种药物组合物，其包含权利要求36-40中任一项所述的RNA制剂、纳米颗粒和任选的与所述纳米颗粒可操作地连接的靶向部分。
50.如权利要求48或49所述的药物组合物，其中所述纳米颗粒是脂质纳米颗粒、核-壳纳米颗粒、生物可降解纳米颗粒、生物可降解脂质纳米颗粒、聚合物纳米颗粒或生物可降解聚合物纳米颗粒。
51.如权利要求41-50中任一项所述的药物组合物，其包含靶向部分，其中在没有细胞分离或纯化的情况下，所述靶向部分介导经受体介导的胞吞作用或直接融合至选定细胞群或组织的选定细胞中。
52.如权利要求48-51中任一项所述的药物组合物，其中所述靶向部分是scFv、纳米抗体、肽、微型抗体、多核苷酸适体、重链可变区、轻链可变区或其片段。
53.如权利要求41-5257-57中任一项所述的药物组合物，其中所述环状RNA多核苷酸或所述RNA制剂处于有效治疗或预防有需要的人受试者中的感染的量。
54.如权利要求41-53中任一项所述的药物组合物，其中与包含含有编码相同抗原的外源性DNA的载体的药物组合物相比，所述药物组合物具有增强的安全性特征。
55.如权利要求41-54中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物中少于1重量％的多核苷酸是双链RNA、DNA夹板或三磷酸化RNA。
56.如权利要求41-55中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物中少于1重量％的多核苷酸和蛋白质是双链RNA、DNA夹板、三磷酸化RNA、磷酸酶蛋白质、蛋白质连接酶和加帽酶。
57.如权利要求48-56中任一项所述的药物组合物，其中所述纳米颗粒包含选自下组的一种或多种阳离子脂质：C12-200、MC3、DLinDMA、DLinkC2DMA、cKK-E12、ICE(基于咪唑的)、HGT5000、HGT5001、DODAC、DDAB、DMRIE、DOSPA、DOGS、DODAP、DODMA和DMDMA、DODAC、DLenDMA、DMRIE、CLinDMA、CpLinDMA、DMOBA、DOcarbDAP、DLinDAP、DLincarbDAP、DLinCDAP、KLin-K-DMA、DLin-K-XTC2-DMA、HGT4003或它们的组合。
58.一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含权利要求1-21中任一项所述的环状RNA多核苷酸、纳米颗粒和任选的与所述纳米颗粒可操作地连接的靶向部分。
59.一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含权利要求36-40中任一项所述的RNA制剂、纳米颗粒和任选的与所述纳米颗粒可操作地连接的靶向部分。
60.如权利要求58或59所述的方法，其中所述靶向部分是scFv、纳米抗体、肽、微型抗体、重链可变区、轻链可变区或其片段。
61.如权利要求58-60中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒是脂质纳米颗粒、核-壳纳米颗粒或生物可降解纳米颗粒。
62.如权利要求58-61中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒包含一种或多种阳离子脂质、可电离脂质或聚β-氨基酯。
63.如权利要求58-62中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒包含一种或多种非阳离子脂质。
64.如权利要求58-63中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒包含一种或多种PEG修饰的脂质、聚谷氨酸脂质或透明质酸脂质。
65.如权利要求58-64中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒包含胆固醇。
66.如权利要求58-65中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒包含花生四烯酸或油酸。
67.如权利要求58-66中任一项所述的方法，其中所述组合物包含靶向部分，其中在没有细胞分离或纯化的情况下，所述靶向部分介导经受体介导的胞吞作用进入选定细胞群的选定细胞中。
68.如权利要求58-67中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒包封多于一种环状RNA多核苷酸。
69.一种用于制备环状RNA多核苷酸的载体，所述载体按以下顺序包含5'双链体形成区、3'I组内含子片段、内部核糖体进入位点(IRES)、编码一种或多种佐剂、抗原、佐剂样或抗原样多肽或其片段的表达序列、5'I组内含子片段和3'双链体形成区。
70.一种用于制备环状RNA多核苷酸的载体，所述载体按以下顺序包含5'双链体形成区、3'I组内含子片段、内部核糖体进入位点(IRES)、非编码序列、5'I组内含子片段和3'双链体形成区。
71.如权利要求69或70所述的载体，其包含位于所述5'双链体形成区与所述3'I组内含子片段之间的第一间隔区，以及位于所述5'I组内含子片段与所述3'双链体形成区之间的第二间隔区。
72.如权利要求69-71中任一项所述的载体，其中所述第一间隔区和所述第二间隔区各自具有约20至约60个核苷酸的长度。
73.如权利要求69-72中任一项所述的载体，其中所述第一间隔区和所述第二间隔区各自包含至少5个核苷酸长的非结构化区域。
74.如权利要求69-73中任一项所述的载体，其中所述第一间隔区和所述第二间隔区各自包含至少7个核苷酸长的结构化区域。
75.如权利要求69-74中任一项所述的载体，其中所述第一双链体形成区和所述第二双链体形成区各自具有约9至50个核苷酸的长度。
76.如权利要求69-75中任一项所述的载体，其中所述载体是密码子优化的。
77.如权利要求69-76中任一项所述的载体，其缺乏存在于等效的预先优化多核苷酸中的至少一个微小RNA结合位点。
78.一种原核细胞，其包含权利要求69-77中任一项所述的载体。
79.一种真核细胞，其包含权利要求1-21中任一项所述的环状RNA多核苷酸。
80.如权利要求79所述的真核细胞，其中所述真核细胞是人细胞。
81.如权利要求79或80所述的真核细胞，其中所述真核细胞是抗原呈递细胞。
82.一种疫苗，其包含：在脂质纳米颗粒中配制的至少一种环状RNA多核苷酸，所述至少一种环状RNA多核苷酸具有编码至少一种病毒抗原多肽、佐剂或佐剂样多肽或其免疫原性片段的表达序列。
83.如权利要求82所述的疫苗，其中所述佐剂或佐剂样多肽选自表10。
84.如权利要求82或83所述的疫苗，其中所述抗原多肽是来自以下的病毒多肽：腺病毒；单纯疱疹，1型；单纯疱疹，2型；脑炎病毒、乳头瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒；爱泼斯坦-巴尔病毒；人巨细胞病毒；人疱疹病毒，8型；人乳头瘤病毒；BK病毒；JC病毒；天花；脊髓灰质炎病毒；乙型肝炎病毒；人博卡病毒；细小病毒B19；人星状病毒；诺沃克病毒；柯萨奇病毒；甲型肝炎病毒；脊髓灰质炎病毒；鼻病毒；严重急性呼吸道综合征病毒；丙型肝炎病毒；黄热病毒；登革热病毒；西尼罗病毒；风疹病毒；戊型肝炎病毒；人免疫缺陷病毒(HIV)；流感病毒；瓜纳里托病毒；胡宁病毒；拉沙病毒；马丘波病毒；萨比亚病毒；克里米亚-刚果出血热病毒；埃博拉病毒；马尔堡病毒；麻疹病毒；腮腺炎病毒；副流感病毒；呼吸道合胞病毒；人偏肺病毒；亨德拉病毒；尼帕病毒；狂犬病病毒；丁型肝炎；轮状病毒；环状病毒；科罗拉多壁虱热病毒；版纳病毒；人肠道病毒；汉坦病毒；西尼罗病毒；中东呼吸道综合征冠状病毒；日本脑炎病毒；水疱性疱疹病毒；SARS-CoV-2；东方马脑炎或前述中的任何两种或更多种的组合。
85.如权利要求82-84中任一项所述的疫苗，其中所述病毒抗原多肽或其免疫原性片段选自或源自SEQ ID NO:325-336中的任一个。
86.如权利要求82-85中任一项所述的疫苗，其中所述病毒抗原多肽或其免疫原性片段具有与SEQ ID NO:325-336中的任一个的氨基酸序列具有至少90同一性的氨基酸序列，并且其中所述病毒抗原多肽或其免疫原性片段具有膜融合活性，附着至细胞受体，引起病毒和哺乳动物细胞膜的融合，和/或负责所述病毒与受感染的细胞的结合。
87.如权利要求82-86中任一项所述的疫苗，其中所述表达序列是密码子优化的。
88.如权利要求82-87中任一项所述的疫苗，其中所述疫苗是多价的。
89.如权利要求82-88中任一项所述的疫苗，其以有效量配制以产生抗原特异性免疫应答。
90.如权利要求82-89中任一项所述的疫苗，其中所述环状RNA多核苷酸包含编码第一病毒抗原多肽的第一表达序列和编码第二病毒抗原多肽的第二表达序列。
91.一种在受试者中诱导免疫应答的方法，所述方法包括以有效在所述受试者中产生抗原特异性免疫应答的量向所述受试者施用权利要求82-90中任一项所述的疫苗。
92.如权利要求91所述的方法，其中所述抗原特异性免疫应答包括T细胞应答或B细胞应答。
93.如权利要求91或92所述的方法，其中向所述受试者施用单剂量的所述疫苗。
94.如权利要求91-93中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用加强剂量的所述疫苗。
95.如权利要求91-94中任一项所述的方法，其中所述疫苗通过鼻内施用、皮内注射或肌内注射施用于所述受试者。
96.如权利要求91-95中任一项所述的方法，其中在所述受试者中产生的抗抗原多肽抗体滴度相对于预先确定的阈值水平增加至少1个对数。
97.如权利要求91-96中任一项所述的方法，其中在所述受试者中产生的抗抗原多肽抗体滴度相对于预先确定的阈值水平增加1-3个对数。
98.如权利要求91-97中任一项所述的方法，其中在所述受试者中产生的所述抗抗原多肽抗体滴度相对于预先确定的阈值水平增加至少2倍。
99.如权利要求91-98中任一项所述的方法，其中在所述受试者中产生的所述抗抗原多肽抗体滴度相对于预先确定的阈值水平增加2-10倍。
100.如权利要求91-99中任一项所述的方法，其中所述预先确定的阈值水平是在尚未施用包含所述抗原多肽的疫苗的受试者中产生的抗抗原多肽抗体滴度。
101.如权利要求91-100中任一项所述的方法，其中所述预先确定的阈值水平是在已经施用了包含所述抗原多肽的减毒活疫苗或灭活疫苗的受试者中产生的抗抗原多肽抗体滴度。
102.如权利要求91-101中任一项所述的方法，其中所述预先确定的阈值水平是在已经施用了包含所述抗原多肽的重组蛋白疫苗或纯化蛋白疫苗的受试者中产生的抗抗原多肽抗体滴度。
103.一种SARS-CoV2疫苗，其包含：在脂质纳米颗粒中配制的至少一种环状RNA多核苷酸，所述至少一种环状RNA多核苷酸具有编码至少一种SARS-CoV2病毒抗原多肽或其免疫原性片段的表达序列。
104.如权利要求102所述的SARS-CoV2疫苗，其中所述SARS-CoV2病毒抗原多肽选自：SARS-CoV2刺突蛋白、Nsp1–Nsp16、ORF3a、ORF6、ORF7a、ORFb、ORF8、ORF10、SARS-CoV2包膜蛋白、SARS-CoV2膜蛋白、SARS-CoV2核衣壳蛋白或SARS-CoV2的任何抗原肽或SARS-CoV2肽的片段。
105.如权利要求102103或104所述的SARS-CoV2疫苗，其中所述SARS-CoV2病毒抗原多肽源自SARS-CoV2病毒株G、株GR、株GH、株L、株V或它们的组合。
106.如权利要求103-105中任一项所述的SARS-CoV2疫苗，其中所述表达序列是密码子优化的。
107.如权利要求103-106中任一项所述的SARS-CoV2疫苗，其中所述疫苗是多价的。
108.如权利要求103-107中任一项所述的SARS-CoV2疫苗，其以有效量配制以产生抗原特异性免疫应答。
109.一种在受试者中诱导免疫应答的方法，所述方法包括以有效在所述受试者中产生抗原特异性免疫应答的量向所述受试者施用权利要求103-108中任一项所述的SARS-CoV2疫苗。
110.如权利要求109所述的方法，其中所述抗原特异性免疫应答包括T细胞应答或B细胞应答。
111.如权利要求109或110所述的方法，其中向所述受试者施用单剂量的所述疫苗。
112.如权利要求109-111中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用加强剂量的所述疫苗。
113.如权利要求109-112中任一项所述的方法，其中所述疫苗通过鼻内施用、皮内注射或肌内注射施用于所述受试者。
114.如权利要求109-113中任一项所述的方法，其中在所述受试者中产生的抗抗原多肽抗体滴度相对于预先确定的阈值水平增加至少1个对数。
115.如权利要求109-114中任一项所述的方法，其中在所述受试者中产生的抗抗原多肽抗体滴度相对于预先确定的阈值水平增加1-3个对数。
116.如权利要求109-115中任一项所述的方法，其中在所述受试者中产生的所述抗抗原多肽抗体滴度相对于预先确定的阈值水平增加至少2倍。
117.如权利要求109-116中任一项所述的方法，其中在所述受试者中产生的所述抗抗原多肽抗体滴度相对于预先确定的阈值水平增加2-10倍。
118.如权利要求109-117中任一项所述的方法，其中所述预先确定的阈值水平是在尚未施用包含所述抗原多肽的疫苗的受试者中产生的抗抗原多肽抗体滴度。
119.如权利要求109-118中任一项所述的方法，其中所述预先确定的阈值水平是在已经施用了包含所述抗原多肽的减毒活疫苗或灭活疫苗的受试者中产生的抗抗原多肽抗体滴度。
120.如权利要求109-119中任一项所述的方法，其中所述预先确定的阈值水平是在已经施用了包含所述抗原多肽的重组蛋白疫苗或纯化蛋白疫苗的受试者中产生的抗抗原多肽抗体滴度。
121.一种环状RNA多核苷酸，其具有编码至少一种病毒抗原多肽、佐剂或佐剂样多肽或其免疫原性片段的表达序列。
122.一种表达载体，其包含编码至少一种权利要求1-21中任一项所述的环状RNA多核苷酸的工程化核酸。
123.一种在脂质纳米颗粒中配制的环状RNA多核苷酸疫苗，其包含权利要求121所述的环状RNA多核苷酸。
124.如权利要求123所述的环状RNA多核苷酸疫苗，其中所述纳米颗粒具有50-200nm的平均直径。
125.如权利要求123或124所述的环状RNA多核苷酸疫苗，其中所述脂质纳米颗粒包含阳离子脂质、PEG修饰的脂质、固醇以及非阳离子脂质。
126.如权利要求123-125中任一项所述的环状RNA多核苷酸疫苗，其中所述脂质纳米颗粒载体包含约20％-60％阳离子脂质、0.5％-15％PEG修饰的脂质、25％-55％固醇和25％非阳离子脂质的摩尔比。
127.如权利要求123-126中任一项所述的环状RNA多核苷酸疫苗，其中所述阳离子脂质是可电离阳离子脂质，并且所述非阳离子脂质是中性脂质，并且所述固醇是胆固醇。
128.如权利要求123-127中任一项所述的环状RNA多核苷酸疫苗，其中所述阳离子脂质选自由以下组成的组：2,2-二亚油基-4-二甲氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)以及二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-(二甲氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(L319)。
129.如权利要求123-128中任一项所述的环状RNA多核苷酸疫苗，其中所述纳米颗粒具有小于0.4的多分散性值。
130.如权利要求123-129中任一项所述的环状RNA多核苷酸疫苗，其中所述纳米颗粒在中性pH值下具有净中性电荷。
131.一种用于受试者的疫苗接种的药物组合物，其包含有效剂量的编码至少一种病毒抗原或佐剂或佐剂样多肽或其免疫原性片段的环状RNA多核苷酸，其中所述有效剂量足以产生通过针对所述抗原或佐剂或佐剂样多肽或其免疫原性片段的中和抗体产生的1,000-10,000中和滴度，如在施用后1-72小时在所述受试者的血清中所测量。
132.一种用于受试者的疫苗接种的药物组合物，其包含有效剂量的编码至少一种病毒抗原或佐剂或佐剂样多肽或其免疫原性片段的环状mRNA，其中所述有效剂量足以产生可检测水平的抗原或佐剂或佐剂样多肽或其免疫原性片段，如在施用后1-72小时在所述受试者的血清中所测量。
133.一种在受试者中诱导、产生或增强免疫应答的方法，所述方法包括以有效在所述受试者中诱导、产生或增强抗原特异性免疫应答的量向所述受试者施用权利要求131或132的药物组合物。
134.如权利要求133所述的方法，其中所述药物组合物使所述受试者针对所述病毒免疫，持续长达2年。
135.如权利要求133或134所述的方法，其中所述药物组合物使所述受试者针对所述病毒免疫，持续超过2年。
136.如权利要求133-135中任一项所述的方法，其中所述受试者已暴露于所述病毒，其中所述受试者感染所述病毒，或者其中所述受试者有被所述病毒感染的风险。
137.如权利要求133-136中任一项所述的方法，其中所述受试者免疫功能低下。
138.如权利要求82-90、103-108和123-130中任一项所述的疫苗或如权利要求131或132所述的药物组合物，其用于在受试者中诱导抗原特异性免疫应答的方法中，所述方法包括以有效在所述受试者中产生抗原特异性免疫应答的量向所述受试者施用所述疫苗或所述组合物。
139.如权利要求82-90、103-108和123-130中任一项所述的疫苗或如权利要求131或132所述的药物组合物在制造用于在受试者中诱导抗原特异性免疫应答的方法中使用的药物中的用途，所述方法包括以有效在所述受试者中产生抗原特异性免疫应答的量向所述受试者施用所述疫苗。
140.一种在哺乳动物中诱导针对多种病毒或病毒株的交叉反应性的方法，所述方法包括向有需要的哺乳动物施用任一前述权利要求所述的疫苗或任一前述权利要求所述的药物组合物。
141.如权利要求140所述的方法，其中分别向所述哺乳动物施用至少两种环状RNA多核苷酸，所述至少两种RNA多核苷酸具有各自编码共有病毒抗原的表达序列。
142.如权利要求140或141所述的方法，其中同时向所述哺乳动物施用至少两种环状RNA多核苷酸，所述至少两种RNA多核苷酸具有各自编码共有病毒抗原的表达序列。
143.如权利要求82-90、103-108和123-130中任一项所述的疫苗，其中所述环状RNA多核苷酸与佐剂在同一纳米颗粒中共配制。
144.如权利要求82-90、103-108、123-130和143中任一项所述的疫苗，其中所述佐剂是CpG、咪喹莫特、铝或弗氏佐剂。
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