CN117625500B - 一种胃梭菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种胃梭菌及其应用，属于微生物技术领域。本发明的胃梭菌为胃梭菌Clostridium ventriculi SYSU‑12保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27761，保藏日期为2023年6月30日。本发明通过采集PD‑1抗体治疗响应的胃癌患者粪便样本，经过连续稀释法厌氧培养分离、纯化得到粪便中的优势菌株SYSU‑12，通过革兰氏染色、显微镜镜检、单菌落形态观察以及分子生物学实验鉴定为胃梭菌Clostridium ventriculi。本发明提供的胃梭菌及其成分可以用于制备免疫激活剂，肿瘤抑制剂及相应的药物或保健食品。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种胃梭菌及其应用。
背景技术
最近几年PD-1/PD-L1阻断剂的免疫疗法已应用于胃癌治疗，其突破了1年生存期瓶颈，但多数患者仍旧获益有限。胃癌抗原性差，免疫浸润少，是传统意义上的“冷肿瘤”。在免疫检查点抑制剂（Immune checkpoint inhibitors，ICIs）治疗中，免疫炎性型“热肿瘤”更敏感。如何将冷肿瘤转变成热肿瘤，提高对肿瘤免疫疗法的响应率和治疗效果，迫切需要解决的问题。
近年来，许多研究发现肿瘤免疫治疗疗效与患者肠道菌群相关，肠道微生物组成与免疫治疗的临床反应之间存在显著的关联。在肺癌，结肠癌模型等多种动物实验种证实了双歧杆菌，阿克曼菌和粪杆菌等细菌对ICIs治疗的增强作用。但上述热门细菌均在胃中难以存活，寻找适应胃生态环境的有效单菌种或多菌种是增强胃癌免疫治疗更佳的解决方向。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种对免疫细胞具有促炎效应，促其分泌趋化因子激活T细胞效应发挥抗肿瘤效应，使“冷”肿瘤转变为“热”肿瘤的胃梭菌及其应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
第一方面，本发明提供了一种胃梭菌，所述胃梭菌为胃梭菌Clostridiumventriculi SYSU-12，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 27761，保藏日期为：2023年6月30日。
本发明通过采集PD-1抗体治疗响应的胃癌患者粪便样本，经过连续稀释法厌氧培养分离、纯化得到粪便中的优势菌株SYSU-12，通过革兰氏染色、显微镜镜检、单菌落形态观察以及分子生物学实验鉴定为胃梭菌Clostridium ventriculi。
胃梭菌Clostridium ventriculi，旧称胃八叠球菌（Sarcina ventriculi），是一种革兰氏阳性厌氧细菌，可产芽孢，能够在酸性环境中存活和生长，具有较好抗逆性，常见于上消化道，可在人胃中定植、增殖。胃梭菌属于梭状芽孢杆菌科，常以四分体或八分体的形式存在，直径为1.8-3.0μm。
作为本发明所述胃梭菌的优选实施方式，所述胃梭菌Clostridium ventriculiSYSU-12的16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过对SYSU-12的16S rRNA进行PCR扩增、测序、比对、建树，鉴定SYSU-12为胃八叠球菌（胃梭菌）。
作为本发明所述胃梭菌的优选实施方式，所述胃梭菌Clostridium ventriculiSYSU-12分离自PD-1抗体治疗响应的胃癌患者粪便。
第二方面，本申请提供了一种胃梭菌培养物，由上述胃梭菌Clostridiumventriculi SYSU-12制备得到。
作为本发明所述胃梭菌培养物的优选实施方式，所述胃梭菌培养物中含有胃梭菌活菌、胃梭菌菌体成分及其衍生物和胃梭菌代谢物中的至少一种。本发明的胃梭菌培养物为胃梭菌活菌、胃梭菌灭活菌体、含有胃梭菌的生物材料以及胃梭菌生长过程所分泌的代谢物。
作为本发明所述胃梭菌培养物的优选实施方式，所述胃梭菌培养物主要由以下方法中的至少一种制备得到：
方法一：刮取活化后的胃梭菌SYSU-12菌体至无菌溶剂中，制备为胃梭菌SYSU-12菌悬液，所述胃梭菌SYSU-12菌悬液为胃梭菌培养物；
方法二：刮取活化后的胃梭菌SYSU-12单菌落接种于培养基中培养后，离心，所得上清为胃梭菌培养物；
方法三：刮取活化后的胃梭菌SYSU-12单菌落接种于培养基中培养后，转入生物反应器批量发酵，所得发酵液为胃梭菌培养物；
方法四：刮取活化后的胃梭菌SYSU-12单菌落接种于培养基中培养后，离心，将所得沉淀重悬至溶剂中，115-130℃高温灭菌15-30min，所得灭活后的菌悬液为胃梭菌培养物。本发明的胃梭菌培养物制备方法并不唯一，只要是由胃梭菌培养得到的产品即为胃梭菌培养物。
作为本发明所述胃梭菌培养物的优选实施方式，所述制备方法的方法一中，所述溶剂包括但不限于磷酸盐缓冲液、二甲基亚砜、生理盐水、水中的至少一种。
作为本发明所述胃梭菌培养物的优选实施方式，所述胃梭菌培养物中的胃梭菌SYSU-12菌体含量不低于1×106CFU。
第三方面，本发明提供了上述胃梭菌或其培养物在制备预防和/或治疗肿瘤制品中的应用。根据实验发现，灭活后的胃梭菌仍具有一定的抗肿瘤活性，这说明胃梭菌及其培养物均具有较好的抗肿瘤活性。
第四方面，本发明提供了上述胃梭菌或其培养物在制备预防和/或治疗肿瘤制品中应用。本发明通过动物实验发现胃梭菌具有较好的抑制微卫星稳定（MSS型）结直肠癌、黑色素瘤及胃癌等冷肿瘤生长及转移的效果，能够有效防止以结直肠癌、黑色素瘤和胃癌为代表的肿瘤的生长和转移。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述制品包括药品、食品和保健品中的至少一种。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述肿瘤包括恶性肿瘤、转移性肿瘤或非转移性肿瘤中的至少一种。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述肿瘤的种类包括但不限于：肾上腺皮质癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺癌、胰腺癌、宫颈癌、胆管癌、结肠癌、结直肠癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、多形成性胶质细胞瘤、胶质瘤、头颈癌、肾嫌色细胞癌、混合肾癌、肾癌、白血病、淋巴瘤、脑癌、肝癌、肺腺癌、肺鳞癌、间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌、嗜铬细胞瘤、副神经节瘤、前列腺癌、直肠腺癌、肉瘤、皮肤黑色素瘤、胃癌、胃肠道间质瘤、食管癌、睾丸癌、甲状腺癌、胸腺癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、葡萄膜黑色素瘤和软组织肉瘤中的至少一种。
第五方面，本发明提供了上述胃梭菌或其培养物联合免疫检查点抑制剂在制备治疗肿瘤药物中的应用。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述免疫检查点抑制剂为作用于T细胞负性共刺激分子和/或其配体的抑制剂、作用于T细胞负性共抑制分子和/或其配体抑制剂中的至少一种。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述T细胞负性共刺激分子配体或T细胞负性共抑制分子配体选自CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、B7-1、B7-2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、A2AR、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA、TIGIT、LAG-3、CD40、KIR、CEACAM1、GARP、PS、CSF1R、CD94/NKG2A、TDO、TNFR和DcR3中的至少一种。
第六方面，本发明提供了上述胃梭菌SYSU-12或其培养物在制备免疫刺激剂中的应用。本发明通过实验发现胃梭菌能够刺激免疫细胞分泌趋化因子激活T细胞效应，加强了CD8+T细胞对肿瘤组织的浸润。
第七方面，本发明提供了一种胃梭菌制剂，包括上述胃梭菌或胃梭菌培养物。
作为本发明所述制剂的优选实施方式，所述胃梭菌制剂的给药方式包括口服、静脉注射、瘤内注射和癌旁注射中的至少一种。
作为本发明所述制剂的优选实施方式，所述制剂还包括药学上可接受的载体和辅料。
作为本发明所述制剂的优选实施方式，所述制剂的剂型包括但不限于冻干粉、粉剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂和针剂中的至少一种。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明通过采集PD-1抗体治疗响应的胃癌患者粪便样本，经过连续稀释法厌氧培养分离、纯化得到粪便中的优势菌株SYSU-12，通过革兰氏染色、显微镜镜检、单菌落形态观察以及分子生物学实验鉴定为胃梭菌Clostridium ventriculi。
2、本发明的胃梭菌为产孢子菌，具有天然的抗逆性，耐热，耐胃酸及胆盐。口服可滞留于胃部和肠道，对多种抗生素敏感。
3、本发明通过使用胃梭菌Clostridium ventriculi SYSU-12单菌或其联合免疫检查点抑制剂对植瘤小鼠进行抗肿瘤治疗，发现本发明筛选的胃梭菌SYSU-12可以刺激产生的抗肿瘤免疫保护反应，重塑肿瘤微环境，使“冷”肿瘤转变为“热”肿瘤。并且，胃梭菌SYSU-12显著增强免疫检查点抑制剂对胃癌的治疗效果，不仅能够抑制肿瘤原位生长同时能够抑制肿瘤细胞的转移且安全性良好。
附图说明
图1为实施例1中分离纯化得到的胃梭菌基本形态，其中A为革兰氏染色镜检结果（比例尺为10μm），B为电镜结果（比例尺为0.5μm），C为培养基上的菌落形态；
图2为实施例1中分离纯化得到的胃梭菌16S rRNA系统发育树；
图3为效果例1中胃梭菌耐酸实验结果；
图4为效果例1中胃梭菌耐胆盐实验结果；
图5为效果例2中A图为胃梭菌入瘤实验示意图，B图为肿瘤匀浆活菌培养结果与培养物涂片镜检结果（比例尺为10 μm）；
图6为效果例3中胃梭菌抗B16-F10肿瘤实验小鼠肺组织重量；
图7为效果例3中胃梭菌抗B16-F10肿瘤实验示意图（A图）和结果图（B图为不同处理组脾脏及肺部变化，C图为主要器官HE染色切片）；
图8为效果例4中口服胃梭菌活菌抗MFC肿瘤实验示意图（A图）和肿瘤体积结果统计图（B图）；
图9为效果例5中口服胃梭菌死菌抗CT26肿瘤实验示意图（A图）和肿瘤体积结果统计图（B图）；
图10为效果例6中胃梭菌活菌与死菌刺激巨噬细胞产生CXCL10结果图；
图11为效果例6中Transwell评估CD8+T细胞肿瘤趋向性实验示意图；
图12为效果例6中不同处理及不同癌细胞的Transwell下室中CD8+T细胞数量统计结果；
上述图中“”表示为两组间具有显著性差异p＜0.05；“/>”表示为两组间具有显著性差异p＜0.01；“/>”表示为两组间具有显著性差异p＜0.005。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
在以下实施例、对比例及实验例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
在以下实施例、对比例及实验例中，所出现的“Clostridium ventriculi”、“胃梭菌”、“胃梭菌SYSU-12”、“C. ventriculi”、“Cv”均代指胃梭菌Clostridium ventriculiSYSU-12。
实施例、对比例及实验例中所用的其他材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
MRS培养基：取66.2 g MRS培养基干粉加入1000 mL水中，充分溶解后放入121℃高压灭菌20 min，冷却后备用，MRS培养基干粉购自环凯（HKM），货号为027312。
BHI培养基：取37 g BHI培养基干粉加入1000 mL水中，充分溶解后放入121℃高压灭菌20 min，冷却后备用，BHI培养基干粉购自环凯（HKM），货号为BR250g。
CBA培养基：取41.2g CBA培养基干粉加入1000 mL水中，充分溶解后放入121℃高压灭菌20 min，冷却后备用，CBA培养基干粉购自环凯（HKM），货号为024064。
改良MRS液体培养基：取酵母粉5g、无水乙酸钠5g、无水葡萄糖30g、蛋白胨10g、七水合硫酸镁0.1g、三水合磷酸氢二钾2.6g、一水合硫酸锰0.05g、柠檬酸氢二铵2g、吐温-801g和L-半胱氨酸盐酸盐1g加入1000mL水中，充分溶解后放入121℃高压灭菌20 min，冷却后备用；改良MRS固体培养基为在液体培养基基础上加入15g/L琼脂粉末制备得到。
冻干保护剂包括0.5-2.5wt%脱脂奶粉、2-6wt%海藻糖聚合物、0.2-0.4wt%谷氨酸钠和水。
复合保护剂包括5wt%钙盐、0.25-0.35wt%阿拉伯胶、5wt%麦芽糊精和0.15-0.25wt%二氧化硅。
干燥保护剂包括10wt%脱脂奶粉、10wt%菊粉、10wt%低聚糖和0.15-0.25wt%二氧化硅。
细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技公司，货号为DP302-02。
C57BL/6和Balb/c小鼠购自中山大学东校园实验动物中心。615小鼠购买自中国医学科学院血液病医院。
黑色素瘤细胞B16-F10购自丰晖生物（Fenghbio），货号CL0039。
直肠癌细胞CT26购自赛百慷（iCell），货号iCell-m014；结肠癌细胞MC38购自赛百慷（iCell），货号iCell-m032；前胃癌细胞MFC购自赛百慷（iCell），货号iCell-m035；巨噬细胞RAW264.7购自赛百慷（iCell），货号iCell-m047；胃癌细胞AGS购自赛百慷（iCell），货号iCell-h016。
CXCL10 RT-qPCR引物合成自上海生工，序列为如下（5'-3'）：
Forward-ATCATCCCTGCGAGCCTATCCT；
Reverse-GACCTTTTTTGGCTAAACGCTTTC。
实施例1
本实施例提供了胃梭菌Clostridium ventriculiSYSU-12的分离纯化方法，包括以下步骤：
1.粪便样本收集及细菌分离
1.1将沾取粪便样本的棉签放入含有20 mL细菌冻存液的细胞培养瓶中，封入厌氧袋，置于冰盒中保存、运输。粪便来源于PD-1抗体治疗响应（Anti-PD-1 therapy respond，PR）的胃癌患者，所采样的粪便为离体10分钟内的新鲜粪便。
1.2振荡含有粪便样本的细胞培养瓶，使粪便样本脱落至细菌冻存液中，按照10倍梯度对含有粪便样本的细菌冻存液进行连续稀释10次，分别取20 μL每个梯度的稀释液涂布于MRS、BHI、CBA培养基中，在37℃、厌氧条件下培养48-72 h，选择长有5-100个单菌落的平板进行纯化。采用PBS缓冲液作为稀释液。
2粪便细菌的纯化
2.1随机挑取单菌落至20 μL PBS中，吹打混匀后取15 μL菌悬液涂布至同种平板中，相同条件培养48-72 h，剩余5 μL菌悬液用于革兰氏染色。
2.2将步骤2.1所得长有单菌落的平板进一步纯化，连续转板3-5次，直至同一平板中均为同一菌落形态为止，每次转板需采用相同的培养基和培养条件。
2.3挑取步骤2.2中纯化好的单菌落至无菌冻存液中，吹打混匀，在-80℃下保存，同时留存适量菌液用于提取细菌基因组DNA；所述无菌冻存液由30%甘油+高温灭菌的BHI液体培养基配制得到。
3胃梭菌的鉴定
3.1将步骤2.1所剩余的5 μL菌悬液进行革兰氏染色，于载玻片中央滴加挑取单菌落时制备的5 μL菌液，使用酒精灯间歇烘烤固定，滴加结晶紫染色液覆盖1 min，流水洗涤，然后滴加卢戈碘液碘染1 min，流水洗涤，再用脱色酒精覆盖载玻片表面20-30 s，期间轻轻摇晃载玻片，流水洗去酒精后使用番红染液复染1 min，流水洗涤，待载玻片干燥后使用光学显微镜镜检观察细菌形态。若菌落不纯，存在一种以上的细菌形态，则对样本进行平板划线接种，培养后重新挑取单菌落（重复步骤2.1-2.3）。
3.2将步骤2.3中留存的适量菌液按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取细菌基因组DNA，采用细菌分子鉴定通用引物16S rRNA、稀释后的基因组DNA作为模板、在PCRmix的作用下进行PCR扩增，PCR扩增程序如表1所示，得到PCR产物。
3.3取5 μL所得PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定为特异性扩增，将剩余的PCR产物送至上海生工进行测序，得到PCR产物的核酸序列。
3.4采用ChromasPro软件将PCR产物的核酸序列进行拼接，并在NCBI数据库（blast.ncbi.nlm.nih.gov）中进行比对，根据比对结果鉴定编号SYSU-12的细菌为胃梭菌Clostridium ventriculi，利用MEGA7软件采用NJ法、重复1000次以构建SYSU-12的系统发育树，基本形态图见图1，系统发育树见图2。
表1 PCR扩增程序
将鉴定为胃梭菌Clostridium ventriculi的SYSU-12保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2023年6月30日，保藏编号为CGMCC No. 27761，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例2
本实施例提供了一种胃梭菌培养物及其制备方法，所述胃梭菌培养物的制备方法包括以下步骤：
（1）吸取20 μL步骤2.3所得胃梭菌冻存液涂布至CBA固体培养基中，37℃培养36h，得到活化后的胃梭菌；
（2）刮取步骤（1）所得的活化后的胃梭菌至100 μL无菌磷酸盐缓冲液中，重悬，制备为胃梭菌菌悬液，所得胃梭菌菌悬液即为胃梭菌培养物。
实施例3
本实施例提供了一种胃梭菌培养物和制剂及其制备方法，所述胃梭菌培养物和制剂的制备方法包括以下步骤：
（1）将胃梭菌接种于改良MRS固体培养基中，恒温培养后将所得菌落以接种量为2-3wt％接种于改良MRS液体培养基中继续37℃恒温培养10-30 h得到种子液；将得到的种子液以接种量3-4％(v/v)接种于液体培养基中，37℃恒温培养10-20 h后得到菌液，将菌液离心，弃去上清，收集菌泥，所得菌泥即为胃梭菌培养物；
（2）按照菌泥：生理盐水=1:1-5的质量比将步骤（1）所得菌泥重悬于生理盐水中，用1-3wt％的氢氧化钠水溶液调节pH至6-7后，按照冻干保护剂：菌泥=2-5:1的质量比加入冻干保护剂后在无菌条件下混合均匀，冷冻干燥，得到胃梭菌冻干粉剂，所得胃梭菌冻干粉剂即为胃梭菌制剂。
实施例4
本实施例提供了胃梭菌培养物和制剂及其制备方法，所述胃梭菌培养物和制剂的制备方法包括以下步骤：
（1）改良MRS液体培养基加入发酵罐后115-121℃灭菌15-20 min，搅拌降温；通氮气至溶氧归零，再降温至35-40℃；将胃梭菌接种至上述改良MRS液体培养基，而后再通入氮气1 L/min，通氮气40 min；停止通气和排气，并保持正压0.015-0.025 Mpa，温度为35-37℃，转速为150rpm，进行发酵，厌氧发酵到发酵晚期产芽孢时36h放罐，得到胃梭菌种子液；
（2）将改良MRS液体培养基加入发酵罐后115-121℃灭菌15-20 min，降温至85-95℃，通氮气至溶氧归零，再降温至35-40℃后调节pH至6.8-7.0，将步骤（1）所的胃梭菌种子液移种至所述培养基，而后以流量20-50 m3/h通入氮气20-30 min；
（3）停止通气和排气，并保持正压0.015-0.025 Mpa，在35-37℃、150 rpm下发酵，直至芽孢形成后停止发酵，离心，保留沉淀，所得沉淀即为胃梭菌培养物；在上述发酵过程中，通入氨水调节pH维持在8.0；
（4）将步骤（3）所得沉淀与复合保护剂混合后在进风温度170-180℃、出风温度70-80℃下进行喷雾干燥，得到喷雾干燥菌粉，所得喷雾干燥菌粉即为胃梭菌制剂。
实施例5
本实施例提供了胃梭菌制剂及其制备方法，所述胃梭菌制剂的制备方法包括以下步骤：
（1）按照实施例3步骤（1）制备得到菌泥；
（2）按照菌泥：生理盐水=1:1-5的质量比将步骤（1）所得菌泥重悬于生理盐水中，高温灭菌后，按照菌泥：干燥保护剂=1:2-5的质量比加入干燥保护剂后在无菌条件下混合均匀，在进风温度170-180℃、出风温度70-80℃下进行喷雾干燥，得到胃梭菌灭活菌粉，所得胃梭菌灭活菌粉即为胃梭菌制剂。
效果例1
对实施例1分离得到的胃梭菌进行生理生化实验，具体步骤如下：
1、耐酸实验。
挑取活化后的胃梭菌单菌落至CBA液体培养基中，37℃、150 rpm振荡培养至生长对数期（菌液浓度约为1×107CFU/mL），分别吸取10 μL菌液至990 μL pH分别为0、1、2的酸液中，另取10 μL菌液加入990 μL无菌PBS中作为空白对照，将菌液与酸液或PBS混匀后，于37℃下静置1 h；
静置后在12000 rpm下离心1 min，弃上清，加入990 μL PBS重悬，重复离心步骤至无酸液残留，取20 μL菌悬液涂布至CBA培养基中进行平板计数，统计结果见图3。
如图3所示，本发明的胃梭菌在pH=1-2的条件下仍能正常生长，具有较好的耐酸特性。
2、耐胆盐实验。
挑取活化后的胃梭菌单菌落至CBA液体培养基中，37℃、150 rpm振荡培养至生长对数期（菌液浓度约为1×107CFU/mL），分别吸取10 μL菌液至990 μL 0.5wt%牛胆盐溶液中，另取10 μL菌液加入990 μL无菌PBS中作为空白对照，将菌液与牛胆盐溶液或PBS混匀后，分别于37℃、厌氧环境下静置0.5、1和2 h；
静置后在12000 rpm下离心1 min，弃上清，加入990 μL PBS重悬，重复离心步骤至无牛胆盐残留，取20 μL菌悬液涂布至CBA培养基中进行平板计数，统计结果见图4。
如图4所示，本发明的胃梭菌在0.5%牛胆盐溶液中静置0.5-2h仍能正常生长，具有较好的耐胆盐特性。
以上结果表明，本发明的胃梭菌具有较好的耐酸耐胆盐特性，在胃肠道具有较好的抗逆性，具有优异的产业化开发潜力。
3、药敏试验。
挑取1环活化后的胃梭菌单菌落至2 mL无菌PBS中，用灭菌棉棒反复蘸取上述菌液，均匀涂布于CBA平板上；
待平板上的菌液吸收后，用镊子将药敏纸片放置在平板上，37℃正置培养36 h，测量药敏纸片附近抑菌圈大小，结果见表2。
所采用的药敏纸片分别含有青霉素（PEN）、庆大霉素（GEN）、头孢曲松（CTR）、环丙沙星（CIP）、氯霉素（CLM）、红霉素（E）、四环素（TET）、林可霉素（LIN）、复方新诺明（T/S）
表2药敏实验统计结果
如表2所示，抗生素PEN、CIP、CLM、E和TET均对本发明的胃梭菌具有较强的抑制效果，表明本发明的胃梭菌对常见的抗生素具有较好的敏感性，使用过程中产生的耐药风险较小。
效果例2
为了验证胃梭菌对厌氧肿瘤部位的趋向性，通过动物实验进行胃梭菌的入瘤实验，具体方案如下：
选用4-6周龄的雄性C57BL/6小鼠作为实验对象，分为两组，每组8只，具体操作见图5中的A和表3，在胃梭菌处理后96 h对小鼠后颈椎脱臼处死，在超净台内摘取肿瘤匀浆为肿瘤悬液，涂布至CBA培养基进行活菌培养以及镜检，结果见图5中的B。
表3各组小鼠处理
如图5中的B所示，通过灌胃给药以及尾静脉注射给药两种方式均能在肿瘤涂片中观察得到胃梭菌SYSU-12（如箭头所示），其中尾静脉注射的给药方式富集到肿瘤内的细菌数量远高于灌胃组，表明本发明的胃梭菌可以通过体内的途径，从胃肠道异位进入血液循环系统到达肿瘤部位，具有一定的肿瘤部位趋向性。
效果例3
为了验证胃梭菌治疗肿瘤的效果及安全性，以黑色素瘤作为肿瘤的代表进行动物实验，具体如下：
1、实验设计。
以4-6周龄的雄性C57BL/6小鼠作为实验对象，将小鼠分为两组，每组5只，具体操作见图7中的A和表4，在植瘤后定期观察的小鼠体重，在植瘤30天后对小鼠进行安乐死并取出肿瘤组织和各主要器官组织，对肺组织和脾组织进行称重，对心肝脾肾等主要器官进行切片HE染色，结果见图6及图7中的B和图7中的C。
表4各组小鼠处理
2、实验结果。
如图6及图7中的B所示，与对照组相比，经胃梭菌处理的小鼠肺转移现象显著降低。对照组小鼠的肺部出现黑色素瘤，而处理组小鼠的肺部黑色素瘤较少，且处理组小鼠的肺部的重量显著低于对照组，表明本发明的胃梭菌具有防止肿瘤转移的效果。如图7中的C所示，主要器官HE切片未见器质性改变说明胃梭菌单用具有良好的安全性。
效果例4
为了进一步验证口服胃梭菌活菌联合免疫检查点抑制剂治疗肿瘤的效果，以PD-1抑制剂为免疫检查点抑制剂的代表联合胃梭菌进行胃癌细胞MFC小鼠抗肿瘤实验，具体方案如下：
1、用4-6周龄的雄性615小鼠作为实验对象，分为四组，每组5只，具体操作及流程见图8中的A和表5。
表5各组小鼠处理
在植瘤后的第11、13、15、17、12、19、天记录肿瘤体积，结果见图8中的B。
如图8中的B所示，与单用PD-1抑制剂和口服胃梭菌相比，联用胃梭菌及PD-1抑制剂组的肿瘤体积生长更加缓慢，说明口服给药方式下，胃梭菌SYSU-12对PD-1抑制剂的抗肿瘤效应具有一定增强作用。
效果例5
为了验证口服灭活胃梭菌是否具有治疗肿瘤转移的效果，以CT26结直肠癌细胞作为肿瘤的代表进行动物实验，具体方案如下：
1、用3-5周龄的雄性Balb/c小鼠作为实验对象，分为两组，每组5只，具体操作及流程见图9中的A和表6。
表6各组小鼠处理
在植瘤后的第6、9、12、15、18、21、24天记录肿瘤体积，结果见图9中的B。
如图9中的B所示，与对照组相比口服灭活胃梭菌组的肿瘤体积生长更加缓慢，说明口服给药方式下，灭活的胃梭菌SYSU-12也具有一定的抗肿瘤活性。
效果例6
为证明胃梭菌SYSU-12具有激活免疫作用，将SYSU-12与小鼠巨噬细胞（RAW264.7）共培养之后取上清液作用测定CXCL10的含量。
具体操作如下：
（1）将巨噬细胞分别与胃梭菌活菌和灭活后的胃梭菌以MOI（感染复数）1:100共培养24h取细胞及上清进行后续操作；
（2）提取细胞RNA逆转录之后进行RT-qPCR检测CXCL10表达水平或CXCL10 ELISA试剂盒测定上清液中的ELISA含量。
（3）CXCL10表达水平RT-qPCR结果统计结果见图10中的A，ELISA含量检测结果见图10中的B。
如图10所示，培养一段时间以后，胃梭菌SYSU-12活菌和死菌均能显著提高了巨噬细胞CXCL10的表达。说明胃梭菌能够激活促“冷”肿瘤转变成热肿瘤关键的细胞因子，由于胃梭菌活菌及死菌均有该功效，说明该功效成分为胃梭菌菌体组分。
效果例7
为证明胃梭菌SYSU-12具有增加肿瘤组织免疫浸润，将“冷”肿瘤转变成热肿瘤的功效，以结直肠癌细胞（MC38）和胃癌细胞（AGS）为例，将癌细胞与胃梭菌共培养之后取上清液作用于从人外周血提取的原代CD8+T细胞，通过Transwell实验观察CD8+T细胞肿瘤趋向性是否增加。
实验原理图如图11所示，具体操作如下：
（1）将癌细胞与细菌以MOI（感染复数）1:100共培养24h取上清进行后续操作；
（2）通过磁珠分选人外周血中的CD8+T细胞；
（3）Transwell实验：将细胞密度调为3×105 cell/mL。将500 µL的对照培养基、细菌共培养培养基加添加到下部孔中，小室内则加入含0.3%v/vFBS的1640培养基、6×107cell/mL单细胞悬液，培养6-8小时。
（4）细胞计数：在荧光显微镜下给下室细胞拍照，每孔拍9个视野，计数，统计结果见图12。
如图12所示，培养一段时间以后，一部分细胞穿过Transwell小室，迁移到下室，在显微镜下可看到掉落的细胞。在两次实验中加入胃梭菌共培养组下室的细胞数均多于对照，说明胃梭菌能够增强CD8+T细胞对肿瘤组织的浸润，表明胃梭菌SYSU-12具有增加肿瘤组织免疫浸润，将“冷”肿瘤转变成热肿瘤的功效。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (7)
1.一种胃梭菌，其特征在于，所述胃梭菌为胃梭菌（Clostridium ventriculi） SYSU-12，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27761，保藏日期为2023年6月30日。
2.一种胃梭菌培养物，其特征在于，由权利要求1所述胃梭菌（Clostridiumventriculi） SYSU-12制备得到；
所述胃梭菌培养物由以下方法中的至少一种制备得到：
方法一：刮取活化后的胃梭菌SYSU-12菌体至无菌溶剂中，制备为胃梭菌SYSU-12菌悬液，所述胃梭菌SYSU-12菌悬液为胃梭菌培养物；
方法二：刮取活化后的胃梭菌SYSU-12单菌落接种于培养基中培养后，转入生物反应器批量发酵，所得发酵液为胃梭菌培养物；
方法三：刮取活化后的胃梭菌SYSU-12单菌落接种于培养基中培养后，离心，将所得沉淀重悬至溶剂中，115-130℃高温灭菌15-30min，所得灭活后的菌悬液为胃梭菌培养物。
3.如权利要求2所述胃梭菌培养物，其特征在于，所述胃梭菌培养物中含有胃梭菌活菌或灭活菌中的至少一种。
4.如权利要求1所述胃梭菌或权利要求2所述胃梭菌培养物在制备预防和/或治疗肿瘤制品中的应用；所述肿瘤为结直肠癌、胃癌和黑色素瘤中的至少一种。
5.如权利要求1所述胃梭菌或权利要求2所述胃梭菌培养物联合免疫检查点抑制剂在制备治疗肿瘤药物中的应用；所述肿瘤为结直肠癌、胃癌和黑色素瘤中的至少一种。
6.如权利要求1所述胃梭菌或权利要求2所述胃梭菌培养物在制备免疫刺激剂中的应用；所述免疫刺激剂能够刺激免疫细胞分泌趋化因子激活T细胞效应，加强CD8+T细胞对肿瘤组织的浸润。
7.一种胃梭菌制剂，其特征在于，所述胃梭菌制剂包括权利要求1所述胃梭菌或权利要求2所述胃梭菌培养物。
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