CN108387561B - 一种基于碱基淬灭荧光原理实现低成本高通量核酸适配体最优序列的优化方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于碱基淬灭荧光原理实现低成本高通量核酸适配体最优序列的优化方法属于分子生物学领域，包括：将已获得长链核酸适配体分成若干个含有G碱基的段；对含有G碱基的段分别设计互补序列，使互补序列的3’端的对位有突出的G碱基；设计合适的互补短链的长度；将核酸适配体与靶标分子在结合溶液中反应后，加入荧光素标记的互补短链，根据荧光强度判断各个区域对结合的影响，判断结合区域；以与中心结合区域互补的探针为指示，通过截短、分割等手段获得能与靶标分子结合的最短核酸序列。本发明优化方法更快速，所需标记的荧光序列少，标记荧光探针具有通用性，可同时对多条核酸序列进行优化及新设计的核酸适配体序列进行结合能力进行表征。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种基于碱基淬灭荧光原理实现低成本高通量核酸适配体最优序列的优化方法。
背景技术
核酸适配体(Aptamer，也译为核酸识体、核酸适体、适配体)是指通过指数富集配体系统进化法(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)，从人工合成的DNA或RNA文库中筛选出来的、能够对靶标高亲合性地结合和高特异性识别的单链寡核苷酸。随机文库的基本序列结构包括：中间随机序列长度为35-60个碱基，两端用于扩增的引物长度为约20个碱基。最终筛选到的核酸适配体的总长度约60-100个碱基。
核酸适配体可以形成独特的三维结构，这使得核酸适配体可以更好地和靶标相结合，核酸适配体的靶标小到离子、单分子，大到整个细胞。核酸适配体对于靶标具有很好的选择性和很强的亲和力，这使其具有超过传统识别元素的优势，在某种程度上可以与抗体相媲美。因此核酸适配体替代传统抗体在多种疾病的基础研究、药物筛选、临床诊断及疾病治疗中具有广泛的应用前景。
在已报道研究中发现核酸适配体长度过长不利于形成稳定的结构，且易引起不必要的碱基错配，从而影响识别过程。而通过去除与识别区域不相关对的非必需序列，仅保留识别的核心区域，可以使核酸适配体长度大大缩短，并提高核酸适配体与靶标结合的亲和力和特异性，便于后续研究，同时也节省了合成成本。当前，已被广泛应用的核酸适配体，例如凝血酶适配体、ATP适配体、IgE适配体等，其核心序列长度在15-30个碱基水平。现有大量已筛选出的核酸适配体由于序列过长无法获得充分利用，因此对于筛选到的核酸适配体进行序列优化，已成为其进一步应用必经之路，而且是亟待解决的难题。
对核酸适配体进行序列优化的方法包括生物信息学预测法、酶切保护实验、芯片分析法等。生物信息学预测法是基于热力学最小自由能等算法预测核酸适配体的二级结构，但由于各算法可预测到的核酸二级结构十分有限，其可靠性难以保证；酶切保护实验是利用核酶水解核酸适配体与靶标结合的复合物，这样可以得知核酸适配体与靶标结合的部分序列，但该方法无法得知核酸适配体中对稳定性起关键作用的非结合序列；芯片技术是将核酸适配体的截短片段制成芯片，利用荧光修饰靶标与芯片的结合信号，优选亲和力更好的优化序列，该方法准确性高，但成本过于昂贵。由于目前对于核酸适配体进行序列优化尚缺乏快速、准确、令人满意的方法，大量筛选到的核酸适配体因为缺乏有效优化而序列过长，从而限制了其广泛应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中操作负责，成本高等问题，提供一种基于碱基淬灭荧光原理实现低成本高通量核酸适配体最优序列的优化方法。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案是：
一种基于碱基淬灭荧光原理实现低成本高通量核酸适配体最优序列的优化方法，包括互补序列位置的优化，互补序列长度的优化，以及核酸适配体最优序列的优化，具体包括以下步骤：
(1)将已获得长链核酸适配体分成若干个含有G碱基的段，其中每一个段至少含有一个G碱基。所述的长链核酸适配体作为候选核酸适配体，为一种序列或多种序列，包括60-100个碱基。
(2)对第一步得到的若干个含有G碱基的段分别设计互补序列，使得互补序列的3’端的对位有突出的G碱基。
(3)根据核酸适配体与靶标分子的结合能力，设计合适的互补短链的长度，并对互补短链进行荧光素标记。所述的互补短链一般为8-15个碱基；所述的靶标为小分子、大分子、细胞及病原体。
(4)室温下，将核酸适配体与靶标分子在结合溶液中反应5-30分钟后，加入荧光素标记的互补短链，根据荧光强度判断各个区域对结合的影响，判断结合区域。所述结合溶液包括溶剂和溶质，其中，溶剂为水；溶质包括浓度为80-200nM NaCl，浓度为1-30mM的钙离子或者浓度为1-30mM的镁离子，浓度为10-30mM的Tris-HCl缓冲溶液，缓冲溶液pH为5-10，质量分数为0.01％-0.2％的表面活性剂Tween20。
(5)以与中心结合区域互补的探针为指示，通过截短、分割等手段获得能与靶标分子结合的最短核酸序列，作为解析序列。所述的解析序列的长度范围根据候选核酸适配体的不同进行调整，具体为14-45个碱基。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明首次利用G碱基具有淬灭荧光素的特性，仅用有限数量的修饰有荧光素的短链核酸来高通量筛选、优化无修饰的核酸适配体。该方法以核酸适配体二级序列为基础，避免了生物信息学分析的不确定性，序列优化的准确性提高显著；通芯片方法相比，成本显著降低，有限的单标记核酸探针，以及大量廉价的无标记核酸适配体。可用于任何类型靶标的核酸适配体。针对不同靶标或不同核酸适配体，设计不同的互补荧光探针，这样实现基于碱基淬灭荧光原理实现低成本高通量核酸适配体最优序列的优化方法，可同时对多种候选核酸适配体进行优化。
附图说明
图1为本发明进行核酸适配体序列优化的方法原理示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清晰，以下结合附图及具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，该具体实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据候选核酸适配体及靶标的不同做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
实施赭曲霉毒素A核酸适配体的序列优化方法示例：请参阅图1，为根据本发明的一种基于碱基淬灭荧光原理实现低成本高通量核酸适配体最优序列的优化方法流程示意图。主要包括以下步骤：
一、作为可用于筛选的互补链位置的选择
根据核酸的氧化电位与荧光素FAM的氧化电位关系，FAM的电位只高于G碱基，当FAM靠近G碱基时，基于荧光染料与核苷酸碱基之间光诱导电子转移的荧光淬灭现象，用G碱基作为FAM的淬灭团，而且更多为未互补的G碱基淬灭效果更好。已获得的赭曲霉毒素A的核酸适配体序列为TGGTGGCTGTAGGTCAGCATCTGATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACAACG。
经过前期的实验结果已获得的最佳序列为：
GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA。
然而这个序列并非最短序列，本发明以此序列为例进一步进行优化。
本发明选择了6条探针序列进行对比。
GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA
从实验结果来看，F11响应值变化更大，但是这需要从两个方面来考虑，一个是淬灭团和FAM的位置关系，一个是互补链的长度，在这个体系中核酸适配体与赭曲霉毒素A的解离常数在200nM，所以其竞争分子(既互补链)的解离常数也要在这个数量级。因为互补链是将抑制赭曲霉毒素A与核酸适配体相互作用，所以对于结合能力强的小分子，互补链的长度在7-20个。
二、最佳核酸适配体序列的筛选
| OTA Ap36 | 5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA |
| OTA Ap35 | 5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGAC |
| OTA Ap34 | 5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGA |
| OTA Ap33 | 5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGG |
| OTA Ap32 | 5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCG |
| OTA Ap31 | 5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATC |
| OTA Ap30 | 5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCAT |
| OTA Ap29 | 5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCA |
| OTA Ap28 | 5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGC |
经过对实验数据分析，反应的EC50值分别为，从实验结果来看，相对于36个碱基的赭曲霉毒素A的核酸适配体，31个碱基的核酸适配体依旧具有很好的识别能力，而30个碱基的核酸适配体及更短的核酸适配体的结合能力明显减弱。
三、对核酸适配体进行改造
根据实验结果和前期工作，在这里认为核酸适配体识别赭曲霉毒素A以后形成反平行G四链体而31个碱基的分析结构正好是形成G四链体后尾链互补，互补的尾链结构对于整个系统的稳定性有利。所以我们在尾链上适当增加几对互补碱基，结果如我们所期待的那样，EC50值进一步降低，这进一步证明形成的复合结构其尾链是互补的，并且延长互补尾链有利于靶标分子识别。
Claims (10)
1.一种基于碱基淬灭荧光原理实现低成本高通量核酸适配体最优序列的优化方法，其特征在于以下步骤：
(1)将已获得长链核酸适配体作为候选核酸适配体，分成若干个含有G碱基的段，其中每一个段至少含有一个G碱基；
(2)对第一步得到的若干个含有G碱基的段分别设计互补序列，使得互补序列的3’端的对位有G碱基；
(3)根据核酸适配体与靶标分子的结合能力，设计合适的互补短链的长度，并对互补短链进行荧光素标记；
(4)室温下，将核酸适配体与靶标分子在结合溶液中反应5-30分钟后，加入荧光素标记的互补短链，根据荧光强度判断各个区域对结合的影响，判断结合区域；所述的结合溶液包括溶剂和溶质，其中，溶剂为水；溶质包括NaCl，钙离子或镁离子，Tris-HCl缓冲溶液，表面活性剂；
(5)以与中心结合区域互补的探针为指示，通过截短、分割手段获得能与靶标分子结合的最短核酸序列，作为解析序列；所述的解析序列的长度范围根据候选核酸适配体的不同进行调整。
2.根据权利要求1所述的一种基于碱基淬灭荧光原理实现低成本高通量核酸适配体最优序列的优化方法，其特征在于，步骤(1)所述的候选核酸适配体为一种序列或多种序列，包括60-100个碱基。
3.根据权利要求1或2所述的一种基于碱基淬灭荧光原理实现低成本高通量核酸适配体最优序列的优化方法，其特征在于，步骤(3)所述的互补短链长度为8-15个碱基。
4.根据权利要求1或2所述的一种基于碱基淬灭荧光原理实现低成本高通量核酸适配体最优序列的优化方法，其特征在于，步骤(5)所述的解析序列的长度为14-45个碱基。
5.根据权利要求3所述的一种基于碱基淬灭荧光原理实现低成本高通量核酸适配体最优序列的优化方法，其特征在于，步骤(5)所述的解析序列的长度为14-45个碱基。
6.根据权利要求1或2或5所述的一种基于碱基淬灭荧光原理实现低成本高通量核酸适配体最优序列的优化方法，其特征在于，步骤(4)所述的结合溶液中NaCl的浓度为80-200nM；钙离子或者镁离子的浓度为1-30mM；Tris-HCl缓冲溶液的浓度为10-30mM，pH为5-10；表面活性剂为Tween20，其质量分数为0.01％-0.2％。
7.根据权利要求3所述的一种基于碱基淬灭荧光原理实现低成本高通量核酸适配体最优序列的优化方法，其特征在于，步骤(4)所述的结合溶液中NaCl的浓度为80-200nM；钙离子或者镁离子的浓度为1-30mM；Tris-HCl缓冲溶液的浓度为10-30mM，pH为5-10；表面活性剂为Tween20，其质量分数为0.01％-0.2％。
8.根据权利要求4所述的一种基于碱基淬灭荧光原理实现低成本高通量核酸适配体最优序列的优化方法，其特征在于，步骤(4)所述的结合溶液中NaCl的浓度为80-200nM；钙离子或者镁离子的浓度为1-30mM；Tris-HCl缓冲溶液的浓度为10-30mM，pH为5-10；表面活性剂为Tween20，其质量分数为0.01％-0.2％。
9.根据权利要求1或2或5或7或8所述的一种基于碱基淬灭荧光原理实现低成本高通量核酸适配体最优序列的优化方法，其特征在于，步骤(3)所述的靶标为小分子、大分子、细胞及病原体。
10.根据权利要求6所述的一种基于碱基淬灭荧光原理实现低成本高通量核酸适配体最优序列的优化方法，其特征在于，步骤(3)所述的靶标为小分子、大分子、细胞及病原体。
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