CN111647686B

CN111647686B - 肠道病毒ev71、ca16、ev通用型核酸检测试剂

Info

Publication number: CN111647686B
Application number: CN202010448461.0A
Authority: CN
Inventors: 李宁; 高歌; 高利飞; 李振红; 付光宇
Original assignee: Autobio Diagnostics Co Ltd
Current assignee: Autobio Diagnostics Co Ltd
Priority date: 2020-05-25
Filing date: 2020-05-25
Publication date: 2023-06-09
Anticipated expiration: 2040-05-25
Also published as: CN111647686A

Abstract

本发明涉及病原检测技术领域，尤其涉及肠道病毒EV71、CA16、EV通用型核酸检测试剂。本发明提供的肠道病毒EV71、CA16、EV通用型核酸检测试剂添加了抗抑制的成分，可以耐受抑制物胆酸盐、血红素的干扰，并且该试剂能够于2～8℃稳定保存，避免了‑20℃冻存的苛刻条件，从而使反应前无需解冻，提高了反应效率。将该试剂制成试剂盒，适用于更多的样本类型，如咽拭子、粪便、疱疹液、肛拭子。该试剂盒通用性引物覆盖更多的血清型，包括柯萨奇A组、B组、肠道病毒71型，埃可病毒。该试剂盒具有良好的灵敏度、特异性、重复性。

Description

肠道病毒EV71、CA16、EV通用型核酸检测试剂

技术领域

本发明涉及病原检测技术领域，尤其涉及肠道病毒EV71、CA16、EV通用型核酸检测试剂。

背景技术

肠道病毒(enterovirus，EV)属于小RNA病毒科肠道病毒属，能引起人类致病的肠道病毒有多种，包括人肠道病毒A、B、C、D组，有100多个血清型，人对人肠道病毒普遍易感，不同年龄组均可感染发病，以5岁及以下儿童为主，尤以3岁及以下儿童发病率最高，占发病数85％～95％。肠道病毒以上呼吸道、咽喉和肠道为侵入门户，先在局部黏膜和咽、扁桃体等淋巴组织和肠道集合淋巴结中初步增殖，然后释放入血，形成第一次病毒血症。扩散至带有受体的靶组织，再次增殖后，引起第二次病毒血症和临床症状。为进一步指导医疗机构做好手足口病诊疗工作，根据手足口病诊疗进展，国家卫生健康委员会办公厅研究制定了《手足口病诊疗指南(2018年版)》和《中华人民共和国卫生行业标准-手足口病诊断》，适用于全国各级各类医疗卫生机构及其医务人员对手足口病的诊断。卫生部发布《手足口病预防控制指南》指导各地做好手足口病的预防控制。

目前，国内对EV的诊断方法主要有病毒分离培养法、血清学检测法和分子生物学诊断法。病毒分离培养法是EV的实验室诊断常规方法，是检测EV的金标准，即：其利用组织技术从感染部位或传染源分离出病毒病鉴定其特异性血清型型。病人标本是最常采集的标本，如粪便、咽拭子、疱疹液、脑脊液和血液等。病毒的分离鉴定繁琐、费力、耗时，一般一周才能观察到细胞病理反应，而且许多肠道病毒不能进行细胞培养，或者可以培养但不出现细胞病理效应。血清学检测方法在疾病早期(即病毒“窗口期”)血液中不易检测到病毒抗体，不适用于早期诊断，可作为回顾性诊断，且由于肠道病毒血清型众多，临床使用检测价值有限，而多为流行病学采用。分子诊断学方法包括：基因序列测序及核酸检测方法，其中基因序列测序具有成本昂贵，步骤复杂繁琐，耗时长等缺点，临床检测不适宜使用。但病毒核酸荧光PCR 检测法具有快速性、准确性和高灵敏性等优点，能够对细菌感染作出早期诊断，适合临床诊断，同时给疫情的快速分析和控制提供有力的技术支撑。因此，在国内采用实时荧光PCR技术进行EV检测是最快速、可靠的方法。

目前是市售的荧光PCR试剂必须-20℃冷冻储存，且存在对肠道病毒通用型型别覆盖偏少、对胆酸盐、血红素等抑制物耐受能力较差、适用样本类型单一或偏少等问题。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供肠道病毒EV71、CA16、 EV通用型核酸检测试剂，该试剂性质稳定，可于2℃～8℃储存备用。

本发明提供的肠道病毒EV71、CA16、EV通用型核酸检测试剂，其包括反应液1和反应液2；

所述反应液1包括：Tris-HCl、氯化钾、硫酸铵、叠氮钠、PEG2000和亚精胺；

所述反应液2包括醋酸镁和叠氮钠。

本发明中，所述反应液1中包括如下浓度的：

本发明中，所述反应液2中，醋酸镁的浓度为2-20mM；叠氮钠的浓度为 0.05wt％～2wt％。

本发明实施例中，所述反应液1中还包括肠道病毒EV71、CA16、EV的引物和探针。

本发明实施例中，所述特异性引物和探针包括：

EV71病毒特异性上游引物，其序列如SEQ ID NO:1所示；

EV71病毒特异性下游引物，其序列如SEQ ID NO:2所示；

EV71病毒特异性探针，其序列如SEQ ID NO:3所示；

CA16病毒特异性上游引物，其序列如SEQ ID NO:4所示；

CA16病毒特异性下游引物，其序列如SEQ ID NO:5所示；

CA16病毒特异性探针，其序列如SEQ ID NO:6所示；

EV病毒通用型上游引物，其序列如SEQ ID NO:7所示；

EV病毒通用型下游引物，其序列如SEQ ID NO:8所示；

EV病毒特异性通用型探针，其序列如SEQ ID NO:9所示。

本发明中，所述反应液1中还包括内标基因的引物和探针；所述内标基因为人18SrRNA基因；

人18S rRNA基因的上游引物，其序列如SEQ ID NO:10所示；

人18S rRNA基因的下游引物，其序列如SEQ ID NO:11所示；

人18S rRNA基因的探针序列，其序列如SEQ ID NO:12所示。

本发明所述的探针上，5’端修饰荧光基团，3’端修饰淬灭基团；

其中，EV71病毒特异性探针的5’端修饰CY5荧光基团；3’端修饰BHQ2 淬灭基团。

CA16病毒特异性探针的5’端修饰ROX荧光基团；3’端修饰BHQ2淬灭基团。

EV病毒通用型探针的5’端修饰FAM荧光基团；3’端修饰BHQ1淬灭基团。

人18S rRNA基因探针的5’端修饰HEX荧光基团；3’端修饰BHQ2淬灭基团。

一些具体实施例中，反应液1包括：

本发明还提供了一种肠道病毒EV71、CA16、EV通用型核酸检测试剂盒，其包括本发明所述的检测试剂和阳性对照和阴性对照；

所述阳性对照为肠道病毒EV71、CA16、EV通用型毒株悬液；

所述阴性对照为灭菌生理盐水。

本发明所述的试剂盒中反应液1与反应液2的体积比为1:1。

本发明所述的试剂盒中还包括样品处理液，所述样品处理液为生理盐水。

还包括取样器；所述取样器包括咽拭子、肛拭子、棉签。

本发明还提供了一种肠道病毒EV71、CA16、EV通用型的检测方法，其包括：以本发明提供的试剂盒对样品进行检测。

所述样品为咽拭子、粪便、疱疹液或肛拭子。

本发明提供的肠道病毒EV71、CA16、EV通用型核酸检测试剂添加了抗抑制的成分，可以耐受抑制物胆酸盐、血红素的干扰，并且该试剂能够于2～8℃ 稳定保存，避免了-20℃冻存的苛刻条件，从而使反应前无需解冻，提高了反应效率。将该试剂制成试剂盒，适用于更多的样本类型，如咽拭子、粪便、疱疹液、肛拭子。该试剂盒通用性引物覆盖更多的血清型，包括柯萨奇A组的2、4、5、6、7、9、10、12、16型，B组的1、2、3、4、5型，肠道病毒 71型，埃可病毒3、6、11、14、16、19、25、30型。该试剂盒具有良好的灵敏度、特异性、重复性。

附图说明

图1为本发明实施例1中组2提供的肠道病毒EV71、CA16、EV通用型核酸检测试剂盒检测检测限参考品的扩增曲线图；

图2为本发明实施例1中组2提供的肠道病毒EV71、CA16、EV通用型核酸检测试剂盒检测阴阳参考品的扩增曲线图；

图3为本发明实施例1中组2提供的肠道病毒EV71、CA16、EV通用型核酸检测试剂盒特异性实验扩增曲线图；

图4为本发明实施例1中组2提供的肠道病毒EV71、CA16、EV通用型核酸检测试剂盒对不同血清型样本验证的扩增曲线图；

图5为本发明实施例1中组2提供的肠道病毒EV71、CA16、EV通用型核酸检测试剂盒对粪便/肛拭子样本验证的扩增曲线图；

图6为本发明实施例1中组2提供的肠道病毒EV71、CA16、EV通用型核酸检测试剂盒对抑制物胆酸盐和血红素抵抗能力验证的扩增曲线图；

图7为实施例1各组试剂于2-8℃存放12个月后对阳性样品的扩增曲线。

具体实施方式

本发明提供了提供肠道病毒EV71、CA16、EV通用型核酸检测试剂，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的肠道病毒EV71、CA16、EV通用型核酸检测试剂盒中，包括PCR反应液、阳性对照及阴性对照。所述PCR反应液包括用于靶多核苷酸扩增的上游引物和下游引物以及用于靶多核苷酸检测的探针。所述PCR反应液中添加了抗抑制的成分使体系能够耐受胆酸盐、血红素的抑制。并且，该试剂盒，特别是其中的反应液1可于2～8℃储存备用，打破-20℃保存条件，试剂操作更简便。

本发明中，所述PCR反应液进一步包括反应液1和反应液2，所述反应液1包括以下组分：

1、0.2μmol/L～1.0μmol/L的用于靶多核苷酸检测的探针，所述用于靶多核苷酸检测的探针序列为：

EV71：5’-CTTGGAGTGCTGGAACCTTACCTG-3’；

CA16：5’-CAAGTRTCRGTCCCCTTCATGTCACCAGC-3’；

EV通用型：5’-AACTCTGCAGCGGAACCGACTACTTTGG-3’

2、0.2μmol/L～1.0μmol/L的用于靶多核苷酸检测的上游引物和下游引物，所述用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物及用于靶多核苷酸的探针是源于肠道病毒EV71、CA16、EV通用型的保守区域的引物和探针，所述用于靶多核苷酸扩增的上下游引物的序列为：

EV71上游引物：5’-CACTCACGCTCTACCAGCAC-3’；

EV71下游引物：5’-AAGAACACAGCGTGTCTCAA-3’；

CA16上游引物：5’-GGRGCYCCRAAACCYACHTCC-3’

CA16下游引物：5’-TTGRAGRTGCTCNCCGAARG-3’

EV通用型上游引物：5’-CCCTGAATGCGGCTAATCC-3’

EV通用型下游引物：5’-ATTGTCACCATAAGCAGCCA-3’

本发明所述肠道病毒EV71、CA16、EV通用型核酸检测试剂盒中包含的引物和探针能够覆盖更多肠道病毒型别，包括柯萨奇A组的2、4、5、6、7、 9、10、12、16型，B组的1、2、3、4、5型，肠道病毒71型，埃可病毒3、 6、11、14、16、19、25、30型。

3、0.2μmol/L～1.0μmol/L的用于人18S rRNA内标核苷酸检测的探针，所述用于检测的探针序列为：5’-CTTGCCATGTCCTTTGAAGACCCT-3’。

4、0.2μmol/L～1.0μmol/L的用于人18S rRNA内标检测的上游引物和下游引物，所述用于人18S rRNA内标核苷酸扩增的上游引物、下游引物及用于人 18S rRNA内标核苷酸的探针是源于人18S rRNA基因保守区域的引物和探针，所述用于人18S rRNA内标核苷酸扩增的上下游引物的序列为：

上游引物：5’-TTGGAGCCTTTGACTAATTGGGA-3’；

下游引物：5’-TCAGGTCACATTAGAAAACGCATT-3’。

5、0.2μmol/L～1.0μmol/L脱氧核糖核苷三磷酸。

6、同时所述PCR反应液还包括DNA聚合酶、尿嘧啶DNA糖基化酶和 dNTP。利用UNG酶可以降解含dU的DNA链的特点，在PCR体系中添加了 UNG酶和dUTP，可以预防前次PCR产物的污染，防止样本检测假阳性。

7、PCR反应增强剂

优选的，所述PCR反应缓冲液包括pH7.0-pH9.0 1mol/LTris-HCl溶液、 6.25％-12.5％PCR扩增增强剂；本发明所述PCR反应增强剂为硫酸铵。

8、所述肠道病毒EV71、CA16、EV通用型核酸检测试剂盒进一步包括 PCR反应液2溶液，所述PCR反应2溶液即为醋酸镁盐和叠氮钠的溶液。

9、所述肠道病毒EV71、CA16、EV通用型核酸检测试剂盒进一步还包括阳性对照和阴性对照。其中，阳性对照为培养的肠道病毒EV71、CA16、 EV通用型毒株悬液，其浓度为1.00×10⁵～5.00×10⁵PFU/mL；阴性对照为灭菌后的生理盐水。

10、本发明提供的试剂盒适用的样本类型包括：咽拭子、粪便、疱疹液、肛拭子，因此，所述试剂盒中还包括取样器，取样器包括咽拭子、肛拭子、棉签。

本发明提供的肠道病毒EV71、CA16、EV通用型核酸检测试剂盒，提供一种操作快捷、方法简便、检测范围广、灵敏度高的肠道病毒EV71、CA16、 EV通用型核酸检测试剂盒。应用该试剂盒，可以对来源于人体的咽拭子、疱疹液、粪便和肛拭子样本中的肠道病毒RNA进行体外定性检测，同时区分柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型，临床用于辅助诊断手足口病等肠道病毒感染相关性疾病。适用人群为手足病、疱疹性咽炎等患者或疑似患者。

本发明采用的试材和仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1试剂盒的制备

根据肠道病毒EV71、CA16、以及EV病毒保守序列，设计引物和探针：

EV71上游引物：5’-CACTCACGCTCTACCAGCAC-3’；

EV71下游引物：5’-AAGAACACAGCGTGTCTCAA-3’；

CA16上游引物：5’-GGRGCYCCRAAACCYACHTCC-3’

CA16下游引物：5’-TTGRAGRTGCTCNCCGAARG-3’

EV通用型上游引物：5’-CCCTGAATGCGGCTAATCC-3’

EV通用型下游引物：5’-ATTGTCACCATAAGCAGCCA-3’

EV71探针：5’-CTTGGAGTGCTGGAACCTTACCTG-3’；

CA16探针：5’-CAAGTRTCRGTCCCCTTCATGTCACCAGC-3’；

EV通用型探针：5’-AACTCTGCAGCGGAACCGACTACTTTGG-3’

各组PCR反应液1、PCR反应液2由水和如下浓度的组分配制而成：

表1试剂配方

/>

反应液1与反应液2相互独立包装，体积比为1：1。

还包括样品处理液，其为生理盐水。

还包括阳性对照和阴性对照。其中，阳性对照为培养的肠道病毒EV71、 CA16、EV通用型毒株，其浓度为1.00×10⁵～5.00×10⁵PFU/mL；阴性对照为灭菌后的生理盐水。

实施例2样品检测

以上述实施例1所述肠道病毒EV71、CA16、EV通用型核酸检测试剂盒用于检测咽拭子、疱疹液、粪便和肛拭子未知样本中的肠道病毒EV71、CA16、 EV通用型-RNA的操作步骤是：

一、试剂准备

根据待测样本、阴性对照和阳性对照数量，按比例(PCR反应液1 10μ L/人份+PCR反应液2 10μL/人份)混合，即将反应液1与反应液2以体积比 1:1充分混匀成PCR-MIX混合液，瞬时离心后备用。

二、样本处理

1、咽拭子和肛拭子样本样本：将待测拭子放入3mL生理盐水中，涮洗5-10次，涮洗后液体作为待测样本；

2、粪便样本：取0.2g于3mL生理盐水中，振荡均匀后12000rpm离心10min，取上清作为待测样本。

3、疱疹液：可同时采集多个疱疹作为1份标本，先用75％酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有3-5mL生理盐水的采样管中，涮洗后液体作为待测样本。

4、取600μL待测样本，配合安图磁珠法核酸提取试剂提取待测样本中肠道病毒EV71、CA16、EV通用型RNA核酸，备用。

5、同时取600μL阴/阳性质控品，配合安图磁珠法核酸提取试剂提取阴、阳性质控品RNA核酸，备用。

6、取PCR反应管若干，加入PCR-MIX混合液20μL，再分别加入提取的待测样本、阴/阳性质控品核酸产物各20μL，盖上管盖(去除气泡后)，瞬时离心10秒。

三、荧光PCR反应

1、将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称。

2、荧光检测通道选择：选择FAM通道检测EV通用型靶标；选择ROX 通道检测CA16靶标；选择CY 5通道检测EV71靶标；选择HEX通道检测内标；参比荧光设置为none。

3、荧光PCR反应条件见表2：

表2：荧光PCR反应条件：

四、结果分析方法

反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析(也可手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线进行分析)，然后记录样本Ct值结果。扩增曲线与阈值线的交点，称为Ct值(即cycle threshold,指 PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值)；仪器软件根据各样本Ct值大小，可以判断检测结果。

若检测样本同时满足D和C条件则可判样本为EV71阴性；若检测样本同时满足B和C条件则可判样品为CA16阴性；若检测样品同时满足A、B、 C和D条件则可判样品为肠道病毒阴性。

A、FAM检测通道Ct值＞44或无扩增曲线，

B、ROX检测通道Ct值＞44或无扩增曲线，

C、HEX通道有扩增曲线，

D、CY5检测通道Ct值＞44或无扩增曲线

若检测样品在CY5检测通道有扩增曲线且Ct≤44，FAM检测通道有扩增曲线且Ct值≤44，HEX检测通道有或无扩增曲线，可判定为EV71阳性；

若检测样品在ROX检测通道有扩增曲线且Ct≤44，FAM检测通道有扩增曲线且Ct值≤44，HEX检测通道有或无扩增曲线，可判定为CA16阳性；

若检测样品在FAM检测通道有扩增曲线且Ct≤44，HEX检测通道有或无扩增曲线，可判定为EV通用型阳性，此时CY5或ROX通道可能为阳性，说明样本为EV71或CA16阳性；CY5或ROX检测通道也可能均为阴性，说明样本为非EV71非CA16的其他型别肠道病毒。

五、检测结果：

5.1可行性检测

采用上述方法检测检测限参考品检出率＞95％。图1所示为组2试剂盒检测检测限参考品的扩增曲线。其曲线呈标准的对数曲线，证明本发明提供的试剂和引物、探针能够很好的配合，在同一个体系中，实现对多个目标的准确扩增。

5.2准确性检测

组2试剂盒对上述检测企业工作参考品(临床样本)的结果进行分析，阴阳性参考品符合率为100％，检测结果如表2所示：

表3：准确性检测结果

图2所示为试剂盒检测阳性参考品的扩增曲线；图3所示为试剂盒检测阴性参考品的扩增曲线。由图2可知，阴阳性各10例企业工作参考品的符合率为100％。

5.3特异性验证

参考图3，所示为组2肠道病毒EV71、CA16、EV通用型核酸检测试剂盒特异性实验扩增曲线图。本实施例还包括肠道病毒EV71、CA16、EV通用型核酸检测试剂盒，配合、安图磁珠法核酸提取试剂特异性实验，与临床常见病原体：诺如病毒、单纯疱疹病毒1/2型、肠道腺病毒、水痘-带状疱疹病毒、轮状病毒、甲型肝炎病毒、星状病毒、EB病毒、风疹病毒、麻疹病毒、甲型流感病毒、副流感病毒、乙型流感病毒、巨细胞病毒、呼吸道合胞病毒、流行性腮腺炎病毒、戊肝病毒、B族链球菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺菌、弧菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、草绿色链球菌、奈瑟菌属、黏液罗氏菌、变形杆菌等，检测结果为阴性，表明本肠道病毒EV71、CA16、EV通用型核酸检测试剂盒特异性强。

5.4稳定性验证

对实施例1记载的组1～3和对照1～2的试剂进行稳定性验证，试剂在 2～8℃存放12个月，每3个月以各试剂检测样品，观察试剂存放后对于检测结果的影响。结果表明，组1～3的试剂随存放时间的延长，检测效果变化不大(表3～5)，但对照1～2缺少关键组分，试剂难以完成对样品的检测(图7)。

表4组1试剂存放后稳定性

/>

表5组2试剂存放后稳定性

/>

表6组3试剂存放后稳定性

/>

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 郑州安图生物工程股份有限公司

<120> 肠道病毒EV71、CA16、EV通用型核酸检测试剂

<130> MP1927510

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cactcacgct ctaccagcac 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aagaacacag cgtgtctcaa 20

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cttggagtgc tggaacctta cctg 24

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggrgcyccra aaccyachtc c 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttgragrtgc tcnccgaarg 20

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caagtrtcrg tccccttcat gtcaccagc 29

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccctgaatgc ggctaatcc 19

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

attgtcacca taagcagcca 20

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aactctgcag cggaaccgac tactttgg 28

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ttggagcctt tgactaattg gga 23

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tcaggtcaca ttagaaaacg catt 24

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cttgccatgt cctttgaaga ccct 24

Claims

1.肠道病毒EV71、CA16、EV通用型核酸检测试剂，其包括反应液1和反应液2；

所述反应液1包括：肠道病毒EV71、CA16、EV的引物和探针、Tris-HCl、氯化钾、硫酸铵、叠氮钠、PEG2000和亚精胺；

所述反应液2包括醋酸镁和叠氮钠；

所述肠道病毒EV71、CA16、EV的引物和探针包括：

EV71病毒特异性上游引物，其序列如SEQ ID NO:1所示；

EV71病毒特异性下游引物，其序列如SEQ ID NO:2所示；

EV71病毒特异性探针，其序列如SEQ ID NO:3所示；

CA16病毒特异性上游引物，其序列如SEQ ID NO:4所示；

CA16病毒特异性下游引物，其序列如SEQ ID NO:5所示；

CA16病毒特异性探针，其序列如SEQ ID NO:6所示；

EV病毒通用型上游引物，其序列如SEQ ID NO:7所示；

EV病毒通用型下游引物，其序列如SEQ ID NO:8所示；

EV病毒特异性通用型探针，其序列如SEQ ID NO:9所示。

2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述反应液1中包括如下浓度的：Tris-HCl 1mol/L；氯化钾 1wt%~20wt%；硫酸铵 2 vol %~30 vol %；叠氮钠 0.05wt%~2wt%；PEG2000 0.05 vol%~5vol%；亚精胺 0.05 wt%~5wt%。

3.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述反应液2中，醋酸镁的浓度为2~20mM；叠氮钠的浓度为 0.05wt%~2wt%。

4.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述反应液1中还包括内标基因的引物和探针；所述内标基因为人18S rRNA基因；

人18S rRNA基因的上游引物，其序列如SEQ ID NO:10所示；

人18S rRNA基因的下游引物，其序列如SEQ ID NO:11所示；

人18S rRNA基因的探针序列，其序列如SEQ ID NO:12所示。

5.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，反应液1包括：

EV71病毒特异性上游引物 0.2μmol/L~1.0μmol/L；

EV71病毒特异性下游引物 0.2μmol/L~1.0μmol/L；

EV71病毒特异性探针 0.2μmol/L~1.0μmol/L；

CA16病毒特异性上游引物 0.2μmol/L~1.0μmol/L；

CA16病毒特异性下游引物 0.2μmol/L~1.0μmol/L；

CA16病毒特异性探针 0.2μmol/L~1.0μmol/L；

EV病毒通用型上游引物 0.2μmol/L~1.0μmol/L；

EV病毒通用型下游引物 0.2μmol/L~1.0μmol/L；

EV病毒通用型探针 0.2μmol/L~1.0μmol/L；

人18S rRNA基因的上游引物 0.2μmol/L~1.0μmol/L；

人18S rRNA基因的下游引物 0.2μmol/L~1.0μmol/L；

人18S rRNA基因的探针序列 0.2μmol/L~1.0μmol/L；

dUTP 0.2mmol/L~0.8mmol/L；dATP 0.2mmol/L~0.8mmol/L；

dCTP 0.2mmol/L~0.8mmol/L；dGTP 0.2mmol/L~0.8mmol/L；

DNA聚合酶 10U；反转录酶 10U；尿嘧啶DNA糖基化酶 0.1U；

Tris-HCl 1mol/L；氯化钾 1wt%~20wt%；硫酸铵 2 vol %~30 vol %；

叠氮钠 0.05wt%~2wt%；PEG2000 0.05~5vol%；亚精胺 0.05~5wt%。

6.一种肠道病毒EV71、CA16、EV通用型核酸检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1~5任一项所述的检测试剂和阳性对照和阴性对照；

所述阳性对照为肠道病毒EV71、CA16、EV通用型毒株悬液；

所述阴性对照为灭菌生理盐水。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，权利要求1~5任一项所述的检测试剂中，反应液1与反应液2的体积比为1:1。

8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，还包括取样器；所述取样器包括咽拭子、肛拭子、棉签。