CN104561013A - 基于高通量测序技术进行核酸适配体序列优化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于高通量测序技术进行核酸适配体序列优化的方法，包括将核酸适配体以单个碱基顺移的方式解析后，合成带有接头DNA片段的解析DNA片段；将解析DNA片段与靶标孵育，获得其中与靶标结合的部分；以结合解析DNA片段为模板，采用逆转录酶催化获得双链DNA文库；采用高通量测序技术对获得的双链DNA文库进行测序，然后根据测序结果，选择百分比最高的解析DNA片段作为核酸适配体的优化序列。本发明比普通的核酸适配体方法更准确、快速，可以实现多种核酸适配体、多种靶标类型的同步、高通量分析，提高了核酸适配体优化研究的效率。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，更具体地说，涉及一种基于高通量测序技术进行核酸适配体序列优化的方法。
背景技术
核酸适配体是能通过特定三维结构与多种靶标紧密结合的寡核苷酸链（DNA或RNA）。核酸适配体具有亲和力高，特异性好，分子量小，免疫原性低，结构稳定，易合成等优点，因此核酸适配体替代传统抗体在多种疾病的基础研究、药物筛选、临床诊断及疾病治疗中具有广泛的应用前景。
通常，核酸适配体是通过指数富集配体的系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX) 从含有大量序列的随机文库中筛选得到的。随机文库的基本序列结构包括：中间长度为35-60mer的随机序列，两端各为约20mer的引物结合序列。筛选到的核酸适配体同样具有上述序列结构，总长度约60-100mer。在已报道研究中发现核酸适配体长度过长不利于形成稳定的结构，还具有潜在的免疫激活作用。而通过去除核酸适配体与靶标结合的非必需序列，仅保留必需序列可以使核酸适配体长度缩短，并提高核酸适配体与靶标结合的亲和力和特异性，便于后续研究，同时也节省了成本，提高了安全性。目前，应用广泛的核酸适配体，例如凝血酶适配体、ATP适配体、IgE适配体等，均经过序列优化，长度在15-25mer水平。对于筛选到的核酸适配体进行序列优化，已成为其进一步应用前所必须的。
对核酸适配体进行序列优化的方法包括生物信息学预测法、酶切保护实验、芯片分析法等。生物信息学预测法是基于热力学最小自由能等算法预测核酸适配体的二级结构，但由于各算法可预测到的核酸二级结构十分有限，其可靠性难以保证；酶切保护实验是利用核酶水解核酸适配体与靶标结合的二聚体，这样可以得知核酸适配体与靶标结合的部分序列，但该方法无法得知核酸适配体中对稳定性起关键作用的非结合序列；芯片技术是将核酸适配体的截短片段制成芯片，利用荧光修饰靶标与芯片的结合信号，优选亲和力更好的优化序列，该方法准确性高，但成本过于昂贵。由于目前对于核酸适配体进行序列优化尚缺乏快速、准确、令人满意的方法，大量筛选到的核酸适配体因为缺乏有效优化而序列过长，从而限制了其广泛应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中种种不足之处，提供一种基于高通量测序技术进行核酸适配体序列优化的方法。
本发明提供的技术方案是：
一种基于高通量测序技术进行核酸适配体序列优化的方法，其特征在于所属方法包括以下步骤：
(1) 将候选核酸适配体以单个碱基顺移的方式分解为解析序列；
(2) 合成解析DNA片段，所述解析DNA片段包含解析序列，一端与DNA接头片段相连，所述一端为解析序列的3’端或5’端；
(3) 将解析DNA片段按等摩尔混合后制备成解析DNA文库，将解析DNA文库与靶标的混合物，在一定条件下孵育。所述靶标为筛选核酸适配体所采用的物质；所述一定条件为核酸适配体筛选时的孵育条件，包括孵育的温度、时间以及缓冲液的类型、pH值；
(4) 将结合解析DNA片段与游离解析DNA片段分离，所述结合解析DNA片段为与靶标结合的解析DNA片段；
(5) 将结合解析DNA片段与靶标分离，制备结合解析DNA文库；
(6) 以结合解析DNA文库为模板，利用引物和逆转录酶合成结合解析DNA片段的互补链，制备双链DNA文库。所述的引物与所述解析DNA片段中DNA接头序列互补；
(7) 采用高通量测序技术对获得的双链DNA文库进行高通量测序，然后对测序结果进行分析，双链DNA文库中序列最多的解析序列为核酸适配体的优化序列。
优选的，所述方法中所述候选核酸适配体为一种序列或多种序列；
优选的，所述方法中所述解析序列长度范围为15-30碱基，长度范围也可根据候选核酸适配体的不同而进行调整；
优选的，所述方法中所述DNA接头片段为不同长度的多聚A序列、多聚T序列；当候选核酸适配体为多种序列时，DNA接头片段的序列和长度可对应不同。
优选的，所述方法中所述靶标为小分子、大分子、细胞及病原体。
优选的，所述方法中所述逆转录酶为M-MLV逆转录酶、AMV逆转录酶。
优选的，所述步骤(1)中进行候选核酸适配体的解析是利用计算机软件（Sequence Split Tool）来完成。
与现有技术相比，本发明首次利用高通量测序原理完成适配体核酸的序列优化。该方法以核酸适配体一级序列为基础，避免了生物信息学分析的不确定性，序列优化的准确性提高显著；通芯片方法相比，成本显著降低，无需标价靶标，可用于任何类型靶标的核酸适配体。针对不同靶标或不同核酸适配体，设计不同的DNA接头片段加以区分，这样使得一次高通量测序，可同时对多种候选核酸适配体进行优化。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述：
图1为本发明进行核酸适配体序列优化的方法流程示意图；
图2为本发明解析DNA片段的结构示意图；在序列结构组成上，所属解析DNA片段由接头DNA片段+解析序列组成。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图激具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，该具体实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据候选核酸适配体及靶标的不同做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
实施例半乳甘露聚糖（GM）核酸适配体的序列优化方法示例
请参阅图1，为根据本发明的优选事实例的基于高通量测序技术进行核酸适配体序列优化的方法流程示意图。主要包括以下步骤：
一．GM核酸适配体的解析
在步骤①中，以GM为靶标筛选到特异性核酸适配体AT74，长度为62个碱基，序列如下：AT74: TCCCTACGGCGCTAACTGGAGTGAGGAACCCGCCATACCGATGTCTGCC- ACCGTGCTACAAC；
利用Sequence Split Tool软件平台（http://genestamp.sinica.edu.tw/marray/fun/ seqSplit.htm）将AT74序列解析为15-30mer的解析序列。在Minimum length栏中输入15，在Maximum length栏中输入30，在Input sequence栏中输入所述AT74的碱基序列。点击“提交查询内容”，AT74被解析为648条解析序列。
二．核酸适配体解析DNA片段的合成
请参阅图2，解析DNA片段的序列为在每条AT74解析序列的3’端加入polyT（n=15）序列。所有解析DNA片段委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成并通过HPLC纯化。
三．解析DNA文库与GM结合
1. 将合成的解析DNA片段按照4 μmol/L的浓度溶解于Binding buffer（0.05 mol/L Tris-HCl, 0.1 mol/L NaCl, 1mmol/LMgCl2, 5mmol/L KCl，pH=7.4）。
2. 取等份的解析DNA片段混合成解析DNA文库，将解析DNA文库在95℃加热5min，然后放到冰上迅速冷却。
3. 在步骤②中，取解析DNA文库500 μl与GM纯品混合，混合溶液在37℃条件下，震动混合孵育30min，以使DNA与GM能够充分结合。
四．结合解析DNA片段的分离
在步骤③中，将混合溶液转移至10 kDa的超滤离心柱中，12000g 离心5min。超滤离心柱中GM由于分子量大于10 kDa，结合解析DNA片段随着GM被留下来，并于游离解析DNA片段分离。用500 μl Binding Buffer超滤洗涤3次。
五．结合解析DNA文库的制备
1．将结合了结合解析DNA片段的GM中加入200 μl灭菌蒸馏水，100℃加热5min；
2．在步骤④中，将去离子水转移至10 kDa的超滤离心柱中，12000g 离心5min，留取上清。
六．双链DNA文库的制备
在步骤⑤中，以结合解析DNA文库为模板，oligo (dA)15为引物，42℃反应30min，合成双链DNA文库，反应体系如下：
| Temple | 100 μl |
| oligo (dA)15 | 5 μl (100pmol) |
| 10 mM dNTP Mix | 5 μl |
| 5ⅹRT Buffer | 30 μl |
| AMV | 5 μl |
| 灭菌蒸馏水 | Up to 150 μl |
七．高通量测序分析
在步骤⑥中，高通量测序分析双链DNA文库中的序列组成，采用ABI SOLiD连接法测序，委托商业公司完成。测序分析表明， 648个解析片段中的7个与GM具有较高的结合率，最高可达36%；提示核心序列“CGCTAACTGGAGTGAGGAACCCG”可能是核酸适配体AT74的作用位点，而两边侧翼序列起到稳定结构的作用，统计结果见下表：
| 编号 | 序列 | 序列组成(%) |
| 30.7 | ACGGCGCTAACTGGAGTGAGGAACCCGCCA- | 36 |
| 25.10 | --GGCGCTAACTGGAGTGAGGAACCCG--- | 27 |
| 26.10 | ---GCGCTAACTGGAGTGAGGAACCCGCC-- | 18 |
| 26.7 | ----CGCTAACTGGAGTGAGGAACCCGCCA- | 9 |
| 26.9 | -CGGCGCTAACTGGAGTGAGGAACCCG--- | 7 |
| 29.8 | -CGGCGCTAACTGGAGTGAGGAACCCGCCA- | 1.5 |
| 28.6 | ---GCGCTAACTGGAGTGAGGAACCCGCCAT | 0.6 |
八．GM亲和力验证
进一步比较核酸适配体核心序列（AT74C）、碱基突变适配体（AT74MT）和完整DNA适配体(AT74)与GM的亲和力，发现AT74CAT74和与GM的亲和力相当，均显著高于AT74MT，经优化，核酸适配体在保持亲和力不变的情况下，长度被显著缩短。
Claims (6)
1.一种基于高通量测序技术进行核酸适配体序列优化的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
(1) 将候选核酸适配体以单个碱基顺移的方式分解为解析序列；
(2) 合成解析DNA片段，所述解析DNA片段包含解析序列，一端与DNA接头相连，所述一端为解析序列的3’端或5’端；
(3) 将解析DNA片段按等摩尔混合后制备成解析DNA文库，将解析DNA文库与靶标的混合物，在一定条件下孵育，所述靶标为筛选适配体所采用的物质；所述一定条件为核酸适配体筛选时的孵育条件，包括孵育的温度、时间以及缓冲液的类型、pH值；
(4) 将结合解析DNA片段与游离解析DNA片段分离，所述结合解析DNA片段为与靶标结合的解析DNA片段；
(5) 将结合解析DNA片段与靶标分离，制备结合解析DNA文库；
(6) 以结合解析DNA文库为模板，利用引物和逆转录酶合成结合解析DNA片段的互补链，制备双链DNA文库，所述的引物与所述解析DNA片段中DNA接头序列互补；
(7) 采用高通量测序技术对获得的双链DNA文库进行高通量测序，然后对测序结果进行分析，双链DNA文库中序列最多的解析序列为核酸适配体的优化序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中所述解析序列长度范围为15-30碱基。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中所述DNA接头为多聚A序列、多聚T序列。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中所述靶标为小分子、大分子、细胞及病原体。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中所述逆转录酶为M-MLV逆转录酶、AMV逆转录酶。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法步骤(1)中进行候选核酸适配体的解析是利用计算机软件（Sequence Split Tool）来完成。
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