CN103436638B - 一种实时荧光rt-pcr检测人星状病毒的试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因检测领域，涉及一种实时荧光RT-PCR检测人星状病毒的试剂盒及其应用。本发明的试剂盒灵敏度和特异性非常高。通过本发明试剂盒实现了对大便、肛拭子等样品中的人星状病毒的快速早期检测和定量分析。本发明检测周期短、效率高；检测病毒特异性强，准确率高；病毒定性分析的同时还能定量分析；可检测出的病毒的最低浓度为1.0×10²copies/mL，灵敏度比普通PCR和免疫学检测方法高；操作简单、易于推广；实验结果重复性好。

Description

一种实时荧光RT-PCR检测人星状病毒的试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于基因检测领域，涉及一种实时荧光RT-PCR检测人星状病毒的试剂盒及其应用。本发明的试剂盒中包含有筛选获得的一对寡核苷酸引物和一条寡核苷酸探针，本发明试剂盒具有早期、快速、灵敏、特异的特点，还可用于人星状病毒的定量分析。

背景技术

星状病毒(Astrovirus)是1975年由Appleton和Higgins利用电镜从腹泻儿童粪便标本中发现的，且已被证实是引起小婴幼儿、老年人及免疫低下者腹泻的重要病原之一，亦是迄今发现的唯一既可引起散发又可引起暴发流行急性胃肠炎的病原。其病毒颗粒表面在电镜下有5～6个星状突起，故而命名为星状病毒。星状病毒科包括感染哺乳动物的哺乳类星状病毒(Mamastroviruses)和感染禽类的禽星状病毒(Avastroviruses)两个属。星状病毒属于一个独立的病毒家族——星状病毒科(Astroviridae)，因电镜下可观察到约10%的病毒颗粒表面有5～6个星状突起，故而得名。属于无衣壳单股正链RNA病毒,现已能体外培养。该病毒颗粒直径28nm,基因组合长6.8kb,包括三个开放阅读框架(ORF1a、ORF1b、ORF2)、两个非编码区(5’非编码区和3’非编码区)和一个多聚腺苷酸尾，其中ORF1a和ORF1b之间有71个核苷酸的重叠区，ORF1b的5’端缺乏合适的起始密码。ORF1b是三个开放阅读读码框中相对保守的区域，而ORF2区是变异相对较高的区域。ORF2区又可分为四个亚区，其中Ⅰ区在各血清型之间是高度保守的，而Ⅱ－Ⅳ区是相对变异性较高的区域。ORF2编码衣壳蛋白的前体结构蛋白，HAstV的衣壳蛋白由2～3个蛋白组成，根据其血清型的不同而有所不同。

常用的检测人星状病毒感染的方法主要有四种：

(1)组织培养病毒分离：从大便及肛拭子中分离病毒接种于原代人胚肾细胞、人胚肺成纤维细胞或猴肾细胞及HeLa细胞等，经培养2～3d后用中和抗体做中和试验和空斑形成试验，进行特异的血清型鉴定。

(2)血清学检测：包括补体结合试验、血凝抑制试验、间接免疫荧光及酶联免疫试验等，但由于缺乏合适的交叉反应抗原，不能覆盖众多HAstV血清型，敏感性较低，使得这些方法的应用受到很大限制。

(3)分子生物学检测：近来RT-PCR的方法已广泛用于HAstV的检测，其对HAstV检测较组织培养更敏感更快捷。

(4)荧光定量PCR技术（FQ-PCR）是近年来发展起来的一种快速直接的核酸的检测技术。荧光定量PCR技术是在普通PCR的基础上发展起来的实时核算定量检测技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。一步法实时荧光RT-PCR技术是实时荧光定量PCR技术的一种，也称为逆转录实时PCR，这是一种直接快速检测RNA的方法，它与荧光定量PCR技术的不同之处是多加了逆转录酶，同时多加了一个逆转录反应的步骤。实时荧光定量PCR法最大的优点是克服了终点PCR法进入平台期或叫饱和期后定量的较大误差，实现DNA/RNA的精确定量。该技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量，而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点，该技术在医学临床检验及临床医学研究方面有着重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种荧光实时RT-PCR检测试剂盒，特别是涉及以一步法实时荧光逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术早期、快速、灵敏、特异诊断人星状病毒感染的试剂盒。

本试剂盒检测的基本原理是利用一对特异性的寡核苷酸引物和一条特异性寡聚核苷酸探针，在逆转录酶、耐热DNA聚合酶、高品质的脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）、RNA酶抑制剂以及Mg²⁺等RT-PCR反应缓冲液，通过荧光PCR扩增仪实现靶核苷酸的扩增，从而实现分别快速、高效、特异、实时定量检测人星状病毒寡核苷酸的目的。

为了高效、特异、灵敏的检测出人星状病毒，本发明在对GeneBank中所有的现有的人星状病毒基因序列进行生物信息学分析，找出了人星状病毒的特异性保守区，并对这个保守区域设计了多对引物、探针。通过对人星状病毒标准株的检测，筛选出灵敏度高、特异性好、且针对星状病毒的一对引物（用于扩增星状病毒靶多核苷酸）和一条探针，即：能与双链靶多核苷酸的第一条链特异性结合的寡核苷酸正向引物HAstV-F、能与双链靶多核苷酸的第二条链特异性结合的寡核苷酸反向引物HAstV-R、能与靶多核苷酸特异性结合并且两末端分别结合有荧光报告集团和荧光猝灭集团的寡核苷酸探针HAstV-P，其中荧光报告基团任选自FAM、TET、JOE、HEX、VIC；荧光猝灭基团任选自：TAMRA、DABCYL、BHQ。

其中：正向引物HAstV-F的序列为：5′-CCCTCTCCGGTCCGTGAT-3′（SEQIDNO：1）；反向引物HAstV-R的序列为：5′-CTCATATTGACGACACCCGTC-3′（SEQIDNO：2）；寡核苷酸探针HAstV-P的序列为：5′-GTCTGAAACTGCTAACCTTGGGCACCTA-3′（SEQIDNO：3），优选的，该寡核苷酸探针5’端连接有FAM(5’羧基荧光素)，3’端连接有TAMRA(N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基罗丹明)。

本发明提供了一种用于检测人星状病毒的寡核苷酸组合物，所述组合物包含1)-4)中任一个：

1)寡核苷酸正向引物HAstV-F；2)寡核苷酸反向引物HAstV-R；3)寡核苷酸探针HAstV-P；4)1)-3)中一个或多个序列的组合，或包含有上述序列的向5’端和/或3’端延长的序列；或与上述序列同源性大于85％的序列；或上述序列的碱基互补序列；或使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。本发明还提供了上述寡核苷酸组合物在制备检测人星状病毒的试剂中的应用，其中所述试剂为用于实时荧光PCR的试剂。

本发明的目的之一是提供一种人星状病毒的实时荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒包含1)～4)中任一个：1)能与人星状病毒双链靶多核苷酸的第一条链特异性结合的寡核苷酸正向引物HAstV-F；2)能与人星状病毒双链靶多核苷酸的第二条链特异性结合的寡核苷酸反向引物HAstV-R；3)能与人星状病毒靶多核苷酸特异性结合并且两末端分别结合有荧光报告集团和荧光猝灭集团的寡核苷酸探针HAstV-P；4)1)～3)中一个或多个序列的组合，或包含有上述序列的向5’端和/或3’端延长的序列；或与上述序列同源性大于85％的序列；或上述序列的碱基互补序列；或使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。

本发明的目的之一是提供一种人星状病毒的实时荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒包括：RNA提取液、RT-PCR扩增反应液，阴性质控品，阳性质控品，人星状病毒阳性标准品等。其中，所述的RT-PCR扩增反应液还包括DNA聚合酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs和PCRbuffer；所述RT-PCR扩增反应液还包含有能与双链靶多核苷酸的第一条链特异性结合的寡核苷酸正向引物HAstV-F、能与双链靶多核苷酸的第二条链特异性结合的寡核苷酸反向引物HAstV-R、能与靶多核苷酸特异性结合并且两末端分别结合有荧光报告集团和荧光猝灭集团的寡核苷酸探针HAstV-P中任意一种或一种以上的组合。

其中：所述正向引物HAstV-F的序列为：5′-CCCTCTCCGGTCCGTGAT-3′（SEQIDNO：1）；所述反向引物HAstV-R的序列为：5′-CTCATATTGACGACACCCGTC-3′（SEQIDNO：2）；所述寡核苷酸探针HAstV-P的序列为：5′-GTCTGAAACTGCTAACCTTGGGCACCTA-3′（SEQIDNO：3），优选的，该寡核苷酸探针5’端连接有FAM(5’羧基荧光素)，3’端连接有TAMRA(N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基罗丹明)；或包含有上述序列的向5’端和/或3’端延长的序列；或与上述序列同源性大于85％的序列；或上述序列的碱基互补序列；或使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。

本发明所提供的试剂盒还包含：（1）分别装有RNA提取液、RT-PCR扩增反应液，阴性质控品，阳性质控品，人星状病毒阳性标准品的加盖密封的多个试剂瓶或管，和（2）分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。

根据本发明的一个优选实施方法是：所述的试剂盒中，正向引物浓度为0.5-1umol/L、反向引物的浓度为0.5-1umol/L、寡核苷酸探针的浓度为0.25-0.5umol/L；优选为：正向引物浓度为1umol/L、反向引物的浓度为1umol/L、寡核苷酸探针的浓度为0.5umol/L。

根据本发明的一个优选实施方法是：所述的试剂盒中，TaqDNA聚合酶的浓度为1-8U/反应；优选为：TaqDNA聚合酶的浓度为5U/反应。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中用于RT-PCR扩增反应液中Mg²⁺最佳浓度为2.0mmol/L、TaqDNA聚合酶最佳用量为5U/反应、RT酶最佳用量为100U/反应、RNasin最佳用量为20U/反应、高品质的脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）最佳浓度为0.2mmol/L。

本发明所提供的检测样品中人星状病毒的试剂盒可以检测出的HAstV的最低浓度为1.0×10²copies/mL，说明本试剂盒具有非常好的灵敏度。

根据本发明的另一个优选实施方案是，逆转录条件为：37℃60min，94℃5min；PCR反应条件为94℃5min；94℃10s，60℃30s，72℃1s共30个循环。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中阴性质控品为生理盐水。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中阳性质控品为HAstV体外转录RNA。其中，建立HAstV体外转录RNA的技术路线如下：使用HAstV特异性正、反向引物定性扩增病毒核酸，扩增产物纯化后克隆入pGEM-T载体中，阳性克隆经测序确定目的片段是否正确插入并确定插入方向。提取重组质粒pGEM-T-HAstV质粒进行酶切反应，割胶回收后得到其模板，用于体外转录。体外转录后消化DNA模板，进行RNA纯化，得到HASTV-RNA。其中阳性质控品的浓度为10³copies/ml。

根据本发明的另一个优选实施方案，本发明试剂盒中定量参考品为10⁴-10⁷copies/mlHAstV体外转录RNA。其中体外转录步骤同上，体外转录后的RNA用紫外分光光度计测定A260进行定量，根据定量结果，用DEPC处理水将体外转录的HAstVRNA分别稀释至10⁴-10⁷copies/ml作为本试剂盒中定量参考品。所有定量参考品与标本中提取中提取的RNA同时进行扩增，荧光定量PCR仪会根据定量参考品绘制出标准曲线，并依此对检测标本中人星状病毒的感染量进行自动测定。

根据本发明的一个优选实施方法是：使用所述的试剂盒时，检测样本选自大便样品、肛拭子、含大便样品或肛拭子的抽提液或培养上清液。

本发明所提供的检测样品中人星状病毒的试剂盒是针对人星状病毒基因组保守基因片段设计特异引物和探针，可检测出人星状病毒，但不能检测出非人星状病毒病原体，如轮状病毒，人腺病毒等，说明本试剂盒具有很好的特异性。

本发明所提供的检测样品中人星状病毒的试剂盒可以检测大便、肛拭子等样本中的人星状病毒；可为灵敏、快速、特异早期诊断人星状病毒感染提供可靠的实验证据，并且能够准确定量，所以可对疗效进行有效检测。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：（1）同时检测待检测样本中人星状病毒感染量，可真实的反映出患者体内病原体类型、拷贝数的高低和复制情况，有助于判断疾病，选择治疗方案及监测治疗效果；（2）与ELISA技术相比，具有更高的灵敏性，适用于大便、肛拭子等多种样本的检测；（3）针对病毒特异性保守序列设计引物和探针，具有更高的特异性，避免了与其他如轮状病毒，人腺病毒等消化道感染病毒的交叉反应；（4）将PCR的敏感性与探针杂交的特异性相结合，在很大程度上改变了普通PCR的缺陷，降低了反应时间，简化了操作步骤；（5）闭管检测不需要PCR后处理，避免了由于样本间的交叉污染引起的假阳性和环境污染；实时的检测技术可以连续的检测PCR反应中荧光信号的变化，避免了普通PCR的“平台期效应”，而且模板的定量不通过终产物，而是有Ct值计算，准确性和灵敏性均有很大的提高。

附图说明

图1是HAstV病毒标准品扩增曲线；

图2是HAstV病毒标准品浓度标准曲线；

图3是4例HAstV阳性标本扩增曲线。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次或以上重复实验，结果取平均值。

实施例1：人星状病毒一步法实时荧光定量PCR试剂的研制

1、引物和探针的设计：通过对Genebank数据库中已有的人星状病毒核酸序列利用DNAman软件进行序列比对分析，以人星状病毒基因组ORF1-ORF2连接区的保守片段为扩增靶位点，根据引物探针设计的基本原则，利用软件人工设计多对引物和探针。

2、样本的选择：根据国内外相关的文献报道表明，可以选择来自大便、肛拭子等样品。

3、反应体系的建立与优化

样本的准备：以病毒鉴定为人星状病毒阳性的10份样品作为HAstV阳性参考品，分别为HAstV-1、HAstV-2、HAstV-3、HAstV-4、HAstV-5、HAstV-6、HAstV-7、HAstV-8、HAstV-9、HAstV-10；以病毒鉴定为阴性的10份非HAstV样本为阴性参考品，分别为3种病毒样品（轮状病毒，人腺病毒）以及7份正常的粪便样品。分别提取上述阳性参考品和阴性参考品的RNA，待用。

引物探针的筛选：用上述1中设计的多组引物和探针分别检测上述的阳性参考品与阴性参考品的RNA，经反复多次试验，筛选出特异性好、灵敏度高和重复性好的最佳引物探针组合。

引物探针浓度的优化：在反应体系中其他反应组分不变的条件下，分别使用0.5umol/L至1umol/L的浓度梯度的引物和0.25umol/L至0.5umol/L的浓度梯度的探针进行PCR反应，经反复多次重复试验，最终确定最佳的引物浓度为1umol/L、探针浓度为0.5umol/L。

TaqDNA聚合酶用量的优化：在反应体系中其他反应组分不变的情况下，分别使用从1U（酶单位）至8U浓度梯度的酶用量/反应，进行RT-PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的Taq酶用量为5U/反应。

RT酶用量的优化:在反应体系中其他反应组分不变的情况下，分别使用从50U(酶单位）至400U浓度梯度的酶用量/反应，进行RT-PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的RT酶用量为100U/反应。

RNasin用量的优化:在反应体系中其他反应组分不变的情况下，分别使用从5U(酶单位）至40U浓度梯度的酶用量/反应，进行RT-PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的RNasin用量为20U/反应。

dNTPs度的优化：在反应体系中其他反应组分不变的情况下，分别使用从0.1mmol/L至0.25mmol/L浓度梯度的dNTPs用量/反应，进行RT-PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的dNTPs浓度为0.2mmol/L。

反应温度、时间的优化：根据酶的活性和寡多核苷酸的长度，主要对退火温度和延伸时间进行了优化，经多次重复试验，最终确定最佳的反应温度和时间为：37℃60min，94℃5min；PCR反应条件为94℃5min；94℃10s，60℃30s，72℃1s共30个循环。

4.标本检测：以大便、肛拭子等为作为待检标本，分别提取标本的RNA后，经上述优化建立的核酸扩增体系检测，结果表明：本发明试剂盒可以灵敏的检测出临床标本中的人星状病毒（HAstV）。

实施例2：人星状病毒一步法荧光实时定量RT-PCR检测试剂盒及其使用

1、制备包括下列组分成分的试剂盒：RNA提取液、RT-PCR扩增反应液、阴性质控品、阳性质控品、定量参考品、DEPC处理水。

2.标本的采集、运输及保存

2.1适用标本类型：大便、肛拭子等。

2.2标本采集与前处理（注意无菌操作）

2.2.1大便标本采集：粪便的采集应由受过专门培训的人员来施行，标本采集人员采集粪便5g（5ml），置于无菌粪便采样杯中（不添加任何试剂）。

2.2.2肛拭子标本采集：用棉花拭子在生理盐水中浸湿，插入肛门2-3cm处，自肛门周围皱襞处拭取，或在肛门口内轻轻旋转涂擦，然后插入盛有生理盐水的试管内。如做粪便拭子培养，以上操作均需使用无菌器材，并将拭子放入灭菌试管。

2.3标本运输与保存：采集或处理的样本在4℃条件下保存应不超过48h；若需长期保存，须放置-80℃低温冰箱，但应避免反复冻融（最多冻融3次）。采集的样本密封后，采用保温箱加冰密封，并尽快运送到实验室。

3检测步骤

（1）RNA提取

A.取N个（N=1管阴性质控品+待测样本数）灭菌的1.5ml离心管，并作好标记。

B.每个离心管加入600ulTrizol试剂，然后分别加入200ul待测样品上清液或阴性质控品，充分震荡混匀15s，室温静置3～5min；

C.每个离心管加入200ul氯仿，上下震荡混匀10s，12,000rpm离心5min；

D.小心吸取无色上层液体，转移至新灭菌的1.5ml离心管，然后加入10ulRNA提取液，充分吸打混匀，8,000rpm离心1分钟，然后小心弃去所有液体；

E.加入溶液C（确认已经加入无水乙醇）800ul，充分吸打混匀，8，000rpm离心1min，尽可能将液体去除干净；

F.将离心管的盖子打开并放入通风橱中风干15min，也可使用加热器于60℃干燥5min，（主要去除无水乙醇），然后加入30ulDEPC处理水，吸打混匀管中沉淀，得到液体，可直接用于检测，也可存于-80℃备用。

（2）RT-PCR反应与结果分析、判定

分别取阴性质控品、阳性质控品、定量参考品、待测标本各3ul，加入PCR反应管中进行RT-PCR扩增反应。RT-PCR扩增反应的条件为：37℃逆转录60min；94℃5min；PCR反应条件为94℃5min；94℃10s，60℃30s，72℃1s共30个循环。

结果分析：据定量参考品的扩增曲线设置Baseline的Start值、Stop值以及Threshold的Value值，使Stdcurve窗口下的标准曲线图达到最佳，即correlation数值介于-1.0～-0.97。最后在Analysis菜单中选择Analyze自动分析结果。

结果判定：阳性样本扩增曲线呈S型，所有阴性样本无扩增曲线出现，待测标本的HAstV检测结果有效，否则，结果为无效，需要重新检测，并根据标准品进行阳性样本定量检测，结果如图1/2。

实施例3：人星状病毒一步法荧光实时定量RT-PCR检测试剂盒临床检测使用

用上述方法对另外疑似人星状病毒感染病人粪便标本18份进行检测，其中HAstV检测结果阳性4例，病毒荧光定量PCR扩增曲线见图3，根据这4例阳性结果的Ct值结合扩增曲线，由RocheLightCycler480分析软件自动分析得到这4例HAstV阳性标本的病毒浓度，具体结果见表1。

表14例HAstV阳性标本病毒浓度

样品编号	Ct值	HAstv病毒浓度(拷贝数/μl)
			样品1	23.14	2.45X102
样品2	21.89	2.2g×102
			样品3	21.46	2.58×103
样品4	21.86	2.48×102

SEQUENCELISTING

<110>湖北朗德医疗科技有限公司

<120>一种实时荧光RT-PCR检测人星状病毒的试剂盒及其应用

<130>2013

<160>3

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>正向引物

<400>1

ccctctccggtccgtgat18

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>反向引物

<400>2

ctcatattgacgacacccgtc21

<210>3

<211>28

<212>DNA

<213>探针

<400>3

gtctgaaactgctaaccttgggcaccta28。

Claims (6)

1.一种人星状病毒的RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒包括：RNA提取试剂，RT-PCR扩增反应液，阴性质控品，阳性质控品，人星状病毒阳性标准品；所述的RT-PCR扩增反应液包含有能与双链靶多核苷酸的第一条链特异性结合的正向引物HAstV-F、能与双链靶多核苷酸的第二条链特异性结合的反向引物HAstV-R、能与靶多核苷酸特异性结合并且两末端分别结合有荧光报告集团和荧光猝灭集团的寡核苷酸探针HAstV-P，其中：

所述正向引物HAstV-F的序列为：5'-CCCTCTCCGGTCCGTGAT-3'；

所述反向引物HAstV-R的序列为：5'-CTCATATTGACGACACCCGTC-3'；

所述寡核苷酸探针HAstV-P的序列为：5'-GTCTGAAACTGCTAACCTTGGGCACCTA-3'，

或上述序列的碱基互补序列；或使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合；

上述试剂盒中，所述的RT-PCR扩增反应液还包括DNA聚合酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs和PCRbuffer；其中，DNA聚合酶为TaqDNA聚合酶，其最佳浓度为5U/反应；逆转录酶的最佳浓度为100U/反应；RNA酶抑制剂的最佳浓度为20U/反应；dNTPs最佳浓度为0.2mmol/L/反应；

所述试剂盒的反应条件为：37℃60min，94℃5min；PCR反应条件为94℃5min；94℃10s，60℃30s，72℃1s，共30个循环。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，正向引物和反向引物的最佳浓度为1μmol/L，寡核苷酸探针的最佳浓度为0.5μmol/L。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征还在于：检测样本选自肛拭子、含大便样品或肛拭子的抽提液或培养上清液。

4.一种用于检测人星状病毒的寡核苷酸组合物，所述组合物包含：

1)正向引物HAstV-F，其序列为：5'-CCCTCTCCGGTCCGTGAT-3'；

2)反向引物HAstV-R，其序列为：5'-CTCATATTGACGACACCCGTC-3'；

3)寡核苷酸探针HAstV-P，其序列为：5'-GTCTGAAACTGCTAACCTTGGGCACCTA-3'。

5.权利要求4所述的寡核苷酸组合物在制备检测人星状病毒的试剂中的应用。

6.权利要求5所述的应用，其中所述试剂为用于RT-PCR的试剂。