CN113025611B - π-FISH定位单分子的探针组合物及其在核酸原位检测中的应用 - Google Patents
π-FISH定位单分子的探针组合物及其在核酸原位检测中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113025611B CN113025611B CN202110280594.6A CN202110280594A CN113025611B CN 113025611 B CN113025611 B CN 113025611B CN 202110280594 A CN202110280594 A CN 202110280594A CN 113025611 B CN113025611 B CN 113025611B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- probe
- sequence
- region
- complementary
- fish
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/682—Signal amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6841—In situ hybridisation
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种π‑FISH定位单分子的探针组合物及其在核酸原位检测中的应用,所述探针组合物由四步杂交的单链DNA探针组成,分别为一级π型探针、二级探针、三级探针和信号探针;本发明克服了传统荧光原位杂交,探针特异性不高、信号背景噪音大、操作复杂、步骤繁琐、信号放大能力低等缺陷,只需要简单的几步逐级放大探针杂交就能实现对细胞、组织中RNA或DNA核酸信息的原位、单分子检测,在精度、通量和成本上显著优于传统荧光原位杂交方法。
Description
技术领域
本发明涉及核苷酸的原位单分子检测技术领域,具体涉及一种π-FISH定位单分子的探针组合物及其在核酸原位检测中的应用。
背景技术
1969年,Gall和Pardue利用放射性标记的探针最早实现原位解读核酸信息(Pardue 1969),但是这种方法有很多缺陷。首先,放射性标记探针是一种相对昂贵和危险的材料,储存和处理上都不稳定;其次,该方法背景高,自显影时间长,空间分辨率不高(Levsky and Singer 2003)。因此,这种方法很快就被基于荧光标记的技术所取代。1986年,Pinkel等人使用生物素分子或地高辛偶联的DNA探针,进而利用结合在亲和素上的报告分子或通过抗地高辛的抗体进行可视化,提高了目标核酸分子检测的速度和准确性。这种以非放射性荧光标记取代放射性同位素标记检测核酸分子的新型原位杂交方法即荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)方法得以快速发展起来。
FISH本质上是将核酸探针与细胞或组织中的目标DNA或RNA的互补序列进行杂交,通过荧光直接标记的杂交互补探针,或通过非标记的杂交互补探针结合报告分子进而借助荧光标记的检测探针或其他亲和分子,可以最终实现目标核酸的原位检测(Volpi andBridger2008)。FISH技术的出现已经被广泛应用于临床诊断和生命科学包括神经科学、毒理学、微生物生态学、比较基因组学、细胞基因组学和染色体生物学等领域的研究,如研究DNA的复制、RNA的加工和基因的表达、物种间保守序列和物种间的染色体重排等等(Nathand Johnson 2000,Volpi et al 2008)。该项技术使得人类对染色体结构和功能的解析进入了一个新时代,开启了对空间组学探索的大门。
FISH技术中的信号呈现方法最常用的是基于半抗原形式的经典荧光原位杂交技术,其基本原理是:将带有特定标记的(如生物素、地高辛等)核苷酸单链片段作为探针,与组织切片或细胞内待测核酸片段进行杂交,在一定的条件下,形成DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA双键分子,实现核酸检测的目的,但是该方法操作步骤复杂、程序繁琐、杂交信号特异性不是很高。
近年来经过不断的优化与改进,衍生出了许多不同的FISH方法,然而价格昂贵、操作繁琐、检测信号灵敏度不高、特异性不够、背景较强、杂交效率低仍是限制该技术发展的瓶颈。此外,目前的FISH对中高拷贝数的靶分子检测比较有效,对于低拷贝数甚至单拷贝靶分子的检测仍束手无策。随着单细胞技术的发展,核酸的原位检测在精度和通量上有了更高的要求,如何在单个细胞内实现单个分子精度和多个基因的同时检测是目前需要解决的棘手问题。传统的FISH由于信号放大能力有限,在单个分子检测上仍难以实现,除非设计多个荧光互补探针,但成本将大大提高。
因此,亟需开发出一种高灵敏性、高特异性、高通量、低成本的FISH技术,来实现核酸的原位、单分子、高通量检测,助力临床精准诊断和生命科学的精细化水平研究。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供了一种π-FISH定位单分子的探针组合物及其在核酸原位检测中的应用,该π-FISH定位单分子的探针组合物能够有效地能够实现细胞、组织中DNA和RNA的原位、单分子定性与定量检测;该方法具有通量高、特异性好、信号放大能力强、空间分辨率高、背景噪音低、低成本、操作简单等优点,本发明只需要四步探针杂交就实现RNA或DNA的原位、单分子检测,在精度、通量和成本上显著优于传统荧光原位杂交方法。
为实现上述目的,本发明所设计一种π-FISH定位单分子的探针组合物,所述探针组合物由四步杂交的单链DNA探针组成,分别为一级π型探针、二级探针、三级探针和信号探针;其中,
所述一级π型探针,其分别互补于靶分子区域和二级探针的中间区域,形成π型结构;所述一级π型探针包括三个区域,分别为π脚区域、π中区域和π顶区域,所述π脚区域的两个脚均与靶DNA或靶RNA序列互补;所述π中区域为两条序列,用于连接π脚区域和π顶区域,且两条序列间部分互补;所述π顶区域与二级探针的中间区域互补;
所述二级探针分为中间区域和两端区域,所述二级探针的两端区域均间隔互补有多个三级探针;且两端区域的每个互补区域均与对应三级探针的中间区域互补;
所述三级探针分为中间区域和两端区域,两端区域均间隔互补有多个信号探针。
进一步地,所述一级π型探针中,π脚区域的每个脚与靶DNA或靶RNA序列互补序列的长度为22-25nt;
所述π顶区域与二级探针的中间区域互补的长度为12~16nt;
所述π中区域的两条序列的长度均为6-8nt,且两条序列间有2-5nt碱基互补(用于增加杂交效率)。
再进一步地,所述信号探针:在信号探针序列的5’端和3’端分别进行荧光修饰,使得每个信号探针都带有两个荧光基团。
再进一步地,所述荧光基团为常用的任意荧光基团;选自Alexa Fluor 488、AlexaFluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 647、Cy3和Cy5;但是不仅仅局限于上述基团的修饰。
本发明的探针设计原理:
本发明只需要四步逐级放大探针杂交即可完成对核酸的原位检测,首先一级π型探针与靶序列特异性杂交,且只有当π型探针对的π脚区域同时结合靶序列时,才能特异性地形成荧光信号。若单侧π型探针的π脚结合上非特异性序列,随后结合上的二级探针很容易被洗掉,不能形成荧光信号。因此,π型探针的设计方法极大地提高了杂交效率,降低背景,保证信号的特异性。随后通过设计的二级探针、三级探针和信号探针的杂交实现信号逐级放大,其中二级探针、三级探针和信号探针特异性结合区域以及间隔区域不能与需要检测物种的核酸序列同源。设计的π型探针π脚区域要与靶序列的杂交区域要保证100%同源匹配,且不能与其它基因同源。当检测多个基因的共表达时,采取不同的探针组合物杂交即可实现,如附图1所示,只需将不同的探针组合物标记不同的荧光基团进行杂交即可;当荧光通道数目受限时,可以采取同一套探针组合物用双色、三色、或者四色荧光基团修饰去共同定位一个基因,从而提高基因检测的通量,如附图2,附图3和附图4所示。
本发明还提供一种上述π-FISH定位单分子的探针组合物的制备方法,包括以下步骤:
1)一级π型探针按设计采用引物合成的方法进行合成;
2)在设计好二级探针和三级探针的序列两端均加上T7启动子序列和T7终止子序列;再进行基因合成,分别连接在载体上;将对应的重组载体进行体外转录、反转录、去RNA模板和纯化回收,分别获得单链的二级探针和单链的三级探针;
3)信号探针采用引物合成后荧光基团修饰的方法进行制备(即在序列的5’端和3’端分别进行荧光基团修饰,避光保存。
本发明还提供一种上述探针组合物在核酸原位检测中的应用。
本发明还提供一种核酸原位检测的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒包括上述的探针组合物。
作为优选方案,所述试剂盒还包括预杂交液A、预杂交液B、预杂交液C、洗脱缓冲液A和洗脱缓冲液B。
作为优选方案,所述预杂交液A配制体系为如下:
所述预杂交液B配制体系如下:
所述预杂交液C配置体系如下:
所述洗脱缓冲液A的反应体系如下:
所述洗脱缓冲液B反应体系如下:
本发明还提供了一种上述试剂盒用于π-FISH原位检测,定位细胞或组织中核酸的方法,其特征在于:包括以下步骤:
1)固定:将待检测样品进行固定;其中,所述待检测样品为细胞或组织;
2)杂交:将已处理的待检测样品与探针组合物在杂交液中逐步杂交;
3)洗涤:对杂交后的待检测样品进行洗涤;
4)检测:拍照检测是否有阳性信号产生。
本发明的有益效果:
(1)本发明信号放大能力强,只需几步逐级放大探针就可以将信号放大数千倍,对于低表达和中低表达基因都有很好的检测效果。
(2)本发明可以同时检测多个基因的共表达,且可以进行多轮杂交。
(3)本发明可以在单个细胞水平上实现单分子信号精度的检测。
(4)本发明可以定量杂交信号的荧光分子数,实现定量分析。
(5)本发明设计π型探针,极大地降低了非特异性信号,背景噪音更小,信号特异性更高。
(6)本发明制备单链DNA探针,稳定性高,不易降解,杂交信号稳定,且易于储存。
(7)本发明操作简单,只需要简单的几步杂交就可以在原位上检测和定位核酸的信息。
(8)本发明中的二级、三级和信号探针是通配探针,适用于任何基因的检测;检测不同基因或多个基因共定位时,只需更换π型探针即可。
附图说明
图1为π-FISH单色检测单个基因的示意图;
图2为π-FISH双色检测单个基因示意图;
图3为π-FISH三色检测单个基因示意图;
图4为π-FISH四色检测单个基因示意图;
图5为π-FISH原位检测BHK细胞中Actb基因mRNA的结果;
图6为π-FISH原位检测BHK细胞中Actb基因DNA的结果;
图7为π-FISH原位分别检测鼠脑中Cux2和Pcp4基因mRNA的结果;
图8为π-FISH原位同时检测鼠脑中Pcp4和Rorb基因mRNA的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述,以便本领域技术人员理解。
实施例1
如图1所示的单基因检测即π-FISH原位检测BHK细胞中Actb基因的mRNA和DNA的方法,具体步骤如下:
(1)探针的设计:
a.一级π型探针:针对BHK细胞中Actb基因设计了17个一级π型探针对,每一个一级π型探针包括了π脚区域,π顶区域和π中区域;其中,
π脚区域是与Actb mRNA碱基互补配对的特异性杂交区域,用NNN……NNN表示;一级π型探针π顶区域序列分别为NNN……NNN表示;一级π型探针对中间区域互补序列分别为AAGTCCTT和TTCCACTA;
一级π型探针左侧序列:5’-NNN……NNNAAGTCCTTNNN……NNN-3’
一级π型探针右侧序列:5’-NNN……NNNTTCCACTANNN……NNN-3’
b.二级探针:二级探针分为中间区域和两端区域;中间区域是与π型探针对π顶区域互补的序列,为NNN……NNN;两端区域中与三级探针结合区域序列为AATCGAGCATGCACCGAATT,间隔区域序列为CAGATTCATT;
将设计好的序列采取基因合成的方式连接到pUC19载体上。在序列前加上T7启动子序列,为TAATACGACTCACTATAGGG,在序列后加上T7终止子序列:
CTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG。
c.三级探针:三级探针也分为中间区域和两端区域,但是与二级探针序列不同;中间区域是与二级探针结合互补的序列,为AATTCGGTGCATGCTCGATT;两端区域中与信号探针结合区域序列为AACCGATGCATGAAATCGAT,间隔区域序列为CAGATTCATT。将设计好的序列采取基因合成的方式连接到pUC19载体上。
将设计好的序列采取基因合成的方式连接到pUC19载体上,在序列前加上T7启动子序列,为TAATACGACTCACTATAGGG,在序列后加上T7终止子序列:
CTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTT。
d.信号探针:在序列两端分别进行Alexa Fluor 488荧光修饰,使得每条信号探针都带有两个荧光基团,这一设计使信号又放大2倍。
(2)探针的制备:
a.一级π型探针和信号探针的制备:将设计好的一级π型探针以DNA引物合成的方式合成,然后用Nuclease-free water稀释为终浓度1nM备用;同样,将荧光修饰后的信号探针用Nuclease-free water稀释为终浓度100nM备用;
b.二级、三级探针的制备:
①取1ug二级探针和三级探针质粒模板用Nuclease-free water进行稀释,根据表1依次加入试剂,配制体外转录体系,37℃孵育2h,冰上冷却;
②将体外转录获得的RNA产物反转录成DNA,根据表2配制体系,50℃孵育60min,再85℃加热5min终止反应,冰上冷却;
③去除反转录产物中的RNA模板,在上述反应产物中加入20μL0.25M EDTA和0.5MNaOH的混合溶液,95℃孵育10min,水解RNA模版而得到单链DNA探针;
④再通过DNA试剂盒纯化,最后用30μL超纯水洗脱探针,-20℃保存。
表1体外转录体系
10×Reaction Buffer | 2μL |
ATP(100mM) | 2μL |
GTP(100mM) | 2μL |
UTP(100mM) | 2μL |
CTP(100mM) | 2μL |
DNA模板 | 1ug |
RNA酶抑制剂(40U/μL) | 1μL |
T7 RNA Polymerase Mix(NEB) | 2μL |
Nuclease-free water | 补充至20μL |
表2反转录体系
5×RT Buffer | 4μL |
反转录引物 | 0.5nmol |
dNTP Mix(10mM) | 1μL |
体外转录产物 | 2μL |
反转录酶 | 1μL |
Nuclease-free water | 补水至20μL |
(3)细胞样品的处理:
a.玻片的处理:
将48孔板的细胞玻片用1×PBS清洗,用多聚赖氨酸处理10min,使得细胞贴壁效果更好,然后弃掉多聚赖氨酸,晾干备用。
b.样品的处理:
①将BHK细胞铺在已经处理好的细胞玻片上,培养24h,然后弃掉培养基,用1×DEPC-PBS洗2次,每次2min;
②然后用4%PFA/PBS室温固定15min,再DEPC-PBST洗3次,每次5min(其中DEPC-PBST为DEPC-PBS中加入0.1%Tween20);
③用70%酒精(用DEPC-H2O配制)浸泡3min(此步骤后可4℃保存约一个月待用),接着用85%和100%梯度酒精脱水,每个梯度3min;
④再用0.2M HCl(用DEPC-H2O配)室温通透细胞5min,用DEPC-PBST洗3次,每次5min;
⑤5μg/mL蛋白酶K室温处理2min,用DEPC-PBST洗5min;
⑥再用4%PFA/PBS室温再次固定5min,最后用DEPC-PBST洗3次,每次5min。
对于DNA的检测,此步骤后需做变性处理。
即将细胞或组织用RNase A(100ug/ml)37℃消化1h,再用2×SSC洗3遍,每次2min;然后在70%去离子甲酰胺溶液中72℃变性10min;接着迅速置于冰的70%、80%、90%、100%乙醇中,依次1min,最后用2×SSC洗脱,于4℃待用
(4)π-FISH荧光原位杂交:
a.向上述已经处理好的BHK细胞中加入200μL预杂交液A,40℃孵育10min,再加入终浓度为1nM一级π型探针于40℃继续孵育10h。孵育过后弃掉杂交液A,加入200μL提前预热的洗脱缓冲液A,置于40℃摇床中振荡洗脱3次,每次10min;
b.加入200μL预杂交液B于40℃孵育10min,同时将二级探针85℃变性处理2min,然后冰上冷却5min。再加入终浓度为6nM二级探针于40℃继续孵育3h。孵育过后弃掉杂交液A,加入200μL提前预热的洗脱缓冲液B,置于40℃摇床中振荡洗脱3次,每次10min。
c.加入200μL预杂交液B于40℃孵育10min,同时将三级探针85℃变性处理2min,然后冰上冷却5min。再加入终浓度为48nM三级探针于40℃继续孵育3h。孵育过后弃掉杂交液B,加入200μL提前预热的洗脱缓冲液B,置于40℃摇床中振荡洗脱3次,每次10min;
d.加入200μL预杂交液C于40℃孵育10min,再加入终浓度为100nM信号探针于40℃继续孵育3h。孵育过后弃掉杂交液C,加入200μL提前预热的洗脱缓冲液A,置于40℃摇床中振荡洗脱10min。然后加入提前预热的洗脱缓冲液B,置于40℃摇床中振荡洗脱2次,每次10min。
其中,
表3预杂交液A配制体系
20×SSC | 3ml |
去离子甲酰胺 | 3ml |
体积分数为0.1%的Tween 20 | 100μL |
肝素(50ug/mL) | 100μL |
氧钒核糖核苷复合物(200mM) | 100μL |
硫酸葡聚糖 | 1g |
Nuclease-free water | 补充至10ml |
表4预杂交液B配制体系
20×SSC | 2.5ml |
去离子甲酰胺 | 2.5ml |
体积分数为0.1%的Tween 20 | 100μL |
肝素(50ug/mL) | 100μL |
氧钒核糖核苷复合物(200mM) | 100μL |
硫酸葡聚糖 | 1g |
Nuclease-free water | 补充至10ml |
表5预杂交液C配置体系
20×SSC | 2.5ml |
去离子甲酰胺 | 0.5ml |
体积分数为0.1%的Tween 20 | 100μL |
硫酸葡聚糖 | 1g |
Nuclease-free water | 补充至10ml |
表6洗脱缓冲液A的反应体系
20×SSC | 3ml |
去离子甲酰胺 | 2.5ml |
体积分数为0.1%的Tween 20 | 100μL |
肝素(50ug/mL) | 100μL |
Nuclease-free water | 补充至10ml |
表7洗脱缓冲液B反应体系
20×SSC | 0.5ml |
去离子甲酰胺 | 0.5ml |
体积分数为0.1%的Tween 20 | 100μL |
Nuclease-free water | 补充至10ml |
e.DAPI染色2min,再进行70%、85%、100%梯度酒精脱水,最后封片进行显微拍照,如附图5为BHK细胞中Actb基因的mRNA检测结果,从结果中可以明显的看出,实验组细胞质中有明显的阳性信号产生,而对照组中没有信号产生,这一结果表明π-FISH原位检测方法具有非常好的特异性和信号检测能力。附图6中为BHK细胞中Actb基因的DNA检测结果,从附图6中可以看出在细胞核中有明显的两个点状信号产生,说明π-FISH可以很好的检测出BHK细胞基因组DNA中的Actb基因。
实施例2:
如图7~8所示的组织切片中单基因及多基因检测即π-FISH原位检测小鼠脑组织切片中Cux2基因,Pcp4基因以及共检测Pcp4和Rorb基因的mRNA的方法,具体步骤如下:
(1)探针的设计:
a.一级π型探针:Cux2、Pcp4和Rorb基因的π型探针设计原则同实施例1中a;针对Cux2基因设计19个π型探针,Pcp4基因设计8个π型探针,Rorb基因设计17个π型探针,每一部分分为三个区域,即π脚区域,π顶区域和π中区域。π脚区域是与Cux2、Pcp4和Rorb基因mRNA碱基互补配对的特异性杂交区域,用NNN……NNN表示;Cux2和Pcp4基因π型探针π顶区域序列用NNN……NNN表示;Rorb基因π型π顶区域序列用NNN……NNN表示;三者π型探针左右两侧π中区域的序列分别为AAGTCCTT和TTCCACTA;
Cux2和Pcp4基因一级π型探针序列信息如下:
一级π型探针左侧序列:5’--NNN……NNNAAGTCCTTNNN……NNN-3’
一级π型探针右侧序列:5’-NNN……NNNTTCCACTANNN……NNN-3’
Rorb基因π型探针序列信息如下:
一级π型探针左侧序列:5’--NNN……NNNAAGTCCTTNNN……NNN-3’
一级π型探针右侧序列:5’-NNN……NNNTTCCACTANNN……NNN-3’
b.二级探针:
二级探针设计原则同实施例1中b,分为中间区域和两端区域;中间区域是与一级π型探针左右两侧π顶区域互补的序列,检测Cux2和Pcp4基因的二级探针中间区域序列用NNN……NNN表示;两端区域中与三级探针结合区域序列为AATCGAGCATGCACCGAATT,检测Rorb基因的二级探针中间区域序列用NNN……NNN表示;两端区域中与三级探针结合区域序列为GGTTCATGACCATGACCATT,间隔区域序列为CAGATTCATT。将设计好的序列采取基因合成的方式连接到pUC19载体上,在序列前加上T7启动子序列,为TAATACGACTCACTATAGGG,在序列后加上T7终止子序列:
CTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG。
c.三级探针:
三级探针的设计原则同实施例1中c,也分为中间区域和两端区域,但是与二级探针序列不同。中间区域是与二级探针结合互补的序列,其中检测Cux2和Pcp4基因的三级探针中间区域序列为AATTCGGTGCATGCTCGATT;两端区域中与信号探针结合区域序列为AACCGATGCATGAAATCGAT,间隔区域序列为CAGATTCATT。检测Rorb基因的三级探针中间区域序列为AATGGTCATGGTCATGAACC;两端区域中信号探针与三级探针结合区域序列为AATTGAGTCATTAGCCATG,间隔区域序列为CAGATTCATT。将设计好的序列采取基因合成的方式连接到pUC19载体上。在序列前加上T7启动子序列,为TAATACGACTCACTATAGGG,在序列后加上T7终止子序列:CTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG。
d.信号探针:
由于需要同时检测Pcp4基因和Rorb两个基因。所以需要用不同的荧光标记的信号探针进行检测,检测Cux2和Pcp4基因探针的信号序列两端用Alexa Fluor 488荧光修饰,检测Rorb基因的信号探针序列两端用Alexa Fluor 555荧光修饰,使得每条信号探针都带有两个荧光基团,这一设计使信号又放大2倍。
(2)探针的制备:
a.一级π型探针和信号探针的制备:将设计好的π型探针以DNA引物合成的方式合成,然后用Nuclease-free water稀释为终浓度10nM备用。同样,将荧光修饰后的信号探针用Nuclease-free water稀释为终浓度100nM备用。
b.二级、三级探针的制备:
①取1ug二级探针和三级探针质粒模板用Nuclease-free water进行稀释,根据实施例1中的表1依次加入试剂,配制体外转录体系,37℃孵育2h,冰上冷却;
②将体外转录获得的RNA产物反转录成DNA,根据实施例1中的表2配制体系,50℃孵育60min,再85℃加热5min终止反应,冰上冷却;
③去除反转录产物中的RNA模板,在上述反应产物中加入20μL0.25M EDTA和0.5MNaOH的混合溶液,95℃孵育10min,水解RNA模版而得到单链DNA探针;
④再通过DNA试剂盒纯化,最后用30μL超纯水洗脱探针,-20℃保存。
(3)组织样品取材及切片的处理:
a.鼠脑的取材以及固定:按照动物福利的标准,解剖取出新鲜小鼠大脑后及时放入4%PFA/PBS中于4℃固定12h。然后放入30%蔗糖脱水(Nuclease-free water配置)12h,用OCT包被后放入-80℃冰箱保存待用。
b.组织切片的制备:将OCT包被好的鼠脑切片放入冰冻切片机切片,切片厚度为10μm,将切好的组织粘贴到无酶的载玻片上。放入-80℃冰箱保存待用;
c.组织切片样本的处理:
①将鼠脑的组织切片放入杂交盒中,用1×DEPC-PBS清洗2min去掉OCT;
②然后加入4%PFA/PBS室温固定15min后,用DEPC-PBST洗3次,每次5min;
③用70%酒精(用DEPC-H2O配)浸泡5min(注意此步也可长期保存于4℃约1个月),接着用85%、100%梯度乙醇脱水,每个梯度5min;
④用0.2M HCl通透10min,再DEPC-PBST洗3次,每次5min;
⑤用5ug/ml蛋白酶K室温处理5min,用DEPC-PBST洗3次,每次5min;
⑥接着用4%PFA/PBS室温再次固定15min,最后用DEPC-PBST洗3次,每次5min。此时的组织已经处理完毕准备待用。
(4)π-FISH杂交步骤:
a.首先将处理好的鼠脑组织切片的周围用疏水笔画一圈疏水圈,向组织中加入100μL预杂交液A后于40℃孵育10min;再向三张组织切片中加入各自对应的终浓度为10nM的π型探针。载玻片①中加入Cux2基因的π型探针,载玻片②中加入Pcp4基因的π型探针。载玻片③中同时加入Pcp4和Rorb的π型探针于40℃继续孵育10h,孵育过后弃掉杂交液A,向装有组织的杂交盒子中加入10ml提前40℃预热的洗脱缓冲液A,置于摇床中40℃洗3次,每次10min;
b.加入100μL预杂交液B于40℃孵育10min,同时将二级探针85℃变性处理2min,然后冰上冷却5min。再向三张组织切片中加入各自对应的终浓度为6nM二级探针于40℃继续孵育3h。孵育过后弃掉杂交液B,加入10ml提前预热的洗脱缓冲液B,置于40℃摇床中振荡洗脱3次,每次10min。
c.加入100μL预杂交液B于40℃孵育10min,同时将三级探针85℃变性处理2min,然后冰上冷却5min。再向三张组织切片中加入各自对应的终浓度为48nM三级探针于40℃继续孵育3h。孵育过后弃掉杂交液B,加入10ml提前预热的洗脱缓冲液A,置于40℃摇床中振荡洗脱3次,每次10min。
d.加入200μL预杂交液C于40℃孵育10min,再向三张组织切片中加入各自对应的终浓度为100nM三级探针于40℃继续孵育3h。孵育过后弃掉杂交液B,加入200μL提前预热的洗脱缓冲液A,置于40℃摇床中振荡洗脱10min。然后加入提前预热的洗脱缓冲液B,置于40℃摇床中振荡洗脱2次,每次10min。
e.DAPI染色2min,再进行70%、85%、100%梯度酒精脱水,最后封片进行显微拍照。如附图7分别为小鼠脑组织切片中Cux2基因和Pcp4基因的检测结果,检测这两个基因的信号探针都用Alexa Fluor 488标记,从图中可以清晰的看出Cux2基因和Pcp4基因的表达。附图8为多基因检测即在同一张组织切片上共检测Pcp4和Rorb基因的mRNA结果,其中检测Pcp4基因的信号探针都用Alexa Fluor488标记,检测Rorb基因的信号探针用Alexa Fluor555标记,从图中可以分别清楚的看到Alexa Fluor 488标记的绿色信号和Alexa Fluor555标记的红色信号,以及两者在同一个细胞中表达的Merge信号。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述,但它仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部实施例,人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例,这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (7)
1.一种π-FISH定位单分子的探针组合物,其特征在于:所述探针组合物由四步杂交的单链DNA探针组成,分别为一级π型探针、二级探针、三级探针和信号探针;其中,
所述一级π型探针,其分别互补于靶分子区域和二级探针的中间区域,形成π型结构;所述一级π型探针包括三个区域,分别为π脚区域、π中区域和π顶区域,所述π脚区域的两个脚均与靶DNA或靶RNA序列互补;所述π中区域为两条序列,用于连接π脚区域和π顶区域,且两条序列间部分互补;所述π顶区域与二级探针的中间区域互补;
所述二级探针分为中间区域和两端区域,所述二级探针的两端区域均间隔互补有多个三级探针;且两端区域的每个互补区域均与对应三级探针的中间区域互补;
所述三级探针分为中间区域和两端区域,两端区域均间隔互补有多个信号探针;所述一级π型探针中,π脚区域的每个脚与靶DNA或靶RNA序列互补序列的长度为22-25 nt;
所述π顶区域与二级探针的中间区域互补的长度为12~16nt;
所述π中区域的两条序列的长度均为6-8 nt,且两条序列间有2-5 nt碱基互补;
所述π-FISH定位单分子的探针组合物由以下步骤制备而成:
1)一级π型探针按设计采用引物合成的方法进行合成;
2)在设计好二级探针和三级探针的序列两端均加上T7启动子序列和T7终止子序列;再进行基因合成,分别连接在载体上;将对应的重组载体进行体外转录、反转录、去RNA模板和纯化回收,分别获得单链的二级探针和单链的三级探针;
3)信号探针采用引物合成后荧光基团修饰的方法进行制备。
2.根据权利要求1所述π-FISH定位单分子的探针组合物,其特征在于:所述信号探针:在信号探针序列的5’端和3’端分别进行荧光修饰,使得每个信号探针都带有两个荧光基团。
3.根据权利要求2所述π-FISH定位单分子的探针组合物,其特征在于:所述荧光基团选自Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor647、Cy3和Cy5。
4.一种权利要求1所述探针组合物在核酸原位检测中的应用。
5.一种核酸原位检测的试剂盒,所述试剂盒包括权利要求1所述的探针组合物。
7.一种权利要求5~6任意一项的试剂盒在π-FISH原位检测,定位细胞或组织中核酸中的应用,其特征在于:所述应用包括以下步骤:
1)固定:将待检测样品进行固定;其中,所述待检测样品为细胞或组织;
2)杂交:将已处理的待检测样品与探针组合物在杂交液中逐步杂交;
3)洗涤:对杂交后的待检测样品进行洗涤;
4)检测:拍照检测是否有阳性信号产生。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110280594.6A CN113025611B (zh) | 2021-03-16 | 2021-03-16 | π-FISH定位单分子的探针组合物及其在核酸原位检测中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110280594.6A CN113025611B (zh) | 2021-03-16 | 2021-03-16 | π-FISH定位单分子的探针组合物及其在核酸原位检测中的应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN113025611A CN113025611A (zh) | 2021-06-25 |
CN113025611B true CN113025611B (zh) | 2022-06-21 |
Family
ID=76470799
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202110280594.6A Active CN113025611B (zh) | 2021-03-16 | 2021-03-16 | π-FISH定位单分子的探针组合物及其在核酸原位检测中的应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN113025611B (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114959044B (zh) * | 2022-06-29 | 2023-04-07 | 华中农业大学 | 一种π-FISH+核酸探针组、原位杂交方法及其应用 |
CN117467751B (zh) * | 2023-12-27 | 2024-03-29 | 北京百力格生物科技有限公司 | 靶向目的基因fish荧光探针及其自组装放大探针系统 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109161542A (zh) * | 2018-02-23 | 2019-01-08 | 广州简册生物技术有限公司 | 荧光原位杂交探针及其制备方法和应用 |
CN111876471A (zh) * | 2020-07-16 | 2020-11-03 | 华侨大学 | 一种rna的原位检测方法 |
WO2021215428A1 (ja) * | 2020-04-22 | 2021-10-28 | 日華化学株式会社 | 核酸の検出方法及びオリゴヌクレオチドプローブ |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20150105298A1 (en) * | 2013-10-10 | 2015-04-16 | The Research Foundation For The State University Of New York | Multi-oligomer in situ hybridization probes |
-
2021
- 2021-03-16 CN CN202110280594.6A patent/CN113025611B/zh active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109161542A (zh) * | 2018-02-23 | 2019-01-08 | 广州简册生物技术有限公司 | 荧光原位杂交探针及其制备方法和应用 |
WO2021215428A1 (ja) * | 2020-04-22 | 2021-10-28 | 日華化学株式会社 | 核酸の検出方法及びオリゴヌクレオチドプローブ |
CN111876471A (zh) * | 2020-07-16 | 2020-11-03 | 华侨大学 | 一种rna的原位检测方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
HPV-CCDC106 integration alters local chromosome architecture and hijacks an enhancer by 3D genome structure remodeling in cervical cancer;Canhui Cao等;《J Genet Genomics》;20200611;437-450 * |
探索染色质三维构象的"工具箱"研究进展;林达等;《中国科学: 生命科学》;20200430;第50卷(第5期);497-505 * |
荧光原位杂交技术在人染色体异常研究中的应用;宋杰;《大家》;20120715(第20期);229-230 * |
荧光定量PCR和FISH技术诊断肺结核的价值比较;温韵洁等;《现代医院》;20141115(第11期);91-93 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN113025611A (zh) | 2021-06-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11081209B2 (en) | Methods for genome assembly and haplotype phasing | |
US20230399683A1 (en) | Consecutive hybridization for multiplexed analysis of biological samples | |
CN113025611B (zh) | π-FISH定位单分子的探针组合物及其在核酸原位检测中的应用 | |
US20070009915A1 (en) | Microarray analysis of RNA | |
US20070009913A1 (en) | Method of treatment of RNA sample | |
Jin et al. | A fluorescent microarray platform based on catalytic hairpin assembly for MicroRNAs detection | |
CN111876471A (zh) | 一种rna的原位检测方法 | |
CN110643611B (zh) | 一种核酸适配体及其构建方法和其在检测石斑鱼虹彩病毒中的应用 | |
CN113215167B (zh) | 核酸适配体及其在检测大口黑鲈虹彩病毒感染的细胞中的应用 | |
JP2020536525A (ja) | プローブ及びこれをハイスループットシーケンシングに適用するターゲット領域の濃縮方法 | |
CN107523611A (zh) | 一种非扩增型核酸杂交捕获体系及其在核酸检测中的应用 | |
CN111647649B (zh) | 一种基于ccdc39基因cnv检测辅助选择黄牛生长性状的方法 | |
CN116829735A (zh) | 检测靶核酸序列的方法 | |
Rautio et al. | Rapid and multiplexed transcript analysis of microbial cultures using capillary electophoresis-detectable oligonucleotide probe pools | |
US20080051296A1 (en) | Methods and Compositions For Amplification and Detection of MicroRNAs | |
US10590451B2 (en) | Methods of constructing a circular template and detecting DNA molecules | |
US20080102454A1 (en) | Reducing size of analytes in RNA sample | |
US6759195B1 (en) | Method of differential display of prokaryotic messenger RNA by RTPCR | |
CN113025690B (zh) | 一种核酸探针组及其应用 | |
Kiefer | Genome-wide analysis of methylation in bovine clones by methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP) | |
US7645578B2 (en) | Cleavage of RNA at redundant sites | |
CN113337579B (zh) | 一种检测样品中一种或多种靶核酸的存在或其水平的方法 | |
Cortesi et al. | Chromosome conformation capture in primary human cells | |
CN113462694B (zh) | 一种针对大口黑鲈虹彩病毒感染细胞的核酸适配体及其应用 | |
CN117402961B (zh) | 一种胚胎植入前染色体非整倍体快速检测的引物、试剂盒和方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant | ||
TR01 | Transfer of patent right | ||
TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20230331 Address after: 529000 Guangdong Jiangmen Xinhui Economic Development Zone Minke Park Entrepreneurship Service Center Building, Jiangmen City, Guangdong Province Patentee after: Kunyu Biotechnology (Jiangmen) Co.,Ltd. Address before: 430070 No. 1 Lion Rock street, Hongshan District, Hubei, Wuhan Patentee before: HUAZHONG AGRICULTURAL University Patentee before: Kunyu Biotechnology (Jiangmen) Co.,Ltd. |