CN104254610A - 调节atxn3表达的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

公开的是寡核苷酸，其靶向及杂交于编码ATXN3的核酸分子，导致减少的ATXN3的表达。异常ATXN3的表达的减小有益于治疗特定医疗病症，诸如脊髓小脑共济失调3。在特定实施方式中，调节异常ATXN3等位基因或转录物的表达，例如，恢复例如，Purkinje细胞或脊髓神经元的正常功能。本发明的寡核苷酸和使用该寡核苷酸调节异常或伸展的ATXN3的表达的方法提供改善存活和关联于，或甚至治愈，异常ATXN3等位基因或转录物的表达的病态诸如，例如，3型脊髓小脑共济失调(SCA3)的手段。

Description

调节ATXN3表达的组合物和方法

【相关申请】

本申请要求2012年3月12日提交的美国临时申请No.61/609,774的优先权及权益。以上申请的整个教导通过引用并入本文。

【技术领域】

本申请涉及靶向及杂交于核酸编码蛋白共济蛋白-3(ATXN3)的寡核苷酸及相关的药物组合物及使用寡核苷酸调节ATXN3的表达以治疗一系列医疗病症，诸如3型脊髓小脑共济失调(SCA3)的方法。

【背景技术】

3型脊髓小脑共济失调(SCA3)，其也被称为Machado-Joseph病，是具有初现和严重性的变化的年龄的常染色体显性，进行性神经退行性病症。SCA3原本描述于葡萄牙人后裔，及尤其是来自SCA3最普遍的亚速尔群岛(例如,Flores小岛中SCA3的发生率是1/140)(Sudarsky L.,等人,Clin.Neurosci.1995；3:17-22)。SCA3随后在几个其他国家被鉴定，及现在被认为是最常见的显性地遗传的遗传性共济失调。

临床上，患SCA3的患者呈现进行性步态和肢共济失调，构音困难和其他症状包括锥体束征，张力失调，眼球运动病症，面舌虚弱，神经病变，进行性感觉损失和帕金森特征的可变的组合。以其更严重的形式，SCA3特征在于锥体(例如,运动,躯体感觉)和锥体外束(例如,肌张力)神经功能的缺陷。在受影响的家族之内，此形式的共济失调也展示预期效应，其特征在于早先疾病初现和具有各新影响的代的更严重的症状。

全部形式的SCA3归因于编码病原性聚-谷氨酰胺区的在染色体14q32.1上ATXN3的编码区中的(CAG)_n段或翻译的ATXN3蛋白中的段的不稳定和迭代遗传伸展(Kawaguchi Y.,等人,Nature Genet.1994；8：221～228)。ATXN3的编码区中(CAG)_n段(及由此编码的病原性聚-谷氨酰胺段)的不稳定和迭代伸展造成蛋白错折叠的增加，其导致核和细胞质包裹体聚集和形成(Paulson HL,等人,1997,Neuron 19,333～344)。错折叠的蛋白聚集物不仅是SCA3和Machado-Joseph病的特征，而且也是许多其他神经退行性疾病，包括阿尔茨海默病和帕金森病的常见的特征。

对于治疗SCA3目前可利用的治疗方法被限制于症状性治疗，或主要基于锻炼及饮食改良的治疗方法。开发对于治疗SCA3适合的治疗剂的尝试中所做的努力靶向了ATXN3的编码区中的伸展的(CAG)_n段。但是，在许多实例中，该治疗无法有效抑制编码病原性聚-谷氨酰胺段的突变的或异常等位基因(相对于功能野生型等位基因)的表达。例如，国际申请WO2008/018795A1和WO/2009/099326A1描述了通过设计互补于异常和野生型等位基因中的重复子序列，但可优先与表征异常等位基因的更可接近的临时开环结构杂交的寡核苷酸来靶向异常等位基因或编码聚-谷氨酰胺伸展的转录物的各种手段。类似地，Hu等人(Nat.Biotechnol.2009；27(5):478-484)评价了是否寡聚体可部分基于表征各等位基因的结构差异来区别野生型和突变等位基因。SCA3的等位基因-特异性沉默已被Miller等人在小干扰RNA-介导的技术的情景中描述(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2003；100(12):7195-7200)。但是，Miller等人总结出，野生型和突变的等位基因之间的单核苷酸差异可在此情景中不足以赋予等位基因特异性，除非遇到特定病情。

由于患SCA3的患者无目前可利用的治愈法，需要进一步开发以鉴定调节编码ATXN3的核酸的表达及抑制，抑制，预防或减少包括病原性聚-谷氨酰胺伸展的ATXN3的表达的新治疗法作为治愈手段，或至少改善人中与SCA3关联的症状，及存活和病态。特别需要的是能相对于功能野生型等位基因，辨别性地有效靶向编码病原性聚-谷氨酰胺段的突变的或异常等位基因的新反义治疗法。

【发明概述】

在本文提供的是新寡核苷酸，特别锁核酸(LNA)反义寡核苷酸，及对于治疗与异常，突变的或伸展的ATXN3的表达关联的疾病(例如,3型脊髓小脑共济失调或Machado-Joseph病)有用的治疗性干预。本文公开的发明涉及这样的发现，使表达突变的或异常ATXN3等位基因的细胞或组织与本发明的寡核苷酸接触调节该ATXN3的表达，及尤其是调节ATXN3的突变的或天然存在的变体(例如,被表征为具有病原性,伸展的聚-谷氨酰胺段的ATXN3)的表达。在特定实施方式中，调节异常ATXN3等位基因或转录物的表达，例如，恢复例如，Purkinje细胞或脊髓神经元的正常功能。本发明的寡核苷酸和使用该寡核苷酸调节异常或伸展的ATXN3的表达的方法提供改善存活和关联于，或甚至治愈，异常ATXN3等位基因或转录物的表达的病态诸如，例如，3型脊髓小脑共济失调(SCA3)的手段。在特定实施方式中，本发明的寡核苷酸，当施用于患SCA3的受试者时，导致SCA3症状的改善或消退(例如,步态和肢共济失调,构音困难,锥体束征,张力失调,眼球运动病症,面舌虚弱,神经病变,进行性感觉损失,昏睡和帕金森特征的改善)。

一方面，本文公开的发明涉及与ATXN3靶序列(例如,哺乳动物ATXN3或由此编码的mRNA序列)杂交的约8～约50个核苷酸长的寡核苷酸。在特定方面，该寡核苷酸与具有足够的稳定性(例如,具有足够的杂交强度及持续足够的时间)的ATXN3靶序列杂交而抑制或另外调节ATXN3基因产物(例如,被表征为具有伸展的病原性聚-谷氨酰胺段的ATXN3蛋白)的表达。在本文描述了对于此目的和其他目的特别适合的寡核苷酸。

一方面，本发明提供约8～约50个核苷酸长(例如,约8～30,8～20,12～18,或14～16个核苷酸长)的寡核苷酸，其包含与对应于哺乳动物ATXN3基因的编码区的反向互补体或编码ATXN3的mRNA的补体的区具有至少80％同一性(例如,至少约85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％或100％同一性)的约8～约30个核苷酸(例如,约8,9,10,11,12,13,14,15,16,17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29或30个核苷酸长)的连续的核苷酸序列(第1区)。例如，本发明的寡核苷酸可包含是至少80％互补于编码ATXN3的部分核酸序列(例如,至少80％互补于编码ATXN3DNA,前-mRNA或mRNA的部分核酸序列)的连续的核苷酸序列。本文公开的寡核苷酸可包含互补于突变的ATXN3基因的区或由此编码的对应mRNA的核酸序列。类似地，本文公开的寡核苷酸可包含这样的的序列，其互补于ATXN3基因的基因产物(例如,由ATXN3基因编码的mRNA)或其编码突变的多态型或天然存在的变体，诸如编码病原性聚-谷氨酰胺伸展(CAG)_n的区及例如包含G987C单核苷酸多态性，例如由SEQ IDNO:4编码的区，或其天然存在的变体(例如,由NM_004993.5编码的转录物变体或单核苷酸多态性诸如SNP ID rs12895357)。尤其是，本文所述的寡核苷酸可至少80％互补(例如,至少约85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％或更高互补)于编码ATXN3基因或mRNA的突变的区，诸如编码聚-谷氨酰胺伸展突变的区和编码病原性聚-谷氨酰胺伸展区的区的立即上游和/或下游(例如,自聚-谷氨酰胺伸展区的位置约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，125，150，175，200，225，250个或更多核苷酸上游和/或下游)区的核酸序列。

在另一方面，本发明提供包含约8～约20个核苷酸的寡核苷酸，其中寡核苷酸与编码ATXN3的核酸(例如,ATXN3mRNA)的至少8-核碱基部分杂交。例如，在本发明的一些实施方式中，寡核苷酸与编码聚-谷氨酰胺伸展区的核酸(即,mRNA)，或与毗邻于和/或相邻于编码聚-谷氨酰胺伸展区(例如,位于病原性(CAG)_n伸展的一个核苷酸下游或3′侧及在本文被称为“G987C”SNP或突变的G→C单核苷酸多态性)的核酸的区杂交。在一些实施方式中，寡核苷酸互补于编码ATXN3的核酸分子的单链区，诸如，例如具有部分SEQ ID NO:4的序列的核酸分子区或其天然存在的变体(例如,SNP IDrs12895357)。

在一些实施方式中，要求保护的寡核苷酸包含互补于编码ATXN3mRNA的DNA序列或其部分的序列，或替代性地，要求保护的寡核苷酸与由此编码的RNA序列(例如,前-mRNA或其mRNA)或其部分杂交。当与靶向的细胞或组织(例如,受本文公开的SCA3影响的或患受本文公开的SCA3的患者的中枢神经系统的神经元或其他组织)接触时，寡核苷酸可减少ATXN3的表达(及尤其是减少突变的或异常ATXN3的表达)，由此恢复神经元功能。例如，本发明的寡核苷酸可靶向，及在特定实施方式中，杂交于编码突变的或异常ATXN3的核酸(例如,mRNA)，诸如，例如，包含或由SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17和/或SEQ ID NO:18编码的mRNA，或上述任何一个特定部分或区(例如,编码病原性聚-谷氨酰胺伸展的区)和由此调节ATXN3的表达，使得表达减少和/或抑制至少约10％，20％，25％，35％，40％，50％或优选至少60％，65％，70％，75％，85％，90％，95％，99％或100％。

在仍另一方面，本发明提供组合物，其包含寡核苷酸诸如本文所述的那些。在一些实施方式中，组合物可包括药物组合物，其包含一种或更多本文所述的寡核苷酸以及一种或更多药学可接受的赋形剂，佐剂或其他分子，以辅助或改善组合物的递送或稳定性。在一些实施方式中，发明提供缀合物，其包含一种或更多本文所述的寡核苷酸及与之附接(例如，共价或非-共价附接于所述寡核苷酸)的至少一个非-核苷酸或非-多核苷酸部分。本文公开的也是寡核苷酸和包含所述寡核苷酸的缀合物和药物组合物，其用作药物，诸如用于治疗与异常ATXN3的表达关联的疾病(例如,共济失调该SCA3和Machado-Joseph病)，及通过给哺乳动物受试者，例如，人受试者诸如小儿人受试者(出生之前或之后)或成年人受试者施用本文所述的寡核苷酸、缀合物和/或药物组合物来治疗该疾病的方法。

在另一方面，发明提供寡核苷酸或其缀合物用于制备治疗SCA3的药物的用途。也被本发明涵盖的是本文所述的寡核苷酸(例如,与SEQ ID NO:4的区或包含G987C单核苷酸多态性的SNP IDrs12895357杂交的寡核苷酸)作为药物的用途。类似地，在本文提供的是本文所述的寡核苷酸(例如,与编码或相邻于ATXN3聚-谷氨酰胺伸展段的mRNA杂交的寡核苷酸)用了治疗疾病诸如SCA3的用途。本发明也提供治疗与编码突变的或异常ATXN3的核酸的表达关联的疾病或病情，诸如SCA3或Machado-Joseph病的方法，所述方法包括以下步骤：将有效量的本发明的寡核苷酸、缀合物和/或药物组合物施用于患SCA3，可能患SCA3或另外受SCA3影响或患SCA3的受试者(例如,诸如患或敏感于SCA3的人类小儿或成年患者)。在一些实施方式中，与异常ATXN3的表达关联的疾病，病症或病情涉及ATXN3的过表达，及尤其是突变的或伸展的ATXN3(例如,包含(CAG)_n段的不稳定和/或迭代遗传病原性伸展的ATXN3,其中“n”等于或大于52)的过表达。在一些实施方式中，本文所述的寡核苷酸、缀合物和药物组合物优先调节ATXN3突变体，多态型或天然存在的变体，诸如例如包含病原性聚-谷氨酰胺伸展(CAG)_n的ATXN3突变体，多态型或天然存在的变体(例如,由SEQ ID NO:4或SNP IDrs12895357编码的)的表达。由本发明的寡核苷酸的该ATXN3突变体，多态型或天然存在的变体的表达的优先调节可在性质上相对于野生型ATXN3的表达(例如,由SEQ ID NO:1编码的)为部分或绝对的。例如，当施用于患(杂合)SCA3的患者时，本发明的寡核苷酸可靶向编码野生型ATXN3等位基因的mRNA和编码突变的或伸展的ATXN3等位基因的mRNA，但是该寡核苷酸可调节各靶的表达至改变的程度，使得，例如，相比野生型ATXN3等位基因的表达，伸展的ATXN3等位基因的表达被调节至更大程度。本发明的寡核苷酸可，例如，靶向及减少突变的ATXN3变体或包含G987C转变取代的多态型(例如,ATXN3变体或包含由SEQ ID NO:4,5或6编码的序列的多态型)的表达2，4，8，10，15，25，50，75，100，200倍或更多倍；而相同的寡核苷酸分别减少野生型ATXN3(例如,如由SEQ IDNO:1编码的)的表达1，2，4，5，10，15，25，50，75，100倍或更多倍。类似地，本发明的寡核苷酸可，例如，靶向及减少包含病原性聚-谷氨酰胺区的突变的ATXN3多态型或变体(例如,如由SEQ IDNO:4或SNP ID rs12895357编码的)的表达约1％，2.5％，5％，10％，20％，35％，40％，50％，60％，75％，80％，85％，90％，95％，97.5％，99％或更多；而相同的寡核苷酸减少野生型ATXN3(例如,如由SEQ ID NO:1编码的)的表达约1％，2.5％，5％，10％，20％，35％，40％，50％，60％，75％，80％或90％。本文公开的也是相对于编码有功能的或野生型ATXN3的核酸，可辨别地靶向和/或杂交(例如,特异性杂交)于编码突变的或伸展的ATXN3的核酸的寡核苷酸。例如，在患Machado-Joseph病的患者中，本发明的寡核苷酸可相对于有功能的或野生型ATXN3等位基因的表达，靶向及减少突变的或伸展的ATXN3等位基因的表达约1％，2.5％，5％，10％，20％，35％，40％，50％，60％，75％，80％，90％，95％，97.5％，99％或更多。或者，本发明的寡核苷酸可增加野生型ATXN3基因产物或mRNA的表达(例如,在受SCA3影响的小儿患者中)而减少和/或抑制突变的ATXN3基因产物或mRNA的表达。在一些实施方式中，本文公开的寡核苷酸、缀合物和药物组合物减少或另外抑制突变的ATXN3的表达(例如,由优先靶向及杂交于患SCA3的患者的等位基因中编码ATXN3病原性(CAG)_n伸展和/或G987C单核苷酸多态性的核酸(例如,mRNA))，而不影响或最低限度影响不编码突变的ATXN3的表达。

在一些实施方式中，本文公开的寡核苷酸杂交(例如,特异性杂交)于ATXN3的基因产物(即,mRNA)，例如，由包含病原性(CAG)_n突变或伸展的突变的ATXN3多态型或变体编码的mRNA基因产物(例如,如由SEQ ID NO:4或SNP ID rs12895357编码的)。在其他实施方式中，寡核苷酸与编码突变的或伸展的ATXN3多态型或变体的核酸的基因产物(例如,mRNA)杂交，其中编码该ATXN3多态型的核苷酸包含病原性(CAG)_n突变或区(例如,病原性(CAG)_n，其中“n”等于81)。在其他实施方式中，本发明的寡核苷酸可与编码突变的ATXN3多态型或变体的核酸(即,mRNA)的基因产物(例如,如由SEQ ID NO:4或SNP ID rs12895357编码的)特异性杂交，而相同的寡核苷酸不与编码野生型ATXN3的核酸(即,mRNA)的基因产物(例如,如由SEQ ID NO:1编码的)特异性杂交。寡核苷酸与编码伸展的或突变的ATXN3多态型的核酸的该优先或辨别杂交可调节伸展的或突变的基因产物的表达，而野生型ATXN3基因产物的表达保守或另外保持未变化。例如，本发明的寡核苷酸可靶向和优先杂交于由包含SEQ ID NO:15～20的核酸编码的mRNA(或其片段)，使得由该mRNA编码的蛋白的表达被减少和/或抑制至少约10％，20％，25％，35％，40％，50％或优选至少60％，65％，70％，75％，85％或最优选至少90％，95％，99％或100％。

在一些实施方式中，本发明的寡核苷酸与编码人ATXN3的核酸(例如,mRNA)(例如,由登录号No.NM_004993编码的ATXN3mRNA,包括任何其变体和多态型)杂交。例如，本发明的寡核苷酸可靶向及杂交于人ATXN3mRNA(例如,如由SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:4编码的)。也涵盖的是优先与一种或更多靶序列杂交的寡核苷酸，其中该靶序列包含ATXN3mRNA(例如,包含SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18之一个或多个的靶序列)。本发明的寡核苷酸可优选与包含病原性(CAG)_n突变，伸展的人ATXN3mRNA或其片段(例如,由登录号No.NM_004993编码的ATXN3mRNA)杂交，由此调节靶向的人ATXN3的表达。或者，相同的寡核苷酸可与编码ATXN3多态型的核酸特异性杂交，其编码病原性(CAG)_n突变或伸展，但无法在相同的或近似严格度条件下与编码缺乏或不另外编码该病原性(CAG)_n突变或伸展的人物种的野生型的核酸杂交。

也提供的是抑制核酸编码突变的，伸展的或异常ATXN3的表达的方法，及尤其是抑制表达突变的或伸展的ATXN3的细胞(例如,Purkinje细胞或神经元)中编码突变的，伸展的或异常ATXN3基因的该核酸的基因产物(例如,编码伸展的ATXN3的mRNA)的产生(例如,转录或翻译)的方法。在一些实施方式中，所述方法包括给患者施用本发明的寡核苷酸、缀合物或药物组合物，或另外使细胞或组织与该寡核苷酸，缀合物或药物组合物接触，以抑制该患者或细胞中ATXN3(例如,包含病原性聚-谷氨酰胺伸展的ATXN3)的表达。

也公开的是约8～50个单体的寡核苷酸，其包含约8～50个连续的单体(例如,核苷酸)的第1区，其中该第1区的序列是至少80％同一(例如,至少85％,至少90％,至少95％,至少99％同一)于一种或更多选择的靶序列(例如,包含编码突变的或伸展的ATXN3的mRNA的靶序列)。在一些实施方式中，选择的靶序列可包含编码哺乳动物ATXN3(例如,mRNA)的核酸或其片段的区。还提供的是锁的反义寡核苷酸，例如，8～50，12～30或12～20个核苷酸长。例如，在一些实施方式中，寡核苷酸包含一个或更多锁核酸(LNA)残基或单体单元(例如,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ IDNO:22或SEQ ID NO:23)。当本发明的寡核苷酸包含2个或更多LNA单体单元(例如,2或更多β-D-氧基-LNA单体单元)时，该LNA单体单元可彼此毗邻，或替代性地该LNA单体单元可在彼此非-连续的位置。在特定实施方式中，本文公开的寡核苷酸是间隔聚体。例如，在本文公开的是反义寡核苷酸，其包含SEQ ID NO:12，其中寡核苷酸调节ATXN3的表达，且其中寡核苷酸在一个或更多选自下列的核苷酸包含至少一个锁核酸：其中所述寡核苷酸调节ATXN3的表达，且其中所述寡核苷酸在一个或更多选自下列的位置包含至少一个核苷酸类似物：(i)在第1和3位的一个或更多的腺嘌呤核苷酸是氧基-LNA；(ii)在第10位的鸟嘌呤核苷酸是氧基-LNA；(iii)在第9和11位的一个或更多的胞嘧啶核苷酸是氧基-LNA；及(iv)在第2位的胸腺嘧啶核苷酸是氧基-LNA。

任选地，该锁的反义寡核苷酸可包含一个或更多糖取代，诸如例如，2'-O-甲氧基乙基糖取代。本文提供的也是包含一种或更多本发明的寡核苷酸的缀合物，其中该寡核苷酸包含至少一个共价附接于本发明的寡核苷酸的非-核苷酸或非-多核苷酸部分。

也提供的是药物组合物，其包含一种或更多本发明的寡核苷酸或缀合物，及药学可接受的稀释剂，载体，盐，溶剂或佐剂。也提供的是药物组合物，其包含一种或更多本发明的寡核苷酸。该药物组合物可例如，肠胃外通过注射或直接输注到靶作用位点来施用，或可通过吸入，腹膜，局部，经口或鞘内施用。

还提供的是在细胞或组织中下调编码突变的或异常ATXN3的等位基因或核酸的表达(例如,在mRNA水平下调伸展的ATXN3的表达)，及尤其是下调ATXN3的突变体或天然存在的变体的表达的方法。该方法包括使细胞或组织与有效量的一种或更多本发明的寡核苷酸、缀合物或组合物体外或体内接触。在一些实施方式中，本发明的寡核苷酸和组合物能下调哺乳动物(例如,患SCA3或另外受SCA3影响的人患者)中突变的，伸展的或异常ATXN3等位基因的表达，而不调节或另外最低限度影响正常有功能的或野生型等位基因的表达。

也公开的是通过给动物施用治疗或预防性地有效量的一种或更多本文所述的寡核苷酸、缀合物或药物组合物来治疗疑患或敏感于与伸展的或异常ATXN3的表达或过表达关联的疾病或病情的动物(例如,非-人动物或人)的方法。此外，在本文提供的是使用寡核苷酸抑制突变的或异常ATXN3(例如,ATXN3的突变的或天然存在的变体)的表达的方法。

也提供的是治疗与异常ATXN3的表达关联的病情(例如,共济失调诸如SCA3和Machado-Joseph病)的方法和恢复细胞(例如,神经元)功能的方法。该方法包括向表达ATXN的异常等位基因的受影响的细胞(例如,神经元或Purkinje细胞)递送或接触一种或更多本发明的寡核苷酸。要求保护的方法将寡核苷酸导入神经元细胞(例如,转染或剥裸递送)的条件足以减少受影响的细胞中异常ATXN3等位基因的表达，由此恢复正常细胞功能。在一些实施方式中，该方法优先减少包含G987C单核苷酸多态性的伸展的ATXN3多态型或天然存在的变体的表达。本发明提供治疗疾病诸如SCA3和Machado-Joseph病的方法，所述方法包括给有需求的患者(例如,人类受SCA3影响的小儿患者)施用有效量的一种或更多寡核苷酸，缀合物或其药物组合物。本发明提供抑制(例如,通过下调)细胞或组织中突变的或异常ATXN3的表达的方法，所述方法包括以下步骤：使细胞或组织与有效量的一种或更多本文公开的寡核苷酸或其缀合物或药物组合物接触，由此下调突变的或异常ATXN3等位基因的表达(例如,在mRNA水平)。

以上讨论的，及本发明的许多其他特征和伴随优势会通过引用以下本发明的详述结合伴随的实施例而变得更佳明晰。

【附图说明】

图1A和1B例证经历了用互补于包括G987C单核苷酸多态性的伸展的ATXN3等位基因区的部分的寡核苷酸(来自ATXN3mRNA的病原性(CAG)_n伸展的一个核苷酸)48小时的剥裸处理的HEK-293细胞中的FLAG-标记的突变体(MUT)报告子构建体和野生型(WT)内源性表达报告子构建体水平。将HEK-293细胞用包含与萤火虫萤光素酶转录物融合的具有G987C SNP和81个(CAG)重复子的突变的ATXN3转录物的编码区的pFLAG-ATX3Q81-FL-FF萤光素酶报告子构建体稳定地转染，并通过在1μM，5μM和25μM的培养基浓度剥裸而将寡核苷酸随后导入转染的细胞。然后在48小时之后收获细胞，并通过使用关联qPCR测定测定mRNA表达的百分率。结果表示为模拟物-治疗的样品的百分率，及报道为每寡核苷酸3次独立研究的平均。描绘的误差条指示标准偏差。如在图1A和1B中所示，20种寡核苷酸展示具有相对于内源性WT报告子的显著的剂量应答的MUT报告子构建体的稳健的敲落。

图2A和2B显示12种选择的寡核苷酸的剥裸递送后，ATXN3-Q81转染的HEK-293细胞中伸展的ATXN3转录物(MUT)和内源性ATXN3(WT)mRNA的表达。将结果标准化到内源性GAPDH水平及表示为模拟物处理的样品的百分率。将寡核苷酸由剥裸，使用具有0.3μM，1μM，3μM，9μM，27μM和81μM的终浓度的培养基导入细胞。然后在寡核苷酸的剥裸递送之后48小时收获细胞，及提取突变的ATXN3转录物(报告子构建体)和内源性ATXN3转录物的mRNA及由qPCR分析。结果报道为每寡核苷酸3次独立研究的平均值，和误差条指示标准偏差。如显示于图2A和2B，评价的全部12种寡核苷酸被发现在评价的浓度范围产生MUT报告子构建体(相对于WT报告子构建体)的剂量-依赖性敲落。

图3例证被选择为领先的及被设计为互补于包括位于自ATXN3mRNA的病原性(CAG)_n伸展一个核苷酸的G987C单核苷酸多态性的伸展的ATXN3等位基因的区的部分的5种寡核苷酸的半最大抑制性浓度(IC₅₀)曲线。将HEK-293细胞用包含与萤火虫萤光素酶转录物融合的具有G987C SNP和81个(CAG)重复子的突变的ATXN3转录物的编码区的pFLAG-ATX3Q81-FL-FF萤光素酶报告子构建体稳定地转染，并通过使用具有0.3μM，1μM，3μM，9μM，27μM和81μM的终浓度的培养基剥裸而将寡核苷酸随后导入转染的细胞。然后在寡核苷酸的剥裸递送之后48小时收获细胞，及提取突变的ATXN3转录物(报告子构建体)和内源性ATXN3转录物的mRNA，并由qPCR分析。标绘的数据点表示3次独立实验的平均报告子信号，和误差条表示标准偏差。灰色曲线(◆)表示野生型(WT)报告子的拟合的应答曲线，和黑色曲线(▲)表示伸展的或突变体(MUT)报告子的拟合的应答曲线。各曲线的对应IC₅₀值显示在各图上，和5个选择的领先的寡核苷酸的实际值也报道于表2。

图4例证互补于包括位于自ATXN3mRNA的病原性(CAG)_n伸展一个核苷酸的G987C单核苷酸多态性的伸展的ATXN3等位基因的区的部分的各12种寡核苷酸的稳定性。将各寡核苷酸于37℃，在含添加的脑组织的脑脊液中温育120小时。在0，24，48，96和120小时取样品，及由SDS-PAGE分析。各12种寡核苷酸的血浆稳定性被发现在预期的范围之内良好，且尤其是，全部寡核苷酸被发现具有大于96小时的总体半衰期，和多数寡核苷酸未产生任何可感觉到的降解产物。

图5A和5B显示16天体内耐受性研究的结果，其中将互补于包括及邻接编码G987C单核苷酸多态性的核苷酸的区的部分的寡核苷酸在第0，3，7，10和14天施用于小鼠。在第16天处死小鼠及评价。对照施用盐水对照。结果报道为每寡核苷酸5次独立研究的平均值，和误差条指示标准偏差。如显示于图5A和5B，相对于盐水对照，5种选择的寡核苷酸(SH06,SH10,SH13,SH16和SH20,它们分别对应于SEQ ID NO:19,20,21,22和23)导致肝酶丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)的可忽略的升高。

【发明详述】

本文所述的寡核苷酸提供能调节ATXN3的表达的特定治疗性工具。在一些实施方式中，本文所述的短(例如,通常的少于50,40,30,20,18,17,16,15,14,13，12，11，10，9，8个或更少核苷酸长)单链合成寡核苷酸具有互补于ATXN3RNA靶序列(例如,前-mRNA或mRNA)的碱基序列，及由氢键合的碱基配对形成杂交体双联体。例如，在本发明的一些实施方式中，寡核苷酸可靶向或互补于编码ATXN3的核酸(例如,编码ATXN3的mRNA)或其片段(例如,SEQID NO:5或6)，由此调节ATXN3的表达。在其他实施方式中，本发明的寡核苷酸(例如,锁核酸间隔聚体)可通常由切割作用模式或空间阻断加工前-mRNA或mRNA的翻译中涉及的酶来工作。此杂交可被预期预防表达，(即,靶mRNA代码翻译为其蛋白产物)由此排除随后蛋白产物的效应。因此，本文所述的寡核苷酸和方法可用于改善或治疗一种或更多与异常ATXN3的表达关联的病情(例如,疾病或综合征)，例如，共济失调该3型脊髓小脑共济失调(SCA3)。

SCA3(也被称为Machado-Joseph病)是具有初现和严重性的可变年龄的常染色体显性，进行性神经退行性病症。SCA3由编码共济蛋白-3的核酸中病原性(CAG)_n三核苷酸伸展导致，其导致ATXN3蛋白中聚-谷氨酰胺结构域或段的伸展。SCA3原本描述于葡萄牙人后裔，及尤其是来自SCA3和Machado-Joseph病是最普遍的亚速尔群岛(例如,在Flores小岛，SCA3的发生率是1/140)。(Sudarsky L.,等人,Clin.Neurosci.1995；3:17-22)。SCA3随后在其他几个国家被鉴定，及现在被认为是最常见的显性地遗传的遗传性共济失调。

临床，SCA3和Machado-Joseph病呈现进行性步态和肢共济失调，构音困难和其更严重的形式的其他症状的可变的组合，包括锥体束征，张力失调，昏睡，眼球运动病症，面舌虚弱，神经病变，进行性感觉损失和帕金森特征，SCA3特征在于锥体(例如,运动,躯体感觉)，锥体外束(例如,肌张力)和神经功能缺陷。在受影响的家族之内，此形式的共济失调也展示预期效应，其特征在于早先疾病初现和随各新的受影响的代的更严重的症状。

如同临床特征，成为基础的SCA3中退行性变化以一些程度改变。在中枢神经系统之中，经历神经元损失和反应性星形胶质化的区是选择的端脑，小脑和脑干核，脊髓前角，Clarke氏柱和背根神经节。(DürrA,等人,Ann Neurol 1996；39：490-9)。SCA3的分子发病机制仍是推测性的，由于对ATXN3的正常功能知之甚少，但是全部形式的SCA3归因于染色体14q32.1上ATXN3的编码区中(CAG)_n段的不稳定和迭代遗传伸展。(Kawaguchi Y.,等人,Nature Genet.1994；8：221～228)。

ATXN3是聚泛素-结合蛋白，其生理学功能已连系到泛素-介导的蛋白水解。(Doss-Pepe EW,Mol.Cell.Biol.2003；23:6469–6483)。编码ATXN3的核酸中伸展的(CAG)_n突变的存在在ATXN3蛋白的C-端区导致长聚-谷氨酰胺链，及其在本文被称为“聚-谷氨酰胺伸展”或“聚-谷氨酰胺段”。(Dürr A,等人,Ann Neurol 1996；39：490-9)。如本文所用，术语“伸展的”指称存在聚-谷氨酰胺伸展(例如,具有(CAG)_n的伸展的等位基因，其中n大于52)。聚-谷氨酰胺伸展增加蛋白错折叠，其导致核和细胞质包裹体的聚集和形成。(Paulson HL,等人,1997,Neuron 19,333～344)。聚-谷氨酰胺伸展也与Purkinje细胞和脊髓神经元中有害泛素化的核聚集物和包裹体的形成关联。错折叠的蛋白聚集物不仅是SCA3的特征，而且也是许多其他神经退行性疾病，包括阿尔茨海默病和帕金森病的常见的特征。

因为SCA3的显性遗传模式，及因为ATXN3功能的损失不赋予与聚-谷氨酰胺伸展相同的疾病表型，伸展的等位基因在受影响的神经元获取显性毒性。(Schmitt等人,Biochem Biophys Res Commun 2007；362(3):734-9)。毒性可出现自泛素/蛋白酶体机制的饱和，或出现自未折叠或错折叠的蛋白的蓄积，或自缺陷蛋白降解的其他调控缺陷。

相比可展示约55～84之间或更伸展的谷氨酰胺重复长度(通常在本文被称为“病原性(CAG)_n伸展”或“病原性伸展”(例如,(CAG)_n其中n＝约55～84或更多))的患SCA3患者，未受SCA3影响的个体正常展示ATXN3蛋白中约10～40个之间的谷氨酰胺重复长度(例如,(CAG)_n其中“n”等于约10-40)。(见,Paulson,HL,Intranuclearinclusions of expanded polyglutamine protein in spinocerebellarataxia type 3/Machado Joseph disease.BIOS Scientific Publishers,Oxford,United Kingdom；Kawaguchi Y.,et al.Nat.Genet.1994；8:221-228)。聚-谷氨酰胺段的伸展给突变的ATXN3蛋白赋予毒性功能获得，这导致神经元核内包裹体的形成。(Schmidt T,等人,BrainPathol.1998；8:669-679)。聚-谷氨酰胺段的长度与SCA3初现年龄相反地关联。(Netravathi M，等人，J.Neurol Sci.(2009)2771-2:83-6)。

野生型ATXN3等位基因的功能损失也已显示在泛素-介导的蛋白水解中起到作用，且该功能损失可为有害的。(Doss-Pepe EW,Mol.Cell.Biol.2003；23:6469–6483)。因此，本发明的寡聚体化合物单独靶向病原性(CAG)_n伸展的策略可不是有益的。反之，在特定实施方式中，可优选战略性和辨别性地靶向突变的(例如,导致疾病的)ATXN3等位基因。

基于单核苷酸多态性(SNP)的存在的突变的ATXN3等位基因的战略性靶向已被提议确保区别野生型和突变ATXN3等位基因。(Miller VM,等人.Proc Natl Acad Sci.2003；100:7195-7200)。该位于突变的ATXN3等位基因的病原性(CAG)_n伸展的一个核苷酸下游或3′侧的SNP与导致疾病的聚-谷氨酰胺伸展处于连锁不平衡，和一般随患病的等位基因分开。(Stevanin G,等人.Am J Hum Genet.1995；57:1247–1250；及Gaspar C,等人.Hum Genet.1996；98:620-624)。在多数SCA3患者中，野生型ATXN3等位基因在第987位具有G，然而伸展的/突变ATXN3等位基因在第987位具有C。(Gaspar C,等人.Am J Hum Genet.2001；68:523-528)。全部编码聚-谷氨酰胺伸展的突变ATX3等位基因在第987位具有C，而大致50％的野生型等位基因在此位置具有G。

减少的野生型ATXN3等位基因的表达不导致单倍不足，及因此减少的野生型ATXN3等位基因的表达未被预期为有害。因此，G-到-C SNP或突变(在本文被称为“G987C”SNP或突变)的存在提供使用本发明的寡聚体化合物来有区别地靶向伸展的或突变的ATXN3等位基因，而保存野生型ATXN3等位基因的功能的机会。

因此，在一实施方式中，本公开涉及负责SCA3发展的编码ATXN3的突变体或伸展的等位基因的等位基因-特异性靶向或敲落。在这点上特别考虑的是，假定(CAG)_n重复子的末端不稳定性，(CAG)_n段的复制是常见的。如之前讨论，正常等位基因已显示含有约13和36个之间的CAG重复子；但是，在特定实例中，正常等位基因可含有多至47个CAG重复子。SCA3疾病病理学在具有更多末端复制，例如超过52个CAG重复子的伸展的等位基因中发生。(见,KawaguchiY.,等人.Nat.Genet.1994；8：221～228)。

寡核苷酸，本文所述的药物组合物和方法可，例如，通过调节一种或更多异常核酸分子(例如,伸展的ATXN3)的表达或功能来用于改善或治疗共济失调诸如SCA3。

【寡核苷酸】

在一些实施方式中，本文所述的寡核苷酸靶向编码异常ATXN3的核酸(例如,编码ATXN3的mRNA，如SEQ ID NO:4中提供和/或其片段，如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中提供)和该核酸的天然存在的变体，由此调节ATXN3的表达。如本文所用，术语“寡核苷酸”指称由2个或更多核苷酸共价连接形成的分子。术语寡核苷酸通常包括寡核苷酸类似物，寡核苷酸模拟物和这些的嵌合组合。在本发明的情景中，单核苷酸单元也可被称为单体或单元。在一些实施方式中，术语“核苷”，“核苷酸”，“单元”和“单体”互换使用。需知，当指称核苷酸或单体的序列时，所指的是碱基，诸如，例如A，T(或U)，G或C的序列。

在一些实施方式中，本文公开的寡核苷酸对于经反义作用机理调节核酸分子的表达(例如,调节异常ATXN3的表达)有用。此调节可，例如，通过提供互补于和/或杂交于一种或更多靶核酸分子，诸如mRNA的寡核苷酸(例如,SEQ ID NO:4或SNP ID rs12895357)来实现。在一些实施方式中，本发明的寡核苷酸互补于靶核酸的特定区(例如,相邻于或邻接位于病原性(CAG)_n伸展的立即下游(3′)的G987C转变取代的编码ATXN3的核酸的区)。在一些实施方式中，本发明的寡核苷酸能与靶核酸的特定区(例如,编码G987C SNP或转变取代的ATXN3mRNA的区)杂交(例如,在生理条件特异性杂交)。

如本文所用，短语“靶核酸”旨在包括DNA和自该DNA转录的RNA(包括前-mRNA和mRNA或其部分)，及也包括源于该RNA的cDNA。例如，在一些实施方式中，短语“靶核酸”用于指称编码ATXN3的核酸(例如,mRNA)或尤其是编码突变的或异常ATXN3的核酸。如本文所用，术语“基因产物”指称自基因或核酸的表达得到的任何生物化学物质(例如,DNA或RNA)及包括，但不限于mRNA，RNA和/或蛋白。例如，在一些实施方式中，当关于ATXN3基因使用时，短语基因产物指称由ATXN3编码的mRNA。在特定实施方式中，靶核酸包含选自下列的核酸序列：SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14，SEQ IDNO:15，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18。在其他实施方式中，本文公开的寡核苷酸互补于和/或杂交于包含下列之一个或更多的核酸序列：SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:13，SEQID NO:14，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17和/或SEQ ID NO:18。

在一些实施方式中，本发明的寡核苷酸化合物互补于一种或更多靶核酸(例如,mRNA编码ATXN3)及干扰靶向的核酸的正常功能(例如,由反义作用机理)。此靶核酸的功能由与之特异性杂交的本发明的寡核苷酸干扰或调节通常被称为“反义”。待干扰的DNA的功能可包括复制和转录。待干扰的RNA的功能可包括功能诸如，例如，RNA转位到蛋白翻译的位点，蛋白自RNA翻译，RNA剪接而产生一种或更多mRNA种，及可啮合RNA或由RNA辅助的催化性活性。在一些实施方式中，干扰靶核酸功能的总体效应是调节该靶核酸的产物的表达。

如短语在本文所用，“反义化合物”和“反义寡核苷酸”指称至少部分互补(例如,100％,约99％,98％,97.5％,95％,90％,85％,80％,75％,70％，65％，60％，55％或50％互补)于核酸分子，及尤其是靶核酸诸如编码异常或突变的蛋白或酶的mRNA的区的。在一些实施方式中，反义化合物或反义寡核苷酸能与靶核酸杂交，由此调节其表达。

本发明的寡核苷酸包含约8～50个核苷酸长，诸如例如8～30个核苷酸长的连续的核苷酸序列或由其组成。在各种实施方式中，本发明的化合物不包含RNA单元或单体，而是，例如，包含DNA单元或单体和/或在一些实例中LNA单元或单体。优选的是，本发明的化合物是线性分子或被合成为线性分子。在一些实施方式中，寡核苷酸是单链分子，及优选不包含，例如，至少3，4或5个连续的核苷酸的短区(其互补于相同的寡核苷酸之内的相当的区(即,双联体))。在这点上，寡核苷酸基本上不是双链的。

【靶序列】

在特定实施方式中，本文所述的寡核苷酸能调节，或在一些实施方式中，下调(例如减少或消除)ATXN3的表达(例如,在mRNA水平下调编码异常或突变的ATXN3的核酸的翻译)。在这点上，本发明的寡核苷酸可一般在哺乳动物细胞诸如人细胞(例如,A549细胞,HeLa细胞,Purkinje细胞或神经元细胞)中影响ATXN3的抑制。在一些实施方式中，本发明的寡核苷酸与靶核酸(例如,编码伸展的,突变的或异常ATXN3mRNA的mRNA)杂交，及相比正常表达水平影响表达的抑制或减小至少约10％～100％(例如,诸如寡核苷酸或缀合物缺失下的表达水平)。例如，见于携带ATXN3突变等位基因的个体，本文公开的寡核苷酸可相比ATXN3的正常表达水平，影响ATXN3的表达的减小或抑制至少约5％，10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，97.5％，98％，99％或100％。在一些实施方式中，该调节在使靶向的细胞或组织暴露于约0.04nM～25nM浓度(例如,约0.8nM～20nM浓度)的本发明的化合物之后显现。在相同的或不同实施方式中，靶核酸(例如,编码突变的ATXN3的mRNA)的表达抑制小于100％(例如,诸如小于约98％抑制,小于约95％抑制,小于约90％抑制,小于约80％抑制或小于约70％抑制)。在一些实施方式中，本文公开的寡核苷酸能在mRNA水平调节ATXN3的表达(例如,通过靶向及杂交于编码突变的或异常ATXN3的mRNA)。表达调节(例如,在mRNA水平)可通过测量蛋白水平或浓度测定(例如,由SDS-PAGE之后是使用针对靶蛋白产生的适合的抗体的蛋白印迹)。或者，表达调节(例如,在mRNA水平)可通过测量mRNA的水平或浓度来测定(例如,由RNA印迹或定量RT-PCR)。当经mRNA水平或浓度的评估测量表达时，使用适当的剂量或浓度的寡核苷酸(例如,约0.04nM～25nM,或约0.8nM～20nM)的下调程度可相对于在缺失本发明的寡核苷酸、缀合物或组合物下观察到的正常水平或浓度为大于约10％，约10～20％，大于约20％，大于约25％，或大于约30％。

在本发明的情景中，术语“调节”和“调节”可指下列之一种或更多：基因或基因产物(例如,ATXN3mRNA)的表达增加(例如,刺激或上调)，基因或基因产物(例如,ATXN3mRNA)的表达减少(例如,下调或抑制)，和2种或更多基因产物之间相对表达变化(例如,相对于野生型ATXN3的表达，突变ATXN3的表达减少)。在本文所述的一些情景中，下调和抑制是调节的优选的形式，尤其是当其涉及调节突变的或伸展的ATXN3(例如,包含病原性聚-谷氨酰胺段的ATXN3)的表达时。在本文所述的一些情景中，术语“表达”是指来自基因或核酸(例如,DNA)的信息用于合成基因产物(例如,mRNA,RNA和/或蛋白)的过程，及包括，但不限于，下列之一种或更多：复制步骤，转录和翻译。可由本发明的寡核苷酸调节的表达步骤可包括，例如，蛋白的转录，剪接，翻译和翻译后修饰。

由于其涉及靶向，调节和表达，术语“ATXN3”广泛地可指称共济蛋白-3基因或其基因产物(例如,前-mRNA,成熟mRNA,cDNA或蛋白)和可包括突变的及野生型形式，同种型和其变体(例如,编码人ATXN3及编码ATXN3蛋白的核酸)。用斜体显示的术语，“ATXN3”如本文所用，一般指称共济蛋白-3基因。术语“野生型”(如其描述ATXN3)指称受试者或群中最常观察到的ATXN3等位基因，核苷酸序列，氨基酸序列，或表型。例如，相对于由编码该伸展的聚-谷氨酰胺段的核酸的存在表征的突变的ATXN3等位基因，术语“野生型”指称不包含该突变的余下等位基因。术语“突变体”和“突变的”(如它们描述ATXN3)指称包含，例如，一个或更多导致单碱基核苷酸用遗传物质(例如,DNA或RNA)的另一核苷酸取代的转变和颠换点突变的受试者或群中改变的等位基因，核苷酸序列，氨基酸序列，或表型。突变的一例是作为病原性(CAG)_n伸展立即3′侧的G-到-C转变取代及位于NM_004993的第987位的ATXN3中的单核苷酸多态性(包括包含相同的G-到-C转变取代的其任何变体和多态型)，及在本文被称为“G987C”突变或SNP。G987C突变与导致疾病的聚-谷氨酰胺伸展处于连锁不平衡，因此在多数患SCA3的患者中，G987C突变随编码病原性聚-谷氨酰胺伸展的等位基因分开。G987C突变的SNP ID是SNP ID rs12895357。术语“突变体”和“突变的”也旨在包括导致单碱基核苷酸用遗传物质(DNA或RNA)的另一核苷酸取代的转变和颠换点突变。该突变以相邻于病原性(CAG)_n伸展的G987C转变取代为例，其在多数患SCA3的患者中呈现为在第987位C代替G(如在正常患者中)。

如本文所用，术语“伸展”或“伸展的”(如它们描述或定性ATXN3或编码ATXN3的核酸)指称遗传密码中迭代基因复制的区，及尤其是编码病原性聚-谷氨酰胺伸展的包含(CAG)_n三-核苷酸重复子的区(例如,编码包含区(CAG)_n的ATXN的核酸，其中“n”大于约52)。伸展的一例是编码ATXN3的核酸中不稳定(CAG)_n重复子的迭代基因复制，其编码及导致翻译的ATXN3蛋白产物的病原性聚-谷氨酰胺伸展。

如特别涉及ATXN3，短语“调节表达”是指刺激，上调，下调和/或抑制ATXN3基因的基因产物(例如,野生型和/或突变的ATXN3的基因产物)。例如，靶向编码异常ATXN3的核酸(例如,mRNA)，且与该核酸特异性杂交的本发明的寡核苷酸(例如,mRNA编码ATXN3)可调节ATXN3表达。本文所述的寡核苷酸可调节患Machado-Joseph病或SCA3的患者中野生型及突变的ATXN3的表达。或者，在优选的实施方式中，本文所述的寡核苷酸可优先下调或抑制突变体或伸展的ATXN3的表达(例如,在本文描述的寡核苷酸可调节由病原性(CAG)_n三-核苷酸重复子的存在表征的突变ATXN3的表达)。

在一些实施方式中，本发明的寡核苷酸能靶向特定核酸。在本文所述的反义寡核苷酸的情景中，靶向特定核酸可为多步过程。过程通常始于鉴定其功能待调节的核酸序列。此可为，例如，其表达相关于特定病症或疾病状态(例如,SCA3)的核酸(例如,mRNA)。在一些实施方式中，靶核酸(例如,mRNA)编码ATXN3。在本发明的一些实施方式中，寡核苷酸能导致靶核酸的等位基因-特异性调节(例如,通过选择性地靶向编码病原性聚-谷氨酰胺段的等位基因，而由此辨别性地调节伸展的等位基因(相对于有功能的野生型等位基因)的表达)。例如，在特定实施方式中，靶核酸可包含编码ATXN3的G987C转变取代和/或(CAG)_n伸展段的核酸基因的区或片段。或者，在一些实施方式中，靶核酸编码包含ATXN3的G987C突变和/或(CAG)_n伸展段的ATXN3的特定区(或对应mRNA)。靶向过程也可包括在靶基因之内确定发生反义相互作用的位点，使得一个或更多期望效果会产生。一个或更多期望效果可包括，例如，基因产物(例如,野生型和/或突变mRNA或蛋白)的表达的调节，在相同的基因或mRNA上或在其他基因或mRNA上，相对于其他位点，就靶位点的选择性结合(例如,增加的结合亲和力)，足够的或增强的递送到靶，及最小或无不需要的副作用。在一些实施方式中，优选的靶向的核酸或mRNA位点编码ATXN3的G987C SNP和/或(CAG)_n伸展段和/或相邻区。

聚-谷氨酰胺伸展呈现负责脊髓小脑共济失调3发展的最常见的突变。如上所述，术语“聚-谷氨酰胺伸展”指称由(CAG)_n三-核苷酸编码及可存在于编码ATXN3的核酸中的谷氨酰胺残基的迭代和病原性重复子(在本文被称为“病原性(CAG)_n伸展”，其中n≥约52)。由(CAG)_n(其中n≥约52)编码的聚-谷氨酰胺伸展已相关于SCA3，而n≤约47可为更常见的和欠可能导致SCA3。聚-谷氨酰胺伸展也指称毗邻病原性(CAG)_n三-核苷酸重复子的区，例如，自该聚-谷氨酰胺伸展(例如,G987C突变)测量2，5，10，12，20，30，50，60，75，80或100密码子上游和下游的区。聚-谷氨酰胺伸展给ATXN3赋予毒性功能获得，其导致神经元核内包裹体的形成，及呈现负责SCA3发展的最常见的突变。在本发明的情景中，术语“单-核苷酸多态性”或“SNP”指称当物种成员之间或个体中配对的染色体之间单核苷酸不同时发生的核苷酸序列中的变异，例如，位于病原性(CAG)_n伸展的3′端的G987C SNP。

聚-谷氨酰胺伸展赋予ATXN3导致疾病的功能获得，因此，选择性地下调突变的或伸展的ATXN3等位基因的反义寡聚体化合物被预测改善或恢复余下(野生型)等位基因的正常ATXN3功能。特别是，在患SCA3的患者中，本发明的寡聚体化合物辨别性地靶向及杂交于编码突变的ATXN3等位基因的核酸(即,mRNA)(例如,包含SEQID NO:4或SNP ID rs12895357的核酸)，使得突变的ATXN3等位基因的表达被下调或抑制，而相同的化合物不或以更少程度靶向或杂交于野生型等位基因(例如,SEQ ID NO:1)，由此保存余下野生型等位基因的功能。

本文所述的寡核苷酸可被递送到下列之一种或更多：动物，哺乳动物，人，或细胞。靶向的细胞类型可，在一些实施方式中，包括神经元细胞，脑细胞，Purkinje细胞，HeLa细胞，HEK-293或A549细胞。在特定实施方式中，(例如,HEK-293或A549细胞中)使用的寡核苷酸浓度可为约0.025nM，0.03nM，0.05nM，0.1nM，0.25nM，0.27nM，0.3nM，0.5nM，0.81nM，0.9nM，1nM，2.5nM，5nM，40nM，100nM，200nM，250nM或更。使用的寡核苷酸浓度可，在一些实施方式中，是25nM(例如,在Purkinje细胞中)。在转染试剂缺失下(例如,使用剥裸递送)，被表征为具有约1μM～25μM之间的寡核苷酸浓度(例如,诸如约5μM)的介质可用于下调靶基因。

使用的寡核苷酸浓度可，在一些实施方式中，是0.1nM～1nM(例如,在神经元细胞中)。在特定实施方式中，本文公开的寡核苷酸可以约0.2～约20mg/kg的剂量(例如,以至少约0.2mg/kg,0.25mg/kg,0.5mg/kg,1.0mg/kg,1.5mg/kg,2.0mg/kg,2.5mg/kg,3.0mg/kg,3.5mg/kg,4.0mg/kg，4.5mg/kg，5.0mg/kg，6.0mg/kg，7.5mg/kg，8.0mg/kg，10mg/kg，12.5mg/kg，15mg/kg或20mg/kg的每天或每周剂量施用)周期性地施用给受试者(例如,每天,每周,每月,每季,每半年或每年静脉内或皮下施用给人)。需知，在一些实施方式中，可在体外细胞测定中，使用转染试剂(例如,脂转染剂)实施用来处理细胞的寡核苷酸的适当的浓度的确定。

在一些实施方式中，本文所述的寡核苷酸是ATXN3的有力的抑制物(即,在细胞或组织暴露于相对低浓度的寡核苷酸后，能调节该细胞或组织中ATXN3的表达)。在一些实施方式中，寡核苷酸能在相对低浓度的该寡核苷酸减少或另外抑制ATXN3(例如,突变的ATXN3)的表达。例如，在一些实施方式中，寡核苷酸可以相对低浓度抑制ATXN3由细胞的表达(例如,如通过转染测定测定的小于约5nM的IC₅₀,或小于约4nM,诸如小于2nM的IC₅₀)。如本文所用，术语“IC₅₀”指称足以抑制对象参数(例如,ATXN3蛋白表达)约50％的寡核苷酸的浓度。在特定实施方式中，本文公开的反义寡核苷酸特征在于选择性地抑制突变ATXN3蛋白的表达(相对于野生型ATXN3蛋白的表达)。因此，寡核苷酸可特征在于相对于抑制野生型ATXN3蛋白的表达需要的浓度，以更低浓度(例如,约2倍更低)抑制突变ATXN3蛋白的表达。例如，反义寡核苷酸可展示突变体和野生型ATXN3蛋白的IC₅₀的至少2倍差异(例如,在患SCA3的哺乳动物中，相对于正常或野生型蛋白，抑制ATXN3突变蛋白的表达需要的IC₅₀中至少约2-,2.5-,3-,4-,5-,6-,7-,8-,9-或10倍差异)。

本发明因此提供调节(例如,下调或抑制)表达该伸展的或突变的ATXN3蛋白和/或mRNA的细胞(例如,表达突变ATXN3蛋白和/或mRNA的Purkinje细胞)中编码伸展的或异常ATXN3蛋白和/或ATXN的mRNA，及尤其是包含或编码聚-谷氨酰胺伸展的ATXN3mRNA的表达的方法。该方法包括给细胞施用本发明的寡核苷酸或缀合物(或另外使该细胞与该寡核苷酸或缀合物接触)，以下调或抑制所述细胞中ATXN3蛋白和/或mRNA的表达。在一些实施方式中，细胞可为体外或体内哺乳动物细胞，诸如人细胞。例如，本发明的寡核苷酸靶向编码伸展的或突变的ATXN3的核酸和特异性杂交于其基因产物，由此调节伸展的或突变的ATXN3的表达。本发明的寡核苷酸可调节患SCA3的患者中野生型和/或突变的ATXN3等位基因的表达。施用于患者(例如,人或哺乳动物)，受试者(例如,人或哺乳动物)，和/或细胞(例如,人或哺乳动物)可体内，离体或体外发生。例如，在一些实施方式中，药学可接受的制剂和/或药学可接受的载体或递送媒质中的寡核苷酸可直接施用于患者的或受试者的身体，由本文所述的方法。或者，在一些实施方式中，寡核苷酸可在它们被移出之后及在它们回到患者的或受试者的身体之前施用于细胞。在一些实施方式中，细胞可在它们被移出之后及在它们回到患者的或受试者的身体之前维持在培养条件下。

短语“靶核酸”，如本文所用指称编码哺乳动物ATXN3的核酸(例如,mRNA)，及尤其是指称编码突变的或异常ATXN3的核酸(例如,mRNA)。例如，在本文公开的是编码包含病原性聚-谷氨酰胺伸展的ATXN3的靶核酸(例如,诸如由SEQ ID NO:4编码的)。适合的靶核酸包括编码ATXN3的核酸或其天然存在的变体，及源于其的RNA核酸(例如,包含或对应于SEQ ID NO:15～20的mRNA靶序列)，优选mRNA，诸如前-mRNA，尽管优选成熟mRNA。在一些实施方式中，(例如,当在研究或诊断情景中使用时)“靶核酸”可为源于以上DNA或RNA核酸靶的cDNA或合成寡核苷酸。本发明的寡核苷酸能与靶核酸或与该靶核酸的基因产物杂交。需知，在一些实施方式中，靶核酸序列是cDNA序列和像这样，对应于成熟mRNA靶序列，尽管在cDNA序列中尿嘧啶可用取代胸苷。

术语“其天然存在的变体”指称定义的分类群之内，诸如哺乳动物，诸如小鼠，猴和优选人中天然地存在的ATXN3多肽或核酸序列的变体。一般而言，当说到多核苷酸的“天然存在的变体”时，术语也可包括由染色体转位或复制见于染色体的编码基因组DNA的ATXN3，及RNA，源于其的诸如mRNA的任何等位基因变体。例如，ATXN3的天然存在的变体可包括G987C突变体，例如由SEQ ID NO:4编码，或其天然存在的变体(例如,SNP ID rs12895357)。天然存在的变体也可包括源于ATXN3mRNA的可变剪接的变体。当说到特定多肽序列时，术语也包括蛋白的天然存在的形式，其可因此，例如，由共翻译或翻译后修饰加工(例如,信号肽切割,蛋白水解切割,糖基化,等)。

【序列】

在一些实施方式中，寡核苷酸包含对应于SEQ ID NO:1或SEQID NO:4的核苷酸序列，或SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4的片段的反向互补体的连续的核苷酸序列或由其组成。由此，寡核苷酸可包含选自下列的序列或由其组成：SEQ ID NO:9，10，11，12，13或14，其中所述寡核苷酸(或其连续的核苷酸部分)可针对选择的靶序列任选地具有1，2或3个错配。在一些实施方式中，寡核苷酸可包含对应于编码包括G987C SNP和该SNP附近的核苷酸的ATXN3序列区的核苷酸序列的反向互补体的连续的核苷酸序列或由其组成。例如，在一些实施方式中，寡核苷酸可包含表1中鉴定的序列(即,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12)。寡核苷酸可互补于编码包括G987C突变的ATXN3的核酸(例如,mRNA)的区(例如,自G987C突变约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20或更多核苷酸上游和/或下游的区)，诸如表1中鉴定的靶序列。例如，在一些实施方式中，寡核苷酸可互补于表1中鉴定的mRNA靶序列(例如,SEQ IDNO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ IDNO:17或SEQ ID NO:18)。在一些实施方式中，该互补寡核苷酸能与ATXN3的基因产物(即,ATXN3mRNA)和尤其是包含G987C SNP的ATXN3的基因产物杂交(例如,特异性杂交)。

表1

寡核苷酸可包含完全互补(完美互补)于编码哺乳动物ATXN3的核酸的相当的区的连续的核苷酸序列(例如,SEQ ID NO:1,SEQ IDNO:4或其片段)或由其组成。由此，寡核苷酸可包含能与编码ATXN3的核酸(即,ATXN3mRNA)杂交的反义核苷酸序列或由其组成。

但是，在一些实施方式中，当与靶序列杂交时，寡核苷酸可耐受1，2，3或4个(或更多)错配，和仍与靶足够结合，以显示期望效果(例如,靶mRNA的下调)。错配可，例如，由存在于核苷酸序列之内的增加的寡核苷酸序列长度和/或增加的核苷酸类似物，诸如锁核酸(LNA)数补偿。在一些实施方式中，当与靶序列，诸如与编码哺乳动物ATXN3mRNA的核酸的对应区杂交时，连续的核苷酸序列包含不多于3个错配(例如,不多于1个或不多于2个错配)。在一些实施方式中，当与靶序列，诸如与编码哺乳动物ATXN3mRNA的核酸的对应区杂交时，连续的核苷酸序列包含不多于单个错配。

本发明的寡核苷酸的核苷酸序列或连续的核苷酸序列是优选至少80％互补于选自下列的序列：SEQ ID NO:15，16，17，18，19或20，诸如至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，诸如至少100％互补。

本发明的寡核苷酸的核苷酸序列或连续的核苷酸序列优选与存在于SEQ ID NO:4中的对应序列的反向互补体至少80％同源，诸如至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％同源，至少97％同源，至少98％同源，至少99％同源，诸如100％同源(同一)。

本发明的寡核苷酸的核苷酸序列或连续的核苷酸序列优选与存在于SEQ ID NO:4中的亚序列至少80％互补，诸如至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％互补，至少97％互补，至少98％互补，至少99％互补，诸如100％互补(完美互补)。

在一些实施方式中，寡核苷酸(或其连续的核苷酸部分)选自或包含选自下列的序列之一：SEQ ID NO:9，10，11，12，13或14，或其至少约6～10个连续的核苷酸的亚序列。在一些实施方式中，所述寡核苷酸(或其连续的核苷酸部分)可相比该序列任选地包含1，2或3个错配。

在一些实施方式中，亚序列可由8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28或29个连续的核苷酸，诸如约12～22，诸如约12～18个核苷酸组成。适宜地，在一些实施方式中，亚序列与本发明的连续的寡核苷酸的核苷酸序列具有相同的长度。

在本发明的一些实施方式中，寡核苷酸包含根据SEQ ID NO:9，10，11，12，13或14的核苷酸序列或其亚序列，或由其组成。

在本发明的一些实施方式中，寡核苷酸包含根据SEQ ID NO:7的核苷酸序列或其亚序列或由其组成。

在本发明的一些实施方式中，寡核苷酸包含根据SEQ ID NO:8的核苷酸序列或其亚序列或由其组成。

在本发明的一些实施方式中，寡核苷酸包含根据SEQ ID NO:9的核苷酸序列或其亚序列或由其组成。

在本发明的一些实施方式中，寡核苷酸包含根据SEQ ID NO:10的核苷酸序列或其亚序列或由其组成。

在本发明的一些实施方式中，寡核苷酸包含根据SEQ ID NO:11的核苷酸序列或其亚序列或由其组成。

在本发明的一些实施方式中，寡核苷酸包含根据SEQ ID NO:12的核苷酸序列或其亚序列或由其组成。

在测定本发明的寡核苷酸(或其区)及核酸的靶区(例如,编码哺乳动物ATXN3蛋白的mRNA)之间的互补性程度中，互补性(或同源性或同一性)程度表示为与之最佳对齐的寡核苷酸(或其区)序列及靶区(或靶区的反向互补体)的序列之间的百分率同一性(或百分率同源性)。百分率通过对2个序列之间相同的对齐的碱基数进行计数，除以寡核苷酸中连续的单体的总数，及乘以100来计算。在该比较中，如果存在间隔，该间隔可优选仅是错配，而非是间隔之内单体数在本发明的寡核苷酸和靶区之间不同的区。如本文所用，术语“同源”和“同源性”与术语“同一性”和“同一”可互换。

短语“对应于”和“对应于”指称寡核苷酸的核苷酸序列(即,核碱基或碱基序列)或连续的核苷酸序列和选自下列的再一序列的相当体连续的核苷酸序列之间的比较：(i)核酸靶(诸如编码ATXN3蛋白的mRNA)的反向互补体的亚序列，和/或(ii)本文提供的核苷酸的序列诸如由SEQ ID NO:15，16，17，18，19或20组成的，或其亚序列。核苷酸类似物与它们的相当体或对应核苷酸直接比较。对应于(i)或(ii)下的再一序列的第1序列一般在第1序列的长度上与该序列(诸如连续的核苷酸序列)相同，或，如本文所述可，在一些实施方式中，与对应序列至少80％同源，诸如至少85％，至少90％，至少91％，至少92％至少93％，至少94％，至少95％，至少96％同源，诸如100％同源(同一)。

一旦已鉴定一个或更多靶位点，选择与靶足够互补的寡核苷酸(即,足够良好及以足够的特异性杂交,以给出期望效果)。例如，在鉴定针对靶的ATXN3mRNA区后，寡核苷酸可基于与mRNA靶或替代性地与编码该mRNA靶的DNA的互补性选择。在此情景中，“杂交”是指氢键合，其可为互补核苷或核苷酸碱基之间的Watson-Crick，Hoogsteen或逆转的Hoogsteen氢键合。例如，腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)是通过形成氢键配对的互补核碱基。“互补”，如本文所用，指称2个核苷酸之间精确的配对的能力。例如，如果在寡核苷酸的特定位置的核苷酸能与在DNA或RNA分子的相同的位置的核苷酸氢键合，则寡核苷酸和DNA或RNA被认为在该位置彼此互补。当各分子中足够数量的对应位置由可彼此氢键合的核苷酸占据时，寡核苷酸和DNA或RNA彼此互补。由此，“可特异性杂交的”和“互补”是用于指示互补性或精确的配对的足够的程度，使得寡核苷酸和DNA或RNA靶之间发生稳定的和特异性结合的术语。本领域明白，反义化合物的序列无需是100％互补于待可特异性杂交的其靶核酸的序列。反义化合物的序列可为，例如，约40％，50％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，97％，97.5％，99％或100％互补于待可特异性杂交的其靶序列。当化合物与靶DNA或RNA分子结合干扰靶DNA或RNA的正常功能而导致功能或实用性损失，及有足够的互补性程度以避免在期望特异性结合的条件下(例如,在体内测定或治疗性治疗的情况,及在体外测定的情况中的生理条件下,在实施测定的条件下)反义化合物与非-靶序列非特异性结合时，反义化合物是可特异性杂交的。本文所用的短语“反向互补体”，“颠倒互补”和“反转互补性”指称可在给定核酸分子的相同的链上与另一给出的核酸序列杂交的寡核苷酸，因为其的互补相对于该核酸序列。例如，如果5′至3′靶核酸链中的碱基是C，则3′至5′链中的对应碱基是G。

通过实验鉴定与靶核酸(例如,编码突变的ATXN3蛋白的mRNA)杂交及抑制靶核酸的表达的本发明的反义和其他寡核苷酸，及这些化合物的序列是在本文鉴定为本发明的优选的实施方式(例如,表1中鉴定的序列)。这些优选的序列与之互补的靶核酸或位点在本文被称为“活性位点”及因此是优选的靶向用位点(例如,表1中鉴定的靶序列)。由本发明涵盖的活性位点的一例包括G987C SNP附近的区。因此，本发明的另一实施方式包括与此活性位点区(其可包括自活性位点立即上游和/或下游的核苷酸)杂交的化合物。例如，自G987C突变测量约1，2，5，10，12，20，30，50，60，75，80，100个或更多密码子上游和/或下游的区。

短语“对应核苷酸类似物”和“对应核苷酸”旨在表示核苷酸类似物和天然存在的核苷酸中的核碱基是相同的。像这样，在特定实施方式中，核苷酸类似物会与对应核苷酸，基于Watson-Crick碱基配对原理配对或杂交。例如，当核苷酸的2-脱氧核糖单元被连接到腺嘌呤时，对应核苷酸类似物含有与腺嘌呤连接的戊糖单元(不同于2-脱氧核糖)，和该核苷酸类似物会与对应胸腺嘧啶碱基配对或杂交。

【长度】

寡核苷酸可包含总5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29或30个连续的核苷酸长的连续的核苷酸序列或由其组成。在一些实施方式中，寡核苷酸包含总约8～25，诸如约10～22，诸如约12～18，诸如约13～17或12～16，诸如约13，14，15，16个连续的核苷酸长的连续的核苷酸序列或由其组成。在一些实施方式中，寡核苷酸包含总8，9，10，11，12，13或14个连续的核苷酸长的连续的核苷酸序列或由其组成。在一些实施方式中，本发明的寡核苷酸由不多于22个核苷酸，诸如不多于20个核苷酸，诸如不多于18个核苷酸，诸如15，16或17个核苷酸。在本发明的一些实施方式中，寡核苷酸包含少于20个核苷酸组成。需知，当为寡核苷酸或连续的核苷酸序列长度给出范围时，其包括范围中提供的下限和上限长度，例如自10～30(或之间)，包括10和30。

【核苷和核苷类似物】

本文所用的术语“核苷酸”，指称包含糖部分，碱基部分和共价连接的基团(连接基团)，诸如磷酸酯或硫代磷酸酯核苷酸间连接基团的糖苷，及含盖天然存在的核苷酸，诸如DNA或RNA，以及包含修饰的或取代的糖和/或碱基部分的非-天然存在的，合成或人工核苷酸，其也在本文被称为“核苷酸类似物”。在特定实施方式中，核苷酸类似物可包括寡核苷酸，其中核苷酸单元的糖和核苷间连接用新基团，诸如，例如，一个或更多肽核酸(PNA)取代。PNA通常被表征为具有用含有酰胺的骨架，尤其是氨基乙基甘氨酸骨架取代的寡核苷酸糖-骨架。核碱基被保留及直接或间接结合于骨架的酰胺部分的氮杂氮原子。

在本文中，单核苷酸单元也可被称为单体或核酸单元。

在生物化学领域，术语“核苷”通常用来指称包含糖部分和碱基部分的糖苷，因此可在指称由寡核苷酸的核苷酸之间的核苷酸间键共价连接的核苷酸单元时使用。在生物技术领域，术语“核苷酸”通常用来指称核酸单体或单元，及像这样，在寡核苷酸的情景中，可指称碱基，诸如短语“核苷酸序列”一般指称核碱基序列(即隐含存在糖主链和核苷间连接)。同样，特别是在核苷间连接基团中的一个或更多被修饰的寡核苷酸的情况中，术语“核苷酸”可指称“核苷”，例如，术语“核苷酸”可甚至当特别指定核苷之间连接的存在或性质时使用。

如本领域普通技术人员会认可，寡核苷酸的5′末端核苷酸不包含5′核苷酸间连接基团，尽管其可包含或可不包含5′末端基团。

非-天然存在的核苷酸包括修饰了糖部分的核苷酸，诸如双环核苷酸或2′取代的核苷酸。

在一些实施方式中，术语“核苷类似物”和“核苷酸类似物”互换使用。“核苷酸类似物”是天然的核苷酸，诸如DNA或RNA核苷酸的变体(依靠糖和/或碱基部分中的修饰)。类似物可在寡核苷酸的情景中，在原理上，仅是天然的核苷酸的“沉默”或“相当体”(例如,对寡核苷酸抑制靶基因表达的方式无功能性作用)。然而，该相当的类似物可为有用的，如果，例如，它们是更容易制备或制备时更廉价，或在存储或生产条件更稳定，或表现标签或标记物。但是，优选，类似物会对寡核苷酸发挥功能而抑制表达的方式具有功能性作用(例如,通过产生增加的对靶结合亲和力和/或增加的对细胞内核酸酶的抗性和/或增加的运输到细胞的容易度)。核苷类似物的特定例描述于，例如，reier，等人，Nucl.Acid Res.(1997)25:4429-4443和Uhlmann，等人，Curr.Opinion in Drug Development(2000)3(2)：293～213，及以下：

本文公开的寡核苷酸可由此包含天然存在的核苷酸，例如，优选2’-脱氧核苷酸(在本文通常称为“DNA”)，而且核糖核苷酸(在本文通常称为“RNA”)，或该天然存在的核苷酸及一个或更多非-天然存在的核苷酸，(例如,核苷酸类似物)的组合的简单序列或由其组成。该核苷酸类似物可适宜地增强寡核苷酸对靶序列的亲和性。适合的及优选的核苷酸类似物的例提供于国际专利申请WO 2007/031091，或该文中的参考文献。

增强亲和力的核苷酸类似物，诸如锁核酸(LNA)或2’-取代的糖合并进寡核苷酸可使特异性结合寡核苷酸的尺寸减小，及也可在非特异性或异常结合发生之前减小寡核苷酸的尺寸的上限。因此，在一些实施方式中，寡核苷酸包含至少1个核苷类似物。在一些实施方式中，寡核苷酸包含至少2个核苷酸类似物。在一些实施方式中，寡核苷酸包含自3～8个核苷酸类似物，(例如,6或7个核苷酸类似物)。在特定实施方式中，所述核苷酸类似物中的至少一个是LNA，例如核苷酸类似物中的至少3或至少4，或至少5，或至少6，或至少7，或至少8可为LNA。在一些实施方式中，寡核苷酸的全部核苷酸类似物可为LNA。

需知，当说到仅由核苷酸组成的优选的核苷酸序列基序或核苷酸序列时，被该序列定义的本发明的寡核苷酸可包含取代存在于该序列中的一个或更多核苷酸的对应核苷酸类似物或由取代存在于该序列中的一个或更多核苷酸的对应核苷酸类似物组成，诸如LNA单元或其他核苷酸类似物，其升高寡核苷酸/靶双联体的解离的熔解温度(T_m)或双联稳定性/T_m(即增强亲和力的核苷酸类似物)。如本文所用，术语“T_m”指称熔解温度及关于一群互补双联的核酸分子(例如,反义寡核苷酸和对应mRNA靶序列)一半解离为单链的温度而使用。更高T_m通常指示更稳定的双联体。

在一些实施方式中，寡核苷酸的核苷酸序列和靶序列之间的任何错配优选见于在增强亲和力的核苷酸类似物之外的区，诸如在本文所称的区B，和/或在本文所称的区D，和/或在寡核苷酸中非-修饰的核苷酸，诸如DNA核苷酸的位点，和/或对于连续的核苷酸序列是5′或3′的区中。

该核苷酸修饰的例包括修饰糖部分以提供2’-取代基或以产生桥接的(LNA)结构，其增强结合亲和力和也可提供增加的核酸酶抗性。在一些实施方式中，优选的核苷酸类似物是LNA，诸如氧基-LNA(诸如β-D-氧基-LNA,及α-L-氧基-LNA)和/或氨基-LNA(诸如β-D-氨基-LNA和α-L-氨基-LNA)和/或硫代-LNA(诸如β-D-硫代-LNA和α-L-硫代-LNA)和/或ENA(诸如β-D-ENA和α-L-ENA)。最优选的是β-D-氧基-LNA。

在一些实施方式中，存在于本发明的寡核苷酸之内(诸如在本文提及的区A和C内)的核苷酸类似物独立地选自，例如：2’-O-烷基-RNA单元，2’-氨基-DNA单元，2’-氟-DNA单元，LNA单元，阿拉伯糖型核酸(ANA)单元，2’-氟-ANA单元，HNA单元，INA(插入核酸单元，如由Christensen,等人,Nucl.Acids.Res.(2002)30：4918-4925讨论)和2’MOE单元。在一些实施方式中，仅有存在于本发明的寡核苷酸，或其连续的核苷酸序列中的以上类型的核苷酸类似物之一。

在一些实施方式中，核苷酸类似物是2’-O-甲氧基乙基-RNA(2’MOE)，2’-氟-DNA单体或LNA核苷酸类似物，及像这样，本发明的寡核苷酸可包含独立地选自这3种类型的类似物的核苷酸类似物，或可包含仅一种类型的选自3种类型的类似物。在一些实施方式中，所述核苷酸类似物中的至少一个是2’-MOE-RNA，诸如2，3，4，5，6，7，8，9或10个2’-MOE-RNA核苷酸单元。在一些实施方式中，所述核苷酸类似物中的至少一个是2’-DNA氟，诸如2，3，4，5，6，7，8，9或10个2’-氟-DNA核苷酸单元。

在一些实施方式中，本发明的寡核苷酸包含至少一个锁核酸(LNA)单元，诸如1，2，3，4，5，6，7或8个LNA单元，诸如约3～7或4～8个LNA单元，或3，4，5，6或7个LNA单元。在一些实施方式中，全部核苷酸类似物是LNA。在一些实施方式中，寡核苷酸可包含β-D-氧基-LNA，及以下LNA单元之一种或更多：硫代-LNA，氨基-LNA，氧基-LNA和/或β-D或α-L构型的ENA或其组合。在一些实施方式中，全部LNA胞嘧啶单元是5′甲基-胞嘧啶。在本发明的一些实施方式中，寡核苷酸可包含LNA和DNA单元。优选LNA和DNA单元总共是约8～25，诸如10～24，优选10～20，诸如10～18，甚至更优选12～16。在本发明的一些实施方式中，寡核苷酸的核苷酸序列，诸如连续的核苷酸序列包含至少一个LNA和余下核苷酸单元是DNA单元或由其组成。在一些实施方式中，寡核苷酸包含仅LNA核苷酸类似物和天然存在的核苷酸(诸如RNA或DNA,最优选DNA核苷酸)，任选地具有修饰的核苷酸间键诸如硫代磷酸酯。

如本文所用，术语“核碱基”指称核苷酸的碱基部分和含盖天然存在的以及非-天然存在的变体。由此，术语“核碱基”不仅含盖知道的嘌呤和其嘧啶杂环，而且杂环类似物和其互变异构体。核碱基的例基包括，但不限于腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，胸苷，尿嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，5-甲基胞嘧啶，异胞嘧啶，假异胞嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶，6-二氨基嘌呤，2-二氨基嘌呤，肌苷，二氨基嘌呤和2-氯-6-二氨基嘌呤。在一些实施方式中，存在于寡核苷酸中的至少一个核碱基是选自下列的修饰的核碱基：5-甲基胞嘧啶，异胞嘧啶，假异胞嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶，6-二氨基嘌呤，2-二氨基嘌呤，肌苷，二氨基嘌呤和2-氯-6-二氨基嘌呤。

在特定实施方式中，本发明涉及包含一个或更多C5-甲基胞嘧啶核碱基的反义寡核苷酸。例如，寡核苷酸包含SEQ ID NO:12，其中寡核苷酸在一个或更多选自下列的核苷酸包含至少一个核苷酸类似物：(i)在第1和3位的一个或更多的腺嘌呤核苷酸是氧基-LNA；(ii)在第10位的鸟嘌呤核苷酸是氧基-LNA；(iii)在第9和11位的一个或更多的胞嘧啶核苷酸是氧基-LNA；及(iv)在第2位的胸腺嘧啶核苷酸是氧基-LNA。

【锁核酸】

如本文所用，术语“LNA”指称双环核苷类似物，被称为锁核酸。其可指称LNA单体，或，当在“LNA寡核苷酸”的情景中使用时，LNA可指称含有一个或更该双环核苷酸类似物的寡核苷酸。LNA特征在于在核糖环的C2’和C4’之间存在接头基团(诸如桥)，例如，如显示于以下描述的双基R^4*-R^2*。

在本发明的寡核苷酸化合物中使用的LNA优选具有通式I的结构。

其中对于全部手性中心，不对称基团可被发现以R或S取向；

其中X选自-O-，-S-，-N(R^N*)-，-C(R⁶R^6*)-，诸如，在一些实施方式中-O-；

其中B选自：氢，任选地取代的C_1～4-烷氧基，任选地取代的C_{1～ 4}-烷基，任选地取代的C_1～4-酰氧基，核碱基包括天然存在的和核碱基类似物，DNA嵌入剂，光化学活性基团，热化学活性基团，螯合基团，报告基团，及配体或优选是核碱基或核碱基类似物；

其中P指定相邻单体的核苷酸间键，或5′-末端基团，该核苷酸间键或5′-末端基团任选地包括取代基R⁵或等同可应用的取代基R^5*；

其中P*指定相邻单体的核苷酸间键，或3’-末端基团；

其中R^4*和R^2*一起指定选自下列的由1～4个基团/原子组成的二价接头基团：-C(R^aR^b)-，-C(R^a)＝C(R^b)-，-C(R^a)＝N-，-O-，-Si(R^a)₂-，-S-，-SO₂-，-N(R^a)-及>C＝Z，其中Z选自：-O-，-S-及-N(R^a)-，及R^a和R^b各独立地选择自：氢，任选地取代的C_1～12-烷基，任选地取代的C_2～12-烯基，任选地取代的C_2～12-炔基，羟基，任选地取代的C_1～12-烷氧基，C_2～12-烷氧基烷基，C_2～12-烯氧基，羧基，C_1～12-烷氧羰基，C_{1～ 12}-烷基羰基，甲酰基，芳基，芳氧基-羰基，芳氧基，芳羰基，杂芳基，杂芳基氧基-羰基，杂芳基氧基，杂芳基羰基，氨基，单-及二(C_1～6-烷基)氨基，氨基甲酰基，单-及二(C_1～6-烷基)-氨基-羰基，氨基-C_1～6-烷基-氨基羰基，单-及二(C_1～6-烷基)氨基-C_1～6-烷基-氨基羰基，C_1～6-烷基-羰氨基，脲基，C_1～6-烷酰氧基，砜代，C_1～6-烷基磺酰氧基，硝基，叠氮基，硫烷基，C_1～6-烷硫基，卤素，DNA嵌入剂，光化学活性基团，热化学活性基团，螯合基团，报告基团，及配体，其中芳基和杂芳基可被任选地取代，且其中2个成对的取代基R^a和R^b一起可指定任选地取代的亚甲基(＝CH₂)，其中对于全部手性中心，不对称基团可被发现以R或S取向，及；

其中各取代基R^1*，R²，R³，R⁵，R^5*，R⁶和R^6*(其存在)独立地选自：氢，任选地取代的C_1～12-烷基，任选地取代的C_2～12-烯基，任选地取代的C_2～12-炔基，羟基，C_1～12-烷氧基，C_2～12-烷氧基烷基，C_2～12-烯氧基，羧基，C_1～12-烷氧羰基，C_1～12-烷基羰基，甲酰基，芳基，芳氧基-羰基，芳氧基，芳羰基，杂芳基，杂芳基氧基-羰基，杂芳基氧基，杂芳基羰基，氨基，单-及二(C_1～6-烷基)氨基，氨基甲酰基，单-及二(C_1～6-烷基)-氨基-羰基，氨基-C_1～6-烷基-氨基羰基，单-及二(C_{1～ 6}-烷基)氨基-C_1～6-烷基-氨基羰基，C_1～6-烷基-羰氨基，脲基，C_1～6-烷酰氧基，砜代，C_1～6-烷基磺酰氧基，硝基，叠氮基，硫烷基，C_1～6-烷硫基，卤素，DNA嵌入剂，光化学活性基团，热化学活性基团，螯合基团，报告基团，及配体，其中芳基和杂芳基可被任选地取代，且其中2个成对的取代基一起可指定氧代，硫代，亚氨基或任选地取代的亚甲基；其中R^N选自：氢和C_1～4-烷基，且其中2个相邻(非-成对的)取代基可指定另外的导致双键的键；及R^N*，当存在及不涉及双基时，选自：氢和C_1～4-烷基；及其碱式盐和酸加成盐。对于全部手性中心，不对称基团可被发现以R或S取向。

在一些实施方式中，R^4*和R^2*一起指定由选自下列的基团组成的双基：C(R^aR^b)-C(R^aR^b)-，C(R^aR^b)-O-，C(R^aR^b)-NR^a-，C(R^aR^b)-S-及C(R^aR^b)-C(R^aR^b)-O-，其中各R^a和R^b可任选地独立地选择。在一些实施方式中，R^a和R^b可为，任选地独立地选自：氢和C_1～6烷基，诸如甲基，诸如氢。

在一些实施方式中，R^4*和R^2*一起指定R-或S-构型的双基-O-CH(CH₂OCH₃)-(2’O-甲氧基乙基双环核酸)(Seth等人,2010,J.org.Chem)。

在一些实施方式中，R^4*和R^2*一起指定R-或S-构型的双基-O-CH(CH₂CH₃)-2’O-乙基双环核酸。

在一些实施方式中，R^4*和R^2*一起指定R-或S-构型的双基-O-CH(CH₃)-。在一些实施方式中，R^4*和R^2*一起指定双基-O-CH₂-O-CH₂-。

在一些实施方式中，R^4*和R^2*一起指定双基-O-NR-CH₃-。

在一些实施方式中，LNA单元具有选自以下的结构：

在一些实施方式中，R^1*，R²，R³，R⁵，R^5*独立地选自：氢，卤素，C_1～6烷基，取代的C_1～6烷基，C_2～6烯基，取代的C_2～6烯基，C_{2～ 6}炔基或取代的C_2～6炔基，C_1～6烷氧基，取代的C_1～6烷氧基，酰基，取代的酰基，C_1～6氨基烷基或取代的C_1～6氨基烷基。对于全部手性中心，不对称基团可被发现以R或S取向。

在一些实施方式中，R^1*，R²，R³，R⁵，R^5*是氢。

在一些实施方式中，R^1*，R²，R³独立地选自：氢，卤素，C_1～6烷基，取代的C_1～6烷基，C_2～6烯基，取代的C_2～6烯基，C_2～6炔基或取代的C_2～6炔基，C_1～6烷氧基，取代的C_1～6烷氧基，酰基，取代的酰基，C_1～6氨基烷基或取代的C_1～6氨基烷基。对于全部手性中心，不对称基团可被发现以R或S取向。

在一些实施方式中，R^1*，R²，R³是氢。

在一些实施方式中，R⁵和R^5*是各独立地选自：H，-CH₃，-CH₂-CH₃,-CH₂-O-CH₃，及-CH＝CH₂。适宜地在一些实施方式中，R⁵或R^5*均是氢，其中作为其他基团(分别R⁵或R^5*)选自：C₁～₅烷基，C_2～6烯基，C_2～6炔基，取代的C_1～6烷基，取代的C_2～6烯基，取代的C_2～6炔基或取代的酰基(-C(＝O)-)；其中各取代的基团被独立地选自下列的取代基单或多取代：卤素，C_1～6烷基，取代的C_1～6烷基，C_2～6烯基，取代的C_2～6烯基，C_2～6炔基，取代的C_2～6炔基，OJ₁，SJ₁，NJ₁J₂，N₃，COOJ₁，CN，O-C(＝O)NJ₁J₂，N(H)C(＝NH)NJ,J₂或N(H)C(＝X)N(H)J₂，其中X是O或S；及各J₁和J₂独立地是：H，C_{1～ 6}烷基，取代的C_1～6烷基，C_2～6烯基，取代的C_2～6烯基，C_2～6炔基，取代的C_2～6炔基，C_1～6氨基烷基，取代的C_1～6氨基烷基或保护基。在一些实施方式中，R⁵或R^5*均是取代的C_1～6烷基。在一些实施方式中，R⁵或R^5*均是取代的亚甲基，其中优选的取代基包括独立地选自下列的一个或更多基团：F，NJ₁J₂，N₃，CN，OJ₁，SJ₁，O-C(＝O)NJ₁J₂，N(H)C(＝NH)NJ，J₂或N(H)C(O)N(H)J₂。在一些实施方式中，各J₁和J₂独立地是：H或C_1～6烷基。在一些实施方式中，R⁵或R^5*均是甲基，乙基或甲氧甲基。在一些实施方式中，R⁵或R^5*均是甲基。在进一步实施方式中，R⁵或R^5*均是乙炔基。在一些实施方式中，R⁵或R^5*是取代的酰基。在一些实施方式中，R⁵或R^5*均是C(＝O)NJ₁J₂。对于全部手性中心，不对称基团可被发现以R或S取向。该5′修饰的双环核苷酸公开于国际专利申请WO 2007/134181。

在一些实施方式中B是核碱基，包括核碱基类似物和天然存在的核碱基，诸如嘌呤或嘧啶，或取代的嘌呤或取代的嘧啶，诸如这里指称的核碱基，诸如选自下列的核碱基：腺嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶，腺嘌呤，尿嘧啶和/或修饰的或取代的核碱基，诸如5-噻唑并-尿嘧啶，2-硫代-尿嘧啶，5-丙炔基-尿嘧啶，2’硫代-胸腺嘧啶，5-甲基胞嘧啶，5-噻唑并-胞嘧啶，5-丙炔基-胞嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。

在一些实施方式中，R^4*和R^2*一起指定选自下列的双基：-C(R^aR^b)-O-，-C(R^aR^b)-C(R^cR^d)-O-，-C(R^aR^b)-C(R^cR^d)-C(R^eR^f)-O-，-C(R^aR^b)-O-C(R^cR^d)-，-C(R^aR^b)-O-C(R^cR^d)-O-，-C(R^aR^b)-C(RcR^d)-，-C(R^aR^b)-C(R^cR^d)-C(R^eR^f)-，-C(R^a)＝C(R^b)-C(R^cR^d)-，-C(R^aR^b)-N(R^c)-，-C(R^aR^b)-C(R^cR^d)-N(R^e)-，-C(R^aR^b)-N(R^c)-O-及-C(R^aR^b)-S-，-C(R^aR^b)-C(R^cR^d)-S-，其中R^a，R^b，R^c，R^d，R^e和R^f各独立地选自：氢，任选地取代的C_1～12-烷基，任选地取代的C_2～12-烯基，任选地取代的C_2～12-炔基，羟基，C_1～12-烷氧基，C_2～12-烷氧基烷基，C_2～12-烯氧基，羧基，C_1～12-烷氧羰基，C_1～12-烷基羰基，甲酰基，芳基，芳氧基-羰基，芳氧基，芳羰基，杂芳基，杂芳基氧基-羰基，杂芳基氧基，杂芳基羰基，氨基，单-及二(C_1～6-烷基)氨基，氨基甲酰基，单-及二(C_{1～ 6}-烷基)-氨基-羰基，氨基-C_1～6-烷基-氨基羰基，单-及二(C_1～6-烷基)氨基-C_1～6-烷基-氨基羰基，C_1～6-烷基-羰氨基，脲基，C_1～6-烷酰氧基，砜代，C_1～6-烷基磺酰氧基，硝基，叠氮基，硫烷基，C_1～6-烷硫基，卤素，DNA嵌入剂，光化学活性基团，热化学活性基团，螯合基团，报告基团，及配体，其中芳基和杂芳基可被任选地取代，且其中2个成对的取代基R^a和R^b一起可指定任选地取代的亚甲基(＝CH₂)。对于全部手性中心，不对称基团可被发现以R或S取向。

在进一步实施方式中R^4*和R^2*一起指定选自下列的双基(二价基团)：-CH₂-O-，-CH₂-S-，-CH₂-NH-，-CH₂-N(CH₃)-，-CH₂-CH₂-O-，-CH₂-CH(CH₃)-，-CH₂-CH₂-S-，-CH₂-CH₂-NH-，-CH₂-CH₂-CH₂-，-CH₂-CH₂-CH₂-O-，-CH₂-CH₂-CH(CH₃)-，-CH＝CH-CH₂-，-CH₂-O-CH₂-O-，-CH₂-NH-O-，-CH₂-N(CH₃)-O-，-CH₂-O-CH₂-，-CH(CH₃)-O-及-CH(CH₂-O-CH₃)-O-，和/或，-CH₂-CH₂-，及-CH＝CH-，对于全部手性中心，不对称基团可被发现以R或S取向。

在一些实施方式中，R^4*和R^2*一起指定双基C(R^aR^b)-N(R^c)-O-，其中R^a和R^b独立地选自：氢，卤素，C_1～6烷基，取代的C_1～6烷基，C_2～6烯基，取代的C_2～6烯基，C_2～6炔基或取代的C_2～6炔基，C_1～6烷氧基，取代的C_1～6烷氧基，酰基，取代的酰基，C_1～6氨基烷基或取代的C_1～6氨基烷基，诸如氢，及；其中R^c选自：氢，卤素，C_1～6烷基，取代的C_1～6烷基，C_2～6烯基，取代的C_2～6烯基，C_2～6炔基或取代的C_2～6炔基，C_1～6烷氧基，取代的C_1～6烷氧基，酰基，取代的酰基，C_1～6氨基烷基或取代的C_1～6氨基烷基，诸如氢。

在一些实施方式中，R^4*和R^2*一起指定双基C(R^aR^b)-O-C(R^cR^d)-O-，其中R^a，R^b，R^c和R^d独立地选自：氢，卤素，C_1～6烷基，取代的C_1～6烷基，C_2～6烯基，取代的C_2～6烯基，C_{2～ 6}炔基或取代的C_2～6炔基，C_1～6烷氧基，取代的C_1～6烷氧基，酰基，取代的酰基，C_1～6氨基烷基或取代的C_1～6氨基烷基，诸如氢。

在一些实施方式中，R^4*和R^2*形成双基-CH(Z)-O-，其中Z选自：C_1～6烷基，C_2～6烯基，C_2～6炔基，取代的C_1～6烷基，取代的C_2～6烯基，取代的C_2～6炔基，酰基，取代的酰基，取代的酰胺，氢硫基或取代的硫代；，且其中各取代的基团独立地被独立地选自下列的保护的取代基任选地单或多取代：卤素，氧代，羟基，OJ₁，NJ₁J₂，SJ₁，N₃，OC(＝X)J₁，OC(＝X)NJ₁J₂，NJ³C(＝X)NJ₁J₂和CN，其中各J₁，J₂和J₃独立地是：H或C_1～6烷基，及X是O，S或NJ₁。在一些实施方式中，Z是C_1～6烷基或取代的C_1～6烷基。在一些实施方式中，Z是甲基。在一些实施方式中，Z是取代的C_1～6烷基。在一些实施方式中，所述取代基是C_1～6烷氧基。在一些实施方式中，Z是CH₃OCH₂-。对于全部手性中心，不对称基团可被发现以R或S取向。该双环核苷酸公开于美国专利No.7,399,845。在一些实施方式中，R^1*，R²，R³，R⁵，R^5*是氢。在一些实施方式中，R^1*，R²，R^3*是氢，及R⁵，R^5*之一或二者可为以上提及及国际专利申请WO 2007/134181中提及的氢之外的基团。

在一些实施方式中，R^4*和R^2*一起指定在桥中包含取代的氨基的双基，诸如由双基-CH₂-N(R^c)-组成或包含双基-CH₂-N(R^c)-，其中R^c是C_1～12烷基氧基。在一些实施方式中，R^4*和R^2*一起指定双基-Cq₃q₄-NOR-，其中q₃和q₄独立地选自：氢，卤素，C_1～6烷基，取代的C_1～6烷基，C_2～6烯基，取代的C_2～6烯基，C_2～6炔基或取代的C_2～6炔基，C_1～6烷氧基，取代的C_1～6烷氧基，酰基，取代的酰基，C_1～6氨基烷基或取代的C_1～6氨基烷基；其中各取代的基团独立地被独立地选自下列的取代基单或多取代：卤素，OJ₁，SJ₁，NJ₁J₂，COOJ₁，CN，O-C(＝O)NJ₁J₂，N(H)C(＝NH)N J₁J₂或N(H)C(＝X＝N(H)J₂，其中X是O或S；及各J₁和J₂独立地是：H，C_1～6烷基，C_2～6烯基，C_2～6炔基，C_1～6氨基烷基或保护基。对于全部手性中心，不对称基团可被发现以R或S取向。该双环核苷酸公开于WO2008/150729。在一些实施方式中，R^1*，R²，R³，R⁵，R^5*独立地选自：氢，卤素，C_1～6烷基，取代的C_1～6烷基，C_2～6烯基，取代的C_2～6烯基，C_2～6炔基或取代的C_2～6炔基，C_1～6烷氧基，取代的C_1～6烷氧基，酰基，取代的酰基，C_1～6氨基烷基或取代的C_1～6氨基烷基。在一些实施方式中，R^1*，R²，R³，R⁵，R^5*是氢。在一些实施方式中，R^1*，R²，R³是氢，而R⁵，R^5*之一或二者可为以上提及及国际专利申请WO 2007/134181中提及的氢之外的基团。在一些实施方式中，R^4*和R^2*一起指定双基(二价基团)C(R^aR^b)-O-，其中R^a和R^b各独立地是：卤素，C₁～C₁₂烷基，取代的C₁～C₁₂烷基，C₂～C₁₂烯基，取代的C₂～C₁₂烯基，C₂～C₁₂炔基，取代的C₂～C₁₂炔基，C₁～C₁₂烷氧基，取代的C₁～C₁₂烷氧基，OJ₁SJ₁，SOJ₁，SO₂J₁，NJ₁J₂，N₃，CN，C(＝O)OJ₁，C(＝O)NJ₁J₂，C(＝O)J₁，O-C(＝O)NJ₁J₂，N(H)C(＝NH)NJ₁J₂，N(H)C(＝O)NJ₁J₂或N(H)C(＝S)NJ₁J₂；或R^a和R^b一起是＝C(q3)(q4)；q₃和q₄各独立地是：H，卤素，C₁～C₁₂烷基或取代的C₁～C₁₂烷基；各取代的基团独立地被独立地选自下列的取代基单或多取代：卤素，C₁～C₆烷基，取代的C₁～C₆烷基，C₂～C₆烯基，取代的C₂～C₆烯基，C₂～C₆炔基，取代的C₂～C₆炔基，OJ₁，SJ₁，NJ₁J₂，N₃，CN，C(＝O)OJ₁，C(＝O)NJ₁J₂，C(＝O)J₁，O-C(＝O)NJ₁J₂，N(H)C(＝O)NJ₁J₂或N(H)C(＝S)NJ₁J₂.及；各J₁和J₂独立地是：H，C1～C₆烷基，取代的C1～C₆烷基，C₂～C₆烯基，取代的C₂～C₆烯基，C₂～C₆炔基，取代的C₂～C₆炔基，C1～C₆氨基烷基，取代的C1～C₆氨基烷基或保护基。该化合物公开于国际专利申请WO 2009/006478A。

在一些实施方式中，R^4*和R^2*形成双基-Q-，其中Q是C(q₁)(q₂)C(q₃)(q₄)，C(q₁)＝C(q₃)，C[＝C(q₁)(q₂)]-C(q₃)(q₄)或C(q₁)(q₂)-C[＝C(q₃)(q₄)]；q₁，q₂，q₃，q₄各独立地是：H，卤素，C_{1～ 12}烷基，取代的C_1～12烷基，C_2～12烯基，取代的C_1～12烷氧基，OJ₁，SJ₁，SOJ₁，SO₂J₁，NJ₁J₂，N₃，CN，C(＝O)OJ₁，C(＝O)-NJ₁J₂，C(＝O)J₁，-C(＝O)NJ₁J₂，N(H)C(＝NH)NJ₁J₂，N(H)C(＝O)NJ₁J₂或N(H)C(＝S)NJ₁J₂；各J₁和J₂独立地是：H，C_1～6烷基，C_2～6烯基，C_{2～ 6}炔基，C_1～6氨基烷基或保护基；及，任选地其中当Q是C(q₁)(q₂)(q₃)(q₄)及q₃或q₄之一是CH₃时，则其他q₃或q₄中的至少一个或q₁和q₂之一是H之外的基团。在一些实施方式中，R^1*，R²，R³，R⁵，R^5*是氢。对于全部手性中心，不对称基团可被发现以R或S取向。该双环核苷酸公开于WO/2008/154401。在一些实施方式中，R^1*，R²，R³，R⁵，R^5*独立地选自：氢，卤素，C_1～6烷基，取代的C_1～6烷基，C_2～6烯基，取代的C_2～6烯基，C_2～6炔基或取代的C_2～6炔基，C_1～6烷氧基，取代的C_1～6烷氧基，酰基，取代的酰基，C_1～6氨基烷基或取代的C_1～6氨基烷基。在一些实施方式中，R^1*，R²，R³，R⁵，R^5*是氢。在一些实施方式中，R^1*，R²，R³是氢，及R⁵，R^5*之一或二者可为以上提及及国际专利申请WO/2007/134181和WO2009/067647中提及的氢之外的基团(α-L-双环核酸类似物)。

在一些实施方式中，在本发明的寡核苷酸化合物中使用的LNA优选具有通式II的结构。

其中Y选自：-O-，-CH₂O-，-S-，-NH-，N(R^e)和/或-CH₂-；

其中Z和Z*独立地选择自：核苷酸间键，R^H，末端基团或保护基；

其中B构成天然的或非-天然的核苷酸碱基部分(核碱基)，及R^H选自：氢和C_1～4-烷基；R^a，R^b R^c，R^d和R^e任选地独立地选自：氢，任选地取代的C_1～12-烷基，任选地取代的C_2～12-烯基，任选地取代的C_2～12-炔基，羟基，C_1～12-烷氧基，C_2～12-烷氧基烷基，C_2～12-烯氧基，羧基，C_1～12-烷氧羰基，C_1～12-烷基羰基，甲酰基，芳基，芳氧基-羰基，芳氧基，芳羰基，杂芳基，杂芳基氧基-羰基，杂芳基氧基，杂芳基羰基，氨基，单-及二(C_1～6-烷基)氨基，氨基甲酰基，单-及二(C_{1～ 6}-烷基)-氨基-羰基，氨基-C_1～6-烷基-氨基羰基，单-及二(C_1～6-烷基)氨基-C_1～6-烷基-氨基羰基，C_1～6-烷基-羰氨基，脲基，C_1～6-烷酰氧基，砜代，C_1～6-烷基磺酰氧基，硝基，叠氮基，硫烷基，C_1～6-烷硫基，卤素，DNA嵌入剂，光化学活性基团，热化学活性基团，螯合基团，报告基团，及配体，其中芳基和杂芳基可被任选地取代，且其中2个成对的取代基R^a和R^b一起可指定任选地取代的亚甲基(＝CH₂)；，且其中R^H选自：氢和C_1～4-烷基。在一些实施方式中，R^a，R^b R^c，R^d和R^e任选地独立地选自：氢和C_1～6烷基，诸如甲基。对于全部手性中心，不对称基团可被发现以R或S取向，例如，2种例示立体化学异构体包括β-D和α-L同种型，其可例证如下：

特定例示LNA单元示于下：

β-D-氨基-LNA

术语“硫代-LNA”包含锁核苷酸，其中以上通式中的Y选自S或-CH₂-S-。硫代-LNA可处于β-D和α-L-构型。

术语“氨基-LNA”包含锁核苷酸，其中以上通式中的Y选自：-N(H)-，N(R)-，CH₂-N(H)-及-CH₂-N(R)-其中R选自：氢和C_1～4-烷基。氨基-LNA可处于β-D和α-L-构型。

术语“氧基-LNA”包含锁核苷酸，其中以上通式中的Y表示-O-。氧基-LNA可处于β-D和α-L-构型。在特定实施方式中，本文公开的反义寡核苷酸包含至少一个氧基-LNA。例如，在本文公开的是包含SEQ ID NO:12的寡核苷酸，其中寡核苷酸在一个或更多选自下列的位置包含至少一个核苷酸类似物：(a)在第1位的鸟嘌呤核苷酸是氧基-LNA；(b)在第2和3位之一个或更多的腺嘌呤核苷酸是氧基-LNA；(c)在第10和11位之一个或更多的胞嘧啶核苷酸是氧基-LNA；及(d)在第12位的胸腺嘧啶核苷酸是氧基-LNA。在一些实施方式中，该氧基-LNA之一些或全部是β-D-氧基-LNA。

术语“ENA”包含锁核苷酸，其中以上通式中的Y是：-CH₂-O-(其中相对于碱基B，-CH₂-O-的氧原子附接于2’-位置)。r^e是氢或甲基。

在一些例示实施方式中，LNA选自：β-D-氧基-LNA，α-L-氧基-LNA，β-D-氨基-LNA和β-D-硫代-LNA，尤其是β-D-氧基-LNA。

【RNA酶募集】

需知，寡核苷酸可经靶mRNA的非RNA酶-介导的降解，诸如由翻译位阻，或其他方法发挥功能，但是，优选的本发明的寡核苷酸能募集核糖核酸内切酶(RNA酶)，诸如RNA酶H。

可优选的是，寡核苷酸，或连续的核苷酸序列，包含至少6，诸如至少7个连续核苷酸单元，诸如至少8或至少9个连续核苷酸单元，包括7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个连续核苷酸的区，其当与互补靶RNA形成双联体时能募集RNA酶。能募集RNA酶的连续的序列可在本文所述的间隔聚体的情景中为区B。在一些实施方式中，能募集RNA酶的连续的序列，诸如区B的尺寸，可为更大，诸如10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20个核苷酸单元。

EP 1 222 309提供测定RNA酶H活性的体外方法，其可用于测定募集RNA酶H的能力。如果，当提供互补RNA靶时，其具有通过使用仅DNA寡核苷酸(具有相同的碱基序列但仅含有DNA单体，无2’取代，寡核苷酸中的全部单体之间具有硫代磷酸酯连接基团)，使用由EP 1 222 309的实施例91～95提供的方法测定的初速度(以pmol/l/min测量的)的至少1％，诸如至少5％，诸如至少10％或大于20％的初速度，则寡核苷酸被认为能募集RNA酶H。

在一些实施方式中，如果，当提供互补RNA靶及RNA酶H时，RNA酶H初速度(以pmol/l/min测量的)是通过使用相当的仅DNA寡核苷酸(无2’取代，寡核苷酸中的全部核苷酸之间有硫代磷酸酯连接基团)，使用由EP 1222309的实施例91～95提供的方法测定的初速度的小于1％，诸如小于5％,诸如小于10％或小于20％，则寡核苷酸被认为基本上不能募集RNA酶H。

在其他实施方式中，如果，当提供互补RNA靶及RNA酶H时，RNA酶H初速度(以pmol/l/min测量的)是通过使用相当的仅DNA寡核苷酸(无2’取代，寡核苷酸中的全部核苷酸之间有硫代磷酸酯连接基团)，使用由EP 1222309的实施例91～95提供的方法测定的初速度的至少20％，诸如至少40％，诸如至少60％，诸如至少80％，则寡核苷酸被认为能募集RNA酶H。

一般，当与互补靶RNA形成双联体时，形成能募集RNA酶的连续核苷酸单元的寡核苷酸的区由与RNA靶形成DNA/RNA样双联体及包括DNA单元和α-L构型的LNA单元(特别优选的是α-L-氧基LNA)的核苷酸单元组成。

本发明的寡核苷酸可包含核苷酸序列，其包含核苷酸和核苷酸类似物，及可处于间隔聚体，头聚体或混聚体形式。

“头聚体”被定义为包含区X和与之连续的区Y(区Y的5′-多数单体连与区X的3’-多数单体连接)的寡核苷酸。区X包含非-RNA酶募集核苷类似物的连续的延伸物，和区Y包含可被RNA酶识别的和可被RNA酶切割的DNA单体或核苷类似物单体的连续的延伸物(诸如至少7个连续的单体)。

“尾聚体”被定义为包含区X和与之连续的区Y(区Y的5′-多数单体与区X的3’-多数单体连接)的寡核苷酸。区X包含可被RNA酶识别的和可被RNA酶切割的DNA单体或核苷类似物单体的连续的延伸物(诸如至少7个连续的单体)，及区X包含非-RNA酶募集核苷类似物的连续的延伸物。

其他“嵌合”寡核苷酸(被称为“混聚体”)由(i)可被RNA酶识别的和可被RNA酶切割的DNA单体或核苷类似物单体，及(ii)非-RNA酶募集核苷类似物单体的交替组合物组成。

在一些实施方式中，除了增强寡核苷酸对靶区的亲和性之外，一些核苷类似物也介导RNA酶(例如,RNA酶H)结合及切割。由于α-L-LNA单体募集RNA酶H活性至特定程度，在一些实施方式中，含有α-L-LNA单体的寡核苷酸的间隔区(例如,在本文称为区B)由更少可被RNA酶H识别的和可被RNA酶H切割的单体组成，及混聚体构建中导入更多柔性。

【间隔聚体设计】

在本发明的一些实施方式中，寡核苷酸是间隔聚体。间隔聚体是包含能募集RNA酶，诸如RNA酶H的核苷酸的连续的延伸物的寡核苷酸，诸如至少6或7个DNA核苷酸的区，在本文称为区B(B)，其中区B在5′和3′侧接增强亲和力的核苷酸类似物区，诸如能募集RNA酶的核苷酸的连续的延伸物的5′和3′侧约1～6个核苷酸类似物，这些区分别称为区A(A)和C(C)。

在一些实施方式中，能募集RNA酶的单体选自：DNA单体，α-L-LNA单体，C4’烷基化的DNA单体(见PCT/EP2009/050349和Vester等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.18(2008)2296-2300)，及UNA(未连接的核酸)核苷酸(见Fluiter等人,Mol.Biosyst.,(2009)10：1039)。UNA是未锁的核酸，一般其中核糖的C2～C3C-C键已被去除，形成未锁的“糖”残基。优选地，间隔聚体包含式(5′至3′)，A-B-C或任选地A-B-C-D或D-A-B-C的(聚)核苷酸序列，其中；区A(A)(5′区)包含至少一个核苷酸类似物，诸如至少一个LNA单元，诸如约1～6个核苷酸类似物，诸如LNA单元或由其组成，及；区B(B)包含能募集RNA酶(当与互补RNA分子,诸如mRNA靶形成双联体时)的至少5个连续核苷酸，诸如DNA核苷酸或由其组成，及；区C(C)(3’区)包含至少一个核苷酸类似物，诸如至少一个LNA单元，诸如自1～6个核苷酸类似物，诸如LNA单元或由其组成，及；区D(D)，当存在时，包含1，2或3个核苷酸单元，诸如DNA核苷酸或由其组成。

在一些实施方式中，区A由1，2，3，4，5或6个核苷酸类似物，诸如LNA单元，诸如约2～5个核苷酸类似物，诸如2～5个LNA单元，诸如3或4个核苷酸类似物，诸如3或4个LNA单元组成；和/或区C由1，2，3，4，5或6个核苷酸类似物，诸如LNA单元，诸如自2～5个核苷酸类似物，诸如2～5个LNA单元，诸如3或4个核苷酸类似物，诸如3或4个LNA单元组成。

在一些实施方式中，B包含能募集RNA酶的5，6，7，8，9，10，11或12个连续核苷酸，或能募集RNA酶的6～10，或7～9，诸如8个连续核苷酸或由其组成。在一些实施方式中，区B包含至少一个DNA核苷酸单元，诸如1～12个DNA单元，优选4～12个DNA单元，更优选6～10个DNA单元，诸如约7～10个DNA单元，最优选8，9或10个DNA单元或由其组成。

在一些实施方式中，区A由3或4个核苷酸类似物，诸如LNA组成，区B由7，8，9或10个DNA单元组成，及区C由3或4个核苷酸类似物，诸如LNA组成。该设计包括(A-B-C)3-10-3，3-10-4，4-10-3，3-9-3，3-9-4，4-9-3，3-8-3，3-8-4，4-8-3，3-7-3，3-7-4，4-7-3和可还包括区D，其可具有1个或2个核苷酸单元，诸如DNA单元。

其他间隔聚体设计公开于国际申请WO 2004/046160。国际申请WO 2008/113832，其要求US临时申请60/977,409的优先权，说到’短聚体’间隔聚体寡核苷酸。在一些实施方式中，本文呈现的寡核苷酸可为那样的短聚体间隔聚体。

在一些实施方式中，寡核苷酸由总10，11，12，13或14个核苷酸单元的连续的核苷酸序列组成，其中连续的核苷酸序列具有式(5′-3’)，A-B-C或任选地A-B-C-D或D-A-B-C，其中；A由1，2或3个核苷酸类似物单元，诸如LNA单元组成；B由当与互补RNA分子(诸如mRNA靶)形成双联体时能募集RNA酶的7，8或9个连续的核苷酸单元组成；及C由1，2或3个核苷酸类似物单元，诸如LNA单元组成。当存在时，D由单DNA单元组成。

在一些实施方式中，A由1个LNA单元组成。在一些实施方式中，A由2个LNA单元组成。在一些实施方式中，A由3个LNA单元组成。在一些实施方式中，C由1个LNA单元组成。在一些实施方式中，C由2个LNA单元组成。在一些实施方式中，C由3个LNA单元组成。在一些实施方式中，B由7个核苷酸单元组成。在一些实施方式中，B由8个核苷酸单元组成。在一些实施方式中，B由9个核苷酸单元组成。在特定实施方式中，区B由10核苷单体组成。在特定实施方式中，区B包含1～10个DNA单体。在一些实施方式中，B包含约1-9个DNA单元，诸如2，3，4，5，6，7，8或9个DNA单元。在一些实施方式中，B由DNA单元组成。在一些实施方式中，B包含至少1个α-L构型的LNA单元，诸如2，3，4，5，6，7，8或9个α-L-构型的LNA单元。在一些实施方式中，B包含至少1个α-L-氧基LNA单元或其中全部α-L-构型的LNA单元是α-L-氧基LNA单元。在一些实施方式中，存在于A-B-C中的核苷酸数选自：(核苷酸类似物单元-区B-核苷酸类似物单元)：1-8-1，1-8-2，2-8-1，2-8-2，3-8-3，2-8-3，3-8-2，4-8-1，4-8-2，1-8-4，2-8-4，或；1-9-1，1-9-2，2-9-1，2-9-2，2-9-3，3-9-2，1-9-3，3-9-1，4-9-1，1-9-4，或；1-10-1，1-10-2，2-10-1，2-10-2，1-10-3，3-10-1。在一些实施方式中，A-B-C中的核苷酸数选自：2-7-1，1-7-2，2-7-2，3-7-3，2-7-3，3-7-2，3-7-4和4-7-3。在特定实施方式中，各区A和C由3个LNA单体组成，及区B由8或9或10个核苷单体，优选DNA单体组成。在一些实施方式中，A和C各由2个LNA单元组成，及B由8或9个核苷酸单元，优选DNA单元组成。在各种实施方式中，其他间隔聚体设计包括那些，其中区A和/或C由3，4，5或6个核苷类似物，诸如含有2’-O-甲氧基乙基-核糖(2’-MOE)的单体或含有2’-氟-脱氧核糖的单体组成，及区B由8，9，10，11或12个核苷，诸如DNA单体组成，其中区A-B-C具有3-9-3，3-10-3，5-10-5或4-12-4单体。其他间隔聚体设计公开于国际申请WO/2007/146511A2。

【核苷酸间连接】

本文所述的寡核苷酸的单体经连接基团偶联在一起。适宜地，各单体经连接基团连接到3’相邻单体。本领域普通技术人员会明白，在本发明的情景中，在寡核苷酸末端的5′单体不包含5′连接基团，尽管其可或可不包含5′末端基团。

短语“连接基团”和“核苷酸间键”旨在表示能将2个核苷酸共价偶联在一起的基团。特定及优选的例包括磷酸酯基团和硫代磷酸酯基团。在特定实施方式中，本文公开的反义寡核苷酸在各核苷酸间键具有硫代磷酸酯核苷酸间键(例如,SEQ ID NO:19,20,21,22和23)。本发明的寡核苷酸或其连续的核苷酸序列的核苷酸经连接基团偶联在一起。适宜地各核苷酸经连接基团连接到3’相邻核苷酸。

适合的核苷酸间键包括国际申请WO 2007/031091中所列的那些，例如在WO2007/031091的第34页第1段落所列的核苷酸间键。

其是，在一些实施方式中，优选将核苷酸间键自其正常磷酸二酯修饰为更耐受核酸酶作用的键，诸如硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯，这两种键(可被RNA酶H切割的)也允许减少靶基因的表达中反义抑制的途径。

可优选在本文提供的适合的含硫(S)核苷酸间键。也优选硫代磷酸酯核苷酸间键，特别对于间隔聚体的间隔区(B)。硫代磷酸酯键也可用于侧翼区(A和C,及用于连接A或C与D,及在区D内,根据需要)。

区A，B和C，可但是包含硫代磷酸酯之外的核苷酸间键，诸如磷酸二酯键，特别是，例如当使用核苷酸类似物保护区A和C之内的核苷酸间键免于内切核酸酶降解时-诸如当区A和C包含LNA核苷酸时。

寡核苷酸中的核苷酸间键可为磷酸二酯，硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯，以允许靶向的RNA的RNA酶H切割。硫代磷酸酯优选，用于改善的核酸酶抗性和其他原因，诸如制备容易性。

在本发明的寡核苷酸的在一方面，核苷酸和/或核苷酸类似物利用硫代磷酸酯基团彼此连接。

需知，特别在核苷酸类似物单元之间或相邻于核苷酸类似物单元(一般在区A及或C中)的另外的硫代磷酸寡核苷酸中包括磷酸二酯键，诸如1或2个连接，可修饰寡核苷酸的生物利用度和/或生物-分布，见国际申请WO 2008/053314。

在一些实施方式中，诸如以上说到的实施方式中，如果适合，且不特别指示，全部其余连接基团是磷酸二酯或硫代磷酸酯，或其混合物。在一些实施方式中，全部核苷酸间连接基团是硫代磷酸酯。

当说到特定间隔聚体寡核苷酸序列，诸如本文提供的那些时，会明白，在各种实施方式中，当连接是硫代磷酸酯键时，可使用替代性的连接，诸如本文公开的那些，例如可使用磷酸酯(磷酸二酯)连接，特别用于连接核苷酸类似物，诸如LNA，单元之间。同样，当说到特定间隔聚体寡核苷酸序列，诸如本文提供的那些时，当C残基被标注为5′甲基修饰的胞嘧啶时，在各种实施方式中，存在于寡核苷酸中的一个或更多C可为未修饰的C残基。

【寡核苷酸】

本发明的寡核苷酸可，例如，包含选自下列的序列：SEQ ID NO:9，10，11，12，13和14。在特定实施方式中，本发明的寡核苷酸可包含选自下列的序列：SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23。在一些实施方式中，本发明的寡核苷酸可，例如，选自：表1或4中鉴定的序列。

【缀合物】

在本发明的情景中，术语“缀合物”旨在表示由本文所述的寡核苷酸与一个或更多非-核苷酸，或非-多核苷酸部分共价连接形成的异源分子。非-核苷酸或非-多核苷酸部分的例包括大分子剂诸如蛋白，脂肪酸链，糖残基，糖蛋白，聚合物或其组合。一般蛋白可为靶蛋白的抗体。典型聚合物可为聚乙二醇。

因此，在各种实施方式中，本发明的寡核苷酸可包含：一般由核苷酸的连续的序列组成的多核苷酸区，及还包含非-核苷酸区。当说到由连续的核苷酸序列组成的本发明的寡核苷酸时，化合物可包含非-核苷酸组分，诸如缀合组分。

在本发明的各种实施方式中，寡核苷酸被连接到配体/缀合物，其可，例如用来增加寡核苷酸的细胞摄取。国际申请WO 2007/031091提供适合的配体和缀合物。

本发明也提供缀合物，其包含在本文描述的本发明的化合物，及至少一个共价附接于所述化合物的非-核苷酸或非-多核苷酸部分。因此，在各种实施方式中，当本发明的化合物由在本文公开的特定的核酸或核苷酸序列组成时，化合物也可包含至少一个共价附接于所述化合物的非-核苷酸或非-多核苷酸部分(例如不包含一个或更多核苷酸或核苷酸类似物)。

缀合可增强本发明的寡核苷酸的活性，细胞分布或细胞摄取。该部分包括，但不限于，抗体，多肽，脂质部分诸如胆甾醇部分，胆酸，硫醚，例如。己基-s-三苯甲基硫醇，硫代胆甾醇，脂肪族链，例如，十二烷二醇或十一碳烷基残基，磷脂，例如，二-十六碳烷基-消旋-甘油或三乙基铵1,2-二-o-十六碳烷基-消旋-甘油基-3h-膦酸盐，聚胺或聚乙二醇链，金刚烷乙酸，棕榈基部分，十八烷基胺或己基氨基-羰基-氧基胆甾醇部分。

本发明的寡核苷酸也可缀合于活性药物物质，例如，阿司匹林，布洛芬，磺胺药物，抗糖尿病药，抗细菌剂或抗生素。

在特定实施方式中，缀合的部分是甾醇，诸如胆甾醇。

在各种实施方式中，缀合的部分包含带正电的聚合物，诸如例如约1～50，诸如2～20诸如3～10个氨基酸残基长的带正电的肽，和/或聚亚烷基氧化物诸如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(见例如,国际申请WO 2008/034123)或由其组成。适宜地带正电的聚合物，诸如聚亚烷基氧化物可经接头诸如描述于WO 2008/034123的可释放的接头附接于本发明的寡核苷酸。

例如，在本发明的缀合物中可使用以下缀合部分：

【活化的寡核苷酸】

术语“活化的寡核苷酸”，如本文所用，指称共价连接(即,官能化的)于至少一个官能部分的本发明的寡核苷酸，该官能部分允许寡核苷酸共价连接于一个或更多缀合的部分(即,本身不是核酸或单体的部分)而形成本文描述的缀合物。一般而言，官能部分会包含能经，例如，腺嘌呤碱基的3’-羟基或环外NH₂基团而共价键合于寡核苷酸的化学基团，优选是亲水的间隔物和能结合于缀合的部分的末端基团(例如,氨基,巯基或羟基)。在一些实施方式中，此末端基团未被保护(例如,NH₂基团)。在其他实施方式中，末端基团例如，由任何适合的保护基诸如描述于由Theodora W Greene和Peter G M Wuts的“Protective Groups in Organic Synthesis”，第3版(John Wiley&Sons,1999)的那些保护。适合的羟基保护基的例包括酯诸如乙酸酯，芳烷基诸如苄基，二苯甲基或三苯甲基，及四氢吡喃基。适合的氨基保护基的例包括苄基，α-甲基苄基，二苯甲基，三苯甲基，苄氧基羰基，叔-丁氧羰基和酰基诸如三氯乙酰基或三氟乙酰基。在一些实施方式中，官能部分是自我切割的。在其他实施方式中，官能部分是可生物降解的(见例如,美国专利No.7,087,229)。

在一些实施方式中，本发明的寡核苷酸在5′端官能化，以便允许缀合的部分共价连接于寡核苷酸的5′端。在其他实施方式中，本发明的寡核苷酸可在3′端官能化。在仍其他实施方式中，本发明的寡核苷酸可沿着主链或在杂环碱基部分官能化。在仍其他实施方式中，本发明的寡核苷酸可在独立地选自5′端，3′端，主链和碱基的多于一个位置官能化。

在一些实施方式中，活化的本发明的寡核苷酸在合成共价附接于官能部分的一个或更多单体期间通过合并合成。在其他实施方式中，活化的本发明的寡核苷酸用未官能化的单体合成，及寡核苷酸在合成完成后官能化。在一些实施方式中，寡核苷酸用含有氨基烷基接头的阻碍的酯官能化，其中烷基部分具有式(CH₂)_w，其中w是1～10的整数，优选约6，其中烷氨基的烷基部分可为直链或支链，且其中官能团经酯基(-O-C(O)-(CH₂)_wNH)附接于寡核苷酸。

在其他实施方式中，寡核苷酸用含有(CH₂)_w-巯基(SH)接头的阻碍的酯官能化，其中w是1～10的整数，优选约6，其中烷氨基的烷基部分可为直链或支链，且其中官能团经酯基(-O-C(O)-(CH₂)_wSH)附接于寡核苷酸。

在一些实施方式中，巯基-活化的寡核苷酸与聚合物部分诸如聚乙二醇或肽(经二硫键的形成)缀合。

上述含有阻碍的酯的活化的寡核苷酸可由本领域知道的任何方法，及尤其是由国际申请WO 2008/034122和该文实施例中公开的方法合成。

在仍其他实施方式中，本发明的寡核苷酸，利用基本上描述于美国专利No.4,962,029和4,914,210的官能化剂(即,一端具有亚磷酰胺的基本上线性试剂，通过亲水间隔物链连接到包含保护的或未保护的巯基,氨基或羟基的对侧端)，通过向寡核苷酸导入巯基，氨基或羟基来官能化。该试剂主要与寡核苷酸的羟基反应。在一些实施方式中，该活化的寡核苷酸具有与寡核苷酸的5′-羟基偶联的官能化剂。在其他实施方式中，活化的寡核苷酸具有与3’-羟基偶联的官能化剂。在仍其他实施方式中，本发明的活化的寡核苷酸具有与寡核苷酸的主链上的羟基偶联的官能化剂。在仍进一步实施方式中，本发明的寡核苷酸用多于一个描述于美国专利No.4,962,029和4,914,210的官能化剂官能化。合成该官能化剂及将它们合并到单体或寡核苷酸的方法公开于美国专利No.4,962,029和4,914,210。

在一些实施方式中，将固相结合的寡核苷酸的5′-端用二烯基亚磷酰胺衍生物官能化，之后去保护的寡核苷酸经Diels-Alder环加成反应缀合，例如，氨基酸或肽。

在各种实施方式中，将含有2’-糖取代的单体，诸如2’-氨基甲酸取代的糖或2'-(O-戊基-N-酞酰亚氨基)-脱氧核糖并合到寡核苷酸辅助缀合的部分共价连接于寡核苷酸的糖。在其他实施方式中，通过使用剂诸如，例如，5’-二甲氧基三苯甲基-2'-O-(e-酞酰亚氨基氨基戊基)-2'-脱氧腺苷-3’--N,N-二异丙基-氰基乙氧基亚磷酰胺来制备在一个或更多单体的2'-位置具有含有氨基的接头的寡核苷酸(见,例如,Manoharan,等人,Tetrahedron Letters，(1991)34:7171)。

在仍进一步实施方式中，本发明的寡核苷酸可在核碱基上，包括在N6嘌呤氨基，在鸟嘌呤的环外N2，或在胞嘧啶的N4或5位置具有含有胺的官能部分。在各种实施方式中，该官能化可通过使用已在寡核苷酸合成中官能化的商业试剂达到。

一些官能部分是可商购的，例如，异双官能和同双官能连接部分可获自Pierce Co(Rockford,Ill.)。其他可商购的连接基是5’-氨基-修饰物C6和3’-氨基-修饰物试剂，二者可获自Glen研究公司(Sterling,Va.)。5’-氨基-修饰物C6也可获自ABI(Applied Biosystems Inc.,Foster City,Calif)。如Aminolink-2，及3’-氨基-修饰物也可获自Clontech Laboratories Inc(Palo Alto,Calif.)。

【药学组合物】

本发明的寡核苷酸可在药学制剂和组合物中使用。适宜地，该组合物包含药学可接受的溶剂，诸如水或盐水，稀释剂，载体，盐或佐剂。PCT/DK2006/000512提供适合的及优选的药学可接受的稀释剂，载体和佐剂。适合的剂量，制剂，施用途径，组合物，剂型，与其他治疗剂的组合，前药制剂也提供于PCT/DK2006/000512。

本发明也包括药物组合物和制剂，其包括本发明的寡核苷酸。本发明的药物组合物可以许多方式，依赖于是否期望局部或系统性治疗及依赖于待治疗的区施用。施用可为局部(包括经眼及到粘膜包括阴道和直肠递送)，肺部，例如，通过吸入或粉或气雾剂的吸入(包括由雾化器)；气管内，鼻内，表皮和经皮)，口腔或肠胃外。肠胃外施用包括静脉内，动脉内，皮下，腹膜内或肌内注射或输注；或颅内(例如,鞘内,脑室内或心室内施用)。具有至少一个2'-O-甲氧基乙基修饰的寡核苷酸被认为对于口服施用特别有用。

用于局部施用的药物组合物和制剂可包括经皮贴剂，软膏，洗液，霜剂，凝胶，滴剂，栓剂，喷雾剂，液剂和粉剂。常规药学载体，水性，粉或油基，增稠剂等可为必需或期望的。优选的局部制剂包括本发明的寡核苷酸在与局部递送剂的混合物中的那些，所述局部递送剂诸如脂质，脂质体，脂肪酸，脂肪酸酯，甾，螯合剂和表面活性剂。优选的脂质和脂质体包括中性(例如二油酰磷脂酰DOPE乙醇胺,二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱DMPC,二硬脂酰磷酯酰胆碱)，阴离子(例如二肉豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG)和阳离子(例如二油酰基四甲基氨基丙基DOTAP和二油酰磷脂酰乙醇胺DOTMA)。本发明的寡核苷酸可包裹在脂质体之内或可与其形成复合物，尤其是阳离子脂质体。或者，寡核苷酸可复合为脂质，尤其是阳离子脂质。优选的脂肪酸和酯包括但不限于花生四烯酸，油酸，二十烷酸，月桂酸，辛酸，癸酸，肉豆蔻酸，棕榈酸，硬脂酸，亚油酸，亚麻酸，二癸酸，三癸酸，甘油单油酸酯，甘油二月桂酸酯，甘油基1-单癸酸酯，1-十二烷基氮杂环己烷-2-酮，酰基肉毒碱，酰基胆碱，或C_1～10烷基酯(例如肉豆蔻酸异丙酯IPM)，单甘油酯，二甘油脂或其药学可接受的盐。局部制剂详细描述于1999年5月20日提交的美国专利申请No.09/315,298。

用于口服施用的组合物和制剂包括粉或颗粒剂，微粒，纳米颗粒，悬浮液或水中的溶液，盐水或非-水性介质，胶囊，凝胶胶囊，囊，片剂或小片剂。增稠剂，调味剂，稀释剂，乳化剂，分散辅助物或粘合剂可为期望的。优选的口腔制剂是本发明的寡核苷酸结合一种或更多穿透增强剂、表面活性剂和螯合剂施用的那些。优选的表面活性剂包括脂肪酸和/或其酯或盐，胆汁酸和/或其盐。优选的胆汁酸/盐包括鹅脱氧胆酸(CDCA)和熊脱氧鹅脱氧胆酸(UDCA)，胆酸，脱氢胆酸，脱氧胆酸，GLUCHOLIC酸，GLYCHOLIC酸，甘氨脱氧胆酸，牛磺胆酸，牛磺脱氧胆酸，钠牛磺-24,25-二氢-夫西地酸盐，GLYCODIHYDROFUSIDATE钠，优选的脂肪酸包括花生四烯酸，十一酸，油酸，月桂酸，辛酸，癸酸，肉豆蔻酸，棕榈酸，硬脂酸，亚油酸，亚麻酸，二癸酸，三癸酸，甘油单油酸酯，甘油二月桂酸酯，甘油基1-单癸酸酯，1-十二烷基氮杂环己烷-2-酮，酰基肉毒碱，酰基胆碱，或单甘油酯，二甘油脂或其药学可接受的盐(例如钠)。也优选的是穿透增强剂的组合，例如，脂肪酸/盐组合胆汁酸/盐。特别优选的组合是月桂酸，癸酸和UDCA的钠盐。其他穿透增强剂包括聚氧乙烯-9-月桂基醚，聚氧乙烯-20-鲸蜡基醚。本发明的寡核苷酸可以粒状形式(包括喷射的干燥的粒子，或复合而形成微或纳米粒子)经口递送。寡核苷酸络合剂包括聚-氨基酸；聚亚胺；聚丙烯酸酯；聚烷基丙烯酸酯，POLYOXETHANE，聚烷基氰基丙烯酸酯；阳离子化的明胶，白蛋白，淀粉，丙烯酸酯，聚乙二醇(PEG)和淀粉；聚烷基氰基丙烯酸酯；DEAE-衍生的聚亚胺，出芽短梗孢糖，纤维素和淀粉。特别优选的络合剂包括壳聚糖，N-三甲基壳聚糖，聚-L-赖氨酸，聚组氨酸，聚鸟氨酸，聚精胺，鱼精蛋白，聚乙烯基吡啶，聚硫代二乙基氨基-甲基亚乙基P(TDAE)，聚氨苯乙烯(例如p-氨基)，聚(甲基氰基丙烯酸酯)，聚(乙基氰基丙烯酸酯)，聚(丁基氰基丙烯酸酯)，聚(异丁基氰基丙烯酸酯)，聚(异己基氰基丙烯酸酯)，DEAE-甲基丙烯酸酯，DEAE-己基丙烯酸酯，DEAE-丙烯酰胺，DEAE-白蛋白和DEAE-葡聚糖，聚甲基丙烯酸酯，聚己基丙烯酸酯，聚(D,L-乳酸)，聚(DL-乳酸-共-乙醇酸(PLGA)，藻酸和聚乙二醇(PEG)。对于口腔制剂，就寡核苷酸和它们的制备物详细描述于美国应用系列No.08/886,829(1997年7月1日提交的)，美国系列No.09/108,673(1998年7月1日提交的)，美国系列No.09/256,515(1999年2月23日提交的)，美国系列No.09/082,624(1998年5月21日提交的)和美国系列No.09/315,298(1999年5月20日提交的)。

用于肠胃外，鞘内，脑室内或心室内施用的组合物和制剂可包括无菌水溶液，其也可含有缓冲剂，稀释剂和其他适合的添加剂诸如但不限于穿透增强剂，载体化合物和其他药学可接受的载体或赋形剂。

本发明的药物组合物包括，但不限于，溶液，乳剂和含有脂质体的制剂。这些组合物可从包括，但不限于，预形成的液体，自身-乳化固体和自身-乳化半固体的各种组分产生。

本发明的药学制剂，其可便利地以单元剂型存在，可根据药学工业熟知的常规技术制备。该技术包括以下步骤：使活性成分与药学载体或赋形剂联合。一般而言，制剂通过使活性成分与液体载体或精细化的固体载体或二者均匀和密切地联合，然后，如果必需，使产物成形来制备。

本发明的组合物可配制为任何许多可能的剂型，诸如但不限于片剂，胶囊，凝胶胶囊，液体糖浆，软凝胶，栓剂和灌肠剂。本发明的组合物也可在水性，非-水性或混合的培养基中制成悬浮液。水性悬浮液可还含有增加悬浮液的粘度的物质，包括，例如，羧甲基纤维素钠，山梨糖醇和/或葡聚糖。悬浮液也可含有稳定剂。

在本发明的一实施方式中，药物组合物可配制及作为泡沫使用。药学泡沫包括制剂诸如但不限于乳剂，微乳剂，霜剂，胶冻剂和脂质体。尽管性质上基本上类似，这些制剂在组分和最终产物的一致性方面有变化。该组合物和制剂的制备通常为药物和制剂领域技术人员所知，和可应用于本发明的组合物的制剂。

在另一方面，提供方法以使本发明的化合物靶向身体中的特定组织，器官或位置。例示靶包括中枢神经系统的细胞和组织(例如,脑细胞和组织,神经元细胞,Purkinje细胞,Schwann细胞,少突胶质细胞和星形胶质细胞)。靶向化合物的方法为本领域所熟知。在一实施方式中，化合物由直接或局部施用靶向。例如，当靶向血管时，化合物自血管腔之内直接施用到血管的关联部分，例如，单气囊或双气囊导管，或用辅助化合物的慢释放的材料(例如，描述于Simons等人，Nature(1992)359：67～70的普流尼克凝胶系统)通过血管外膜施用。其他用于将化合物局部递送到血管的慢释放技术包括用化合物包被支架。将寡核苷酸递送到血管的方法公开于美国专利No.6,159,946。

本发明的反义化合物包括任何药学可接受的盐，酯或该酯的盐，或在施用到动物包括人之后，能提供(直接或间接)有生物学活性的代谢物或其残留物的任何其他化合物。因此，例如，本公开也涉及本发明的化合物的药物前体和药学可接受的盐，该药物前体的药学可接受的盐，及其他生物等价体。

术语“药物前体”指示以无活性形式制备的治疗剂，其通过内源性酶或其他化学品和/或条件的作用而在身体或其细胞之内转化为有活性的形式(即,药物)。尤其是，本发明的寡核苷酸的药物前体形式根据国际申请WO 1993/24510和WO 1994/26764及美国专利No.5,770,713中公开的方法制备为SATE[(S-乙酰-2-硫代乙基)磷酸盐]衍生物。

术语“药学可接受的盐”指称本发明的化合物的生理学和药学可接受的盐(即,保留母化合物的期望的生物学活性及不向其附加不期望的毒理学效果的盐)。对于寡核苷酸，药学可接受的盐的优选的例包括但不限于(a)与阳离子诸如钠，钾，铵，镁，钙，聚胺诸如精胺和亚精胺，等形成的盐；(b)与无机酸，例如盐酸，氢溴酸，硫酸，磷酸，硝酸等形成的酸加成盐；(c)与有机酸诸如，例如，乙酸，草酸，酒石酸，琥珀酸，马来酸，富马酸，葡萄糖酸，柠檬酸，苹果酸，抗坏血酸，苯甲酸，鞣酸，棕榈酸，藻酸，聚谷氨酸，萘磺酸，甲基磺酸，p-甲苯磺酸，萘二磺酸，聚半乳糖醛酸等形成的盐；及(d)自元素阴离子形成的盐，诸如氯，溴和碘。

【应用】

本发明的寡核苷酸可用作研究试剂，例如，用于诊断学，治疗学和预防学。在研究中，该寡核苷酸可用于在细胞和实验动物中特异性抑制伸展的或另外突变的ATXN3的合成(一般通过降解或抑制mRNA和由此防止蛋白形成)，由此辅助靶的功能分析或评价其作为用于治疗性干预的靶的有用性。

在诊断学中，寡核苷酸可用于由RNA印迹，原位杂交或类似技术检测及定量细胞和组织中ATXN3表达。

对于治疗学，通过施用根据本发明的寡核苷酸来治疗疑患可通过调节ATXN3的表达来治疗的疾病或病症(例如,SCA3)的动物或人。还提供的是通过施用治疗或预防性地有效量的一种或更多本发明的寡核苷酸或组合物来治疗疑患与ATXN3的表达关联的疾病或病情或有患与ATXN3的表达关联的疾病或病情的倾向的哺乳动物，诸如治疗人的方法。本发明的寡核苷酸、缀合物或药物组合物一般以有效量施用。

本发明也提供如描述的本发明的化合物或缀合物用于制备治疗在本文所到的病症的药物的用途，或治疗在本文说到的病症的方法。

本发明也提供治疗在本文说到的病症的方法，所述方法包括给有需求的患者施用在本文描述的本发明的化合物，和/或本发明的缀合物，和/或本发明的药物组合物。

也被本发明涵盖的是本文所述的寡核苷酸(例如,寡核苷酸，其与包含G987C单核苷酸多态性的SEQ ID NO:4的区杂交)作为药物的用途。类似地，在本文提供的是本文所述的寡核苷酸(例如,与编码或相邻于ATXN3聚-谷氨酰胺伸展段的mRNA杂交寡核苷酸)用于治疗疾病诸如SCA3的用途。

【医疗适应症】

本发明的寡核苷酸和其他组合物可用于治疗与突变的形式的ATXN3的过表达或表达关联的病情(例如,脊髓小脑共济失调3)。在一些实施方式中，本文公开的寡核苷酸及组合物可用作药物。在其他实施方式中，本文提供的寡核苷酸用于治疗疾病。例如，寡核苷酸(其与包含G987C单核苷酸多态性的SEQ ID NO:4的区杂交)可用于治疗脊髓小脑共济失调3。本发明还提供本发明的化合物用于制备治疗在本文说到的疾病，病症或病情的药物的用途。

总言之，本发明的一方面针对治疗哺乳动物患或敏感于与突变的，异常，伸展的或另外异常ATXN3关联(例如,相关于伸展的ATXN3的表达)的病情的方法，包括给哺乳动物施用治疗有效量的靶向包含一个或更多LNA单元的ATXN3的突变的或天然存在的变体的基因产物(例如,mRNA编码突变的或伸展的ATXN3)的寡核苷酸。在本文所说的疾病或病症可，在一些实施方式中，相关于ATXN3基因或其蛋白产物与ATXN3相关或相互作用的基因中的突变。因此，在一些实施方式中，靶mRNA是突变的形式的ATXN3mRNA。

本发明的一方面针对寡核苷酸或缀合物用于制备治疗在本文说到的疾病，病症或病情的药物的用途。

本发明的方法优选用于治疗或预防针对由异常ATXN3水平导致的疾病。换言之，在一些实施方式中，本发明是此外针对治疗异常ATXN3水平的方法，所述方法包括给有需求的患者施用本发明的寡核苷酸，或本发明的缀合物或本发明的药物组合物。

本发明也涉及本文定义的寡核苷酸，组合物或缀合物，其用作药物。

本发明还涉及本文定义的化合物，组合物，或缀合物用于制备治疗异常ATXN3水平或突变体形式的ATXN3(诸如等位基因变体,诸如与在本文说到的疾病之一关联的那些)的表达的药物的用途。

而且，本发明涉及治疗患疾病或病情诸如在本文说到的那些的受试者的方法。

有治疗需求的患者是患或可能患疾病或病症的患者。

在一些实施方式中，本文所用的术语“治疗”指称治疗既患疾病(例如在本文说到的疾病或病症)，或防止疾病，(即,预防)。需知，在本文说到的治疗可，在一些实施方式中，是预防性的。

本发明的反义化合物可用于诊断学，治疗学，预防及用作研究试剂和试剂盒。对于治疗学，通过施用根据本发明的寡核苷酸来治疗疑患可通过调节ATXN3的表达来治疗的疾病或病症的动物，优选人。本发明的寡核苷酸可通过向适合的药学可接受的稀释剂或载体添加有效量的寡核苷酸来在药物组合物中利用。

本发明的反义化合物对于研究和诊断学有用，因为这些化合物与编码ATXN3的核酸杂交，致使容易构建夹层和其他测定来开拓此事实。本发明的寡核苷酸与编码ATXN3的核酸杂交可由本领域知道的手段检测。该手段可包括使酶缀合于寡核苷酸，寡核苷酸的放射性标记或任何其他适合的检测手段。也可制备使用用于检测样品中ATXN3蛋白或mRNA的水平的该检测手段的试剂盒。

尽管已根据特定实施方式描述本发明的特定化合物，组合物和方法，下列实施例仅旨在例证本发明的化合物及未旨在限制。在本文引用各出版物，参考材料，GenBank登录号等来描述本发明的背景及提供关于其实施的另外的细节，其通过引用以其整体在此合并。

本说明书及权利要求中所用的“a”和“an”，除非另外说明，应理解为包括复数个指示物。权利要求或说明书在一组的一个或更多成员之间包括“或”被认为满足，如果一个，多于一个，或全部组成员存在于，采用于或另外关联于给定产物或过程，除非相反指示或自情景另外明白。本发明包括精确地组的一个成员存在于，采用干或另外关联于给定产物或过程的实施方式。本发明也包括多于一个，或全部组成员存在于，采用于或另外关联于给定产物或过程的实施方式。此外，需知，本发明包括全部变异，组合和置换，其中一个或更多限制，元件，从句，描述性术语，等，自所列的权利要求中的一个或更多导入从属于相同的基础权利要求的另一权利要求(或,如关联,任何其他权利要求)，除非另外指示或除非本领域普通技术人员会明白会出现争议或不一致性。其中元件表示为列表，例如，以Markush组或类似形式，需知，元件的各亚组也公开，及任何元件可从组除去。应知，一般而言，当本发明或本发明的方面，被称作包含特定元件，特征，等时，本发明的特定实施方式或本发明的方面由该元件，特征，等组成，或基本上由该元件，特征，等组成。为简单起见，那些实施方式未在每情况中特别用如此多词汇描述。需知，本发明的任何实施方式或方面可自权利要求明确地排除，无论是否说明书叙述了特定排除。

【实施例】

下列实施例描述靶向包含位于自病原性(CAG)_n重复子一个核苷酸的G987C单核苷酸多态性(SNP)的突变ATXN3mRNA转录物的几种寡核苷酸，以及这些寡核苷酸的各种更优性质。尤其是，实施例1展示20种寡核苷酸敲落突变体/伸展的ATXN3的表达的功效和那20种寡核苷酸的选择性(例如,相比野生型ATXN3表达的抑制而突变体/伸展的ATXN3表达的抑制)。实施例2展示各12种寡核苷酸抑制突变体/伸展的ATXN3的表达的如IC₅₀值测量的强度，及抑制突变体/伸展的ATXN3表达相比野生型ATXN3表达的强度差异。实施例3描述各12种寡核苷酸及伸展的G987C ATXN3靶序列(完美互补性)或野生型ATXN3序列(在G987C SNP位点一个互补性错配)之间的如熔解温度(T_m)测量的结合能。实施例4展示12种寡核苷酸的如血浆稳定性测量的核酸酶灵敏度。实施例5描述在标准16天小鼠研究中选择的寡核苷酸的体内耐受性的评定。

【实施例1：就20种寡核苷酸测试的功效和选择性】

总20种反义寡核苷酸(各具有一个或更多锁核酸(LNA))被设计为选择性地靶向人ATXN3突变的(即,伸展的)等位基因。尤其是，20种LNA反义寡核苷酸被设计为选择性地靶向及杂交于在自ATXN3mRNA的病原性(CAG)_n伸展一个核苷酸的位置(即,G987CSNP)以及该位置的核苷酸上游和/或下游包括“C”的伸展的ATXN3等位基因的区。

为了表征各20种寡核苷酸，将HEK-293细胞用包含与萤火虫萤光素酶转录物融合的特征在于具有81个(CAG)重复子及包括G987CSNP的突变的ATXN3转录物的编码区的报告子构建体(pFLAG-ATXN3Q81-FL-FF萤光素酶)稳定地转染。将萤光素酶活性与用作读取的突变的ATXN3蛋白量关联，及标准化到由WST-1测定测量的细胞增殖和活力。WST-1测定是基于活细胞中四唑鎓盐WST-1由线粒体脱氢酶的切割的用于细胞增殖和细胞活力的定量的比色测定。设计定性PCR(qPCR)测定来通过靶向FLAG序列特异性识别载体表达产物。此外，设计qPCR测定来通过靶向ATXN3的5′UTR(其未作为载体表达系统的部分包括)来特异性识别内源性地表达的ATXN3产物。

为了研究反义寡核苷酸对野生型和伸展的/突变的ATXN3的表达的效应，优化qPCR测定来特异性识别突变的或野生型(内源性)ATXN3的表达。关于突变的ATXN3报告子构建体，设计及优化靶向作为ATXN3-报告子构建体的部分的萤光素酶基因(位于ATXN3转录物的下游)的qPCR测定。关于测定野生型等位基因的表达(在HEK-293细胞中内源性地表达)，设计及优化靶向内源性ATXN3转录物的5′UTR的qPCR测定，及可区别突变ATXN3等位基因，因为靶向的5′UTR不存在于报告子构建体中。

在pFLAG-ATXN3Q81-FL-FF萤光素酶-转染的HEK-293细胞中，使用剥裸递送(即,未辅助的摄取)作为将寡核苷酸导入细胞的手段，通过暴露于具有1μM，5μM和25μM的终浓度的培养基来评定各寡核苷酸的功效和选择性。特别是，寡核苷酸由剥裸递送，之后将细胞洗涤彻底，以消除仍粘附于细胞表面或另外残留在培养容器中的任何寡核苷酸。收获细胞及在转染之后48小时由qPCR检定，和通过使用关联qPCR测定来测定mRNA表达的百分率。在全部实验中，包括被指定为PCON2的寡核苷酸(靶向萤火虫萤光素酶转录物的16聚体间隔聚体)作为突变ATXN3(报告子构建体)的阳性对照，包括被指定为PCON1的寡核苷酸(靶向突变的及野生型ATXN3的16聚体间隔聚体)作为阳性对照，及包括被指定为NCON的寡核苷酸(乱序的寡核苷酸)作为阴性对照。在测试寡核苷酸的缺失下(用水取代)评价模拟物-处理的样品。读取值是相对于模拟物-处理的样品，突变的ATXN3转录物(报告子构建体)和内源性ATXN3转录物的mRNA水平的百分率。

本研究的结果作为相对于模拟物-处理的样品的表达的mRNA的百分率而显示在图1A和1B中。用标识符辩识20种寡核苷酸，各以“SH”起始。对评价的多数寡核苷酸观察到具有显著的剂量应答的稳健的敲落及，如显示于图1A和1B，及可建立清楚的排序。如显示于图1A和1B，相比模拟物样品中观察的ATXN3的表达，依赖于寡核苷酸的浓度(1μM,5μM或25μM)，特定寡核苷酸调节(即,减小或另外减少)野生型ATXN3和/或突变ATXN3的表达约60％或更少，50％或更少，40％或更少，30％或更少，25％或更少，20％或更少，及甚至10％或更少。而且，特定寡核苷酸相比野生型ATXN3表达，基本上和优先减少突变ATXN3的表达(即,下调表达)。例如，1μM浓度的被指定为SH10的寡核苷酸(SEQ ID NO:20)减小突变ATXN3水平至对应野生型ATXN3水平的几乎一半。阳性对照，被指定为5744，展示突变体和野生型ATXN3水平的实质性抑制，显示少到无特异性，因为其未针对突变位点。

上述数据例证，各20种寡核苷酸在一个或更多评价的浓度显示功效和选择性。自该集体数据鉴定12种寡核苷酸及就另外的表征进行选择。

【实施例2：12种寡核苷酸的IC₅₀测试】

对作为实施例1中描述的研究的结果选择的12种寡核苷酸，通过评定各寡核苷酸的IC₅₀值来进一步评价它们的抑制强度。使选择的寡核苷酸候选体经历在已用之前-描述的报告构建体(pFLAG-ATXN3Q81-FL-FF萤光素酶)稳定地转染的HEK-293细胞中实施的IC₅₀测定。

由剥裸，使用具有0.3μM，1μM，3μM，9μM，27μM和81μM的终浓度的培养基向细胞导入寡核苷酸。随后在添加寡核苷酸之后48小时收获细胞，和提取突变的ATXN3转录物(报告子构建体)和内源性ATXN3转录物的mRNA，及由qPCR分析。图2A和2B例证在选择的寡核苷酸的剥裸递送后ATXN3-Q81转染的细胞中突变的ATXN3转录物(MUT)和内源性ATXN3(WT)mRNA的表达。结果标准化到内源性GAPDH水平，及表示为模拟物处理的样品的百分率。研究重复3次，并将值在针对S形应答曲线的Graphpad Prism中，使用非-线性回归标绘。

自回归测定报告测定中IC₅₀值的估计值。IC₅₀曲线显示于图3，和对应IC₅₀值列表于下表2。作为针对突变的ATXN3(MUT)对比内源性ATXN3(WT)转录物的IC₅₀值的倍数差异计算12种寡核苷酸的计算的选择性，和选择领先的5种寡核苷酸的IC₅₀值显示于下表2。

表2

关于选择的寡核苷酸对突变体/伸展的ATXN3报告子(相对于野生型ATXN3转录物)的选择性，选择的12种中的9种寡核苷酸对突变体/伸展的报告子，相比野生型转录物，展示好于大致3倍选择性。

【实施例3：退火到野生型或突变ATXN3的12种寡核苷酸的熔解温度】

作为以上实施例2中描述的12种寡核苷酸候选体的表征的部分，评价各寡核苷酸自互补突变体靶RNA(指定为cMUT)的熔解温度(T_m)。也针对代表野生型等位基因(指定为cWT)(其包括针对位于自(CAG)伸展一个核苷酸的G987C SNP的单互补性错配)的RNA测试各12种寡核苷酸。

测定各12种寡核苷酸的T_m值，及T_m变化(ΔT_m)表示各寡核苷酸的熔解及退火温度的平均值。代表5种选择的领先寡核苷酸的T_m数据显示于表3，其中ΔTm定义为cMUT(完美互补)和cWT(在突变位点一个互补错配)值之间的差异。

表3

当靶向针对ATXN3的WT等位基因的12种寡核苷酸时，单错配是在位于病原性(CAG)伸展的3′侧一个核苷酸的G987C SNP的G-C错配。ΔT_m从高至15.5℃到低至-8.7℃，而对于5种选择的寡核苷酸，如显示于表3，ΔT_m从高至12.8℃到低至9.0℃。

【实施例4：各12种寡核苷酸的血浆稳定性】

作为实施例2和3中描述的12种寡核苷酸的表征的部分，评定各12种寡核苷酸的稳定性。特别是，将各12种寡核苷酸在含添加的脑组织的脑脊液中于37℃温育120小时，及取样品及在0，24，48，96和120小时分析。将样品由SDS-PAGE，就全长寡核苷酸的损失和降解产物的出现进行评价。将样品与被指定为PCON的不稳定的，18聚体全硫代磷酸酯阳性对照寡核苷酸进行比较。

全部寡核苷酸的血浆稳定性被发现在预期的范围之内。如显示于图4，全部寡核苷酸被发现具有大于约96小时的总体半衰期。

【实施例5：寡核苷酸的体内耐受性研究】

在16天小鼠研究中测试各12种寡核苷酸的体内耐受性。在雌性NMRI小鼠中测试各寡核苷酸的体内耐受性，主要以评定任何不期望的肝效应。给受试动物在第0，3，7，10和14天，以15mg/kg静脉内施剂，然后在第16天处死。将小鼠血清采样及就丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)浓度进行分析。对照小鼠施用盐水对照。如显示于图5A和5B，被指定为SH06(SEQ ID NO:19)，SH10(SEQ ID NO:20)，SH13(SEQ ID NO:21)，SH16(SEQ IDNO:22)和SH20(SEQ ID NO:23)的寡核苷酸相对于盐水对照，展示肝酶水平的可忽略的升高。

基于在实施例1～4中鉴定的特征，5种寡核苷酸(即寡核苷酸指定的SH06,SH10,SH13,SH16和SH20)显示对于在给受试者施用以减少表达伸展的(突变体)ATXN3中使用具有更优性质，及被指定为领先化合物。如上所述，相对于未选择的寡核苷酸群，选择的寡核苷酸被选择为更优。这5种领先寡核苷酸的序列显示于下表4，其中β-D-氧基LNA以粗体大写字母显示，右侧上标“o”，小写字母指示脱氧核糖，及‘s’和‘m’分别对应于硫代磷酸酯和C5-甲基胞嘧啶。

表4

【实施例6：脊髓小脑共济失调3小鼠模型中寡核苷酸的治疗性益处的展示】

将被指定为SH06，SH10，SH13，SH16和SH20的领先寡核苷酸(分别对应于SEQ ID NO:19,20,21,22和23)减少与伸展的/突变的ATXN3的表达相关的疾病病理学的能力如下进行测定。可开发或选择脊髓小脑共济失调3的动物模型。优选的动物模型与人ATXN3的突变(例如,被表征为具有G987C SNP的延伸的ATXN3)关联。活体内功效的主要终点可包括，例如，步态和肢共济失调，构音困难，锥体束征，张力失调，眼球运动病症，面舌虚弱，神经病变，进行性感觉损失，昏睡和帕金森特征的改善。可由本领域知道的各种方法，例如，由物理或组织检查确证疾病表型，及其被各寡核苷酸逆转。

待研究的参数可包括，尤其是，相比寡核苷酸-未处理的小鼠，寡核苷酸-治疗的小鼠中步态和肢共济失调，构音困难，锥体束征，张力失调，眼球运动病症，面舌虚弱，神经病变，进行性感觉损失，昏睡和帕金森特征的统计学地更佳改善。

此例中描述的研究可提供如下项的进一步表征：(1)针对突变体或伸展的ATXN3的反义-锁核酸寡核苷酸，其作为疾病SCA3或Machado-Joseph病的有效治疗，(2)用于特定脊髓小脑共济失调3疾病模型及用作药代动力学和毒理学研究的候选体的寡核苷酸和(3)用于临床施用本文所述的寡核苷酸的施剂及剂量-进程。

【序列】

SEQ ID NO:1

智人(Homo sapiens)ATXN3mRNA

NM_004993

SEQ ID NO:2

智人(Homo sapiens)ATXN3mRNA(WT；不包含G987C SNP)的核苷酸961-1020

961 cagcagcagc agcagcagca gcagggggac ctatcaggac agagttcaca tccatgtgaa

SEQ ID NO:3

智人(Homo sapiens)ATXN3mRNA(WT；不包含G987C SNP)的核苷酸977-997

977 agcagcaggg ggacctatca g

SEQ ID NO:4

SNP ID rs12895357

SEQ ID NO:5

突变智人(Homo sapiens)ATXN3，mRNA(包含G987C SNP)的核苷酸961-1020

961 cagcagcagc agcagcagca gcagcgggac ctatcaggac agagttcaca tccatgtgaa

SEQ ID NO:6

突变智人(Homo sapiens)ATXN3，mRNA(包含G987C SNP)的核苷酸977-997

977 agcagcagcg ggacctatca g

SEQ ID NO:7

5’-ATAGGTCCCGCTGCT-3’

SEQ ID NO:8

5’-TGATAGGTCCCGCTGC-3’

SEQ ID NO:9

5’-CTGATAGGTCCCGCTG-3’

SEQ ID NO:10

5’-CTGATAGGTCCCGCT-3’

SEQ ID NO:11

5’-CTGATAGGTCCCGC-3’

SEQ ID NO:12

5’-ATAGGTCCCGC-3’

SEQ ID NO:13

SH06的mRNA靶

5’-AGCAGCGGGACCUAU-3’

SEQ ID NO:14

SH10的mRNA靶

5’-GCAGCGGGACCUAUCA-3’

SEQ ID NO:15

SH13的mRNA靶

5’-CAGCGGGACCUAUCAG-3’

SEQ ID NO:16

SH16的mRNA靶

5’-AGCGGGACCUAUCAG-3’

SEQ ID NO:17

SH20的mRNA靶

5’-GCGGGACCUAUCAG-3’

SEQ ID NO:18

mRNA靶

5’-GCGGGACCUAU-3’

SEQ ID NO:19

SH06

5’-A_s ^oT_s ^oA_s ^og_sg_st_sc_sc_s ^mc_sg_sc_st_sG_s ^omC_s ^oT^o-3'

SEQ ID NO:20

SH10

5’-T_s ^oG_s ^oA_s ^ot_sa_sg_sg_st_sc_sc_s ^mc_sg_sc_sT_s ^oG_s ^omC^o-3’

SEQ ID NO:21

SH13

5’-^mC_s ^oT_s ^oG_s ^oa_st_sa_sg_sg_st_sc_sc_s ^mc_sg_s ^mC_s ^oT_s ^oG^o-3'

SEQ ID NO:22

SH16

5’-^mC_s ^oT_s ^oG_s ^oa_st_sa_sg_sg_st_sc_sc_s ^mc_sG_s ^omC_s ^oT^o-3'

SEQ ID NO:23

SH20

5’-^mC_s ^oT_s ^og_sa_st_sa_sg_sg_st_sc_sc_s ^mC_s ^oG_s ^omC^o-3’

Claims (148)

1.寡核苷酸，其与包含G987C单核苷酸多态性的SEQ ID NO:4的区杂交，其中寡核苷酸调节ATXN3的表达。 

2.权利要求1的寡核苷酸，其中寡核苷酸调节编码伸展的ATXN3的核酸的表达。 

3.权利要求2的寡核苷酸，其中寡核苷酸选自：SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23。 

4.权利要求2的寡核苷酸，其中寡核苷酸与选自下列的寡核苷酸具有至少80％同一性：SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12。 

5.权利要求2的寡核苷酸，其中寡核苷酸是14个核苷酸长。 

6.权利要求2的寡核苷酸，其中寡核苷酸是至少15个核苷酸长。 

7.权利要求2的寡核苷酸，其中寡核苷酸是至少16个核苷酸长。 

8.权利要求2的寡核苷酸，其中寡核苷酸是至少18个核苷酸长。 

9.权利要求1的寡核苷酸，其中寡核苷酸能与包含G987C单核苷酸多态性的SEQ ID NO:4的区特异性地杂交。 

10.权利要求1的寡核苷酸，其中调节减少ATXN3的表达至少 约50％。 

11.权利要求1的寡核苷酸，其中调节减少ATXN3的表达至少约75％。 

12.权利要求1的寡核苷酸，其中调节减少ATXN3的表达至少约90％。 

13.权利要求1的寡核苷酸，其中寡核苷酸不与编码野生型ATXN3的核酸杂交。 

14.权利要求1的寡核苷酸，其中寡核苷酸相对于野生型ATXN3的表达而优先调节伸展的ATXN3的表达。 

15.权利要求9的寡核苷酸，其中寡核苷酸抑制伸展的ATXN3的表达。 

16.权利要求1的寡核苷酸，其中所述调节下调ATXN3的表达。 

17.权利要求1的寡核苷酸，其中所述调节相对于伸展的ATXN3的表达而上调野生型ATXN3的表达。 

18.权利要求1的寡核苷酸，其中寡核苷酸不与包含SEQ ID NO:1的核酸特异性杂交。 

19.权利要求1的寡核苷酸，其中寡核苷酸不在第987位与包含SEQ ID NO:1的核酸杂交。 

20.权利要求1的寡核苷酸，其中寡核苷酸与包含SEQ ID NO:5 或SEQ ID NO:6的核酸杂交。 

21.权利要求1的寡核苷酸，其中寡核苷酸还与相邻于G987C单核苷酸多态性的迭代(CAG)_n伸展的部分杂交。 

22.权利要求1的寡核苷酸，其中寡核苷酸在包含G987C单核苷酸多态性的区与包含SEQ ID NO:4的核酸特异性杂交。 

23.权利要求1的寡核苷酸，其中寡核苷酸在第987位与包含SEQ ID NO:4的核酸特异性杂交。 

24.权利要求1的寡核苷酸，其中寡核苷酸是反义寡核苷酸。 

25.权利要求24的寡核苷酸，其中寡核苷酸选自：SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23。 

26.权利要求24的寡核苷酸，其中寡核苷酸包含至少一个选自下列的糖修饰的核苷酸：锁核酸(LNA)单元；2’-O-烷基-RNA单元，2’-OMe-RNA单元，2’-氨基-DNA单元和2’-氟-DNA单元。 

27.权利要求26的寡核苷酸，其中寡核苷酸包含2个或更多LNA单体单元。 

28.权利要求27的寡核苷酸，其中寡核苷酸是间隔聚体。 

29.权利要求27的寡核苷酸，其中2个或更多LNA单体单元彼此毗邻。 

30.权利要求1的寡核苷酸，其中ATXN3的表达的调节恢复神经元功能。 

31.权利要求1的寡核苷酸用于治疗与伸展的ATXN3的表达关联的病情的用途。 

32.权利要求1的寡核苷酸用于治疗脊髓小脑共济失调3的用途。 

33.寡核苷酸，其包含SEQ ID NO:7，其中寡核苷酸调节ATXN3的表达。 

34.寡核苷酸，其包含SEQ ID NO:8，其中寡核苷酸调节ATXN3的表达。 

35.寡核苷酸，其包含SEQ ID NO:9，其中寡核苷酸调节ATXN3的表达。 

36.寡核苷酸，其包含SEQ ID NO:10，其中寡核苷酸调节ATXN3的表达。 

37.寡核苷酸，其包含SEQ ID NO:11，其中寡核苷酸调节ATXN3的表达。 

38.寡核苷酸，其在包含G987C单核苷酸多态性的区与包含SEQ ID NO:4的核酸杂交，其中寡核苷酸包含一个或更多LNA单体单元，且其中寡核苷酸调节ATXN3的表达。 

39.权利要求38的寡核苷酸，其中寡核苷酸是14个核苷酸长。 

40.权利要求38的寡核苷酸，其中寡核苷酸是15个核苷酸长。 

41.权利要求38的寡核苷酸，其中寡核苷酸是16个核苷酸长 。

42.权利要求38的寡核苷酸，其中调节减少ATXN3的表达至少约50％。 

43.权利要求38的寡核苷酸，其中调节减少ATXN3的表达至少约75％。 

44.权利要求38的寡核苷酸，其中调节减少ATXN3的表达至少约90％。 

45.权利要求38的寡核苷酸，其中ATXN3包含突变的形式的ATXN3。 

46.权利要求45的寡核苷酸，其中调节抑制突变的形式的ATXN3的表达。 

47.权利要求46的寡核苷酸，其中突变的形式的ATXN3是伸展的ATXN3。 

48.权利要求47的寡核苷酸，其中寡核苷酸不调节野生型形式的ATXN3的表达。 

49.权利要求38的寡核苷酸，其中寡核苷酸在包含G987C单核苷酸多态性的区与包含SEQ ID NO:4的核酸特异性杂交。 

50.权利要求38的寡核苷酸，其中寡核苷酸与包含SEQ ID NO:4的片段的核酸杂交，其中片段包含核苷酸987。 

51.权利要求38的寡核苷酸，其中寡核苷酸在G987C单核苷酸多态性与包含SEQ ID NO:4的核酸特异性杂交。 

52.权利要求38的寡核苷酸，其中寡核苷酸是反义寡核苷酸。 

53.权利要求38的寡核苷酸，其中寡核苷酸包含2个或更多LNA单体单元。 

54.权利要求53的寡核苷酸，其中寡核苷酸是间隔聚体。 

55.权利要求53的寡核苷酸，其中2个或更多LNA单体单元彼此毗邻。 

56.权利要求38的寡核苷酸，其中ATXN3的表达的调节恢复神经元功能。 

57.权利要求38的寡核苷酸用于治疗与异常ATXN3的表达关联的病情的用途。 

58.权利要求57的寡核苷酸的用途，其中与异常ATXN3的表达关联的病情是脊髓小脑共济失调3。 

59.对于治疗脊髓小脑共济失调3有用的寡核苷酸，其中寡核苷酸与包含G987C单核苷酸多态性的SEQ ID NO:4的区杂交，且其中寡核苷酸包含至少一个LNA单体单元。 

60.权利要求59的寡核苷酸，其中寡核苷酸是14个核苷酸长。 

61.权利要求59的寡核苷酸，其中寡核苷酸是15个核苷酸长。 

62.权利要求59的寡核苷酸，其中寡核苷酸是16个核苷酸长。 

63.权利要求59的寡核苷酸，其中寡核苷酸下调ATXN3的表达，且其中ATXN3包含病原性聚-谷氨酰胺伸展。 

64.权利要求59的寡核苷酸，其中寡核苷酸是反义寡核苷酸。 

65.对于治疗脊髓小脑共济失调3有用的寡核苷酸，其中寡核苷酸在包含G987C单核苷酸多态性的区与SEQ ID NO:4杂交，且其中寡核苷酸包含至少一个LNA单体单元。 

66.调节ATXN3mRNA的表达的方法，包括下列步骤：使ATXN3mRNA与权利要求1的寡核苷酸在对于ATXN3mRNA与寡核苷酸杂交适当的条件下接触，由此调节ATXN3mRNA的表达。 

67.权利要求66的方法，其中ATXN3mRNA编码病原性聚-谷氨酰胺伸展，且其中调节ATXN3的表达导致减少的ATXN3的表达。 

68.调节ATXN3的表达的方法，其中ATXN3包括病原性聚-谷氨酰胺伸展，其中方法包括使一种或更多编码ATXN3的核酸与权利要求2的寡核苷酸在对于一种或更多核苷酸与寡核苷酸杂交适当的条件下接触，由此调节ATXN3的表达。 

69.权利要求68的方法，其中调节ATXN3的表达导致减少的ATXN3的表达。 

70.治疗与异常ATXN3的表达关联的病情的方法，包括选择被诊断患该病情的受试者及给受试者施用权利要求2的寡核苷酸。 

71.治疗与异常ATXN3的表达关联的病情的方法，包括选择被诊断患该病情的受试者及给受试者施用权利要求38的寡核苷酸。 

72.寡核苷酸，其在包含G987C单核苷酸多态性的区与包含SEQ ID NO:4的核酸特异性杂交，其中寡核苷酸包含至少一个LNA单体单元，且其中寡核苷酸不与包含SEQ ID NO:1的核酸特异性杂交。 

73.药物组合物，其包含对于治疗脊髓小脑共济失调3有用的寡核苷酸，其中寡核苷酸在包含G987C单核苷酸多态性的区与包含SEQ ID NO:4的核酸杂交，且其中寡核苷酸包含至少一个LNA单体单元。 

74.权利要求73的药物组合物，其中寡核苷酸是反义寡核苷酸。 

75.权利要求73的药物组合物，其中组合物被配制用于脑室内施用。 

76.权利要求73的药物组合物，其中组合物被配制用于肠胃外施用。 

77.权利要求73的药物组合物，其中寡核苷酸通过在包含G987C单核苷酸多态性的区与包含SEQ ID NO:4的核酸杂交来调节ATXN3的表达。 

78.权利要求77的药物组合物，其中寡核苷酸不与包含SEQ ID NO:1的核酸杂交。 

79.权利要求73的药物组合物，其中寡核苷酸通过与包含SEQ ID NO:4的核酸在G987C单核多态性特异性杂交来调节ATXN3的表达。 

80.权利要求79的药物组合物，其中寡核苷酸不与包含SEQ ID NO:1的核酸特异性杂交。 

81.寡核苷酸，其调节ATXN3的表达，其中寡核苷酸包含SEQ ID NO:12，且其中寡核苷酸包含至少一个LNA单体单元。 

82.约14～20个核苷酸长的寡核苷酸，其中寡核苷酸包含与包含G987C单核苷酸多态性的SEQ ID NO:4的区的反向互补体具有至少80％同源性的核苷酸序列，或其天然存在的变体。 

83.权利要求82的寡核苷酸，其中连续的核苷酸序列与SEQ ID NO:4的反向互补体包含不多于一个错配，且其中错配不在第987位。 

84.权利要求82的寡核苷酸，其中核苷酸序列包含一个或更多核苷酸类似物。 

85.权利要求84的寡核苷酸，其中一个或更多核苷酸类似物是糖修饰的核苷酸。 

86.权利要求85的寡核苷酸，其中糖修饰的核苷酸选自：锁核酸(LNA)单元，2’-O-烷基-RNA单元，2’-OMe-RNA单元，2’-氨基-DNA单元和2’-氟-DNA单元。 

87.权利要求84的寡核苷酸，其中一个或更多核苷酸类似物是LNA。 

88.权利要求82的寡核苷酸，其中寡核苷酸选自：SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23。 

89.权利要求82的寡核苷酸，其中寡核苷酸是间隔聚体。 

90.权利要求82的寡核苷酸，其中寡核苷酸抑制表达ATXN3mRNA的细胞中ATXN3mRNA的表达，其中ATXN3mRNA编码病原性聚-谷氨酰胺伸展。 

91.权利要求90的寡核苷酸，其中ATXN3mRNA包含三-核苷酸重复(CAG)_n，其中“n”大于52。 

92.权利要求91的寡核苷酸，其中“n”等于或大于81。 

93.缀合物，其包含权利要求82的寡核苷酸和共价附接于寡核苷酸的至少一个非-核苷酸部分。 

94.药物组合物，其包含权利要求82的寡核苷酸和药学可接受的稀释剂，载体，盐或佐剂。 

95.权利要求82的寡核苷酸用于治疗脊髓小脑共济失调3的用途。 

96.治疗受脊髓小脑共济失调3影响的受试者的方法，所述方法包括给受试者施用权利要求82的寡核苷酸的步骤，使得脊髓小脑共济失调3的一个或更多目标症状改善。 

97.权利要求96的方法，其中目标症状选自：减少的痉挛状态，增加的肌张力及改善的步态。 

98.减少表达异常ATXN3的细胞中异常ATXN3的表达的方法，所述方法包括使所述细胞与权利要求82的寡核苷酸接触的步骤，使得异常ATXN3的表达减少。 

99.权利要求98的方法，其中ATXN3包含病原性聚-谷氨酰胺伸展。 

100.治疗患脊髓小脑共济失调3的哺乳动物的方法，所述方法包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的靶向ATXN3的寡核苷酸，其中寡核苷酸与包含G987C单核苷酸多态性的SEQ ID NO:4的区杂交，其中寡核苷酸包括一个或更多LNA单元，且其中ATXN3包含病原性聚-谷氨酰胺伸展。 

101.权利要求100的方法，其中寡核苷酸包含选自下列的序列：SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23。 

102.权利要求100的方法，其中寡核苷酸肠胃外施用。 

103.权利要求100的方法，其中寡核苷酸静脉内施用。 

104.权利要求100的方法，其中寡核苷酸由推注施用于靶器官或组织。 

105.权利要求100的方法，其中寡核苷酸腹膜内施用。 

106.寡核苷酸，其包含SEQ ID NO:19，其中寡核苷酸调节 ATXN3的表达。 

107.权利要求106的寡核苷酸，其中寡核苷酸与编码ATXN3的核酸杂交而形成具有至少约65℃的解离T_m的双联的结构。 

108.权利要求106的寡核苷酸，其中ATXN3包含G987C突变，且其中调节ATXN3的表达包含抑制ATXN3的表达。 

109.权利要求108的寡核苷酸，其中寡核苷酸以约0.3～约81μM之间的IC₅₀浓度抑制ATXN3的表达。 

110.权利要求106的寡核苷酸，其中寡核苷酸于37℃，在血浆中稳定至少约96小时。 

111.寡核苷酸，其包含SEQ ID NO:20，其中寡核苷酸调节ATXN3的表达。 

112.权利要求111的寡核苷酸，其中寡核苷酸与编码ATXN3的核酸杂交而形成具有至少约60℃的解离T_m的双联的结构。 

113.权利要求111的寡核苷酸，其中ATXN3包含G987C突变，且其中调节ATXN3的表达包含抑制ATXN3的表达。 

114.权利要求113的寡核苷酸，其中寡核苷酸以约0.3～约81μM之间的IC₅₀浓度抑制ATXN3的表达。 

115.权利要求111的寡核苷酸，其中寡核苷酸于37℃，在血浆中稳定至少约96小时。 

116.寡核苷酸，其包含SEQ ID NO:21，其中寡核苷酸调节ATXN3的表达。 

117.权利要求116的寡核苷酸，其中寡核苷酸与编码ATXN3的核酸杂交而形成具有至少约65℃的解离T_m的双联的结构。 

118.权利要求116的寡核苷酸，其中ATXN3包含G987C突变，且其中调节ATXN3的表达包含抑制ATXN3的表达。 

119.权利要求118的寡核苷酸，其中寡核苷酸以约0.3～约81μM之间的IC₅₀浓度抑制ATXN3的表达。 

120.权利要求116的寡核苷酸，其中寡核苷酸于37℃，在血浆中稳定至少约96小时。 

121.寡核苷酸，其包含SEQ ID NO:22，其中寡核苷酸调节ATXN3的表达。 

122.权利要求121的寡核苷酸，其中寡核苷酸与编码ATXN3的核酸杂交而形成具有至少约60℃的解离T_m的双联的结构。 

123.权利要求121的寡核苷酸，其中ATXN3包含G987C突变，且其中调节ATXN3的表达包括抑制ATXN3的表达。 

124.权利要求123的寡核苷酸，其中寡核苷酸以约0.3～约81μM之间的IC₅₀浓度抑制ATXN3的表达。 

125.权利要求121的寡核苷酸，其中寡核苷酸于37℃，在血浆中稳定至少约96小时。 

126.寡核苷酸，其包含SEQ ID NO:23，其中寡核苷酸调节ATXN3的表达。 

127.权利要求126的寡核苷酸，其中寡核苷酸与编码ATXN3的核酸杂交而形成具有至少约55℃的解离T_m的双联的结构。 

128.权利要求127的寡核苷酸，其中ATXN3包含G987C突变，且其中调节ATXN3的表达包含抑制ATXN3的表达。 

129.权利要求128的寡核苷酸，其中寡核苷酸以约0.3～约81μM之间的IC₅₀浓度抑制ATXN3的表达。 

130.权利要求126的寡核苷酸，其中寡核苷酸于37℃，在血浆中稳定至少约96小时。 

131.寡核苷酸，其与包含SEQ ID NO:18的核酸杂交，其中寡核苷酸调节ATXN3的表达。 

132.权利要求131的寡核苷酸，其中寡核苷酸包含SEQ ID NO:12。 

133.寡核苷酸，其包含SEQ ID NO:12，其中寡核苷酸调节ATXN3的表达。 

134.权利要求133的寡核苷酸，其中寡核苷酸包含至少一个核苷酸类似物，且其中核苷酸类似物是锁核酸。 

135.寡核苷酸，其包含SEQ ID NO:12，其中寡核苷酸调节 ATXN3的表达，且其中寡核苷酸在一个或更多选自下列的位置包含至少一个核苷酸类似物： 

(a)在第1和3位的一个或更多的腺嘌呤核苷酸是氧基-LNA； 

(b)在第10位的鸟嘌呤核苷酸是氧基-LNA； 

(c)在第9和11位的一个或更多的胞嘧啶核苷酸是氧基-LNA；以及 

(d)在第2位的胸腺嘧啶核苷酸是氧基-LNA。 

136.权利要求135的寡核苷酸，其中在第1和3位的腺嘌呤核苷酸是β-D-氧基-LNA，其中在第2位的胸腺嘧啶核苷酸是β-D-氧基-LNA，其中在第9位的胞嘧啶核苷酸是C5-甲基胞嘧啶，且其中全部核苷酸间连接基团是硫代磷酸酯核苷酸间连接基团。 

137.权利要求135的寡核苷酸，其中在第1位的腺嘌呤核苷酸是β-D-氧基-LNA，其中在第9位的胞嘧啶核苷酸是C5-甲基胞嘧啶，且其中全部核苷酸间连接基团是硫代磷酸酯核苷酸间连接基团。 

138.权利要求135的寡核苷酸，其中在第9和11位的胞嘧啶核苷酸均是C5-甲基胞嘧啶，其中在第11位的胞嘧啶核苷酸是β-D-氧基-LNA，且其中全部核苷酸间连接基团是硫代磷酸酯核苷酸间连接基团。 

139.权利要求135的寡核苷酸，其中在第10位的鸟嘌呤核苷酸是β-D-氧基-LNA，其中在第11位的胞嘧啶核苷酸是β-D-氧基-LNA，其中在第9和11位的胞嘧啶核苷酸均是C5-甲基胞嘧啶，且其中全部核苷酸间连接基团是硫代磷酸酯核苷酸间连接基团。 

140.权利要求135的寡核苷酸，其中在第9和11位的胞嘧啶核苷酸均是β-D-氧基-LNA，其中在第10位的鸟嘌呤核苷酸是β-D-氧基 -LNA，其中在第9和11位的胞嘧啶核苷酸均是C5-甲基胞嘧啶，且其中全部核苷酸间连接基团是硫代磷酸酯核苷酸间连接基团。 

141.权利要求135的寡核苷酸，其中至少一个核苷酸是独立地选自下列的修饰的核碱基：5-甲基胞嘧啶，异胞嘧啶，假异胞嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶，6-二氨基嘌呤，2-二氨基嘌呤，肌苷，二氨基嘌呤和2-氯-6-二氨基嘌呤胞嘧啶。 

142.权利要求135的寡核苷酸，其中氧基-LNA是β-D-氧基LNA。 

143.权利要求135的寡核苷酸，其中至少一个核苷酸间连接基团是硫代磷酸酯核苷酸间连接基团。 

144.权利要求135的寡核苷酸，其中全部核苷酸间连接基团是硫代磷酸酯核苷酸间连接基团。 

145.权利要求135的寡核苷酸，其用作药物。 

146.权利要求135的寡核苷酸，其用于治疗3型脊髓小脑共济失调(SCA3)。 

147.权利要求1的寡核苷酸，其用作药物。 

148.权利要求1的寡核苷酸，其用于治疗3型脊髓小脑共济失调(SCA3)。