CN111436617B - 基于牛血清白蛋白的岩藻糖拟糖蛋白在抑制惰性凝集杆菌方面的用途及制备方法 - Google Patents

Abstract

本申请公开了基于牛血清白蛋白的岩藻糖拟糖蛋白(Fuc‑BSA)在抑制惰性凝集杆菌(Aggregatibacter segnis，A.segnis)方面的用途及制备方法。其抑制作用体现在降低了A.segnis对口腔细胞CAL‑27以及HOEC的黏附作用，降低了A.segnis的细胞毒性。而且，据此也可以明确：基于牛血清白蛋白的岩藻糖拟糖蛋白(Fuc‑BSA)在制备用于预防由A.segnis引起的疾病的药品方面的用途，所述药品作用于口腔(给药直达染菌部位)，所述由A.segnis引起的疾病可以是心内膜炎、阑尾炎、胆囊炎、胰腺脓肿等。

Description

基于牛血清白蛋白的岩藻糖拟糖蛋白在抑制惰性凝集杆菌方 面的用途及制备方法

技术领域

本申请涉及一种拟糖蛋白及其在抑制惰性凝集杆菌(Aggregatibacter segnis，A.segnis)方面的用途和制备方法。

背景技术

惰性凝集杆菌(Aggregatibacter segnis，A.segnis)是一种多形性杆菌是一种多形性杆菌，常表现为不规则的丝状、小棒状。生长于巧克力琼脂上菌落表现为光滑、灰白色、不透明的颗粒状凸起。培养48h后其菌落直径可以达到0.5mm。在肉汤和发酵培养液中生长缓慢，二氧化碳可以促进该菌的生长。因子V(辅酶I(即烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD)或辅酶II(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，NADP))是其生长所必需的因子，同时其生长不依赖因子X。A.segnis存在多种形式的过氧化氢酶和半乳糖苷酶，代谢产物包括少量的酸，由葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖和麦芽糖发酵而成。蔗糖发酵通常比葡萄糖发酵更强烈。不能利用阿拉伯糖、纤维二糖、乳糖、甘露醇、甘露糖、蜜二糖、松三糖、蜜三糖、水杨苷、山梨糖、山梨醇、海藻糖和木糖进行发酵。

A.segnis是人体口腔中的常见共生菌，主要分布在牙菌斑和咽喉部。A.segnis很少被认为是病原体，但有时认为它与牙周病关联，偶尔与严重感染包括感染性心内膜炎，急性胆囊炎，急性阑尾炎和胰腺脓肿有关。1987年第一次报道了由A.segnis引起的心内膜炎病例，2003年再次有研究者发现了A.segnis引起的心内膜炎。1986年和1991年报道了由A.segnis引起的阑尾炎。1997年报道了由A.segnis引起的胆囊炎。

发明内容

申请人针对胃癌患者口腔微生物的测序，发现A.segnis在胃癌患者口腔中的丰度发生了显著的上调，在健康志愿者中其相对丰度为0.1％，而在胃癌患者口腔中其相对丰度达到了0.41％。而在申请人前期的研究发现胃癌患者唾液糖蛋白糖型发生了显著的改变，包括胃癌患者唾液中岩藻糖基化糖型的下调，半乳糖和甘露糖糖型的上调。口腔微环境的改变会影响口腔细菌的组成于分布，由此申请人开始研究拟糖蛋白对A.segnis的影响，并主要得出以下方案和结论：

A、拟糖蛋白(Fuc-BSA)的合成及测定。

B、30μg/mL与100μg/mL浓度下的Fuc-BSA显著降低了A.segnis对口腔细胞CAL-27以及HOEC的黏附作用。

C、Fuc-BSA的持续刺激导致了A.segnis外膜糖型发生了显著的改变。

D、Fuc-BSA主要通过下调三种LPS相关糖基转移酶(NCTC10977_00605(Rfaq_1)，NCTC10977_00729和NCTC10977_00649(WaaA))的表达水平而引起A.segnis外膜糖型的改变。

E、Fuc-BSA处理显著降低了A.segnis的细胞毒性。

据此，申请人给出以下在产业上目前具有实用价值的技术方案：

第一方面，惰性凝集杆菌(Aggregatibacter segnis，A.segnis)的抑制剂，其作用于口腔，活性成分包括基于牛血清白蛋白的岩藻糖拟糖蛋白(Fuc-BSA)。其抑制作用体现在降低了A.segnis对口腔细胞CAL-27以及HOEC的黏附作用，降低了A.segnis的细胞毒性。

进一步地，所述基于牛血清白蛋白的岩藻糖拟糖蛋白(Fuc-BSA)的分子量为65.6kD，平均每个BSA分子连接的单糖数量为8.5个Fuc。推测类似单糖数量、分子量的Fuc-BSA也会有类似的抑制作用。

进一步地，所述基于牛血清白蛋白的岩藻糖拟糖蛋白(Fuc-BSA)的浓度大于30μg/mL，能够起到更好的抑制效果。

第二方面，基于牛血清白蛋白的岩藻糖拟糖蛋白(Fuc-BSA)在制备惰性凝集杆菌(Aggregatibacter segnis，A.segnis)的抑制剂方面的用途。

第三方面，基于牛血清白蛋白的岩藻糖拟糖蛋白(Fuc-BSA)在制备用于预防由A.segnis引起的疾病的药品方面的用途，所述药品作用于口腔(给药直达染菌部位)。

进一步地，所述由A.segnis引起的疾病可以是心内膜炎、阑尾炎、胆囊炎、胰腺脓肿等。

进一步地，所述药品的制剂形式可以为凝胶、贴片、咀嚼片、喷雾、漱口水等。同理，上述抑制剂的剂型也可以是这些类型。

第四方面，上述牛血清白蛋白的岩藻糖拟糖蛋白(Fuc-BSA)的合成方法，包括以下步骤：

1)岩藻糖与5-(4-羟基苯基)戊酸偶联；

2)活化5-(4-羟基苯基)戊酸-糖链复合物上的羧基；

3)BSA与活化的5-(4-羟基苯基)戊酸-糖链复合物反应。

进一步地，步骤1)的反应条件为pH 3.0，60℃，200rpm，避光反应12h；步骤2)的反应条件为pH 6.0，50rpm，室温，避光反应4h；步骤3)的反应条件为pH 9.0，室温避光反应4h。

进一步地，步骤3)之后，还进行以下步骤：

4)透析：将合成产物装入14000Da的透析袋中，置于磁力搅拌器上于4℃环境中连续透析2-3天，每8h换液一次，彻底除去盐类以及未连接至BSA上的小分子化合物；

5)过膜：将透析后溶液先用0.45μm滤膜过滤除去不溶物，然后用0.22μm滤膜过滤除菌。

附图说明

图1为不同拟糖蛋白的SDS-PAGE胶图。

图2示意了不同拟糖蛋白的分子量；图中，A：经过相同处理流程的对照组BSA分子量质谱图；B：甘露糖拟糖蛋白分子量质谱图，(Man-Linker)n-BSA；C：半乳糖拟糖蛋白分子量质谱图，(Gal-Linker)n-BSA；D：岩藻糖拟糖蛋白分子量质谱图，(Fuc-Linker)n-BSA。

图3示意了地衣酚-硫酸法测定含糖量；图中，A：不同浓度的Man标品和Man-BSA地衣酚-硫酸法显色结果；B：不同浓度的Gal标品和Gal-BSA地衣酚-硫酸法显色结果；C：不同浓度的Fuc标品和Fuc-BSA地衣酚-硫酸法显色结果；1-6标示的为不同浓度单糖的地衣酚-硫酸显色图，右边分别为三种单糖的地衣酚-硫酸显色标准曲线，中间①②③标号的为三个稀释梯度下检测的拟糖蛋白显色图。

图4示意了岩藻糖拟糖蛋白对A.segnis黏附CAL-27细胞的影响；图中，DAPI用于指示细胞核；DiD用于指示细胞膜；FITC-d-Lys用于指示细菌；Bright：明场；*：p＜0.05；**：p＜0.01；***：p＜0.001；ns：no significant。

图5示意了甘露糖拟糖蛋白，半乳糖拟糖蛋白对A.segnis黏附CAL-27功能的影响；图中，DAPI用于指示细胞核；DiD指示细胞膜；FITC-d-Lys指示细菌；Bright：明场；*：p＜0.05；**：p＜0.01；***：p＜0.001；ns：no significant。

图6示意了岩藻糖拟糖蛋白处理对A.segnis黏附HOEC的影响；图中，DAPI用于指示细胞核；DiD指示细胞膜；FITC-d-Lys指示细菌；Bright：明场；*：p＜0.05；**：p＜0.01；***：p＜0.001；ns：no significant。

图7示意了细菌外膜糖型的改变；图中，A：细菌外膜糖型凝集素芯片检测结果；B：相对荧光信号值发生显著差异改变的凝集素；C：随着浓度升高，NFIs下降的凝集素；D：随着浓度升高，NFIs升高的凝集素；*：p＜0.05，具有显著差异；**：p＜0.01，具有非常显著差异；***：p＜0.001，具有极显著差异。

图8示意了LPS相关糖基转移酶mRNA表达水平；图中，直方条上端数字：foldchange值；*：p＜0.05，具有显著差异；**：p＜0.01，具有非常显著差异。

图9示意了Fuc-BSA对HOEC和CAL-27细胞增殖能力的影响；图中，A：0-100μg/mL的Fuc-BSA对HOEC细胞增殖能力的影响；B：0-100μg/mL的Fuc-BSA对CAL-27细胞增殖能力的影响，ns：无显著性差异。

图10示意了A.segnis和Fuc-BSA处理后的A.segnis对口腔细胞HOEC增殖能力的影响；图中，A：A.segnis对口腔细胞HOEC增殖能力的影响；B：Fuc-BSA处理后的A.segnis对口腔细胞HOEC增殖能力的影响。IC50：半抑制浓度。

图11示意了A.segnis和Fuc-BSA处理后的A.segnis对CAL-27细胞增殖能力的影响；图中，A：A.segnis对CAL-27细胞增殖能力的影响；B：Fuc-BSA处理后的A.segnis对CAL-27细胞增殖能力的影响；IC50：半抑制浓度。

具体实施方式

以下详细介绍本申请的相关实验及分析，发明人具体的研发过程不限于此。

1、实验过程

1.1实验试剂及耗材

表1凝集素芯片等实验所用主要实验试剂及耗材目录

1.2实验仪器

表2主要实验仪器目录

1.3拟糖蛋白的合成

(1)糖链与5-(4-羟基苯基)戊酸偶联(以岩藻糖为例)：称取0.06g 5-(4-羟基苯基)戊酸与0.02g岩藻糖，溶于15mL磷酸盐缓冲液中，完全溶解后调节pH至3.0，补足体积至20mL，60℃，200rpm，避光反应12h；

(2)活化5-(4-羟基苯基)戊酸-糖链复合物上的羧基：调节pH至6.0后，加入0.06gEDC，0.1g NHS充分混匀后再次调节pH至6.0，50rpm，室温，避光反应4h；

(3)BSA与活化的5-(4-羟基苯基)戊酸-糖链复合物反应：称取0.1g BSA溶于20mL碳酸盐缓冲液中，吸取上述100μL活化后的5-(4-羟基苯基)戊酸-糖链复合物，调节pH至9.0，室温避光反应4h；

(4)透析：将合成产物装入14000Da的透析袋中，置于磁力搅拌器上于4℃环境中连续透析2-3天，每8h换液一次，彻底除去盐类以及未连接至BSA上的小分子化合物；

(5)过膜：将透析后溶液先用0.45μm滤膜过滤除去不溶物，然后用0.22μm滤膜过滤除菌。

1.4蛋白定量

使用BCA蛋白浓度检测试剂盒测定过膜后的拟糖蛋白蛋白浓度。首先利用试剂盒中的BSA标准液配制成0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0浓度梯度的标准液，再配置BCA工作液(BCA试剂A液∶B液＝50∶1)。分别取10μL标准液以及稀释2倍、5倍和10倍的待测蛋白加入至96孔板中，每孔加入200μL现配的BCA工作液，混匀后置于37℃中反应20min，冷却至室温后用酶标仪测定A562nm波长的吸光度。以不同浓度梯度标准液绘制的标准曲线，计算待测蛋白的浓度。

1.5聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

(1)配制分离胶和浓缩胶：本实验配制了10％的分离胶以及5％的浓缩胶。配方如表3所示。

表3分离胶、浓缩胶配方

(2)蛋白样本处理：各取3μg蛋白样本，加超纯水体积至12μL，加入3μL的5×SDSPAGE loading buffer，充分混匀后，短暂离心后100℃水浴加热5min，使蛋白充分变性展开。使用配置好的SDS-PAGE胶进行恒压电泳，先以60V的恒定电压运行30min，后调至100V电泳2h左右。

(3)固定：电泳完成后拆下胶板，取出胶放置于银染固定液中浸泡，室温摇床振荡3h直至胶体显著缩小。

(4)增敏：倒去固定液，加入银染增敏液，继续室温摇床振荡1h。

(5)漂洗：除去增敏液，加入200mL超纯水，继续室温摇床振荡1h，每15min换超纯水一次，彻底漂洗胶体，并恢复胶体体积。

(6)银染：倒去超纯水后加入现配的银染液，室温摇床振荡20min。

(7)显色与终止：用超纯水快速漂洗一次后加入显色液显色，在照胶台上观察显色程度，当显色程度达到理想状态时，迅速加入终止液，终止显色反应。待完全终止不再产生气泡后取出胶体，平铺在照胶台上，拍照留存。

1.6拟糖蛋白分子量的测定(LC-Q-TOF-MS)

三种拟糖蛋白以及经过同样处理的对照组BSA使用Agilent 1290HPLC串联Q-TOF6530测定其分子量。液相色谱-四级杆-飞行时间质谱(LC-Q-TOF-MS)分析的具体流程如下。

(1)液相色谱分析条件

BSA以及拟糖蛋白进样量为20μL，采用Agilent C18柱(4.6mm×250mm，5μm)，使用流动相A(0.1％FA)和流动相B(ACN/0.1％FA)以0.3mL/min的速度进行梯度洗脱(表4)。

表4梯度洗脱体系与时间表

(2)LC-Q-TOF-MS分析条件

质谱数据采集范围为1150-1550m/z。Electrospray电压：3.5kV；Fragmentor电压：175V；sheath气体温度：350℃；鞘气体流量：9L/min；毛细管加热温度：320℃。

采集MS数据后，分别使用Agilent MassHunter软件对MS值进行2-15万Da的峰谱反褶积。首先，在反褶积模块中，反褶积算法为最大熵，反褶积设置质量范围为20000-150000Da，减去基线，基线因子为7。其次，在峰值信噪比≥30的最大熵模块中，设置最大峰值数为100，使用峰值高度的top 90％计算平均质量，其他模块的设定均为默认。

1.7地衣酚-硫酸法测定拟糖蛋白的糖链含量

(1)地衣酚-硫酸试剂配置：使用前将预冷至4℃的75mL 60％硫酸加入至10mL 4℃的1.6％地衣酚溶液中，充分混匀，整个过程需要在冰上完成。

(2)标曲的制备(以岩藻糖为例)：a.岩藻糖标准液的配置：称取1mg岩藻糖，3mgBSA溶于10mL超纯水中，充分溶解混匀，配置成100μg/mL的岩藻糖标准液(含300μg/mL的BSA)；b.取6个灭菌的离心管，分别加入0，50μL，100μL，150μL，200μL，250μL的100μg/mL的岩藻糖标准液，加入超纯水补足体积至250μL，混匀后分别加入750μL的地衣酚-硫酸溶液，80℃水浴加热30min，取出冷却至室温后吸取200uL至96孔板中进行490nm吸光度测定。测定结果进行标准曲线的绘制。

(3)拟糖蛋白样本液的显色(以岩藻糖拟糖蛋白为例)：首先将岩藻糖拟糖蛋白浓度进行精准定量，配置成300μg/mL拟糖蛋溶液，配成三个250μL不同稀释倍数的待测液，加入750μL的地衣酚-硫酸溶液，充分混匀后80℃水浴加热30min，取出冷却后吸取至96孔板中，测定490nm吸光度。测定结果代入标准曲线进行蛋白含糖量的计算。

1.8口腔鳞癌细胞及正常细胞培养

(1)细胞传代培养：购买的细胞运至后先进行镜检，检查细胞状态，75％酒精对瓶表面进行消毒后置于细胞培养箱中过夜使其沉淀贴壁。第二天观察细胞生长情况，如果细胞还未长满，吸走全部培养液后加入5mL完全培养液，放入细胞培养箱中继续培养，待细胞长至80％-90％时进行冻存以及传代培养。

细胞传代培养具体步骤如下：

a.用移液枪吸去T25细胞培养瓶中的培养液，加入5mL预热的无菌1×PBS缓冲液清洗细胞，缓缓晃动后吸走PBS，加入1mL胰蛋白酶消化液，摇晃培养瓶使消化液与细胞充分接触，然后置于37℃，消化5min。

b.待细胞变圆脱落后再加入1mL完全培养液用以中和胰蛋白酶，终止反应。

c.用移液枪轻轻吹打细胞瓶底部，使细胞充分掉落。吹打均匀后将细胞移入15mL离心管中，1000g离心5min，弃去上清。

d.加入适量完全培养液后，轻轻吹吸细胞，使其重悬，吸取1mL加入新的细胞培养瓶中，再加入4mL完全培养液，十字晃动使细胞充分散布在培养瓶底部，置于细胞培养箱中37℃，5％CO₂培养。

(2)细胞冻存：清洗消化步骤同上述细胞传代培养部分，不再赘述。消化后获得的细胞移入15mL离心管中，1000g离心5min，弃去上清。加入细胞冻存液重悬细胞后，吸至冻存管中，然后4℃、-20℃、-80℃梯度降温后放置于液氮罐中长期保存。

(3)细胞计数：先用95％的乙醇清洗血球计数板，干燥后，吸取10μL待测细胞、细菌悬液，滴在盖玻片边缘，让细胞/细菌悬液自行缓缓进行计数室。5min后，将计数板放在低倍镜下观察，然后换置高倍镜下，根据细胞、细菌大小的不同选择合适倍数的物镜以及相应的计数区进行细胞或细菌的计数。然后通过计算得出细胞、细菌浓度。

1.9 A.segnis培养

用砂轮在安瓿瓶颈部划圈后，掰断安瓿瓶，吸取0.5mL无菌水溶解细菌冻干粉，重悬后涂布或者划线接种于数块巧克力固体培养基上，37℃，5％CO2环境下倒置培养72h。待固体培养基上长出菌落，挑取单菌落接种于20mL GC培养液中培养，置于37℃，5％CO2，200rpm培养。

1.10细菌黏附实验

(1)接种细胞：将1×10⁵个细胞(CAL-27细胞和HOEC细胞)接种到共聚焦培养皿中，并向培养皿中加入1mL DMEM完全培养液，晃动培养皿至细胞分布均匀，置于细胞培养箱中培养。

(2)饥饿处理：待细胞长至70％左右时，移去培养液后加入1mL无血清DMEM培养基饥饿处理过夜。

(3)细胞膜染色：移去培养液后加入1mL DMEM培养液以及2μL 5mM DiD荧光，混匀后置于细胞培养箱中孵育20min，移去培养液后加入1mL DMEM培养液，置于细胞培养箱中孵育15min，重复4次，除去未结合至细胞膜上的DiD荧光。

(4)感染黏附：将1mLDMEM培养液以及A.segnis(1×10⁶cells/mL)加入共聚焦小皿中，混匀后于细胞培养箱中共培养90min，使细菌黏附感染细胞。

(5)细胞固定：移去培养液，用无菌PBS清洗4次，每次15min，清洗结束后加入500μL4％多聚甲醛固定细胞。

(6)细菌染色：随后使用无菌1×PBS清洗3次，每次5min，清洗后加入500μL无菌1×PBS以及5μL 10mM FITC-d-Lys溶液(终浓度100μM)，37℃孵育20min。

(7)细胞核着色：孵育结束后移去染色液，用1×PBS清洗3次，每次5min。培养皿中加入500μL DAPI染色液，染色10min。使用1×PBS清洗3次，每次5min。

(8)激光共聚焦扫描：设置相关参数与通道，选择合适的放大倍数，对染色结果进行图像采集。

1.11凝集素芯片实验

(1)环氧化片基制备：①预清洗：a.取20张1×3英寸无伤无刮痕的高透光型玻片置于玻片架中，放置于2％RBS-35清洗液中70℃水浴加热30min，超声清洗15min，再用超纯水彻底洗去清洁剂；b.将清洗后的玻片转入5％的盐酸中，摇床震荡清洗2h，超纯水清洗5次，每次5min，然后用无水乙醇清洗2次，每次3min，600rpm离心5min甩干；c.将玻片转入10％NaOH溶液中，60rpm震荡孵育12h；d.取出玻片用超纯水清洗5次，每次5min，再用无水乙醇清洗3次，每次3min，600rpm离心5min甩干。②环氧化硅烷化修饰：将处理后的玻片置于GPTS溶液中(含有10％的GPTS，0.5％的冰乙酸的无水乙醇溶液)，避光，60rpm，37℃，振荡孵育10h。孵育完成后，用无水乙醇清洗6次，每次5min，600rpm离心5min。甩干后置于真空干燥箱中37℃，干燥3h。制备好的环氧化修饰片基避光恒温干燥箱中保存。

(2)凝集芯片点制：以1mg/mL BSA作为阴性对照，Cy3荧光标记的BSA作为位置标记。将37种凝集素根据其推荐的缓冲液配制成2mg/mL的凝集素溶液，随后与点样缓冲液以1：1比例混合。将阴性对照，位置标记以及凝集素溶液转移至384孔板中，使用博奥晶芯SmartArrayer48生物芯片点样系统，设置参数，每个孔重复点样三次。每张片基重复4个点样矩阵。点样结束后将芯片置于湿盒中过夜孵育使凝集素充分与片基结合，孵育完成后将芯片取出，转入真空干燥箱中37℃干燥3h后置于4℃避光干燥器内保存。

(3)凝集素芯片的封闭、孵育：a.细菌荧光标记与分离：收集对数生长期细菌的菌液于离心管中，置于离心机中3000g离心5min，弃去上清后加入1×PBS重悬细菌，重复清洗五次，加入10μL活化后的Cy3荧光，充分混匀后置于室温，80rpm避光反应3h。反应后3000g离心5min，弃去上清，加入1×PBS重悬细菌，离心后弃去上清，重复清洗五次，收集Cy3荧光标记的细菌。b.芯片封闭：将芯片取出后置于37℃真空干燥箱中干燥回温30min，先用1×PBST清洗2次，每次5min，再用1×PBS清洗2次，每次5min。玻片用Force mini离心机甩干。向每个点样阵列中加入150μL回温后的封闭缓冲液，盖紧芯片孵育盒，置于生物芯片杂交仪中37℃低速旋转封闭1h；c.芯片孵育：封闭完成后，将芯片取出，完成封闭后，取出芯片，先用1×PBST清洗2次，每次5min，再用1×PBS清洗2次，每次5min，玻片用Force mini离心机甩干。配置好芯片孵育液(4μg荧光标记蛋白，终浓度为1×凝集素芯片孵育液)后依次按区加入至对应规格的盖片内，扣上甩干后的芯片，旋紧芯片孵育盒后置于生物芯片杂交仪中37℃低速旋转孵育3h；d.清洗：孵育完成后，小心拆开孵育盒，取出凝集素芯片，分别用1×PBST和1×PBS清洗(缓缓清洗，50rpm)，各洗两遍，然后用热风慢慢吹干。

(4)芯片数据读取与分析。

1.12细菌总RNA的提取

使用细菌总RNA快速抽提试剂盒对A.segnis总RNA进行提取。具体步骤如下：

(1)细菌清洗：吸取1mL对数生长期的A.segnis ATCC 33393细菌，12000g离心10min，除去上清后加入1mL DEPC水重悬清洗细菌，12000g离心10min后除去上清，再用DEPC水重复重悬清洗两遍。

(2)细菌裂解：彻底洗除培养基后，加入100μL溶菌酶，使溶菌酶的终浓度为400μg/mL，振荡混匀后，室温酶解5min，然后再加入900μL Buffer Rlysis-B震荡混匀后室温放置5min。

(3)萃取分离：向裂解样品中加入200μL氯仿，充分混匀。4℃，12000g离心5min，取上清。

(4)沉淀RNA：向上清液中加入1/3体积的无水乙醇，充分混匀后室温静置3min，4℃，12000g离心10min，小心倒掉上清，离心管底部白色沉淀即细菌的总RNA。

(5)清洗沉淀：用700μL的75％乙醇(DEPC水配制)小心清洗沉淀，4℃，12000g离心5min，小心倒掉上清，再重复一遍。

(6)浓度测定：吸走液体，晾干后加入10μL DEPC水溶解沉淀，充分混匀后用Nanophotometer测定提取的RNA浓度并记录。

1.13 Real-Time PCR

(1)逆转录：使用PrimeScript RT Master Mix逆转录试剂盒合成cDNA。逆转录反应体系如表5所示：

表5 RNA逆转录体系

冰上配制反应体系，反应条件为：37℃15min，85℃5s，合成好的cDNA置于-20℃保存用。

(2)引物设计：使用Primer3.0设计了A.segnis ATCC 33393中NCTC10977_00835(OCH1)，NCTC10977_00376(RfaF)，NCTC10977_00605(Rfaq_1)，NCTC10977_00605(Rfaq_2)，NCTC10977_00605(Rfaq_3)，NCTC10977_00780(LpxB)，NCTC10977_00729，NCTC10977_01271，NCTC10977_00649(WaaA)的特异引物，并以16S rDNA为内参，具体信息如表6所示：

表6 RT-PCR引物信息

将引物用灭菌水溶解，配制成0.1mM浓度的母液分装保存。

(3)RT-PCR：检测目的基因mRNA水平时，以16S rDNAV3-V4为内参基因，每个样本3个重复孔。使用Real-time PCR试剂盒进行RT-PCR反应，反应体系如表7所示：

表7 RT-PCR反应体系

反应扩增条件为：预变性95℃30s，设置40个循环：95℃5s，60℃30s，72℃30s。检测目的基因mRNA水平时，以16S rDNAV3-V4片段基因为内参基因，每个样本3个重复孔。使用bio-rad icycler5读取ct值，使用-ΔΔCT法计算不同样本基因表达差异。

1.14 CCK8实验

使用CCK8检测A.segnis对口腔细胞增殖能力的影响。选择生长状态良好的CAL-27和HOEC细胞，常规消化处理后收集细胞，用10mL DMEM培养液重悬细胞，用血球计数板对细胞计数(计数方法同4.3.1)，稀释至1×10⁴cells/mL后。按照每孔200μL将细胞悬液加至96孔板中，每孔大约2000个细胞。进行实验分组，对照组：包括正常细胞组和不同浓度的Fuc-BSA拟糖蛋白组；细菌组：正常细胞中加入不同数量的A.segnis(MOI 1，5，10，20和50)；Fuc-BSA处理细菌组：正常细胞中加入不同数量的Fuc-BSA处理的A.segnis(MOI 1，5，10，20和50)。每个组三个复孔。分别在0，12h，24h，36h，48h，72h进行CCK8检测，操作步骤如下：首先将96孔板中原培养液吸出，用无菌PBS清洗3遍，加入100μL DMEM培养液和10μL CCK8溶液，37℃孵育2h，随后使用酶标仪检测450nm波长的吸光度。

2、实验结果

2.1拟糖蛋白的合成

上述合成方法中，第一步单糖与5-(4-羟基苯基)戊酸反应条件为pH 3.0，60℃，200rpm，避光反应12h；第二步活化单糖与5-(4-羟基苯基)戊酸复合体的反应条件为pH6.0，50rpm，室温，避光反应4h；第三步活化后的复合体与BSA反应的条件为pH 9.0，室温避光反应4h。实验结果如图1所示，甘露糖拟糖蛋白，岩藻糖拟糖蛋白和半乳糖拟糖蛋白的带条相对于BSA均出现了明显的上移，表明了拟糖蛋白分子量的增大。

2.2质谱法推导拟糖蛋白含糖量

本实验利用LC-Q-TOF-MS对合成的拟糖蛋白进行了分子量的测定。结果如图2所示，对照组BSA分子量在62.8kD左右，甘露糖拟糖蛋白分子量在65.9kD左右，半乳糖拟糖蛋白分子量在66.0kD左右，岩藻糖拟糖蛋白分子量在65.6kD左右。那么根据理论公式：

(Man-Linker)n-BSA拟糖蛋白的分子量＝356*n₁+对照组BSA分子量；

(Gal-Linker)n-BSA拟糖蛋白的分子量＝356*n₂+对照组BSA分子量；

(Fuc-Linker)n-BSA拟糖蛋白的分子量＝340*n₃+对照组BSA分子量；

可以计算得到n₁＝8.9；n₂＝9.0；n₃＝8.5。

在假设每个5-(4-羟基苯基)戊酸均连接上了单糖，且单糖没有连接在BSA自身的游离羟基的基础上，平均每个BSA分子连接的单糖数量约为8.9个Man，9.0个Gal或者8.5个Fuc。

2.3地衣酚-硫酸法测定连接单糖的数量

本实验采用地衣酚-硫酸法进行糖浓度的测定，进一步推算单位BSA连接的单糖数量。结果如图3所示，图中左边1→6标示的为3种不同浓度单糖标准液的地衣酚-硫酸显色图，右边分别为三种单糖标准液的地衣酚-硫酸显色标准曲线，中间①②③标号的为三个稀释梯度下检测的拟糖蛋白显色图。根据标曲计算得到每300mg蛋白含有的12.36mg的Man，8.07mg的Gal和6.64mg的Fuc。换算后得到每个BSA分子连接的单糖数量约为14.4个Man，9.4个Gal或者8.5个Fuc。

2.4岩藻糖拟糖蛋白(Fuc-BSA)抑制了A.segnis对人舌鳞癌细胞CAL-27的黏附作用

将正常培养的细胞饥饿处理后加入1×10⁶A.segnis以及3-100μg/mL的Fuc-BSA。共孵育90min后，洗去未黏附的细菌，对细菌和细胞组分进行荧光标记，以便在共聚焦显微镜下观察细菌的黏附情况。结果如图4所示(FITC-d-Lys标记细菌，DiD指示细胞膜，DAPI指示细胞核)，岩藻糖拟糖蛋白在3μg/mL和10μg/mL浓度的情况下对A.segnis的黏附作用没有显著的影响，而在达到30μg/mL和100μg/mL的情况下能够观察到黏附至CAL-27细胞上的细菌数量显著减少。而30μg/mL以及100μg/mL的Man-BSA和Gal-BSA对CAL-27细胞的黏附作用均没有显著的影响(图5)。

2.5岩藻糖拟糖蛋白(Fuc-BSA)抑制了A.segnis对口腔上皮细胞HOEC的黏附作用

同样的结果在另一株人口腔正常上皮细胞中(Human Oral Epithelial Cell，HOEC)得到验证。30μg/mL和100μg/mL Fuc-BSA同样能够影响A.segnis对HOEC的黏附作用，并且这种影响与BSA和单糖岩藻糖无关(图6)。

2.6岩藻糖拟糖蛋白改变了A.segnis外膜糖型的表达

结果如图7所示，30μg/mL和100μg/mL Fuc-BSA浓度下培养四天后的A.segnis外膜糖型存在显著差异。其中存在九种凝集素Jacalin，GSL-II，EEL，GSL-I，DSA，ACA，WGA，PHA-E+L和SNA的NFIs值随着Fuc-BSA浓度的升高而下降，三种凝集素PHA-E，LEL以及MAL-I的NFIs随着Fuc-BSA浓度的增加而增加(图7)。NFIs发生显著改变的12种凝集素识别的糖链类型如表8所示。

表8凝集素特异性识别的糖链

2.7 Fuc-BSA刺激细菌影响了细菌糖基转移酶mRNA的表达

A.segnis中存在八个LPS合成相关的糖基转移酶(NCTC10977_00376(RfaF)，NCTC10977_00605(Rfaq_1)，NCTC10977_00652(Rfaq_2)，NCTC10977_00728(Rfaq_3)，NCTC10977_00780(LpxB)，NCTC10977_00729，NCTC10977_01271和NCTC10977_00649(WaaA))。针对这八个糖基转移酶设计特异性引物进行qPCR实验。结果如图8所示，qPCR结果显示了存在三种LPS相关糖基转移酶的mRNA水平存在显著差异，包括NCTC10977_00605(Rfaq_1)，NCTC10977_00729和NCTC10977_00649(WaaA)在Fuc-BSA处理后的细菌中均表现出显著下调表达。

2.8 Fuc-BSA降低了A.segnis的细胞毒性

(1)拟糖蛋白Fuc-BSA不影响细胞的增殖能力

如图9所示，CCK8检测细胞增殖实验结果显示0-100μg/mL的拟糖蛋白Fuc-BSA处理组HOEC和CAL-27细胞与对照组细胞相比OD 450吸光值无明显变化，这表明了0-100μg/mL的Fuc-BSA对HOEC和CAL-27细胞的增殖能力均没有显著的影响。

(2)拟糖蛋白Fuc-BSA降低了A.segnis的细胞毒性(对细胞增殖的影响)

如图10所示，不同浓度A.segnis和Fuc-BSA treatedA.segnis(MOI 1，5，10，20和50)处理组HOEC细胞的OD 450吸光值与对照组存在显著的差异，随着细菌浓度的增加OD450吸光度下降，说明了无论是A.segnis还是经过Fuc-BSA treated A.segnis均会引起细胞增殖能力的下降。但是Fuc-BSA treated A.segnis对HOEC细胞的半抑制浓度(IC50)为16.4MOI，而正常A.segnis对HOEC细胞的IC50为10.67MOI。说明了Fuc-BSA的处理降低了A.segnis的毒性。趋势一致的结果也在CAL-27细胞系实验中得到了体现(图11)，Fuc-BSAtreated A.segnis对CAL-27细胞的IC50为12.3MOI，而正常A.segnis对CAL-27细胞的IC50为9.72MOI。而Fuc-BSA本身并不会对A.segnis的增殖水平产生影响，因此说明了Fuc-BSA通过影响A.segnis，降低了A.segnis的细胞毒性。

Claims (8)

1.惰性凝集杆菌(Aggregatibacter segnis，A.segnis)的抑制剂，其特征在于：作用于口腔，活性成分包括基于牛血清白蛋白的岩藻糖拟糖蛋白(Fuc-BSA)；所述基于牛血清白蛋白的岩藻糖拟糖蛋白(Fuc-BSA)的浓度大于30μg/mL；

所述牛血清白蛋白的岩藻糖拟糖蛋白(Fuc-BSA)的合成方法包括以下步骤：

1)岩藻糖与5-(4-羟基苯基)戊酸偶联；

2)活化5-(4-羟基苯基)戊酸-糖链复合物上的羧基；

3)BSA与活化的5-(4-羟基苯基)戊酸-糖链复合物反应。

2.根据权利要求1所述的抑制剂，其特征在于：所述基于牛血清白蛋白的岩藻糖拟糖蛋白(Fuc-BSA)的分子量为65.6kD，平均每个BSA分子连接的单糖数量为8.5个Fuc。

3.根据权利要求1所述的抑制剂，其特征在于：步骤1)的反应条件为pH 3.0，60℃，200rpm，避光反应12h；步骤2)的反应条件为pH 6.0，50rpm，室温，避光反应4h；步骤3)的反应条件为pH 9.0，室温避光反应4h。

4.根据权利要求3所述的抑制剂，其特征在于，步骤3)之后，还进行以下步骤：

4)透析：将合成产物装入14000Da的透析袋中，置于磁力搅拌器上于4℃环境中连续透析2-3天，每8h换液一次，彻底除去盐类以及未连接至BSA上的小分子化合物；

5)过膜：将透析后溶液先用0.45μm滤膜过滤除去不溶物，然后用0.22μm滤膜过滤除菌。

5.基于牛血清白蛋白的岩藻糖拟糖蛋白(Fuc-BSA)在制备惰性凝集杆菌(Aggregatibacter segnis，A.segnis)的抑制剂方面的用途；所述基于牛血清白蛋白的岩藻糖拟糖蛋白(Fuc-BSA)的浓度大于30μg/mL；

所述牛血清白蛋白的岩藻糖拟糖蛋白(Fuc-BSA)的合成方法包括以下步骤：

1)岩藻糖与5-(4-羟基苯基)戊酸偶联；

2)活化5-(4-羟基苯基)戊酸-糖链复合物上的羧基；

3)BSA与活化的5-(4-羟基苯基)戊酸-糖链复合物反应。

6.基于牛血清白蛋白的岩藻糖拟糖蛋白(Fuc-BSA)在制备用于预防由惰性凝集杆菌(Aggregatibacter segnis，A.segnis)引起的疾病的药品方面的用途，所述药品作用于口腔；

所述牛血清白蛋白的岩藻糖拟糖蛋白(Fuc-BSA)的合成方法包括以下步骤：

1)岩藻糖与5-(4-羟基苯基)戊酸偶联；

2)活化5-(4-羟基苯基)戊酸-糖链复合物上的羧基；

3)BSA与活化的5-(4-羟基苯基)戊酸-糖链复合物反应。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述由惰性凝集杆菌(Aggregatibactersegnis，A.segnis)引起的疾病包括心内膜炎、阑尾炎、胆囊炎和/或胰腺脓肿。

8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述药品的制剂形式为凝胶、贴片、咀嚼片、喷雾或漱口水。

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