CN116286803B - 一种同步检测22种手足口病毒的检测引物探针组合及基因芯片 - Google Patents
一种同步检测22种手足口病毒的检测引物探针组合及基因芯片 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种同步检测22种手足口病毒的检测引物探针组合及基因芯片，涉及病毒检测技术领域。22种手足口病毒包括13种柯萨奇病毒、1种肠道病毒和8种埃可病毒，检测引物组合的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～20所示。本发明提供的引物组合及探针组合具有检测手足口病的病原体的类型多(达22种)，范围广，准确度高的优势。利用设计的引物和探针制备的基因芯片和基因检测试剂盒仅通过一次试验就能同时检测22种手足口病毒。本发明提供的试剂盒不仅特异性好、灵敏度高，而且检测时间短、成本低、操作方便，对开展手足口病毒的临床筛查和辅助诊断具有重大的意义。可以在社区手足口病毒检测和院内病原体感染的场景中使用。
Description
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，具体而言，涉及一种同步检测22种手足口病毒的检测引物探针组合及基因芯片。
背景技术
手足口病(hand-foot-and-mouth disease,HFMD)由肠道病毒感染而引起，以发热，咽喉痛，全身不适，手、足、口腔等部位皮疹或疱疹为主要特征的常见传染病，虽然大多数手足口病患者症状轻微，并且具有自限性，但仍有相当一部分患者有致死性心肺功能疾病和神经系统并发症，个别重症患者病情进展迅速，甚至可导致死亡。
手足口病致病病原体传染源为患者或隐性感染者，主要的传播途径为粪-口传播，也可经接触患者的疱疹液传播，接触病人和携带者的粪便、唾液和疱疹液污染的日常生活用品均可传播此病原体，近年来的报道显示，该病原体也可垂直传播，导致新生儿重症感染。人对肠道病毒普遍易感，不同年龄段均可感染发病，以5岁以下儿童为主，尤以3岁以下儿童发病率最高，该病流行无明显的地区性，全年均可发生，一般5-7月为发病高峰。该病的潜伏期一般为2-10天，平均潜伏期为3-5天，感染者发病前的数天即可从其咽拭子样本和粪便样本中检出病毒，病程为7天左右，咽部排毒可持续在发病后1-2周，而粪便排毒可持续至发病后3-5周。
引起手足口病的肠道病毒包括柯萨奇病毒A组的2、4、5、6、7、9、10、16型等，B组的1、2、3、4、5型等，肠道病毒71型及埃可病毒等，其中以EV71和CA16型较为常见。
目前，手足口病毒感染的特异性诊断方法有三种，即病毒分离鉴定、血清学检测技术以及分子生物学技术。病毒的分离培养和血清学方法繁杂费时，无法满足大量样本的快速诊断；而分子生物学技术主要对病毒核酸进行检测，主要包括胶体金、酶联免疫以及荧光PCR产品，其中以荧光PCR法居多，但是该检测方法具有检测靶点少，灵敏度较低，操作繁琐，检测耗时，检测仪器费用昂贵等缺陷。因此，有必要建立一种高通量、高效率、多靶点的检测方法，以实现临床快速检测或大规模人群筛查。
杂交分析检测技术由于其特异性高而被广为推崇，是高密度基因芯片之核心分析方法，能在同一芯片上同时分析千万个不同的基因片段，大大加速了研究的速度。杂交技术和PCR扩增技术结合，具有技术操作简单、自动化程度高、序列数量大、检测效率高、应用范围广、成本相对低的特点。
杂交法能提升核酸分析的特异性，但是大多数杂交方法耗时耗力，无法达到临床快速检测的要求。将灵敏性高的PCR检测技术配合特异性极高的反斑点杂交技术以一种简单、快速且省钱的方式结合起来，利用导流杂交技术可大大提高杂交的效率，且操作方便，从而避免了传统杂交方法冗长的操作过程。目前，市场上还未有获证的多靶点手足口病毒检测产品，因此，开展该项目的检测用于人群大规模筛查具有很大的市场潜力。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种同步检测22种手足口病毒的检测引物探针组合及基因芯片以满足简单、快速检测和大规模人群筛查的需求。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一种同步检测22种手足口病毒的检测引物组合，22种手足口病毒包括13种柯萨奇病毒、1种肠道病毒和8种埃可病毒；
柯萨奇病毒包括CA2、CA4、CA5、CA6、CA7、CA9、CA10、CA16、CB1、CB2、CB3、CB4和CB5，肠道病毒为EV71，埃可病毒包括ECHO3、ECHO6、ECHO11、ECHO14、ECHO16、ECHO19、ECHO25和ECHO30；
检测引物组合的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～20所示。具体的引物序列如下表所示：
本发明提供的检测引物组合为发明人在NCBI数据库中下载了13种柯萨奇病毒(CA2、CA4、CA5、CA6、CA7、CA9、CA10、CA16、CB1、CB2、CB3、CB4、CB5)、1种肠道病毒(EV71)、8种埃可病毒(ECHO3、ECHO6、ECHO11、ECHO14、ECHO16、ECHO19、ECHO25、ECHO30)传染病病原体代表株的核苷酸序列，通过多序列对比与分析，经过特异性、灵敏性等检测效果的考察，最终得到的上表所示的多重PCR引物。与现有技术相比，扩大了病原体的检测范围。
在本发明应用较佳的实施方式中，检测引物组合的5’端标记有抗原；抗原为生物素、异硫氰酸荧光素(FITC)、羧基荧光素(FAM)、地高辛(DIG)和羧基四甲基罗丹明(TAMRA)中的任意一种。
第二方面，本发明还提供了一种同步检测22种手足口病毒的检测探针组合，22种手足口病毒包括13种柯萨奇病毒、1种肠道病毒和8种埃可病毒；
柯萨奇病毒包括CA2、CA4、CA5、CA6、CA7、CA9、CA10、CA16、CB1、CB2、CB3、CB4和CB5，肠道病毒为EV71，埃可病毒包括ECHO3、ECHO6、ECHO11、ECHO14、ECHO16、ECHO19、ECHO25和ECHO30；
检测探针组合的核苷酸序列如SEQ ID NO.23～44所示。
| 检测病原体型别 | 探针序列 |
| CA2 | SEQ ID NO.23：GACACCATGGTGCATC |
| CA4 | SEQ ID NO.24：ATGCACCCTGGTGTCT |
| CA5 | SEQ ID NO.25：CCTGAGGAGAAGTCTG |
| CA6 | SEQ ID NO.26：CTGACTCGAGGAGAAG |
| CA7 | SEQ ID NO.27：TTCTCCTTAGGAGTCAG |
| CA9 | SEQ ID NO.28：ACTCCTGTGGAGAAGT |
| CA10 | SEQ ID NO.29：TCCTGGGAGAAGTCT |
| CA16 | SEQ ID NO.30：AGACCTCCTCAGGA |
| CB1 | SEQ ID NO.31：GCAGACCTTCTCCT |
| CB2 | SEQ ID NO.32：TCACCTTGCCCCACAG |
| CB3 | SEQ ID NO.33：CTGTAGGGCAAGGTGA |
| CB4 | SEQ ID NO.34：TCACCTTCCCCACAG |
| CB5 | SEQ ID NO.35：GGGGCTAGGTGAAC |
| EV71 | SEQ ID NO.36：GGGCAAGGTGAACG |
| ECHO3 | SEQ ID NO.37：GAGCGTGGATGAA |
| ECHO6 | SEQ ID NO.38：GTGAGGCCCTGG |
| ECHO11 | SEQ ID NO.39：GGTGGTGAGGCCCT |
| ECHO14 | SEQ ID NO.40：GGCATAAAAGTCAGGG |
| ECHO16 | SEQ ID NO.41：TGACTTTCATGCCCA |
| ECHO19 | SEQ ID NO.42：GGGCATAGAAGTCAG |
| ECHO25 | SEQ ID NO.43：AAATGTAAGCAATAGAT |
| ECHO30 | SEQ ID NO.44：TGCTTCCATTTGCTTC |
| IC(内标) | SEQ ID NO.45：TCCAAGGGGAAACTGAT |
| Bio | SEQ ID NO.46：TCCAAGGGAACTGATCT |
在本发明应用较佳的实施方式中，探针的5’端进行氨基化处理或生物素修饰。
例如针对探针的5’端进行氨基化处理，将其固定在芯片基材上，制备检测芯片。
在其他实施方式中，在不考虑操作繁琐、检测耗时和检测仪器费用昂贵的情形下，在探针的5’端标记荧光报告基团，在探针的3’端均标记荧光淬灭基团以满足检测的需求，使用本发明提供的探针组合同步检测22种手足口病毒，也在本发明的发明构思范围内。探针可以采用不同的荧光标记。当使用不同荧光标记时，检测结果可以对引起手足口病的肠道病毒进行分型。
在本发明应用较佳的实施方式中，荧光报告基团选自HEX、FAM、5-FAM、6-FAM、TET、CF532、JOE、TAMRA、ROX、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Texas Red、NED、Alexa Flour、TET、Quasar670和VIC等，淬灭基团选自MGB、TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3和QSY等。
第三方面，本发明还提供了一种同步检测22种手足口病毒的检测引物探针组合物，其包括上述的检测引物组合和上述的检测探针组合。该引物探针组合物的形态为粉末或液体。
第四方面，本发明还提供了一种基因芯片，含有上述的检测探针组合。在一种可选的实施方式中，基因芯片的探针固定在尼龙膜或硝酸纤维膜上。
在一种可选的实施方式中，基因芯片还包括检测内标基因的探针和检测生物素的探针，检测内标基因的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示，检测生物素的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.46所示。
在一种可选的实施方式中，检测内标基因和生物素的探针的5’端均采用生物素修饰。
例如设置内标探针的5’端进行氨基化处理，用于监测样本的采集质量质控和样本核酸提取过程中质量质控，避免假阴性结果，可以与杂交显色液结合显色；检测生物素探针的5’端采用生物素修饰，用于监控杂交过程。
第五方面，本发明还提供了检测引物组合和/或检测探针组合在制备检测22种手足口病毒的试剂盒中的应用。
第六方面，本发明还提供了基因芯片在制备检测22种手足口病毒的试剂盒中的应用。
第七方面，本发明还提供了一种试剂盒，其包括如下产品中的至少一种：
检测引物组合、检测探针组合和基因芯片。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂盒还包括用于检测内标基因的引物，检测内标基因的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.21-22所示；
在一种可选的实施方式中，试剂盒还包括检测内标基因的探针和检测生物素的探针，检测内标基因的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示，检测生物素的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.46所示。
例如设置内标探针的5’端进行氨基化处理，用于监测样本的采集和提取过程，避免假阴性结果；检测生物素探针的5’端采用生物素修饰，用于监控杂交过程。
试剂盒还含有多重PCR的反应液。多重PCR的反应液包括PCR Buffer、Q-solution、MgCl2、dNTPs/dUTPs、酶混合液、ddH2O。
在一种可选的实施方式中，多重PCR的反应液各成分的浓度及反应量如下表所示：
Q-solution为基因扩增的辅助试剂，在引物的5’端均标记有生物素，酶混合液包含Taq酶、逆转录酶、UNG酶和RNA酶抑制剂。
试剂盒的PCR扩增程序为：50℃逆转录15min，95℃热启动2min，95℃变性30sec、55℃退火30sec、72℃延伸30sec，共35个循环，72℃延伸5min。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的引物组合及探针组合具有检测手足口病的病原体的类型多(达22种)，范围广，准确度高的优势。利用设计的引物和探针制备的基因芯片和基因检测试剂盒仅通过一次试验就能同时检测22种手足口病毒，包括13种柯萨奇病毒(CA2、CA4、CA5、CA6、CA7、CA9、CA10、CA16、CB1、CB2、CB3、CB4、CB5)、1种肠道病毒(EV71)、8种埃可病毒(ECHO3、ECHO6、ECHO11、ECHO14、ECHO16、ECHO19、ECHO25、ECHO30)。
提供的检测试剂盒采用生物素标记的引物分别对22种手足口病毒突变区域进行特异性扩增，将扩增产物与标记不同突变类型的手足口病毒探针的固相基质(例如尼龙膜)在导流杂交仪上进行导流杂交(flow-through hybridization)，然后通过化学显色对结果进行判读，来对22种手足口病毒的分型检测。本发明可以在同一个条件下扩增多种传染病病原体，减少了PCR试剂的用量以及PCR仪的需求量，减少了操作步骤，降低了成本。该试剂盒不仅特异性好、灵敏度高，而且检测时间短、成本低、操作方便，对开展手足口病毒的临床筛查和辅助诊断具有重大的意义。可以在社区手足口病毒检测和院内病原体感染的场景中使用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明所述基因芯片中各病原体检测探针的排列顺序图。
图2为利用所述引物和探针对22种手足口病毒的假病毒检测结果图，其中：编号1为CA2假病毒的检测结果；编号2为CA4假病毒的检测结果；编号3为CA5假病毒的检测结果；编号4为CA6假病毒的检测结果；编号5为CA7假病毒的检测结果；编号6为CA9假病毒的检测结果；编号7为CA10假病毒的检测结果；编号8为CA16假病毒的检测结果；编号9为CB1假病毒的检测结果；编号10为CB2假病毒的检测结果；编号11为CB3假病毒的检测结果；编号12为CB4假病毒的检测结果；编号13为CB5假病毒的检测结果；编号14为EV71假病毒的检测结果；编号15为ECHO3假病毒的检测结果；编号16为ECHO6假病毒的检测结果；编号17为ECHO11假病毒的检测结果；编号18为ECHO14假病毒的检测结果；编号19为ECHO16假病毒的检测结果；编号20为ECHO19假病毒的检测结果；编号21为ECHO25假病毒的检测结果；编号22为ECHO30假病毒的检测结果。
图3为对同步检测22种手足口病毒试剂盒的准确性和特异性检测结果图。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种用于检测22种手足口病毒病原体的基因芯片。
一、引物和探针的设计
1、多重PCR引物的设计和PCR反应体系以及扩增程序的确定。
(1)引物的设计
本发明以13种柯萨奇病毒(CA2、CA4、CA5、CA6、CA7、CA9、CA10、CA16、CB1、CB2、CB3、CB4、CB5)、1种肠道病毒(EV71)、8种埃可病毒(ECHO3、ECHO6、ECHO11、ECHO14、ECHO16、ECHO19、ECHO25、ECHO30)代表株，这22种病原体的核苷酸序列为目标，在NCBI数据库中下载了上述传染病病原体代表株的核苷酸序列，通过多序列对比与分析，设计了可用于检测上述病原体的多重PCR引物和探针，同时还设计了内标引物、内标探针以及显色体系控制探针，用于监测样本的采集和提取过程，避免假阴性结果。
设计用于扩增待检样品中RNA的特异性引物，经过特异性、灵敏性等检测效果的考察，最终得到表1所示的多重PCR引物及内标引物；引物的序列为SEQ ID NO.1～22，引物的5′端标记有生物素，引物序列具体如表1所示：
表1引物序列及对应检测基因型
(2)多重PCR反应体系的确定
通过大量的实验对比，控制Mg2+浓度、引物浓度和PCR Buffer浓度可以做到对22种手足口病毒的高效率扩增，且特异性好。最终确定最优的PCR反应体系为PCR反应液45μL，DNA加样量5μL，总反应体积为50μL，具体如表2所示：
表2多重PCR反应体系
(3)多重PCR扩增程序的确定
经过大量实验对比优化，控制退火温度和退火时间可以做到特异性好，扩增效率高，最终确定的最佳扩增程序为：50℃逆转录15min，95℃热启动2min，95℃变性30sec、55℃退火30sec、72℃延伸30sec，共35个循环，最后一步72℃延伸5min。
在同一个条件下扩增22种手足口病毒，能够减少PCR仪的需求量，减少操作步骤，降低了成本，能够同时检测13种柯萨奇病毒(CA2、CA4、CA5、CA6、CA7、CA9、CA10、CA16、CB1、CB2、CB3、CB4、CB5)、1种肠道病毒(EV71)、8种埃可病毒(ECHO3、ECHO6、ECHO11、ECHO14、ECHO16、ECHO19、ECHO25、ECHO30)。
2、探针的设计
针对22种手足口病毒病原体，共设计检测上述病原体类型的22条探针序列如SEQID NO.23～44所示，其中探针的5’端进行氨基化处理，将其固定在芯片基材上，制备检测芯片；设计1条内标探针和1条生物素探针，序列分别如SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46所示，内标探针的5’端进行氨基化处理，用于监测样本的采集和提取过程，避免假阴性结果；生物素探针的5’端采用生物素修饰，用于监控杂交过程。探针序列具体如表3所示：
表3探针序列及对应检测基因型
| 检测病原体型别 | 探针序列 |
| CA2 | SEQ ID NO.23：GACACCATGGTGCATC |
| CA4 | SEQ ID NO.24：ATGCACCCTGGTGTCT |
| CA5 | SEQ ID NO.25：CCTGAGGAGAAGTCTG |
| CA6 | SEQ ID NO.26：CTGACTCGAGGAGAAG |
| CA7 | SEQ ID NO.27：TTCTCCTTAGGAGTCAG |
| CA9 | SEQ ID NO.28：ACTCCTGTGGAGAAGT |
| CA10 | SEQ ID NO.29：TCCTGGGAGAAGTCT |
| CA16 | SEQ ID NO.30：AGACCTCCTCAGGA |
| CB1 | SEQ ID NO.31：GCAGACCTTCTCCT |
| CB2 | SEQ ID NO.32：TCACCTTGCCCCACAG |
| CB3 | SEQ ID NO.33：CTGTAGGGCAAGGTGA |
| CB4 | SEQ ID NO.34：TCACCTTCCCCACAG |
| CB5 | SEQ ID NO.35：GGGGCTAGGTGAAC |
| EV71 | SEQ ID NO.36：GGGCAAGGTGAACG |
| ECHO3 | SEQ ID NO.37：GAGCGTGGATGAA |
| ECHO6 | SEQ ID NO.38：GTGAGGCCCTGG |
| ECHO11 | SEQ ID NO.39：GGTGGTGAGGCCCT |
| ECHO14 | SEQ ID NO.40：GGCATAAAAGTCAGGG |
| ECHO16 | SEQ ID NO.41：TGACTTTCATGCCCA |
| ECHO19 | SEQ ID NO.42：GGGCATAGAAGTCAG |
| ECHO25 | SEQ ID NO.43：AAATGTAAGCAATAGAT |
| ECHO30 | SEQ ID NO.44：TGCTTCCATTTGCTTC |
| IC(内标) | SEQ ID NO.45：TCCAAGGGGAAACTGAT |
| Bio | SEQ ID NO.46：TCCAAGGGAACTGATCT |
这些探针有着合理的碱基成分、Tm值相近，有利于在同一杂交温度下的同步性，不会因为温度的问题而影响杂交的结果，使检查的准确性大大增加。
二、用于检测22种手足口病毒病原体的基因芯片的制备。
1、基因芯片的尼龙膜处理
首先对尼龙膜进行处理，将尼龙膜放入0.1M HCl溶液中浸泡30秒钟，然后把已除去残余溶液的膜放入20％的EDAC溶液中浸泡15分钟，最后放在洗膜盘中用200mL的纯化水冲洗10秒钟，此步骤重复3次，再放到吸水纸上除去多余的残液。转入温度为20℃、湿度为45％的烘干箱内烘干12小时。将已烘干的尼龙膜用Kimwipes纸隔开，转入封口薄膜袋中，放进点膜间的冰箱中，贮藏在4℃的温度下，备用。
2、探针的点样、排列和固定
在直接寡核苷酸DNA探针的固定中，先将以上设计的DNA探针用探针稀释液(pH8.4的0.5M Na2CO3和0.5M NaHCO3的溶液)混合，进行点样。
启动DNA点样装置，在芯片制作程序的控制下，进行DNA探针的打印。通过DNA打印针每次取一个DNA探针，通过三维定点传递装置将DNA探针传递到指定的点样位置。完成一次打印后，荷样打印针清洗、干燥，进行下一轮探针的点样，依次类推，直至所有DNA探针传递点样完毕。
通过微量移液设备将上述制备好的探针分别点在上述处理好的尼龙膜上，每滴0.4μL。点膜结束后，将膜放置于室温15分钟，进行反应。然后将膜转入0.1M NaOH溶液中浸泡10分钟，停止反应；将洗好的膜转入温度为20℃、湿度为45％的烘干箱内烘干12小时，即制得基因芯片。
各探针在基因芯片上的具体分布位置如表4和图1所示，本发明的基因芯片总共24个格子，每个格子对应一条探针。
表4检测各基因型的探针在基因芯片中的具体分布位置
注：上表中Bio为标记生物素的基因探针，用于监控杂交过程，不需加入扩增产物，也可以与杂交显色液结合显色；IC为内标基因探针，用于监测样本的采集和提取过程，避免假阴性结果。
实施例2
本实施例提供了一种同步检测22种手足口病毒的试剂盒。其由上述实施例1设计合成的多重PCR引物、反应体系和基因芯片组成。
(1)分别进行假病毒颗粒的制备：
用内切酶BamH I和Hind III分别对pET-MS质粒、含靶基因和内参基因目的片段的质粒进行双酶切，37℃酶切过夜；酶切后利用T4连接酶使pET-MS载体大片段分别与靶基因和内参基因目的片段进行连接；连接产物转化至大肠杆菌BL21中，并加入终浓度为0.05mmol/L的IPTG，28℃，180～200转/分钟过夜诱导表达，之后通过离心收集菌体沉淀，用TE缓冲液洗涤并重新悬于TSM缓冲液中，进行超声破碎；将破碎完全的表达产物离心收集上清液，即为含假病毒颗粒的表达产物。
(2)22种手足口病毒病原体的PCR扩增
利用上述的多重PCR引物对22种手足口病毒的假病毒(即为含假病毒颗粒的表达产物)进行PCR扩增，得到22种手足口病毒的扩增产物。
(3)基因型杂交检测
利用上述制备的基因芯片对步骤(2)获得的22种手足口病毒的假病毒样品扩增产物进行检测，22种手足口病毒的假病毒样品的扩增产物通过和基因芯片中尼龙膜上的探针反应，最后根据显色情况进行判断，具体方法如下：
将获得的22种手足口病毒的假病毒样品的扩增产物在95℃下变性5～10分钟，迅速转移到冰水混合物中，放置2分钟；然后加入到预先温浴到42℃的0.8mL杂交液(2×SSC/0.1％SDS)中，混合后加入到杂交仪的反应孔中，应用于上述制得的基因芯片，42℃杂交30分钟，然后用溶液WB1(0.5×SSC/0.1％SDS，42℃温浴)清洗3～4遍。加入0.5mL封阻液(0.25％脱脂奶粉，0.05％硫柳汞)，25℃封闭5分钟。
抽干反应孔的溶液后加入0.5mL的酶标液(TBS中溶解的带有链霉亲和素标记的AP酶)，酶标5分钟；用0.8mL溶液A(TBS，0.1％ Tween20及0.05％叠氮钠)清洗4遍，然后加入0.5mL的显色液(NBT/BCIP)，避光显色5分钟。最后用溶液B冲洗3遍，晾干，分析显色情况，判读结果。
(4)实验结果
分析判读：基因芯片检测的手足口病毒有22种，共有探针24条(含内标探针和生物素探针)，检测结果可由肉眼判断。
22种手足口病毒的假病毒检测结果如图2所示，其中：编号1为CA2假病毒的检测结果；编号2为CA4假病毒的检测结果；编号3为CA5假病毒的检测结果；编号4为CA6假病毒的检测结果；编号5为CA7假病毒的检测结果；编号6为CA9假病毒的检测结果；编号7为CA10假病毒的检测结果；编号8为CA16假病毒的检测结果；编号9为CB1假病毒的检测结果；编号10为CB2假病毒的检测结果；编号11为CB3假病毒的检测结果；编号12为CB4假病毒的检测结果；编号13为CB5假病毒的检测结果；编号14为EV71假病毒的检测结果；编号15为ECHO3假病毒的检测结果；编号16为ECHO6假病毒的检测结果；编号17为ECHO11假病毒的检测结果；编号18为ECHO14假病毒的检测结果；编号19为ECHO16假病毒的检测结果；编号20为ECHO19假病毒的检测结果；编号21为ECHO25假病毒的检测结果；编号22为ECHO30假病毒的检测结果。
实验例1
本实验例对实施例2提供的检测试剂盒进行准确性和特异性试验。
一、实验方法
样本设置：以30份已知基因型的临床样本RNA作为试剂盒检测准确性、特异性的参考品，RNA浓度均在20～40ng/μL。
检测方法：使用实施例1的检测试剂盒和检测方法，在博日基因扩增仪上扩增样本DNA，然后在凯普医用核酸分子杂交仪HB-2012A上进行杂交，对测试品进行检测，具体操作按照试剂盒使用说明书进行；其检测结果与金标准测序的结果进行对比，判断准确率和特异性。
二、实验结果
检测结果如图3(从左往右与表5中的样本编号对应)和表5所示，30份已知基因型的样品均与本发明检测试剂盒对样品检测得到的基因型一致，准确性为100％，特异性好。
表5试剂盒准确性和特异性检测结果
/>
注：“N”是指不含上述22种病毒型别的样本。
实验例2
本实验例对实施例2提供的检测试剂盒进行稳定性和灵敏度试验。
一、实验方法
样本设置：以22份假病毒样本作为灵敏度参考品，22份假病毒【包括13种柯萨奇病毒(CA2、CA4、CA5、CA6、CA7、CA9、CA10、CA16、CB1、CB2、CB3、CB4、CB5)、1种肠道病毒(EV71)、8种埃可病毒(ECHO3、ECHO6、ECHO11、ECHO14、ECHO16、ECHO19、ECHO25、ECHO30)】提取的核酸浓度均设置1000copies/反应、500copies/反应和250copies/反应。
检测方法：使用3批实施例1的检测试剂盒(批号：220901、220902、220903)和检测方法在博日基因扩增仪上扩增样本，然后在凯普医用核酸分子杂交仪HB-2012A上进行杂交，对待检样品进行检测，每份待检样品测定20次；其检测结果与金标准测序的结果进行对比，判断稳定性和灵敏度。
二、实验结果
试剂盒稳定性和灵敏度的检测结果见表6，结果显示，22份假病毒【包括13种柯萨奇病毒(CA2、CA4、CA5、CA6、CA7、CA9、CA10、CA16、CB1、CB2、CB3、CB4、CB5)、1种肠道病毒(EV71)、8种埃可病毒(ECHO3、ECHO6、ECHO11、ECHO14、ECHO16、ECHO19、ECHO25、ECHO30)】提取的核酸浓度为1000copies/反应和500copies/反应时，杂交信号清晰；而提取的核酸浓度为250copies/反应时，杂交信号看不到。因此本试剂盒对假病毒样本的最低检出量为500copies/反应，且3批试剂盒的检测结果均一致，稳定性好。
表6 3批试剂盒稳定性和灵敏度检测结果
/>
/>
/>
注：以上“+、-”表示各杂交结果，“+”表示有信号且深浅正常；“-”表示无信号。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (12)
1.一种同步检测22种手足口病毒的检测引物探针组合物，其特征在于，其包括检测引物组合和检测探针组合，22种手足口病毒包括13种柯萨奇病毒、1种肠道病毒和8种埃可病毒；
所述柯萨奇病毒包括CA2、CA4、CA5、CA6、CA7、CA9、CA10、CA16、CB1、CB2、CB3、CB4和CB5，所述肠道病毒为EV71，所述埃可病毒包括ECHO3、ECHO6、ECHO11、ECHO14、ECHO16、ECHO19、ECHO25和ECHO30；
所述检测引物组合的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～20所示；所述检测探针组合的核苷酸序列如SEQ ID NO.23～44所示。
2.根据权利要求1所述的检测引物探针组合物，其特征在于，所述检测引物组合的5’端带有标记。
3.根据权利要求2所述的检测引物探针组合物，其特征在于，所述检测引物组合的5’端的标记为生物素、异硫氰酸荧光素(FITC)、羧基荧光素(FAM)、地高辛(DIG)和羧基四甲基罗丹明(TAMRA)中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的检测引物探针组合物，其特征在于，所述探针的5’端进行氨基化处理或生物素修饰。
5.一种基因芯片，其特征在于，含有权利要求1-4任一项所述的检测引物探针组合物。
6.根据权利要求5所述的基因芯片，其特征在于，所述基因芯片还包括检测内标基因的探针和检测生物素的探针，所述检测内标基因的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示，所述检测生物素的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.46所示。
7.如权利要求1-4任一项所述的检测引物探针组合物在制备检测22种手足口病毒的试剂盒中的应用。
8.如权利要求5所述的基因芯片在制备检测22种手足口病毒的试剂盒中的应用。
9.一种试剂盒，其特征在于，其包括如下产品中的至少一种：
权利要求1-4任一项所述的检测引物探针组合物和权利要求6所述基因芯片。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于检测内标基因的引物，所述检测内标基因的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.21-22所示。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测内标基因的探针和检测生物素的探针，所述检测内标基因的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示，所述检测生物素的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.46所示。
12.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括多重PCR的反应液，所述多重PCR的反应液包括PCR Buffer、Q-solution、MgCl2、dNTPs/dUTPs、酶混合液。
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