CN114959044B - 一种π-FISH+核酸探针组、原位杂交方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种π‑FISH+核酸探针组、原位杂交方法及其应用,所述π‑FISH+核酸探针组包括一级π型靶标探针、二级探针、三级探针、四级π型探针和信号探针。本发明设计的π‑FISH+核酸探针组克服了传统荧光原位杂交信号放大能力低、背景噪音大、只能检测长核酸序列等缺点,具有信号放大能力强、特异性高、效率高、背景噪音低等优点;本发明可以检测大于16个碱基的DNA或RNA核酸分子,可实现对长、短核酸序列定性、定量和定位的检测;另外,本发明设计的π‑FISH+核酸探针组可以精准地检测前列腺癌抗雄激素治疗耐药标志物雄激素受体剪接变体7(ARV7),指导患者临床治疗,具有巨大的临床应用潜力。
Description
技术领域
本发明属于核苷酸的原位单分子检测技术领域,具体涉及一种π-FISH+核酸探针组、原位杂交方法及其应用。
背景技术
荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)技术是一种利用荧光标记的探针在原位上显示核酸空间信息的方法。由于其特异、高效、原位等优势,已经被广泛应用于生物学研究和临床诊断。
随着FISH技术的不断发展与优化,在复杂的细胞和组织环境中,FISH技术经常面临着信号放大能力有限、特异性低,效率低、背景噪音高的挑战,对于一些中高拷贝数靶分子的检测比较有效,对于低拷贝数的靶分子检测效果较差,虽然增加靶标探针的数目可以在一定程度上提高信号的强度,但是需要更长的核酸序列进行杂交,通常需要杂交的靶标序列在1kb左右,这极大限制了对短序列检测的应用。对于一些具有重要功能的短核酸序列RNA、短核酸序列DNA和可变剪切体(alternative splicing),目前还没有既能产生足够强的信号,又能保证高效和低背景噪音的FISH检测方法。
此外,近年来FISH技术在临床检测中发挥重要作用。研究表明,前列腺癌是目前全球男性发病率最高的癌症,严重威胁着男性的生命健康。在临床治疗中,前列腺癌循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells,CTCs)中雄激素受体剪接变体7(androgen receptorsplice variant 7,ARV7)的表达与新型雄激素受体(AR)靶向治疗的先天和获得性耐药性相关。因此,ARV7可以作为一个生物标志物来监测前列腺癌治疗过程中耐药性的出现,并指导临床治疗。目前,虽然已经有一些方法尝试检测CTCs中的ARV7 mRNA的表达,如基于PCR扩增的技术和基于抗体的检测技术。但是由于雄激素受体剪切变体有多种类型,包括ARV1、ARV2、ARV4、ARV5和ARV7,不同的AR系列剪切变体序列相似性高,因此PCR扩增技术很难将ARV7与其它剪切变体区分开来,同时,当前市面上检测ARV7的抗体,特异性低,检测效果和准确性仍不明确。
有鉴于此,亟需开发出一种信号强度高、效率高、特异性强和背景噪音低的FISH技术实现灵活的对长、短核酸序列进行检测来解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供一种π-FISH+核酸探针组、原位杂交方法及其应用。本发明设计的π-FISH+核酸探针组可灵活的对长、短核酸序列进行定性、定量和定位的检测;具有信号放大能力强、特异性强、效率高、背景噪音低、低成本等优点;同时,还可以精准检测和区分前列腺癌循环肿瘤细胞中的抗雄激素治疗耐药标志物雄激素受体剪接变体7(ARV7)。
本发明的第一个目的在于提供一种π-FISH+核酸探针组。
一种π-FISH+核酸探针组,包括一级π型靶标探针、二级探针、三级探针、四级π型探针和信号探针;具体原理如图1所示,其中,
所述一级π型靶标探针由左右两条探针组成,形成π型结构,所述一级π型靶标探针包括三个区域,分别为π脚区域、π中区域和π顶区域,所述π脚区域的两个脚均与靶标序列互补;
所述二级探针包括3’端和5’端序列区域以及中间序列区域,所述3’端和5’端序列区域均间隔与多个三级探针互补,所述二级探针的中间序列区域与所述一级π型靶标探针的π顶区域互补;
所述三级探针包括3’端和5’端序列区域以及中间序列区域,所述3’端和5’端序列区域均间隔与多个四级π型探针互补,所述三级探针中间序列区域与所述二级探针3’端和5’端序列区域互补;
所述四级π型探针由左右两条探针组成,形成π型结构,所述四级π型探针包括三个区域,分别为π脚区域、π中区域和π顶区域,所述三级探针3’端和5’端序列均间隔与对应所述四级π型探针两个π脚区域互补;所述四级π型探针的π顶区域与信号探针序列互补。
进一步地,所述一级π型靶标探针的两个π脚区域碱基为16~25个,并且两个π脚区域之间间隔1~2个碱基;所述一级π型靶标探针π中区域的两条序列碱基为6~8个,且两条序列间有2~4个碱基互补;所述一级π型靶标探针π顶区域碱基为12~16个。
进一步地,所述四级π型探针两个π脚区域的碱基为20~22个,并且两个π脚区域之间间隔1~2个碱基;所述四级π型探针π中区域的两条序列的碱基为6~8个,且两条序列间有2~4个碱基互补;所述四级π型探针π顶区域的碱基为9~20个,
进一步地,所述信号探针包括信号探针A和信号探针B,所述信号探针A的5’端部分序列与所述四级π型探针的π顶区域互补,所述信号探针A的3’端部分序列与所述信号探针B的3’端部分序列互补;所述信号探针A和所述信号探针B的序列长度均为36~80个碱基。
更进一步地,所述信号探针A和所述信号探针B序列均标记有荧光基团,所述荧光基团选自Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor647、Cy3和Cy5。
在复杂的组织环境中,FISH技术经常面临着检测信号弱和背景噪音高的挑战,而且需要1kb左右核酸序列进行杂交,这极大限制了对短序列检测的应用,如对于一些具有重要功能的miRNA、短核酸序列RNA、短核酸序列DNA和序列差异较小的可变剪切体等。为了解决这一局限性,本发明通过如下技术原理得以实现:
本发明只需要一个核酸探针组便可实现对短核酸序列的检测,实现超强信号放大的同时,又具有效率高、特异性强和背景噪音低等特点,可实现对长、短核酸序列进行定性、定量和定位的检测。一级π型靶标探针和四级π型探针与目标序列杂交,只有当π型探针对的左右两条探针的π脚区域同时结合上目标序列时,才能特异性地实现信号的放大;若单侧探针的π脚区域结合上非特异性序列,随后结合上的探针很容易被洗掉,不能形成荧光信号。因此,该π型探针的设计极大地提高了杂交效率,并降低了背景,随后通过设计的二级探针、三级探针和信号探针的杂交实现信号逐级放大。
本发明设计的π-FISH+核酸探针组可灵活的对长、短核酸序列进行定性、定量和定位的检测;具有信号放大能力强、特异性强、效率高、背景噪音低、低成本等优点;
本发明的第二个目的在于提供上述任一项所述的π-FISH+核酸探针组在核酸原位检测中的应用。
进一步地,所述π-FISH+核酸探针组可检测长、短核酸序列,其中短核酸序列包括短的DNA突变或者缺失、可变剪切体序列、短的RNA序列;所述核酸可选自mRNA、tRNA、rRNA、miRNA、LncRNA、ssDNA、dsDNA、cDNA、和DNA序列;所述核酸序列的长度大于16个碱基。
需要说明的是,如果待检测目标核酸序列的长度少于40个碱基,在第一步杂交之前需要将一条长度为49~59个碱基的单链与目标核酸杂交,之后再将一级π型靶标探针与该单链杂交,接下来依次进行二级探针、三级探针、四级π型探针和信号探针的杂交。
进一步地,所述可变剪切体序列为前列腺癌抗雄激素治疗耐药标志物雄激素受体剪接变体7(ARV7)。
本发明的第三个目的在于提供一种核酸原位检测的试剂盒。
所述试剂盒包括上述任一项所述的π-FISH+核酸探针组。
进一步地,所述试剂盒还包括预杂交液A、预杂交液B、预杂交液C、洗脱缓冲液A、洗脱缓冲液B和洗脱缓冲液C;
所述预杂交液A的配制体系如下:2.5~3mL 20×SSC,2~3mL去离子甲酰胺,600~800μL 3%SDS,100μL 200mM氧钒核糖核苷复合物,1~2g硫酸葡聚糖,1mL Denhardt's溶液,Nuclease-free water补充至10mL;
所述预杂交液B的配制体系如下:2~2.5mL 20×SSC,2~2.5mL去离子甲酰胺,1mL3%SDS,100μL 200mM氧钒核糖核苷复合物,1~2g硫酸葡聚糖,1mL Denhardt's溶液,Nuclease-free water补充至10mL;
所述预杂交液C的配制体系如下:2~2.5mL 20×SSC,1~1.5mL去离子甲酰胺,1mL3%SDS,100μL 200mM氧钒核糖核苷复合物,1~2g硫酸葡聚糖,1mL Denhardt's溶液,Nuclease-free water补充至10mL;
所述洗脱缓冲液A的配制体系如下:1mL 20×SSC,2mL去离子甲酰胺,100μL 3%SDS,Nuclease-free water补充至10mL;
所述洗脱缓冲液B的配制体系如下:500μL 20×SSC,1mL去离子甲酰胺,100μL 3%SDS,Nuclease-free water补充至10mL;
所述洗脱缓冲液C的配制体系如下:100μL 20×SSC,100μL 3%SDS,Nuclease-free water补充至10mL。
本发明的第四个目的在于提供上述任一项所述的试剂盒在核酸原位检测中的应用。
进一步地,所述核酸为前列腺癌循环肿瘤细胞中抗雄激素治疗耐药标志物雄激素受体剪接变体7(ARV7)。
雄激素受体剪切变体有多种类型,由于各剪切变体的序列相似,PCR扩增技术很难将ARV7剪切变体与其它剪切变体区分开来。同时,当前市面上检测ARV7的抗体,特异性低,检测效果参差不齐。为了解决这一局限,本发明开发了一种高效、特异、放大能力强的新型荧光原位杂交方法,可精准地检测ARV7变体,具体原理如图5所示;本发明只需设计两个探针组,第一位置探针组和第二位置的探针组;第一位置的探针组可定位ARV1,ARV2,ARV3,ARV4和ARV7转录本,第二位置的探针组可定位ARV5和ARV7转录本。第一位置探针组和第二位置的探针组的探针用不同的信号探针标记,每一个探针组包括一级π型靶标探针,二级探针,三级探针,四级π型探针和信号探针,这一设计既保证了检测的信号强度,又保证了检测信号的准确性,只有当两个探针组的信号共定位的时候,即为ARV7剪切变体的信号。
本发明的第五个目的在于提供一种用于检测前列腺癌循环肿瘤细胞中抗雄激素治疗耐药标志物雄激素受体剪接变体7(ARV7)的原位杂交方法。
所述原位杂交方法包括如下步骤:
S1、细胞固定:将待检测的前列腺癌循环肿瘤细胞进行固定;
S2、杂交:首先,分别设计第一位置探针组和第二位置探针组,所述第一位置探针组用于定位检测雄激素受体剪接变体1、2、4和7,所述第二位置探针组用于定位检测雄激素受体剪接变体5和7,所述第一位置探针组和所述第二位置探针组均为上述任一项所述的π-FISH+核酸探针组,并且所述第一位置探针组和所述第二位置探针组用不同的信号探针标记;然后将已处理的待检测的前列腺癌循环肿瘤细胞与所述第一位置探针组和所述第二位置探针组在杂交液中逐步杂交;
S3、洗涤:对杂交后的待检测的前列腺癌循环肿瘤细胞进行洗涤;
S4、检测:染色并拍照,观察是否有阳性信号产生;
S5、分析:分析两个探针组共定位的信号。
进一步地,步骤S2中,所述杂交的具体方法如下:
1)第一步杂交:将所述第一位置探针组和所述第二位置探针组中的一级π型靶标探针与待检测的前列腺癌循环肿瘤细胞中的靶核酸序列杂交;
2)第二步杂交:将与所述第一位置探针组和所述第二位置探针组中分别对应的二级探针进一步与对应的所述一级π型靶标探针杂交,放大信号;
3)第三步杂交:将与所述第一位置探针组和所述第二位置探针组中分别对应的三级探针进一步与对应的所述二级探针杂交,进一步放大信号;
4)第四步杂交:将与所述第一位置探针组和所述第二位置探针组中分别对应的四级π型探针与对应的所述三级探针杂交;
5)第五步杂交:将与所述第一位置探针组和所述第二位置探针组中分别对应的信号探针与对应的所述四级π型探针杂交,通过两条信号探针的反复引发杂交,不断延伸,进行信号的再次放大和可视化。
与现有技术相比,本发明具有如下优点:
1)本发明设计的π-FISH+核酸探针组信号放大能力强,只需一个核酸探针组便可实现超强信号放大;同时,兼具特异性高、效率高、背景噪音低等优点;
2)本发明设计的π-FISH+核酸探针组所述二级探针、三级探针、四级π型探针和信号探针是配套探针,用于任何基因的检测,节约成本;
3)本发明可以检测大于16个碱基的核酸序列,可实现对长、短核酸序列定性、定量和定位的检测;
4)本发明设计的π-FISH+核酸探针组可以精准地将ARV7剪切变体与其它剪切变体进行区分,并进行特异性地检测;
5)本发明可应用于mRNA、tRNA、rRNA、miRNA、LncRNA、ssDNA、dsDNA、cDNA、和DNA等多种核酸分子的检测,可助力于临床检测和生物学研究,应用范围广。
附图说明
图1为本发明设计的π-FISH+核酸探针组原理示意图;
图2为本发明实施例1中π-FISH+核酸探针组原位检测HeLa细胞中miR-145的结果;
图3为本发明实施例2中π-FISH+核酸探针组原位检测HeLa细胞中LncRNA(MALAT1)的结果;
图4为本发明实施例3中π-FISH+核酸探针组原位检测HeLa细胞中ACTB基因DNA的结果;
图5为本发明实施例4中检测ARV7剪切变体的第一位置和第二位置探针设计位置的示意图;
图6为本发明实施例4中检测LNCaP细胞中ARV7剪切变体的结果;
图7为本发明实施例4中检测PC-3细胞中ARV7剪切变体的结果;
图8为本发明实施例4中原位检测前列腺癌患者CTCs细胞中ARV7的结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例,基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明所使用的常规试剂和设备,如无特殊说明,均可市售获得。
实施例1π-FISH+核酸探针组原位检测HeLa细胞中miR-145
1.1样品的预处理
①将HeLa细胞培养在无菌的细胞爬片上,24h后弃掉培养基,用1×DEPC-PBS洗2次,每次3min;
②用4%PFA室温固定10min,再用1×DEPC-PBS洗3次,每次5min;
③用0.2M HCl(DEPC-H2O稀释)室温通透细胞5min,用1×DEPC-PBS洗3min;
④5μg/mL蛋白酶K室温处理1min,用1×DEPC-PBS洗5min;
⑤2mg/mL Glycine(1×DEPC-PBS稀释)快洗1次,再5min;
⑥最后用4%PFA再次固定5min,用1×DEPC-PBS洗3次,每次5min;
⑦将上述处理好的样品用于下一步杂交。
1.2杂交步骤:
①向上述已经处理好的细胞样品中加入300μL预杂交液A,40℃孵育10min;再加入终浓度为10nM单链DNA与靶标miR-145杂交,40℃继续孵育4h;弃掉杂交液A,加入500μL洗脱缓冲液A,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液A;然后加入500μL洗脱缓冲液B,振荡洗脱2次,每次5min;所述长单链DNA具体序列如下:
5’GTTAGGGACGCTCGAGCTCGCAGGGATTGGGAGGGATTCCTGGGAAAACTGGACTTG-3’。
②加入300μL含终浓度为10nM的一级π型靶标探针的预杂交液A与步骤①中单链DNA杂交,40℃孵育6-10h;弃掉杂交液A,加入500μL洗脱缓冲液A,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液A;然后加入500μL洗脱缓冲液B,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液B;最后加入500μL洗脱缓冲液C,振荡洗脱3min,弃掉洗脱缓冲液C;所述一级π型靶标探针的序列信息如下所示:
一级π型靶标探针左侧序列:
5’-CAAGTCCAGTTTTCCCAATTCACCTCTTGCTAGCTATCC-3’;
一级π型靶标探针右侧序列:
5’-CCTATCGATCGTTCTGGACTTAGAATCCCTCCCAATCCC-3’。
③将二级探针85℃变性处理2min,然后冰上冷却5min;加入300μL含终浓度为30nM二级探针的预杂交液B与步骤②中一级π型靶标探针杂交,40℃孵育2-3h;弃掉杂交液B,加入500μL洗脱缓冲液A,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液A;然后加入500μL洗脱缓冲液B,振荡洗脱2次,每次5min,弃掉洗脱缓冲液B;最后加入500μL洗脱缓冲液C,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液C;所述二级探针的序列信息如下所示:
中间区域的序列:GGATAGCTAGCAAGTGAACGATCGATAGG;
两端重复区域的序列:AATCGAGCATGCACCGAATTCAGATTCATT;
与三级探针互补配对的结合区域序列:AATCGAGCATGCACCGAATT;
非互补的间隔区域序列:CAGATTCATT。
④将三级探针85℃变性处理2min,然后冰上冷却5min;加入300μL含终浓度为50nM三级探针的预杂交液B与步骤③中二级探针杂交,40℃孵育2-3h;弃掉杂交液B,加入500μL洗脱缓冲液A,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液A;然后加入500μL洗脱缓冲液B,振荡洗脱2次,每次5min,弃掉洗脱缓冲液B;最后加入500μL洗脱缓冲液C,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液C;所述三级探针的序列信息如下所示:
中间区域的序列:AATTCGGTGCATGCTCGATT;
两端重复区域的序列:AACCGATGCATGAAATCGATCAGATTCATT;
与四级π型探针两个脚互补配对区域的序列分别为:
AACCGATGCATGAAATCGATCAGAT;
CATTAACCGATGCATGAAATCGATC;
非互补的间隔区域序列:CAGATTCATT。
⑤加入300μL含终浓度为100nM四级π型探针的预杂交液A与步骤④中三级探针杂交,40℃孵育4h;弃掉杂交液A,加入500μL洗脱缓冲液A,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液A;然后加入500μL洗脱缓冲液B,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液B;最后加入500μL洗脱缓冲液C,振荡洗脱3min,
弃掉洗脱缓冲液C;所述四级π型探针的序列信息如下所示:
四级π型探针左侧序列:5’-CTCTATATCTTATCTGATCGATTTCATGCATCGGTT-3’;
四级π型探针右侧序列:5’-GATCGATTTCATGCATCGGTTAATGTTTCCAACCCG-3’。
⑥将信号探针A和信号探针B于90℃变性处理1-2min,然后自然冷却30min;再加入含终浓度为100nM的信号探针A和信号探针B的预杂交液C与步骤⑤中四级π型探针杂交,40℃孵育12h;弃掉杂交液C,加入500μL洗脱缓冲液B,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液B;再加入500μL洗脱缓冲液C,
振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液C;所述信号探针的序列信息如下所示:
信号探针A序列:5’-CGGGTTGGAGATATAGAGTAATCCCTCTATATCTCC-3’;
信号探针B序列:5’-CTCTATATCTCCAACCCGGGAGATATAGAGGGATTA-3’;
信号探针A和信号探针B均用Alexa Fluor 594荧光修饰。
同时,上述单链DNA、一级π型靶标探针、二级探针、三级探针、四级π型探针、信号探针A和信号探针B均可采用常规方式合成。
⑦DAPI染色2min,再进行70%、85%、100%梯度酒精脱水,最后封片进行显微拍照。结果如图2所示,在只使用一个探针组的情况下便可以检测HeLa细胞中miR-145的表达,结果表明π-FISH+策略对短核酸序列具有很好的检测效果。
其中,预杂交液A、预杂交液B、预杂交液C、洗脱缓冲液A、洗脱缓冲液B和洗脱缓冲液C配制体系如下表1-6所示:
表1预杂交液A配制体系
20×SSC | 2.5~3mL |
去离子甲酰胺 | 2~3mL |
质量分数为3%SDS | 600~800μL |
氧钒核糖核苷复合物(200mM) | 100μL |
硫酸葡聚糖 | 1~2g |
Denhardt's溶液 | 1mL |
Nuclease-free water | 补充至10mL |
表2预杂交液B配制体系
20×SSC | 2~2.5mL |
去离子甲酰胺 | 2~2.5mL |
质量分数为3%SDS | 1mL |
氧钒核糖核苷复合物(200mM) | 100μL |
硫酸葡聚糖 | 1~2g |
Denhardt's溶液 | 1mL |
Nuclease-free water | 补充至10mL |
表3预杂交液C配置体系
20×SSC | 2~2.5mL |
去离子甲酰胺 | 1~1.5mL |
质量分数为3%SDS | 300μL |
氧钒核糖核苷复合物(200mM) | 100μL |
硫酸葡聚糖 | 1~2g |
Denhardt's溶液 | 1mL |
Nuclease-free water | 补充至10mL |
表4洗脱缓冲液A的反应体系
20×SSC | 1mL |
去离子甲酰胺 | 2mL |
质量分数为3%SDS | 100μL |
Nuclease-free water | 补充至10mL |
表5洗脱缓冲液B反应体系
20×SSC | 0.5mL |
去离子甲酰胺 | 1mL |
质量分数为3%SDS | 100μL |
Nuclease-free water | 补充至10mL |
表6洗脱缓冲液C反应体系
20×SSC | 100μL |
质量分数为3%SDS | 100μL |
Nuclease-free water | 补充至10mL |
实施例2π-FISH+核酸探针组原位检测HeLa细胞中LncRNA MALAT1
2.1样品的预处理
HeLa细胞的处理同实施例1步骤1.1中的步骤一致。
2.2杂交步骤
①向上述已经处理好的细胞样品中加入300μL预杂交液A,40℃孵育10min;再加入300μL含终浓度为10nM的一级π型靶标探针的预杂交液A与靶标MALAT1杂交,40℃孵育8-10h;弃掉杂交液A,加入500μL洗脱缓冲液A,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液A;然后加入500μL洗脱缓冲液B,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液B;最后加入500μL洗脱缓冲液C,振荡洗脱3min,弃掉洗脱缓冲液C;所述一级π型靶标探针的序列信息如下所示:
一级π型靶标探针左侧序列:
5’-CCTATCGATCGTTCTGGACTTATTACAAAACGAATTCAGGGTGAGGA-3’;
一级π型靶标探针右侧序列:
5’-CTCAGTTACACATCCAAACTCTACAATTCACCTCTTGCTAGCTATCC-3’。
②将二级探针85℃变性处理2min,然后冰上冷却5min;加入300μL含终浓度为30nM二级探针的预杂交液B与步骤①中一级π型靶标探针杂交,40℃孵育2-3h;弃掉杂交液B,加入500μL洗脱缓冲液A,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液A;然后加入500μL洗脱缓冲液B,振荡洗脱2次,每次5min,弃掉洗脱缓冲液B;最后加入500μL洗脱缓冲液C,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液C;所述二级探针的序列信息如下所示:
中间区域的序列:GGATAGCTAGCAAGTGAACGATCGATAGG;
两端重复区域的序列:AATCGAGCATGCACCGAATTCAGATTCATT;
与三级探针互补配对的结合区域序列:AATCGAGCATGCACCGAATT;
非互补的间隔区域序列:CAGATTCATT。
③将三级探针85℃变性处理2min,然后冰上冷却5min;加入300μL含终浓度为50nM三级探针的预杂交液B与步骤②中二级探针杂交,40℃孵育2-3h;弃掉杂交液B,加入500μL洗脱缓冲液A,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液A;然后加入500μL洗脱缓冲液B,振荡洗脱2次,每次5min,弃掉洗脱缓冲液B;最后加入500μL洗脱缓冲液C,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液C;所述三级探针的序列信息如下所示:
中间区域的序列:AATTCGGTGCATGCTCGATT;
两端重复区域的序列:AACCGATGCATGAAATCGATCAGATTCATT;
与四级π型探针两个脚互补配对区域的序列分别为:
AACCGATGCATGAAATCGATCAGAT;
CATTAACCGATGCATGAAATCGATC;
非互补的间隔区域序列:CAGATTCATT。
④加入300μL含终浓度为100nM四级π型探针的预杂交液A与步骤③中三级探针杂交,40℃孵育4h;弃掉杂交液A,加入500μL洗脱缓冲液A,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液A;然后加入500μL洗脱缓冲液B,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液B;最后加入500μL洗脱缓冲液C,振荡洗脱3min,
弃掉洗脱缓冲液C;所述四级π型探针的序列信息如下所示:
四级π型探针左侧序列:5’-CTCTATATCTTATCTGATCGATTTCATGCATCGGTT-3’;
四级π型探针右侧序列:5’-GATCGATTTCATGCATCGGTTAATGTTTCCAACCCG-3’。
⑤将信号探针A和信号探针B于90℃变性处理1-2min,然后自然冷却30min;再加入含终浓度为100nM的信号探针A和信号探针B的预杂交液C与步骤④中四级π型探针杂交,40℃孵育12h;弃掉杂交液C,加入500μL洗脱缓冲液B,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液B;再加入500μL洗脱缓冲液C,
振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液C;所述信号探针的序列信息如下所示:
信号探针A序列:5’-CGGGTTGGAGATATAGAGTAATCCCTCTATATCTCC-3’;
信号探针B序列:5’-CTCTATATCTCCAACCCGGGAGATATAGAGGGATTA-3’;
信号探针A和信号探针B均用Alexa Fluor 594荧光修饰。
同时,上述一级π型靶标探针、二级探针、三级探针、四级π型探针、信号探针A和信号探针B均可采用常规合成。
⑥DAPI染色2min,再进行70%、85%、100%梯度酒精脱水,最后封片进行显微拍照。结果如图3所示,在只使用一个探针组的情况下便可以检测HeLa细胞中MALAT1基因mRNA的表达,结果表明π-FISH+策略同样可以检测长核酸序列,在保证信号的特异性的同时,具有很强的信号放大能力。
另外,本实施例所述的预杂交液和洗脱缓冲液体系与实施例1相同。
实施例3π-FISH+核酸探针组原位检测HeLa细胞中ACTB基因DNA位点
3.1样品的预处理
前①~⑥步同实施例1步骤1.1中的步骤一致,还需要进行下面的步骤:
⑦将细胞用100μg/mL RNase A于37℃消化1h,再用2×SSC洗3遍,每次2min;
⑧置于70%去离子甲酰胺溶液中72℃变性10min,然后迅速置于冰浴冷的70%、85%、100%乙醇中,依次1min;
⑨最后用2×SSC洗脱2min,用于下一步杂交。
3.2杂交步骤:
①向上述已经处理好的细胞样品中加入300μL预杂交液A,40℃孵育10min;再加入300μL含终浓度为10nM的一级π型靶标探针的预杂交液A与靶标ACTB基因DNA位点杂交,40℃孵育8-10h;弃掉杂交液A,加入500μL洗脱缓冲液A,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液A;然后加入500μL洗脱缓冲液B,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液B;最后加入500μL洗脱缓冲液C,振荡洗脱3min,弃掉洗脱缓冲液C;所述一级π型靶标探针的序列信息如下所示:
一级π型靶标探针左侧序列:
5’-CCCTAGGCACCAGGTAAGTGACCTATTCACCTCTTGCTAGCTATCC-3’;
一级π型靶标探针右侧序列:
5’-CCTATCGATCGTTCTGGACTTATTACTTTGGGAGTGGCAAGCCTGG-3’。
②将二级探针85℃变性处理2min,然后冰上冷却5min;加入300μL含终浓度为30nM二级探针的预杂交液B与步骤①中一级π型靶标探针杂交,40℃孵育2-3h;弃掉杂交液B,加入500μL洗脱缓冲液A,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液A;然后加入500μL洗脱缓冲液B,振荡洗脱2次,每次5min,弃掉洗脱缓冲液B;最后加入500μL洗脱缓冲液C,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液C;所述二级探针的序列信息如下所示:
中间区域的序列:GGATAGCTAGCAAGTGAACGATCGATAGG;
两端重复区域的序列:AATCGAGCATGCACCGAATTCAGATTCATT;
与三级探针互补配对的结合区域序列:AATCGAGCATGCACCGAATT;
非互补的间隔区域序列:CAGATTCATT。
③将三级探针85℃变性处理2min,然后冰上冷却5min;加入300μL含终浓度为50nM三级探针的预杂交液B与步骤②中二级探针杂交,40℃孵育2-3h;弃掉杂交液B,加入500μL洗脱缓冲液A,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液A;然后加入500μL洗脱缓冲液B,振荡洗脱2次,每次5min,弃掉洗脱缓冲液B;最后加入500μL洗脱缓冲液C,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液C;所述三级探针的序列信息如下所示:
中间区域的序列:AATTCGGTGCATGCTCGATT;
两端重复区域的序列:AACCGATGCATGAAATCGATCAGATTCATT;
与四级π型探针两个脚互补配对区域的序列分别为:
AACCGATGCATGAAATCGATCAGAT;
CATTAACCGATGCATGAAATCGATC;
非互补的间隔区域序列:CAGATTCATT。
④加入300μL含终浓度为100nM四级π型探针的预杂交液A与步骤③中三级探针杂交,40℃孵育4h;弃掉杂交液A,加入500μL洗脱缓冲液A,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液A;然后加入500μL洗脱缓冲液B,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液B;最后加入500μL洗脱缓冲液C,振荡洗脱3min,
弃掉洗脱缓冲液C;所述四级π型探针的序列信息如下所示:
四级π型探针左侧序列:5’-CTCTATATCTTATCTGATCGATTTCATGCATCGGTT-3’;
四级π型探针右侧序列:5’-GATCGATTTCATGCATCGGTTAATGTTTCCAACCCG-3’。
⑤将信号探针A和信号探针B于90℃变性处理1-2min,然后自然冷却30min;再加入含终浓度为100nM的信号探针A和信号探针B的预杂交液C与步骤④中四级π型探针杂交,40℃孵育12h;弃掉杂交液C,加入500μL洗脱缓冲液B,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液B;再加入500μL洗脱缓冲液C,
振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液C;所述信号探针的序列信息如下所示:
信号探针A序列:5’-CGGGTTGGAGATATAGAGTAATCCCTCTATATCTCC-3’;
信号探针B序列:5’-CTCTATATCTCCAACCCGGGAGATATAGAGGGATTA-3’;
信号探针A和信号探针B均用Alexa Fluor 488荧光修饰。
同时,上述一级π型靶标探针、二级探针、三级探针、四级π型探针、信号探针A和信号探针B均可采用常规合成。
⑥DAPI染色2min,再进行70%、85%、100%梯度酒精脱水,最后封片进行显微拍照。结果如图3所示,结果如图4所示,在细胞核中有两个明显的信号点产生,说明π-FISH+可以很好的检测出HeLa细胞ACTB基因的DNA位点。
另外,本实施例中对于DNA的检测所述的预杂交液和洗脱缓冲液体系与实施例1相同,唯一不同之处是不需要用无RNA酶的试剂进行杂交和洗涤。
实施例4π-FISH+核酸探针组用于检测前列腺癌循环肿瘤细胞中雄激素受体剪接变体7的应用测试
由于前列腺癌循环肿瘤细胞中的雄激素受体剪切变体有多种类型,包括ARV1、ARV2、ARV4、ARV5和ARV7,不同的AR系列剪切变体序列相似性高。因此,使用现有的技术很难将ARV7与其它剪切变体区分开来。而本发明所述的π-FISH+核酸探针组不受核酸序列长度的限制,可实现对长、短核酸序列的自由检测,信号放大能力强,检测效率高,因此,可以将π-FISH+核酸探针组用于前列腺癌循环肿瘤细胞中ARV7的检测。为验证π-FISH+技术检测ARV7的能力,首先在前列腺癌细胞系LNCaP(ARV7阳性)和PC-3(ARV7阴性)中验证其准确性,然后在前列腺癌患者CTCs中进一步确定其检测效果。
下面将结合具体的应用实施例进行详细的说明。
4.1π-FISH+核酸探针组原位检测前列腺癌细胞系LNCaP和PC-3中ARV7mRNA的表达
4.1.1样品的预处理
LNCaP和PC-3细胞的处理同实施例1步骤1.1中的步骤一致。
4.1.2杂交步骤
①向上述已经处理好的LNCaP和PC-3细胞样品中分别加入300μL预杂交液A,40℃孵育10min;再加入终浓度各为10nM第一位置和第二位置对应的一级π型靶标探针的预杂交液A于40℃孵育8-10h;弃掉杂交液A,加入500μL洗脱缓冲液A,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液A;然后加入500μL洗脱缓冲液B,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液B;最后加入500μL洗脱缓冲液C,振荡洗脱3min,弃掉洗脱缓冲液C;所述第一位置和第二位置对应的一级π型靶标探针的序列信息如下所示:
第一位置一级π型靶标探针左侧序列:
5’-AATCCGATTGGAACTGGACTTAGCAGTCTCCAAACGCATGTCCC-3’;
第一位置一级π型靶标探针右侧序列:
5’-GTCAATGGGCAAAACATGGTCCCTATTCACCTCAAGGTTAGCCTAA-3’;
第二位置一级π型靶标探针左侧序列:
5’-GTTAGGGACGCTCGTGGACTTATCTGGTCCTTGTTTACTGAACTTCT-3’;
第二位置一级π型靶标探针右侧序列:
5’-GGCTTCTTCTCCTGGAGAAGCAGAAATTCACCTGCTCGCAGGGATTG-3’。
②将第一位置和第二位置对应的二级探针85℃变性处理2min,然后冰上冷却5min;加入300μL含终浓度为30nM上述第一位置和第二位置对应的二级探针的预杂交液B与步骤①中一级π型靶标探针杂交,40℃孵育2-3h;弃掉杂交液B,加入500μL洗脱缓冲液A,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液A;然后加入500μL洗脱缓冲液B,振荡洗脱2次,每次5min,弃掉洗脱缓冲液B;最后加入500μL洗脱缓冲液C,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液C;所述第一位置和第二位置对应的二级探针的序列信息如下所示:
所述第一位置二级探针的中间区域的序列:TTAGGCTAACCTTGTGTTCCAATCGGATT;
两端重复区域的序列:AATCGAGCATGCACCGAATTCAGATTCATT;
与第一位置三级探针互补配对的结合区域序列:AATCGAGCATGCACCGAATT;
非互补的间隔区域序列:CAGATTCATT;
所述第二位置二级探针的中间区域的序列:CAATCCCTGCGAGCTCGAGCGTCCCTAAC;
两端重复区域的序列:GGTTCATGACCATGACCATTCAGATTCATT;
与第二位置三级探针互补配对的结合区域序列:GGTTCATGACCATGACCATT;
非互补的间隔区域序列:CAGATTCATT。
③将第一位置和第二位置对应的三级探针85℃变性处理2min,然后冰上冷却5min;加入300μL含终浓度为50nM上述第一位置和第二位置对应的三级探针的预杂交液B与步骤②中二级探针杂交,40℃孵育2-3h;弃掉杂交液B,加入500μL洗脱缓冲液A,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液A;然后加入500μL洗脱缓冲液B,振荡洗脱2次,每次5min,弃掉洗脱缓冲液B;最后加入500μL洗脱缓冲液C,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液C;
所述第一位置和第二位置对应的三级探针的序列信息如下所示:
所述第一位置三级探针中间区域序列:AATTCGGTGCATGCTCGATT;
两端重复区域中的序列:AACCGATGCATGAAATCGATCAGATTCATT;
与第一位置四级π型探针两个脚互补配对区域的序列分别为:
AACCGATGCATGAAATCGATCAGAT
CATTAACCGATGCATGAAATCGATC;
所述第二位置三级探针中间区域序列:AATGGTCATGGTCATGAACC;
两端重复区域中的序列:AATTGAGTCATTAGCCATGCAGATTCATT;
与第二位置四级π型探针两个脚互补配对区域的序列分别为:
AATTGAGTCATTAGCCATGCAGATT;
ATTAATTGAGTCATTAGCCATGCAG。
④加入300μL含终浓度为100nM第一位置和第二位置对应的四级π型探针的预杂交液A与步骤③中三级探针杂交,40℃孵育4h;弃掉杂交液A,加入500μL洗脱缓冲液A,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液A;然后加入500μL洗脱缓冲液B,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液B;最后加入500μL洗脱缓冲液C,振荡洗脱3min,弃掉洗脱缓冲液C;所述第一位置和第二位置对应的四级π型探针的序列信息如下所示:
第一位置四级π型探针左侧序列:
5’-CAGCAAACGTTATCTGATCGATTTCATGCATCGGTT-3’;
第一位置四级π型探针右侧序列:
5’-GATCGATTTCATGCATCGGTTAATGTTGGATTTACG-3’;
第二位置四级π型探针左侧序列:
5’-ATCCTCATCTTAATCTGCATGGCTAATGACTCAATT-3’;
第二位置四级π型探针右侧序列:
5’-CTGCATGGCTAATGACTCAATTAATTTAATACCgCC-3’。
⑤将第一位置和第二位置对应的信号探针A和信号探针B于90℃变性处理1-2min,然后自然冷却30min;再加入含终浓度为100nM上述第一位置和第二位置探针组中对应的信号探针A和信号探针B的预杂交液C与步骤④中四级π型探针杂交,40℃孵育12h;弃掉杂交液C,加入500μL洗脱缓冲液B,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液B;再加入500μL洗脱缓冲液C,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液C;所述第一位置和第二位置对应的信号探针的序列信息如下所示:
第一位置信号探针A序列:
5’-CGTAAATCCCGTTTGCTGTTTCTTCAGCAAACGGGA-3’;
第一位置信号探针B序列:
5’-CAGCAAACGGGATTTACGTCCCGTTTGCTGAAGAAA-3’;
第二位置信号探针A序列:
5’-GGCGGTATTGATGAGGATGTCCATATCCTCATCAAT-3’;
第二位置信号探针B序列:
5’-ATCCTCATCAATACCGCCATTGATGAGGATATGGAC-3’;
第一位置的信号探针A和信号探针B用Alexa Fluor 647荧光修饰,第二位置的信号探针A和信号探针B用Alexa Fluor 594荧光修饰。
同时,上述第一位置一级π型靶标探针、第二位置一级π型靶标探针、第一位置二级探针、第二位置二级探针、第一位置三级探针、第二位置三级探针、第一位置四级π型探针、第二位置四级π型探针、第一位置信号探针A、第一位置信号探针B、第二位置信号探针A、第二位置信号探针B均可采用常规方式合成。
⑥DAPI染色2min,再进行70%、85%、100%梯度酒精脱水,最后封片进行显微拍照。结果如图6和图7所示,图6所示的LNCaP细胞系为已经建立好的商品化前列腺癌症患者的细胞系,并有ARV7剪切变体的表达;图7所示的PC-3细胞系是已经建立好的商品化前列腺癌症患者的细胞系(作为对照细胞系),几乎没有ARV7剪切变体的表达。从本发明提供的原位杂交检测ARV7可变剪切体的结果可以看出,在LNCaP细胞系中,有大量的ARV7剪切变体,而在PC-3细胞系中,几乎没有ARV7剪切变体,表明本发明可以精确、特异地检测出ARV7剪切变体。
另外,本实施例所述的预杂交液和洗脱缓冲液体系与实施例1相同。
4.2π-FISH+核酸探针组原位检测前列腺癌循环肿瘤细胞(CTCs)中ARV7 mRNA的表达
4.2.1样本的预处理
①将从前列腺癌症患者血液中分离到的CTCs细胞,立即加入4%PFA室温固定15min,再用1×DEPC-PBS洗3次,每次5min;
②用70%,85%和100%酒精梯度脱水,每个梯度3min;
③1×DEPC-PBS洗3min;
④用0.2M HCl室温通透细胞5min,用1×DEPC-PBS洗3min;
⑤5μg/mL蛋白酶K室温处理1min,用1×DEPC-PBS洗5min;
⑥2mg/mL Glycine(1×DEPC-PBS稀释)快洗1次,再5min;
⑦最后用4%PFA再次固定5min,用1×DEPC-PBS洗3次,每次5min;
⑧将上述处理好的样品用于下一步杂交。
4.2.2杂交步骤
①向上述已经处理好的CTCs细胞中加入300μL预杂交液A,40℃孵育10min;再加入终浓度各为10nM第一位置和第二位置对应的一级π型靶标探针的预杂交液A于40℃孵育8-10h;弃掉杂交液A,加入500μL洗脱缓冲液A,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液A;然后加入500μL洗脱缓冲液B,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液B;最后加入500μL洗脱缓冲液C,振荡洗脱3min,弃掉洗脱缓冲液C;
②将第一位置和第二位置对应的二级探针85℃变性处理2min,然后冰上冷却5min;加入300μL含终浓度为30nM上述第一位置和第二位置对应的二级探针的预杂交液B与步骤①中一级π型靶标探针杂交,40℃孵育2-3h;弃掉杂交液B,加入500μL洗脱缓冲液A,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液A;然后加入500μL洗脱缓冲液B,振荡洗脱2次,每次5min,弃掉洗脱缓冲液B;最后加入500μL洗脱缓冲液C,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液C;
③将第一位置和第二位置对应的三级探针85℃变性处理2min,然后冰上冷却5min;加入300μL含终浓度为50nM上述第一位置和第二位置对应的三级探针的预杂交液B与步骤②中二级探针杂交,40℃孵育2-3h;弃掉杂交液B,加入500μL洗脱缓冲液A,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液A;然后加入500μL洗脱缓冲液B,振荡洗脱2次,每次5min,弃掉洗脱缓冲液B;最后加入500μL洗脱缓冲液C,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液C;
④加入300μL含终浓度为100nM第一位置和第二位置对应的四级π型探针的预杂交液A与步骤③中三级探针杂交,40℃孵育4h;弃掉杂交液A,加入500μL洗脱缓冲液A,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液A;然后加入500μL洗脱缓冲液B,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液B;最后加入500μL洗脱缓冲液C,振荡洗脱3min,弃掉洗脱缓冲液C;
⑤将第一位置和第二位置对应的信号探针A和信号探针B于90℃变性处理1-2min,然后自然冷却30min;再加入含终浓度为100nM上述第一位置和第二位置探针组中对应的信号探针A和信号探针B的预杂交液C与步骤④中四级π型探针杂交,40℃孵育12h;弃掉杂交液C,加入500μL洗脱缓冲液B,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液B;再加入500μL洗脱缓冲液C,振荡洗脱5min,弃掉洗脱缓冲液C;
⑥DAPI染色2min,再进行70%、85%、100%梯度酒精脱水,最后封片进行显微拍照。结果如图8所示,上图为两个探针组检测CTCs细胞中ARV7剪切变体mRNA的荧光原位杂交原图;下图为通过原位杂交原图解析每种荧光信号的空间分布,以及共定位分析ARV7表达的解析图。从图中可以看出,在前列腺癌患者CTCs细胞中有明显的ARV7剪切变体的表达。结果进一步证明本发明中的新型荧光原位杂交技术具有很强的实用性,可用于临床前列腺癌雄激素治疗耐药性的诊断。
另外,本实施例所述的预杂交液和洗涤缓冲液体与实施例1相同。同时,实施例所述的第一位置一级π型靶标探针、第二位置一级π型靶标探针、第一位置二级探针、第二位置二级探针、第一位置三级探针、第二位置三级探针、第一位置四级π型探针、第二位置四级π型探针、第一位置信号探针A、第一位置信号探针B、第二位置信号探针A、第二位置信号探针B与实施例4.1相同。以上实施例,仅为本发明的具体实施方式,用以说明本发明的技术方案,而非对其限制,本发明的保护范围并不局限于此,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改或可轻易想到变化,或者对其中部分技术特征进行等同替换,而这些修改、变化或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (15)
1.一种π-FISH+核酸探针组,其特征在于,包括一级π型靶标探针、二级探针、三级探针、四级π型探针和信号探针;其中,
所述一级π型靶标探针由左右两条探针组成,形成π型结构;所述一级π型靶标探针包括三个区域,分别为π脚区域、π中区域和π顶区域,所述π脚区域的两个脚均与靶标序列互补;
所述二级探针包括3’端和5’端序列区域以及中间序列区域,所述3’端和5’端序列区域均间隔与多个三级探针互补,所述二级探针的中间序列区域与所述一级π型靶标探针的π顶区域互补;
所述三级探针包括3’端和5’端序列区域以及中间序列区域,所述3’端和5’端序列区域均间隔与多个四级π型探针互补,所述三级探针中间序列区域与所述二级探针3’端和5’端序列区域互补;
所述四级π型探针由左右两条探针组成,形成π型结构,所述四级π型探针包括三个区域,分别为π脚区域、π中区域和π顶区域,所述三级探针3’端和5’端序列区域均间隔与对应所述四级π型探针的两个π脚区域互补;所述四级π型探针的π顶区域与信号探针序列互补。
2.根据权利要求1所述的π-FISH+核酸探针组,其特征在于,所述一级π型靶标探针的两个π脚区域碱基为16~25个,并且两个π脚区域之间间隔1~2个碱基;所述一级π型靶标探针π中区域的两条序列碱基为6~8个,且两条序列间有2~4个碱基互补;所述一级π型靶标探针π顶区域碱基为12~16个。
3.根据权利要求1所述的π-FISH+核酸探针组,其特征在于,所述四级π型探针两个π脚区域的碱基为20~22个,并且两个π脚区域之间间隔1~2个碱基;所述四级π型探针π中区域的两条序列的碱基为6~8个,且两条序列间有2~4个碱基互补;所述四级π型探针π顶区域的碱基为9~20个。
4.根据权利要求1所述的π-FISH+核酸探针组,其特征在于,所述信号探针包括信号探针A和信号探针B,所述信号探针A的5’端部分序列与所述四级π型探针的π顶区域互补,所述信号探针A的3’端部分序列与所述信号探针B的3’端部分序列互补;所述信号探针A和所述信号探针B的序列长度均为36~80个碱基。
5.根据权利要求4所述的π-FISH+核酸探针组,其特征在于,所述信号探针A和所述信号探针B序列均标记有荧光基团,所述荧光基团选自Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 647、Cy3和Cy5。
6.权利要求1~5任一项所述的π-FISH+核酸探针组在非诊断为目的的核酸原位检测中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述π-FISH+核酸探针组为两组,为采用不同信号探针标记的第一位置探针组和第二位置探针组,第一位置探针组定位ARV1,ARV2,ARV3,ARV4和 ARV7转录本,第二位置探针组定位ARV5和ARV7转录本。
8.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述π-FISH+核酸探针组检测长、短核酸序列,其中短核酸序列包括短的DNA突变或者缺失、可变剪切体序列、短的RNA序列;所述核酸选自mRNA、tRNA、rRNA、miRNA、LncRNA和DNA序列;所述核酸序列的长度大于16个碱基。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述核酸序列选自ssDNA、dsDNA序列。
10.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述核酸序列为cDNA序列。
11.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述可变剪切体序列为前列腺癌抗雄激素治疗耐药标志物雄激素受体剪接变体7(ARV7)。
12.一种核酸原位检测的试剂盒,其特征在于,包括权利要求1~5任一项所述的π-FISH+核酸探针组。
13.根据权利要求12所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括预杂交液A、预杂交液B、预杂交液C、洗脱缓冲液A、洗脱缓冲液B和洗脱缓冲液C;
所述预杂交液A的配制体系如下: 2.5~3 mL 20×SSC, 2~3 mL去离子甲酰胺,600~800μL 3% SDS,100 μL 200 mM氧钒核糖核苷复合物,1~2 g硫酸葡聚糖,1 mL Denhardt's 溶液,Nuclease-free water补充至10 mL;
所述预杂交液B的配制体系如下: 2~2.5 mL 20×SSC, 2~2.5 mL去离子甲酰胺,1 mL3% SDS,100 μL 200 mM氧钒核糖核苷复合物,1~2 g硫酸葡聚糖,1 mL Denhardt's 溶液,Nuclease-free water补充至10 mL;
所述预杂交液C的配制体系如下: 2~2.5 mL 20×SSC, 1~1.5 mL去离子甲酰胺,1 mL3% SDS,100 μL 200 mM氧钒核糖核苷复合物,1~2 g硫酸葡聚糖,1 mL Denhardt's 溶液,Nuclease-free water补充至10 mL;
所述洗脱缓冲液A的配制体系如下: 1 mL 20×SSC,2 mL去离子甲酰胺,100 μL 3%SDS,Nuclease-free water补充至10 mL;
所述洗脱缓冲液B的配制体系如下: 500 μL 20×SSC,1 mL去离子甲酰胺,100 μL 3%SDS,Nuclease-free water补充至10 mL;
所述洗脱缓冲液C的配制体系如下: 100 μL 20×SSC, 100 μL 3% SDS,Nuclease-free water补充至10 mL。
14.权利要求12或13所述的试剂盒在非诊断为目的的核酸原位检测中的应用。
15.根据权利要求14所述的应用,其特征在于,所述核酸为前列腺癌抗雄激素治疗耐药标志物雄激素受体剪接变体7(ARV7)。
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