CN113337579B

CN113337579B - 一种检测样品中一种或多种靶核酸的存在或其水平的方法

Info

Publication number: CN113337579B
Application number: CN202110521332.4A
Authority: CN
Inventors: 刘玲; 黄丽华; 柯荣秦
Original assignee: Xiamen Xianneng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Xiamen Xianneng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-05-13
Filing date: 2021-05-13
Publication date: 2022-08-12
Anticipated expiration: 2041-05-13
Also published as: CN113337579A; WO2022237335A1

Abstract

本发明涉及一种检测样品中一种或多种靶核酸的存在或其水平的方法，还涉及一种探针组以及包含一个或多个所述探针组的试剂盒。本申请的探针组和检测方法能够减少检测所用的探针个数，同时缩短了检测时间，降低了酶的用量，还能够检测较短的靶核酸。

Description

一种检测样品中一种或多种靶核酸的存在或其水平的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测样品中一种或多种靶核酸的存在或其水平的方法，还涉及一种探针组以及包含一个或多个所述探针组的试剂盒。

背景技术

近年来单细胞研究的成果向我们揭示了单个细胞的基因表达水平与其周围细胞群体的平均表达水平存在极大的差异，即组织中存在细胞群体的表达异质性。而RNA的表达水平及其组织中的定位，往往与细胞和组织的生长发育调控有着密切的关系。所以，为了在保留空间位置信息的同时能更好地了解基因的功能及其调控网络，对RNA进行定量检测就显得意义重大。

以往传统的原位杂交可对RNA实现原位检测，但由于此方法的反应产物为小分子或沉淀物，在环境中极易扩散开甚至脱离检测探针，因此在精确定位目标分子的具体位置方面还存在一些问题，同时传统方法由于制备探针的过程复杂，缺乏一定灵敏度和特异性，在科研和诊断实验室中一直未能受到广泛使用。

随后发展起来的单分子荧光原位杂交在一定程度上解决了上述原位杂交所存在的问题，该方法基于的检测思路主要是在单条RNA上杂交多条带有多个荧光基团标记的检测探针，或者是在单条RNA上杂交大量带有单个荧光基团标记的检测探针。这种方法尽管能利用荧光基团数量的线性累积，来达到一定强度的检测阈值，但是受到可用于标记的不同荧光基团之间光谱重叠的限制，此方法能同时检测到的RNA数量十分有限。同时，在组织中进行基于该方法的多重检测通常会受到背景荧光及光散射的干扰，因此也都限制了该方法在RNA高度多重检测方面中的应用。

单细胞测序技术的发展更是推动了这一需求，但是，其仅能提供关于细胞群体异质性的信息，而缺乏对RNA确切细胞种类来源和位置信息的准确判断。因此，迫切需要一种既能定量分析RNA表达丰度，又能实现原位检测的技术手段。

发明内容

本申请通过独特设计的v型探针/c型探针和锁式探针，实现了特异性检测靶核酸的存在或其水平。本申请的检测方法或探针组可以与荧光显微镜或流式细胞术相结合，以同时分析大量细胞中的多个靶核酸(例如，1个，5个，10个，15个，20个，50个，100个或更多)。

因此，在第一方面，本申请提供了一种检测样品中一种或多种靶核酸的存在或其水平的方法，所述方法包括：

(a)提供怀疑含有一种或多种靶核酸的检测样品，并且，针对每一种靶核酸，提供至少1个(例如，至少2个，至少3个，至少5个，或更多个)探针组，所述探针组包括第一探针、第二探针、锁式探针和检测探针；

其中，所述第一探针的序列包含：(i)与锁式探针特异性结合的第一互补序列；(ii)与所述靶核酸特异性结合的第一靶结合序列；(ii)任选地，用于连接第一互补序列和第一靶结合序列的第一连接序列；

所述第二探针的序列从5’至3’方向包含：(i)与所述靶核酸特异性结合的第二靶结合序列；(ii)与锁式探针特异性结合的第二互补序列；(iii)任选地，用于连接第二靶结合序列和第二互补序列的第二连接序列；

所述锁式探针为单链核酸，其包含：(i)骨架序列和(ii)检测探针序列；在允许杂交或退火的条件下，所述锁式探针能够与第一探针的第一互补序列以及第二探针的第二互补序列杂交或退火，形成带有一个缺口的环状多核苷酸；

所述检测探针包含可检测的标记和所述检测探针序列或其片段；

(b)在允许连接酶连接核酸缺口的条件下，使所述检测样品与所述第一探针、第二探针和锁式探针、连接酶接触；

(c)在允许扩增的条件下，使用扩增酶对步骤b的产物进行滚环扩增；

(d)在允许杂交或退火的条件下，将前一步骤的产物与检测探针接触，并且，检测与所述产物结合的检测探针的信号；

(e)根据检测探针的信号的存在或水平，确定检测样品中靶核酸的存在或其水平。

在某些实施方案中，所述第一连接序列不与靶核酸或锁式探针结合。在某些实施方案中，所述第一靶结合序列位于所述第一互补序列的上游或者下游。

在某些实施方案中，所述第二连接序列不与靶核酸或锁式探针结合。

在某些实施方案中，所述第一靶结合序列位于所述第一互补序列的上游。在某些优选的实施方案中，所述第一探针从5’至3’方向包含第一靶结合序列，第一连接序列和第一互补序列。在某些优选的实施方案中，所述第二探针从5’至3’方向包含第二靶结合序列，第二连接序列和第二互补序列。在此类实施方案中，所述第一探针与第二探针形成类似于“双c”的结构，因此在本文的某些实施方案中称为“c型探针”。

在某些实施方案中，所述第一靶结合序列位于所述第一互补序列的下游。在某些优选的实施方案中，所述第一探针从5’至3’方向包含第一互补序列，第一连接序列和第一靶结合序列。在某些优选的实施方案中，所述第二探针从5’至3’方向包含第二靶结合序列，第二连接序列和第二互补序列。在此类实施方案中，所述第一探针与第二探针形成类似于“v型”的结构，因此在本文的某些实施方案中称为“v型探针”。

在某些实施方案中，在步骤(b)中，使检测样品与第一探针、第二探针和锁式探针接触。若所述检测样品含有至少一种待测的靶核酸，则探针组中的第一探针的第一靶结合序列与第二探针的第二靶结合序列分别与靶核酸杂交或退火。随后，锁式探针与第一探针的第一互补序列以及第二探针的第二互补序列杂交或退火，并形成带有一个缺口的环状多核苷酸。在允许连接酶连接核酸缺口的条件下，所述锁式探针以第一探针的第一互补序列或者第二探针的第二互补序列为模板，形成环状DNA。

在某些实施方案中，所述锁式探针以第一探针的第一互补序列为模板，此时，锁式探针的骨架序列位于检测探针序列的上游。在某些实施方案中，所述锁式探针以第二探针的第二互补序列为模板，此时，锁式探针的检测探针序列位于骨架序列的上游。

在此类实施方案中，所述锁式探针为单条多核苷酸链，并且，锁式探针在与第一探针和第二探针杂交或退火后，形成带有一个缺口的环状多核苷酸。所述单条多核苷酸链与多条(例如，2个，3个，4个，5个，或更多更)多核苷酸链相比，能够更好的与靶核酸特异性结合，减少与非特异性靶核酸结合的几率，使检测结果中的背景检出低并获得较高的信噪比。

在某些实施方案中，在步骤(c)中，在允许扩增的条件下，以所述环状DNA为模板，以第二互补序列作为扩增引物，使用核酸聚合酶对步骤(b)的产物进行滚环扩增，以获得滚环扩增产物，并且，所述滚环扩增产物含有至少一个(例如，2个，3个，4个，5个，10个，15个，20个或更多个)与检测探针序列互补的序列。

在某些实施方案中，在步骤(d)中，在允许杂交或退火的条件下，将前一步骤的产物与检测探针接触，并检测与所述产物结合的检测探针的信号。

在某些实施方案中，在步骤(e)中，根据检测探针的信号的存在或水平，确定检测样品中靶核酸的存在或其水平。可通过多种方式确定检测探针的信号的存在或水平，例如通过纳米SIM，流式/质量细胞术，荧光显微镜等。

在某些实施方案中，所述第一探针的第一互补序列与所述锁式探针的第一区域杂交，且所述第二探针的第二互补序列与所述锁式探针的第二区域杂交，并且，所述第一区域与所述第二区域之间含有间隔序列。

在某些实施方案中，所述间隔序列的长度为0-30nt(例如，0-5nt，5-10nt，10-15nt，15-20nt，20-25nt，25-30nt)。

在某些实施方案中，所述间隔序列的长度为0-10nt(例如，0nt，3nt，5nt，8nt，10nt)。

在某些实施方案中，所述第一靶结合序列与第二靶结合序列在所述靶核酸上间隔0-30nt(例如，0-5nt，5-10nt，10-15nt，15-20nt，20-25nt，25-30nt)。

在某些实施方案中，所述第一靶结合序列与第二靶结合序列在所述靶核酸上间隔0-10nt(例如，0nt，3nt，5nt，8nt，10nt)。

在某些实施方案中，所述检测样品选自单细胞，细胞群，组织，器官，或其任何组合。在某些实施方案中，预处理所述检测样品。在某些实施方案中，所述预处理选自细胞透化，核酸提取，纯化，富集。

在某些实施方案中，所述靶核酸为DNA和/或RNA。在一些实施方案中，所述靶核酸是编码RNA(例如mRNA)。在一些实施方案中，所述靶核酸是非编码RNA(例如tRNA，rRNA，microRNA(miRNA)，成熟miRNA，未成熟miRNA，LncRNA(长链非编码RNA))。

在某些实施方案中，所述靶核酸在细胞中。在某些实施方案中，所述细胞选自真核细胞(例如，动物细胞，植物细胞，真菌细胞或原核细胞)，原核细胞，古细菌细胞，人工细胞，或其任何组合。

在某些实施方案中，所述细胞是哺乳动物的细胞(例如，人的细胞)。在某些优选的实施方案中，所述细胞经过了预处理。在某些实施方案中，所述预处理选自细胞透化，核酸提取，纯化，富集。

在某些实施方案中，所述可检测标记选自荧光标记，生物发光标记，化学发光标记，同位素标记，或其任何组合。

在某些实施方案中，为所述荧光标记为荧光基团(例如，ALEX-350,FAM,VIC,TET,CAL Fluor Gold 540,JOE,HEX,CAL Fluor Orange 560,TAMRA,CAL Fluor Red 590,ROX,CAL Fluor Red 610,TEXAS RED,CALFluor Red 635,Quasar 670,CY3,CY5,CY5.5,Quasar705)。

在某些实施方案中，所述扩增酶为核酸聚合酶(特别是模板依赖性核酸聚合酶)。在某些实施方案中，所述核酸聚合酶为DNA聚合酶，例如热稳定的DNA聚合酶。在某些实施方案中，所述热稳定的DNA聚合酶获自，Thermus aquaticus(Taq),Thermus thermophiles(Tth),Thermus filiformis,Thermis flavus,Thermococcus literalis,Thermusantranildanii,Thermus caldophllus,Thermus chliarophilus,Thermus flavus,Thermus igniterrae,Thermus lacteus,Thermus oshimai,Thermus ruber,Thermusrubens,Thermus scotoductus,Thermus silvanus,Thermus thermophllus,Thermotogamaritima,Thermotoga neapolitana,Thermosipho africanus,Thermococcus litoralis,Thermococcus barossi,Thermococcus gorgonarius,Thermotoga maritima,Thermotoganeapolitana,Thermosiphoafricanus,Pyrococcus woesei,Pyrococcus horikoshii,Pyrococcus abyssi,Pyrodictium occultum,Aquifexpyrophilus和Aquifex aeolieus。在某些实施方案中，所述DNA聚合酶为Φ29聚合酶。

在某些实施方案中，提供怀疑含有一种或多种靶核酸的检测样品、第一探针、第二探针、锁式探针和连接酶，并使检测样品与第一探针、第二探针、锁式探针和连接酶接触，然后提供检测探针，或者，提供怀疑含有一种或多种靶核酸的检测样品、第一探针、第二探针、锁式探针、连接酶和检测探针，并使检测样品与它们接触。

在某些实施方案中，所述连接酶选自T4 DNA连接酶，DNA连接酶Ⅰ，DNA连接酶Ⅲ和DNA连接酶Ⅳ。

在某些实施方案中，所述连接酶为T4 DNA连接酶。

在某些实施方案中，所述第一探针和第二探针各自独立地包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸(例如肽核酸(PNA)或锁核酸)，或其任何组合组成。

在某些实施方案中，所述第一探针和第二探针的长度各自独立地为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-200nt，200-300nt，300-400nt，400-500nt，500-600nt，600-700nt，700-800nt，800-900nt，900-1000nt。

在某些实施方案中，所述第一互补序列和第二互补序列的长度各自独立地为10-15nt，15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt。在某些实施方案中，所述第一互补序列和第二互补序列的长度各自独立地为10-20nt。

在某些实施方案中，所述第一互补序列具有与骨架序列互补的第一部分，以及与检测探针序列互补的第二部分。

在某些实施方案中，所述第二互补序列具有与骨架序列互补的第三部分，以及与检测探针序列互补的第四部分。

在某些实施方案中，所述第一部分、第二部分、第三部分和第四部分的长度各自独立地为0nt-15nt。在某些实施方案中，所述第一部分、第二部分、第三部分和第四部分的长度各自独立地为5nt-10nt(例如，5nt，6nt，7nt，8nt，9nt，10nt)。

在某些实施方案中，所述第一和第二连接序列的长度各自独立地为5-10nt，10-15nt，15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt。在某些实施方案中，所述第一和第二连接序列的长度各自独立地为5-15nt(例如，5nt，6nt，7nt，8nt，9nt，10nt，11nt，12nt，13nt，14nt，15nt)。

在某些实施方案中，所述第一和第二靶结合序列的长度各自独立地为12-15nt，15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt。在某些实施方案中，，所述第一和第二靶结合序列的长度各自独立地为12-30nt。

在某些实施方案中，所述检测探针各自独立地包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸(例如肽核酸(PNA)或锁核酸)，或其任何组合组成。

在某些实施方案中，所述检测探针的长度各自独立地为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-200nt，200-300nt，300-400nt，400-500nt，500-600nt，600-700nt，700-800nt，800-900nt，900-1000nt。

在某些实施方案中，所述检测探针各自独立地具有3'-OH末端；或者，所述探针的3'-末端是封闭的；例如，通过在探针的最后一个核苷酸的3'-OH上添加化学部分(例如，生物素或烷基)，通过将探针的最后一个核苷酸的3'-OH去除，或者将所述最后一个核苷酸替换为双脱氧核苷酸，从而封闭检测探针的3'-末端。

在某些实施方案中，所述检测探针各自独立地是线性的，或者具有发夹结构。

在某些实施方案中，所述检测探针各自独立第带有可检测标记。在某些实施方案中，所述不同探针组中的检测探针具有不同的可检测标记。

在某些实施方案中，所述检测探针不可被核酸聚合酶(例如DNA聚合酶)降解。

在某些实施方案中，所述锁式探针在自然状态下，为一条线性的连续的多核苷酸。

在某些实施方案中，所述锁式探针在与第一探针和第二探针杂交或退火的状态下，为带有一个缺口的环状多核苷酸。

在某些实施方案中，所述锁式探针各自独立地包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸(例如肽核酸(PNA)或锁核酸)，或其任何组合组成。

在某些实施方案中，所述锁式探针的长度各自独立地为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-200nt，200-300nt，300-400nt，400-500nt，500-600nt，600-700nt，700-800nt，800-900nt，900-1000nt。

在某些实施方案中，所述锁式探针不可被核酸聚合酶(例如DNA聚合酶)降解。

在第二方面，本申请提供了一种探针组，所述探针组包括第一探针、第二探针、锁式探针和检测探针；

所述检测探针包含可检测的标记和所述检测探针序列或其片段。

在某些实施方案中，所述第一靶结合序列位于所述第一互补序列的下游。在某些优选的实施方案中，所述第一探针从5’至3’方向包含第一互补序列，第一连接序列和第一靶结合序列。在某些优选的实施方案中，所述第二探针从5’至3’方向包含第二靶结合序列，第二连接序列和第二互补序列。所述第一探针与第二探针形成类似于“v型”的结构，因此在本文的某些实施方案中称为“v型探针”。

在第三方面，本申请提供了一种试剂盒，其包含一个或多个如前所述的探针组。

在某些实施方案中，所述试剂盒还包含选自连接酶，扩增酶，用于进行核酸扩增的试剂，用于滚环扩增的试剂，用于检测荧光信号的试剂，或其任何组合。

在某些实施方案中，所述连接酶选自T4 DNA连接酶，DNA连接酶Ⅰ，DNA连接酶Ⅲ和DNA连接酶Ⅳ。在某些实施方案中，所述连接酶为T4 DNA连接酶。

在某些实施方案中，所述检测探针具有如前所述的特征。

在某些实施方案中，所述用于进行核酸扩增的试剂包括，酶(例如核酸聚合酶)的工作缓冲液、dNTPs(标记或未标记的)、水、包含离子(例如Mg²⁺)的溶液、单链DNA结合蛋白、或其任何组合。

在某些实施方案中，用于滚环扩增的试剂选自无核糖核酸酶水，dNTPs(标记或未标记的)，RNA酶抑制剂，或其任何组合。

在某些实施方案中，所述试剂盒用于检测样品中一种或多种靶核酸的存在或其水平。

术语定义

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学、化学、分子生物学、生物化学、细胞培养、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文所用，术语“靶核酸”是存在于单细胞中的任何多核苷酸分子(例如，DNA分子；RNA分子，修饰的核酸分子等)。在一些实施方案中，靶核酸是编码RNA(例如mRNA)。在一些实施方案中，靶核酸是非编码RNA(例如tRNA，rRNA，microRNA(miRNA)，成熟miRNA，未成熟miRNA，LncRNA(长链非编码RNA)等)。在一些实施方案中，靶核酸是RNA分子(例如mRNA，前mRNA等)的剪接变体。因此，合适的靶核酸可以是未剪接的RNA(例如，pre-mRNA，mRNA)，部分剪接的RNA或完全剪接的RNA等。

如本文所用，术语“靶结合序列”是指第一或第二探针上与靶核酸互补的序列。通常，第一靶结合序列与第二靶结合序列互补于靶核酸上的相邻位置，例如，通常距离不超过10nt(不超过9，8，7，6，5，4，3，2或1nt)。第一靶结合序列与第二靶结合序列也可以是邻接的位置(即距离0nt)。每个靶结合序列的长度通常为约12-30nt，例如15-25nt，18-23nt，18-21nt。

如本文所用，术语“第一探针”和“第二探针”的序列包含：(i)与锁式探针特异性结合的互补序列；(ii)与所述靶核酸特异性结合的靶结合序列；(ii)任选地，用于连接互补序列和靶结合序列的连接序列。在一些实施方案中，所述连接序列是一段poly-A序列。在一些实施方案中，所述连接序列的长度为5-20nt，例如，8-15nt，10-12nt。

如本文所用，术语“锁式探针”为一段连续的单链核酸，其包含(i)骨架序列和(ii)检测探针序列。在允许杂交或退火的条件下，所述锁式探针能够与第一探针以及第二探针杂交或退火，形成带有一个缺口的环状多核苷酸。在一些实施方案中，骨架序列位于检测探针序列的上游，在此类实施方案中，所述缺口位于与第一探针互补的第一区域。在一些实施方案中，骨架序列位于检测探针序列的下游，在此类实施方案中，所述缺口位于与第二探针互补的第二区域。

如本文所用，术语“滚环扩增”是指以环状DNA为模板，通过一个引物(与部分环状模板互补)，在酶催化下将dNTPs合成单链DNA，此单链DNA包含许多重复的模板互补片段。该技术是本领域已知的(参见，例如，Baner et al,Nucleic Acids Research,26:5073-5078,1998；Lizardi et al,Nature Genetics 19:226,1998；Schweitzer et al.Proc.NatlAcad.Sci.USA 97:10113-119,2000；Faruqi et al,BMC Genomics 2:4,2000；Nallur etal,Nucl.Acids Res.29:el 18,2001；Dean et al.Genome Res.11:1095-1099,2001；Schweitzer et al,Nature Biotech.20:359-365,2002；U.S.Pat.Nos.6,054,274,6,291,187,6,323,009,6,344,329and 6,368,801)。

如本文所用，术语“检测探针”通过在杂交或退火的条件下，其与待测核酸直接或间接接触来确定细胞中待测核酸的存在和水平。所述检测探针包括可检测的标记，所述可检测标记可被测量和定量。在一些实施方案中，检测探针带有单个可检测标记。在一些实施方案中，检测探针带有多个可检测标记(例如，3个)，其中的第一个可检测标记能够特异性结合第一种待测核酸，其余可检测标记特异性结合或者不结合其余待测核酸。

如本文所用，术语“可检测标记”是指在检测条件下，能够提供检测信号的任何组分，包括直接和间接可检测的标记。可用于本文所述方法的可检测标记包括可通过光谱，光化学，生物化学，免疫化学，电学，光学，化学或其它手段间接或直接检测的任何组分。例如，抗原标记(例如地高辛素(DIG)，荧光素，二硝基苯酚(DNP)等)，用于用标记的链霉亲和素缀合物染色的生物素，荧光染料(例如荧光素，德士古红，罗丹明，荧光团标记如阿利克斯Fluor标记等)，放射性标记(例如，125i，35S，14C，OR32p)酶(例如过氧化物酶，碱性磷酸酶，半乳糖苷酶和通常用于ELISA的其它酶)，荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白，红色荧光蛋白，黄色荧光蛋白等)，螯合金属的合成聚合物，比色标记等。

其中，所述可检测标记可以使用光电检测器(例如，流式细胞仪，荧光显微镜)来检测产生的信号。当用于确定细胞表面蛋白的存在或其构象或翻译后修饰，或者细胞内或分泌的蛋白质时，可以使用流式或质量式细胞术来定量参数。当用于单细胞多参数和多细胞多参数多重测定时，可以通过定量成像和荧光共焦显微镜术来识别输入细胞类型并读取参数，荧光共焦显微镜的方法是本领域已知的，参见，例如，共焦显微镜术方法和方案(Methods in Molecular Biology，第122卷，Humana Press，1998)。

如本文所用，“细胞”是指来自原核生物(例如，细菌，真菌，原虫)、真核生物(例如，植物，动物)或古生物的任何类型的细胞，包括来自组织，器官和活组织的细胞，重组细胞，来自体外培养的细胞系的细胞，以及包含核酸的细胞片段，细胞组分。所述细胞还包括人工细胞，例如包封核酸的颗粒，脂质体，聚合物或微胶囊。细胞可以包括固定的细胞，透化的细胞或活的细胞。本文所述的方法可以在例如包含单细胞，细胞群或组织或器官的样品上进行。本文所用的“活细胞”是指天然存在或修饰的完整细胞。活细胞可以从其它细胞中分离，在培养物中或在组织(部分或完整)或生物体中与其它细胞混合。

如本文所用，术语“多核苷酸”，“寡核苷酸”，“核酸”和“核酸分子”包括任何长度的核苷酸(例如，核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸)的聚合形式，这些术语可以互换使用。该术语包括三链，双链和单链DNA，以及三链，双链和单链RNA。所述术语还包括修饰(例如，甲基化和/或封端)或未修饰的形式。

如本文所用，术语“杂交”和“互补”是指核苷酸序列之间形成复合物，该复合物能够通过Watson-Crick碱基配对来形成。本领域技术人员可以理解，能够与靶核酸杂交或互补的序列不需要与其靶核酸序列完全互补。在许多情况下，杂交体中大约存在10％以内的错配的碱基，均可以形成的稳定的杂交体。因此，与靶核酸序列“杂交”和“互补”的序列，与其靶核酸完全互补的序列具有90％或更高的同源性。

如本文所用，术语“CEU”为酶活力单位。CEU(黏性末端连接单位)可以指在16℃下30min内，能使50％的经HindⅢ消化的核酸片段连接所需的酶量。通常，所使用的酶量越少，证明酶活性越高。酶活力单位还包含U(U-activity unit)等。

发明的有益效果

本申请的探针组和检测方法能够同时检测多个靶核酸的存在或其水平。与现有技术相比，具备一种或多种选自下列的有益效果：(1)减少了检测所用的探针个数；(2)缩短了检测时间；(3)降低了酶的用量(例如，连接酶)；(4)提高了杂交的效率；(5)能够检测较短的靶核酸(例如，检测的靶核酸的长度可低至12nt/bp)；(6)提高了检测准确性，即，减少了非特异性检测结果。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图说明

图1显示了v型探针组对ALB RNA在不同细胞上的原位检测结果图，其中，图1A为HepG2细胞的检测结果，图1B为SKBR3细胞的检测结果。

图2显示了v型探针组对HER2 RNA、UBC RNA和dapB RNA在SKBR3细胞系上的原位检测结果图，其中，dapB为阴性对照基因，靛蓝色荧光为dapB的检测结果；红色荧光为HER2的检测结果；银色荧光为UBC的检测结果。

图3显示了v型探针组对HER2 RNA在SKBR3细胞系上的原位检测结果图，其中，图3A为V型探针与RNA序列杂交长度为10nt的检测结果，图3B为V型探针与RNA序列杂交长度为12nt的检测结果，图3C为V型探针与RNA序列杂交长度为15nt的检测结果，图3D为V型探针与RNA序列杂交长度为20nt的检测结果。

图4显示了v型探针组对HER2 RNA在SKBR3细胞系上的原位检测结果图，其中，图4A为间隔序列的长度为0nt的检测结果，图4B为间隔序列的长度为5nt的检测结果，图4C为间隔序列的长度为10nt的检测结果。

图5显示了v型探针组对HER2 RNA在SKBR3细胞系上的原位检测结果图，V型探针2与锁式探针的骨架序列杂交9bp，与锁式探针的检测探针序列杂交8bp，其中，图5A为V型探针1与锁式探针的骨架序列杂交8bp，与锁式探针的检测探针杂交7bp；图5B为v型探针1与锁式探针的骨架序列杂交7bp，与锁式探针的检测探针杂交6bp；图5C为V型探针1与锁式探针的骨架序列杂交6bp，与锁式探针的检测探针杂交6bp。

图6显示了v型探针组对HER2 RNA在SKBR3细胞系上的原位检测结果图，V型探针1与锁式探针的骨架序列杂交7bp，与锁式探针的检测探针序列杂交6bp，其中，图6A为V型探针2与锁式探针的骨架序列杂交9bp，与锁式探针的检测探针杂交8bp；图6B为V型探针2与锁式探针的骨架序列杂交8bp，与锁式探针的检测探针杂交7bp；图6C为V型探针2与锁式探针的骨架序列杂交7bp，与锁式探针的检测探针杂交6bp；图6D为V型探针2与锁式探针的骨架序列杂交6bp，与锁式探针的检测探针杂交6bp。

图7显示了v型探针组对HER2 RNA在SKBR3细胞系上的原位检测结果图，V型探针2与锁式探针的骨架序列杂交8bp，与锁式探针的检测探针序列杂交7bp，其中，图7A为V型探针1与锁式探针的骨架序列杂交7bp，与锁式探针的检测探针杂交8bp；图7B为V型探针2与锁式探针的骨架序列杂交7bp，与锁式探针的检测探针杂交7bp；图7C为V型探针2与锁式探针的骨架序列杂交6bp，与锁式探针的检测探针杂交7bp。

图8显示了c型探针组对HER2 RNA在SKBR3细胞系上的原位检测结果图。

图9显示了本申请的v型探针对RNA进行原位检测的原理图。

其中，v型探针1的序列从5’至3’方向包含：(i)与锁式探针特异性结合的第一互补序列；(ii)与所述靶核酸特异性结合的第一靶结合序列；(iii)任选地，用于连接第一互补序列和第一靶结合序列的第一连接序列。

v型探针2的序列从5’至3’方向包含：(i)与所述靶核酸特异性结合的第二靶结合序列；(ii)与锁式探针特异性结合的第二互补序列；(iii)任选地，用于连接第二靶结合序列和第二互补序列的第二连接序列。

锁式探针为单链核酸，其包含：(i)骨架序列和(ii)检测探针序列；在允许杂交或退火的条件下，所述锁式探针能够与v型探针1的第一互补序列以及v型探针2的第二互补序列杂交或退火，形成带有一个缺口的环状多核苷酸。

检测探针包含可检测的标记和所述检测探针序列或其片段。

在允许杂交或退火的条件下，v型探针1和v型探针2分别通过第一靶结合序列和第二靶结合序列与目标RNA杂交。随后，锁式探针的第一区域和第二区域分别与v型探针1的第一互补序列和v型探针2的第二互补序列杂交，所述第一区域与所述第二区域之间含有间隔序列；并且，锁式探针由一条线性的单链核酸变成一条带有一个缺口的环状单链核酸。在允许连接酶连接核酸缺口的条件下，所述锁式探针以v型探针1的第一互补序列或者v型探针2的第二互补序列为模板，形成环状DNA。在允许扩增的条件下，以所述环状DNA为模板，以第二互补序列作为扩增引物，进行滚环扩增，以获得滚环扩增产物，并且，所述滚环扩增产物含有与检测探针序列互补的序列。在允许杂交或退火的条件下，添加检测探针，并检测与所述产物结合的检测探针的信号。根据检测探针的信号的存在或水平，确定检测样品中靶核酸的存在或其水平。其中，图9A为间隔序列的长度大于0nt；图9B为间隔序列的长度等于0nt。

图10显示了本申请的c型探针对RNA进行原位检测的原理图。

其中，c型探针1的序列从5’至3’方向包含：(i)与所述靶核酸特异性结合的第一靶结合序列；(ii)与锁式探针特异性结合的第一互补序列；(iii)任选地，用于连接第一互补序列和第一靶结合序列的第一连接序列。

c型探针2的序列从5’至3’方向包含：(i)与所述靶核酸特异性结合的第二靶结合序列；(ii)与锁式探针特异性结合的第二互补序列；(iii)任选地，用于连接第二靶结合序列和第二互补序列的第二连接序列。

锁式探针为单链核酸，其包含：(i)骨架序列和(ii)检测探针序列；在允许杂交或退火的条件下，所述锁式探针能够与c型探针1的第一互补序列以及c型探针2的第二互补序列杂交或退火，形成带有一个缺口的环状多核苷酸。

检测探针包含可检测的标记和所述检测探针序列或其片段。

在允许杂交或退火的条件下，c型探针1和c型探针2分别通过第一靶结合序列和第二靶结合序列与目标RNA杂交。随后，锁式探针的第一区域和第二区域分别与c型探针1的第一互补序列和c型探针2的第二互补序列杂交，所述第一区域与所述第二区域之间含有间隔序列；并且，锁式探针由一条线性的单链核酸变成一条带有一个缺口的环状单链核酸。在允许连接酶连接核酸缺口的条件下，所述锁式探针以c型探针1的第一互补序列或者c型探针2的第二互补序列为模板，形成环状DNA。在允许扩增的条件下，以所述环状DNA为模板，以第二互补序列作为扩增引物，进行滚环扩增，以获得滚环扩增产物，并且，所述滚环扩增产物含有与检测探针序列互补的序列。在允许杂交或退火的条件下，添加检测探针，并检测与所述产物结合的检测探针的信号。根据检测探针的信号的存在或水平，确定检测样品中靶核酸的存在或其水平。

具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。

除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。例如，本发明中所使用的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等常规技术，可参见萨姆布鲁克(Sambrook)、弗里奇(Fritsch)和马尼亚蒂斯(Maniatis)，《分子克隆：实验室手册》(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL)，第2次编辑(1989)；《当代分子生物学实验手册》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)(F.M.奥苏贝尔(F.M.Ausubel)等人编辑，(1987))；《酶学方法》(METHODS IN ENZYMOLOGY)系列(学术出版公司)：《PCR 2：实用方法》(PCR2:A PRACTICAL APPROACH)(M.J.麦克弗森(M.J.MacPherson)、B.D.黑姆斯(B.D.Hames)和G.R.泰勒(G.R.Taylor)编辑(1995))，以及《动物细胞培养》(ANIMAL CELLCULTURE)(R.I.弗雷谢尼(R.I.Freshney)编辑(1987))。

另外，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。

实施例1.V型探针的原位检测实验的对比

1.1V型探针的原位检测实验

本实施例利用设计的V型探针，分别进行了ALB(Albumin血清白蛋白)RNA在HepG2(肝癌细胞)和SKBR3(乳腺癌细胞)细胞上的原位检测实验，所述探针的检测原理如图9所示。

首先加DEPC水制备V型探针储备液，所使用的探针序列具体如表1所示。将HepG2细胞和SKBR3细胞分别制备细胞爬片(细胞爬片的制备：待细胞生长密度达到80％-90％时，消化细胞使成单细胞悬液；取灭菌后的载玻片于培养皿中，向皿内加入完全培养基，然后对细胞滴片，使细胞悬液均匀分布在载玻片上，于CO₂培养箱培养12-48h；当细胞生长密度达至70％-80％时，终止培养，利用4％的多聚甲醛溶液进行细胞固定，细胞爬片完成后于-80℃冰箱保存，使用前取出)，用免疫组化笔限定后续处理区域。然后对HepG2细胞和SKBR3细胞进行处理，用0.5％Triton X-100在1×PBS中渗透10min，DEPC-PBS-Tween(0.1％)洗涤3次。接着将V型探针1和2与目标RNA杂交，所用试剂如表2所示，37℃恒温培养箱中杂交1h，1xHyb缓冲液2(2x SSC，20％甲酰胺)冲洗3次，DEPC-PBS-Tween洗涤3次。然后杂交锁式探针(锁式探针提前通过生工生物工程(上海)股份有限公司进行5’磷酸化修饰)，所使用的试剂具体如表3所示，37℃恒温培养箱中杂交1h，DEPC-PBS-Tween洗涤3次。然后，连接锁式探针，其使用的试剂具体如表4所示，37℃恒温培养箱中杂交1h，DEPC-PBS-Tween洗涤3次。接着进行滚环扩增，其使用的试剂具体如表5所示，37℃恒温培养箱中杂交1h，DEPC-PBS-Tween洗涤3次。加入检测探针(检测探针的5’端带有Cy3)，其使用的试剂具体如表6所示，室温孵育30min，DEPC-PBS-Tween洗涤3次。

将细胞爬片于室温避光条件下，依次通过70％、85％、100％梯度酒精溶液，每个浓度脱水2min，自然风干后，使用含DAPI(DAPI可以透过细胞膜对细胞核进行染色，在检测条件下发出蓝色的荧光)的抗荧光淬灭剂SlowFade Gold Antifade Mountant(购自Invitrogen，货号S36936)进行封片。使用荧光显微镜进行镜检成像。

表1.探针的序列

表2.V型探针的杂交

表3.锁式探针的杂交

锁式探针的杂交	stock	final	1x
				DEPC H<sub>2</sub>O			28.75ul
T4 DNA ligase buffer(Thermo)	10x	1x	5ul
				2.5M NaCl in 2％Tween-20	10x	1x	5ul
ALB锁式探针	2uM	0.2uM	5ul
				BSA	2ug/ul	0.2ug/ul	5ul
RiboLock RNase Inhibitor	40U/ul	1U/ul	1.25ul
				Total			50ul

表4.锁式探针的连接

连接	stock	final	1x
				DEPC H<sub>2</sub>O			27.5ul
T4 DNA ligase buffer(Thermo)	10x	1x	5ul
				2.5M NaCl in 2％Tween-20	10x	1x	5ul
ATP	10mM	1mM	5ul
				BSA	2ug/ul	0.2ug/ul	5ul
0.5U/ul T4 DNA ligase(Thermo)in 50％Glycerol	0.5U/ul	0.0125U/ul	1.25ul
				RiboLock RNase Inhibitor	40U/ul	1U/ul	1.25ul
Total			50ul

表5.滚环扩增

滚环扩增	stock	final	1x
				DEPC H<sub>2</sub>O			26.75ul
Φ29buffer	10x	1x	5ul
				Glycerol	50％	5％	5ul
dNTP	25mM	1mM	2ul
				BSA	2ug/ul	0.2ug/ul	5ul
Φ29polymerase(Thermo)	10u/ul	1u/ul	5ul
				RiboLock RNase Inhibitor	40u/ul	1u/ul	1.25ul
Total			50ul

表6.检测探针的杂交

Detection	stock	final	1x
				H<sub>2</sub>O			22.5ul
2x Hyb buffer2(4x SSC,40％formamide)	2x	1x	25ul
				ALB检测探针	2uM	0.1uM	2.5ul

结果如图1所示，ALB在HepG2有明显的检出(图1A)，其检出量为每个细胞71.47个荧光信号点，而在SKBR3上基本无检出(图1B)，其检出量为0.01个荧光信号点每细胞(视为无检出)。

ALB为肝癌细胞特异性高表达基因，各数据库及文献显示在SKBR3上无表达，本处列举HPA数据库显示的(https://www.proteinatlas.org/ENSG00000163631-ALB/scell)ALB在HepG2和SKBR3上针对RNA表达的数据指标NX，其数值分别为315.9和0(NX指数低于1.0视为该RNA对应的蛋白质无表达)，与本实验利用我们的探针系统及实验条件所得结果具有良好的一致性，不仅说明本探针系统针对高表达的基因具有良好的检出效率，而且特异性高，对于不表达的基因不会出现假阳性的检出结果。并且能够检出基因的水平。

1.2其它设计方式的探针的原位检测实验

本实施例另外合成了两条独立的序列，其为ALB锁式探针中的检测探针序列以及骨架序列，具体序列如表7所示。

表7.检测探针序列以及骨架序列

将上述合成的两条序列，与如上所述的ALB锁式探针、V型探针1-1、V型探针2-1共同进行原位检测实验，实验步骤以及所使用的试剂和原料均与上述相同。其中，分别设置了4组实验，实验组1使用2.5CEU/ul的连接酶，并且，其中的三个实验步骤进行第一组孵育时间，实验组2使用2.5CEU/ul的连接酶，并且，其中的三个实验步骤进行第二组孵育时间，实验组3使用10CEU/ul的连接酶，并且，其中的三个实验步骤第一组孵育时间，实验组4使用10CEU/ul的连接酶，并且，其中的三个实验步骤进行第二组孵育时间。孵育时间具体如表8所示。

表8.不同步骤的孵育时间

检测结果显示，实验组1-4均有大量的非目标检出，且相较于实验组1、2，实验组3、4目标检出更少，非目标检出更多，同时实验组1、2在检测效率上无明显差异。

因此，与其它设计方式的探针相比，本申请所设计的探针组提高了DNA连接酶连接效率，并且，减少了反应所需的时间以及DNA连接酶的用量。另一方面，减少了由两条短核酸序列造成的探针成本，还能避免短核酸序列的非特异性杂交从而极大提高检测的特异性。

实施例2.V型探针的三重检测

本实施例针对HER2&UBC&dapB三个基因分别设计V型探针，进行HER2&UBC&dapB三个基因在SKBR3细胞系上的多重原位检测实验。实验步骤以及使用的试剂同实施例1.1所描述的，具体使用的探针如下表9所示。

表9.探针的序列

本次实验所得结果如图2和表10所示(其中，红色荧光为HER2,银色荧光为UBC，靛蓝色荧光为dapB)：dapB为阴性对照基因，即理论上应无检出，本方法下其检出量仅为0.02，与实际相符；UBC为中高表达管家基因，HER2为SKBR3特异性高表达基因，本方法下此二基因检出量均符合预期。

表10.荧光信号数量

	dapB	UBC	HER2
				信号数量	0.02	72.12	98.39

综上结果，本方法具有两重及以上多重RNA原位检测的能力，并且能够检出基因的水平。

实施例3.V型探针的检测长度

为了探究V型探针能够检测的最低目标RNA长度，本实施例分别设计V型探针，使其与目标RNA序列(在SKBR3上检测HER2)单条杂交长度为10nt，12nt，15nt，20nt。实验步骤同实施例1.1所描述的，具体使用的探针及试剂如下表11所示。

表11.探针的序列

本次实验所得结果如图3和表12所示(图3A为10nt,图3B为12nt,图3C为15nt，图3D为20nt)：10nt基本没有信号点检出，其数值为0；12nt信号点具有检出，为1.30；15nt信号点具有检出量，为34.52；20nt信号点具有检出量，为116.95。检测结果表明本方法具有对microRNA等序列极短的RNA检测的潜力。

表12.荧光信号数量

	10nt	12nt	15nt	20nt
					HER2	0.00	1.30	34.52	116.95

实施例4.V型探针间隔序列的探索

为了探究V型探针间隔序列的长度，本实施例分别设计V型探针1、2，使其与锁式探针杂交区段的间隔序列长度为0、5、10nt(在SKBR3上检测HER2)。实验步骤以及使用的试剂同实施例1.1所描述的，具体使用的探针如下表13所示。

表13.探针的序列

V型探针间隔序列长度的对比实验结果如图4和下表14所示，当间隔序列为5nt时，HER2在SKBR3上具有最高的检出量114.57，而当间隔序列为扩展至10nt时，其检出量仅为0.23，出现此结果的原因可能不仅与间隔序列的扩大有关，还可能是由间隔序列扩大而引起的V型探针与锁式探针杂交序列长度的缩短有关(因间隔序列长度和V型探针与锁式探针杂交序列长度的总和为检测探针序列的总长，其为恒定值)。

表14.荧光信号数量

	0nt	5nt	10nt
				HER2	46.25	114.57	0.23

本结果表明，在本方法的现行方案下，V型探针间隔序列长度为0-10nt都是有信号检出的，且5nt最佳，故常规实验中我们选取5nt为间隔序列长度。

实施例5.V型探针与锁式探针杂交长度的探索

为了探究V型探针与锁式探针杂交长度的影响，本实施例分别设计不同的V型探针1、2，以探究使其与锁式探针杂交长度的影响(在SKBR3上检测HER2)。实验步骤以及使用的试剂同实施例1.1所描述的。

首先，固定V型探针2与锁式探针的杂交序列长度(使V型探针2与锁式探针的骨架序列杂交9bp，与锁式探针的检测探针序列杂交8bp)，改变V型探针1与锁式探针杂交序列的长度。其中，第一条V型探针1与锁式探针的骨架序列杂交8bp，与锁式探针的检测探针杂交7bp；第二条V型探针1与锁式探针的骨架序列杂交7bp，与锁式探针的检测探针杂交6bp；第三条V型探针1与锁式探针的骨架序列杂交6bp，与锁式探针的检测探针杂交6bp；分别针对HER2的5个RNA位点设计以上4种探针，具体探针名称和序列如表15中所示。

表15.探针的序列

实验结果如图5和表16所示，V型探针2与锁式探针的骨架序列杂交9bp，与锁式探针的检测探针序列杂交8bp的情况下，V型探针1与锁式探针的骨架序列杂交7bp，与锁式探针的检测探针杂交6bp时，胞外噪音较低，综合结果最为理想。

表16.荧光信号数量

然后，固定V型探针1与锁式探针杂交序列长度(使V型探针1与锁式探针的骨架序列杂交7bp，与锁式探针的检测探针序列杂交6bp)，改变V型探针2与锁式探针杂交序列的长度。其中，第一条V型探针2与锁式探针的骨架序列杂交9bp，与锁式探针的检测探针杂交8bp；第二条V型探针2与锁式探针的骨架序列杂交8bp，与锁式探针的检测探针杂交7bp；第三条V型探针2与锁式探针的骨架序列杂交7bp，与锁式探针的检测探针杂交6bp；第四条V型探针2与锁式探针的骨架序列杂交6bp，与锁式探针的检测探针杂交6bp。分别针对HER2的5个RNA位点设计以上探针，具体探针名称和序列如下表17中所示。

表17.探针的序列

实验结果如图6和表18所示，在V型探针1与锁式探针的骨架序列杂交7bp，与锁式探针的检测探针序列杂交6bp的情况下，V型探针2与锁式探针的骨架序列杂交8bp，与锁式探针的检测探针杂交7bp时，胞外噪音较低，综合结果最为理想。

表18.荧光信号数量

	HER2	cells
			9+8	33.25	900.00
8+7	38.56	861.00
			7+6	22.78	1387.00
6+6	1.03	962.00

根据上述实验得到的杂交长度，固定V型探针2与锁式探针杂交序列长度(使V型探针2与锁式探针的骨架序列杂交8bp，与锁式探针的检测探针序列杂交7bp)，改变V型探针1与锁式探针杂交序列的长度。其中，第一条V型探针1与锁式探针的骨架序列杂交7bp，与锁式探针的检测探针杂交8bp；第二条V型探针2与锁式探针的骨架序列杂交7bp，与锁式探针的检测探针杂交7bp；第三条V型探针2与锁式探针的骨架序列杂交6bp，与锁式探针的检测探针杂交7bp。分别针对HER2的5个RNA位点设计以上4种探针，具体探针名称和序列如下表19中所示。

表19.探针的序列

实验结果如图7和表20所示，V型探针2与锁式探针的骨架序列杂交8bp，与锁式探针的检测探针序列杂交7bp的情况下，V型探针1与锁式探针的骨架序列杂交7bp，与锁式探针的检测探针杂交8bp时，胞外噪音较低，综合结果最为理想。

表20.荧光信号数量

实施例6.同极性的双C探针的检测

本实施例设计同极性的双C探针，进行HER2基因在SKBR3细胞系上的原位检测实验，所述探针的检测原理如图10所示。实验步骤同实施例1.1所描述的，具体使用的探针以及试剂如下表21-26所示。

表21.探针的序列

表22.探针的杂交

C probes hybridization	stock	final	1x
				DEPC H<sub>2</sub>O			21.25ul
2x Hyb buffer1(12x SSC,20％formamide)	2x	1x	25ul
				HER2双C探针1(3targets)	2uM	0.05uM	1.25ul
HER2双C探针2(3targets)	2uM	0.1uM	2.5ul
				Total			50ul

表23.锁式探针的杂交

Circle-Bridge(PLP)hybridization	stock	final	1x
				DEPC H<sub>2</sub>O			28.75ul
T4 DNA ligase buffer(Thermo)	10x	1x	5ul
				2.5M NaCl in 2％Tween-20	10x	1x	5ul
HER2锁式探针	2uM	0.2uM	5ul
				BSA	2ug/ul	0.2ug/ul	5ul
RiboLock RNase Inhibitor	40U/ul	1U/ul	1.25ul
				Total			50ul

表24.锁式探针的连接

表25.滚环扩增

RCA	stock	final	1x
				DEPC H2O			26.75ul
Φ29buffer	10x	1x	5ul
				Glycerol	50％	5％	5ul
dNTP	25mM	1mM	2ul
				BSA	2ug/ul	0.2ug/ul	5ul
Φ29polymerase(Thermo)	10u/ul	1u/ul	5ul
				RiboLock RNase Inhibitor	40u/ul	1u/ul	1.25ul
Total			50ul

表26.检测探针的杂交

Detection	stock	final	1x
				H<sub>2</sub>O			22.5ul
2x Hyb buffer2(4x SSC,40％formamide)	2x	1x	25ul
				HER2检测探针序列	2uM	0.1uM	2.5ul

本次实验所得显微镜检结果如图8所示：将本方法所用V型探针变形为同极性的双C探针，仍然可以正常工作，在现行实验方案下其信号检出量为37.61。因此，同极性的双C探针可作为本方法中V型探针的替代方案。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

SEQUENCE LISTING

<110> 厦门先能生物科技有限公司

<120> 一种检测样品中一种或多种靶核酸的存在或其水平的方法

<130> IDC210017

<160> 196

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> ALB检测探针

<400> 1

agtagccgtg actatcgact 20

<210> 2

<211> 66

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> ALB锁式探针

<400> 2

attagcggtc cgtctaggag agtagtacag cagccgtcaa gagtgtagta gccgtgacta 60

tcgact 66

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> RNA位点1

<400> 3

tgagagaaat gaatgcttct tgcaacacaa agatgacaac 40

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针1-1

<400> 4

cgctaatagt cgataaaaaa aaaaaagaag cattcatttc tctca 45

<210> 5

<211> 46

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针2-1

<400> 5

gttgtcatct ttgtgttgca aaaaaaaaaa tggctactac actctt 46

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> RNA位点2

<400> 6

tagtgacaga tcttaccaaa gtccacacgg aatgctgcca 40

<210> 7

<211> 45

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针1-2

<400> 7

cgctaatagt cgataaaaaa aaaaatttgg taagatctgt cacta 45

<210> 8

<211> 46

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针2-2

<400> 8

tggcagcatt ccgtgtggac aaaaaaaaaa tggctactac actctt 46

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> RNA位点3

<400> 9

cagatcctca tgaatgctat gccaaagtgt tcgatgaatt 40

<210> 10

<211> 45

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针1-3

<400> 10

cgctaatagt cgataaaaaa aaaaaatagc attcatgagg atctg 45

<210> 11

<211> 46

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针2-3

<400> 11

aattcatcga acactttggc aaaaaaaaaa tggctactac actctt 46

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> RNA位点4

<400> 12

gaagactatc tatccgtggt cctgaaccag ttatgtgtgt 40

<210> 13

<211> 45

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针1-4

<400> 13

cgctaatagt cgataaaaaa aaaaaaccac ggatagatag tcttc 45

<210> 14

<211> 46

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针2-4

<400> 14

acacacataa ctggttcagg aaaaaaaaaa tggctactac actctt 46

<210> 15

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> RNA位点5

<400> 15

gagagacaaa tcaagaaaca aactgcactt gttgagctcg 40

<210> 16

<211> 45

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针1-5

<400> 16

cgctaatagt cgataaaaaa aaaaatgttt cttgatttgt ctctc 45

<210> 17

<211> 46

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针2-5

<400> 17

cgagctcaac aagtgcagtt aaaaaaaaaa tggctactac actctt 46

<210> 18

<211> 46

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> ALB骨架序列

<400> 18

attagcggtc cgtctaggag agtagtacag cagccgtcaa gagtgt 46

<210> 19

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> HER2 RNA位点1

<400> 19

ctcacctacc tgcccaccaa tgccagcctg tccttcctgc 40

<210> 20

<211> 45

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> HER2 V型探针1-1

<400> 20

cgctaatagt cgataaaaaa aaaaattggt gggcaggtag gtgag 45

<210> 21

<211> 46

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> HER2 V型探针2-1

<400> 21

gcaggaagga caggctggca aaaaaaaaaa tggctactac actctt 46

<210> 22

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> HER2 RNA位点2

<400> 22

tcgaagcctc acagagatct tgaaaggagg ggtcttgatc 40

<210> 23

<211> 45

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> HER2 V型探针1-2

<400> 23

cgctaatagt cgataaaaaa aaaaaagatc tctgtgaggc ttcga 45

<210> 24

<211> 46

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> HER2 V型探针2-2

<400> 24

gatcaagacc cctcctttca aaaaaaaaaa tggctactac actctt 46

<210> 25

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> HER2 RNA位点3

<400> 25

acctttctac ggacgtggga tcctgcaccc tcgtctgccc 40

<210> 26

<211> 45

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> HER2 V型探针1-3

<400> 26

cgctaatagt cgataaaaaa aaaaatccca cgtccgtaga aaggt 45

<210> 27

<211> 46

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> HER2 V型探针2-3

<400> 27

gggcagacga gggtgcagga aaaaaaaaaa tggctactac actctt 46

<210> 28

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> HER2 RNA位点4

<400> 28

ttccagaacc tgcaagtaat ccggggacga attctgcaca 40

<210> 29

<211> 45

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> HER2 V型探针1-4

<400> 29

cgctaatagt cgataaaaaa aaaaaattac ttgcaggttc tggaa 45

<210> 30

<211> 46

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> HER2 V型探针2-4

<400> 30

tgtgcagaat tcgtccccgg aaaaaaaaaa tggctactac actctt 46

<210> 31

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> HER2 RNA位点5

<400> 31

agggcccacc cagtgtgtca actgcagcca gttccttcgg 40

<210> 32

<211> 45

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> HER2 V型探针1-5

<400> 32

cgctaatagt cgataaaaaa aaaaatgaca cactgggtgg gccct 45

<210> 33

<211> 46

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> HER2 V型探针2-5

<400> 33

ccgaaggaac tggctgcagt aaaaaaaaaa tggctactac actctt 46

<210> 34

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> UBC RNA位点1

<400> 34

cagccgggat ttgggtcgca gttcttgttt gtggatcgct 40

<210> 35

<211> 45

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> UBC V型探针1-1

<400> 35

cgctaatggc tccacaaaaa aaaaatgcga cccaaatccc ggctg 45

<210> 36

<211> 46

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> UBC V型探针2-1

<400> 36

agcgatccac aaacaagaac aaaaaaaaaa cagacgcaac actctt 46

<210> 37

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> UBC RNA位点2

<400> 37

gggatgcaga tcttcgtgaa gaccctgact ggtaagacca 40

<210> 38

<211> 45

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> UBC V型探针1-2

<400> 38

cgctaatggc tccacaaaaa aaaaattcac gaagatctgc atccc 45

<210> 39

<211> 46

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> UBC V型探针2-2

<400> 39

tggtcttacc agtcagggtc aaaaaaaaaa cagacgcaac actctt 46

<210> 40

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> UBC RNA位点3

<400> 40

cagaaagagt ccactctgca cttggtcctg cgcttgaggg 40

<210> 41

<211> 45

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> UBC V型探针1-3

<400> 41

cgctaatggc tccacaaaaa aaaaatgcag agtggactct ttctg 45

<210> 42

<211> 46

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> UBC V型探针2-3

<400> 42

ccctcaagcg caggaccaag aaaaaaaaaa cagacgcaac actctt 46

<210> 43

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> UBC RNA位点4

<400> 43

tgggcgcacc ctgtctgact acaacatcca gaaagagtcc 40

<210> 44

<211> 45

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> UBC V型探针1-4

<400> 44

cgctaatggc tccacaaaaa aaaaaagtca gacagggtgc gccca 45

<210> 45

<211> 46

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> UBC V型探针2-4

<400> 45

ggactctttc tggatgttgt aaaaaaaaaa cagacgcaac actctt 46

<210> 46

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> UBC RNA位点5

<400> 46

gtgaagacac tcactggcaa gaccatcacc cttgaggtcg 40

<210> 47

<211> 45

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> UBC V型探针1-5

<400> 47

cgctaatggc tccacaaaaa aaaaattgcc agtgagtgtc ttcac 45

<210> 48

<211> 46

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> UBC V型探针2-5

<400> 48

cgacctcaag ggtgatggtc aaaaaaaaaa cagacgcaac actctt 46

<210> 49

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> dapB RNA位点1

<400> 49

agaatcatgg cgtatctgaa gcgtttggcc atccatgccg 40

<210> 50

<211> 45

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> dapB V型探针1-1

<400> 50

cgctaatagc gattaaaaaa aaaaattcag atacgccatg attct 45

<210> 51

<211> 46

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> dapB V型探针2-1

<400> 51

cggcatggat ggccaaacgc aaaaaaaaaa cagcgcgaac actctt 46

<210> 52

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> dapB RNA位点2

<400> 52

agttccgctt ggtgcgtcaa gcttctggtc atgatgaagc 40

<210> 53

<211> 45

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> dapB V型探针1-2

<400> 53

cgctaatagc gattaaaaaa aaaaattgac gcaccaagcg gaact 45

<210> 54

<211> 46

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> dapB V型探针2-2

<400> 54

gcttcatcat gaccagaagc aaaaaaaaaa cagcgcgaac actctt 46

<210> 55

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> dapB RNA位点3

<400> 55

cttctgagaa accggttgtt ccgacaactg gacggactcc 40

<210> 56

<211> 45

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> dapB V型探针1-3

<400> 56

cgctaatagc gattaaaaaa aaaaaaacaa ccggtttctc agaag 45

<210> 57

<211> 46

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> dapB V型探针2-3

<400> 57

ggagtccgtc cagttgtcgg aaaaaaaaaa cagcgcgaac actctt 46

<210> 58

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> dapB RNA位点4

<400> 58

tgtggtgttc gttctgccaa tttaacagct tcctgcccca 40

<210> 59

<211> 45

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> dapB V型探针1-4

<400> 59

cgctaatagc gattaaaaaa aaaaattggc agaacgaaca ccaca 45

<210> 60

<211> 46

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> dapB V型探针2-4

<400> 60

tggggcagga agctgttaaa aaaaaaaaaa cagcgcgaac actctt 46

<210> 61

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> dapB RNA位点5

<400> 61

gatcagtccc ggaagacgga cgctgtgcaa gcgaataccg 40

<210> 62

<211> 45

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> dapB V型探针1-5

<400> 62

cgctaatagc gattaaaaaa aaaaatccgt cttccgggac tgatc 45

<210> 63

<211> 46

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> dapB V型探针2-5

<400> 63

cggtattcgc ttgcacagcg aaaaaaaaaa cagcgcgaac actctt 46

<210> 64

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> UBC检测探针

<400> 64

tgcgtctatt tagtggagcc 20

<210> 65

<211> 66

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> UBC锁式探针

<400> 65

attagcggtc cgtctaggag agtagtacag cagccgtcaa gagtgttgcg tctatttagt 60

ggagcc 66

<210> 66

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> dapB检测探针

<400> 66

tcgcgcttgg tataatcgct 20

<210> 67

<211> 66

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> dapB锁式探针

<400> 67

attagcggtc cgtctaggag agtagtacag cagccgtcaa gagtgttcgc gcttggtata 60

atcgct 66

<210> 68

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> HER2 RNA位点1

<400> 68

tgcccaccaa tgccagcctg 20

<210> 69

<211> 35

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针10nt1-1

<400> 69

cgctaatagt cgataaaaaa aaaaattggt gggca 35

<210> 70

<211> 36

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针10nt2-1

<400> 70

caggctggca aaaaaaaaaa tggctactac actctt 36

<210> 71

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> RNA位点2

<400> 71

acagagatct tgaaaggagg 20

<210> 72

<211> 35

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针10nt1-2

<400> 72

cgctaatagt cgataaaaaa aaaaaagatc tctgt 35

<210> 73

<211> 36

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针10nt2-2

<400> 73

cctcctttca aaaaaaaaaa tggctactac actctt 36

<210> 74

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> RNA位点3

<400> 74

ggacgtggga tcctgcaccc 20

<210> 75

<211> 35

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针10nt1-3

<400> 75

cgctaatagt cgataaaaaa aaaaatccca cgtcc 35

<210> 76

<211> 36

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针10nt2-3

<400> 76

gggtgcagga aaaaaaaaaa tggctactac actctt 36

<210> 77

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> RNA位点1

<400> 77

cctgcccacc aatgccagcc tgtc 24

<210> 78

<211> 37

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针12nt1-1

<400> 78

cgctaatagt cgataaaaaa aaaaattggt gggcagg 37

<210> 79

<211> 38

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针12nt2-1

<400> 79

gacaggctgg caaaaaaaaa aatggctact acactctt 38

<210> 80

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> RNA位点2

<400> 80

tcacagagat cttgaaagga gggg 24

<210> 81

<211> 37

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针12nt1-2

<400> 81

cgctaatagt cgataaaaaa aaaaaagatc tctgtga 37

<210> 82

<211> 38

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针12nt2-2

<400> 82

cccctccttt caaaaaaaaa aatggctact acactctt 38

<210> 83

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> RNA位点3

<400> 83

acggacgtgg gatcctgcac cctc 24

<210> 84

<211> 37

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针12nt1-3

<400> 84

cgctaatagt cgataaaaaa aaaaatccca cgtccgt 37

<210> 85

<211> 38

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针12nt2-3

<400> 85

gagggtgcag gaaaaaaaaa aatggctact acactctt 38

<210> 86

<211> 30

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> RNA位点1

<400> 86

ctacctgccc accaatgcca gcctgtcctt 30

<210> 87

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针15nt1-1

<400> 87

cgctaatagt cgataaaaaa aaaaattggt gggcaggtag 40

<210> 88

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针15nt2-1

<400> 88

aaggacaggc tggcaaaaaa aaaaatggct actacactct t 41

<210> 89

<211> 30

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> RNA位点2

<400> 89

gcctcacaga gatcttgaaa ggaggggtct 30

<210> 90

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针15nt1-2

<400> 90

cgctaatagt cgataaaaaa aaaaaagatc tctgtgaggc 40

<210> 91

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针15nt2-2

<400> 91

agacccctcc tttcaaaaaa aaaaatggct actacactct t 41

<210> 92

<211> 30

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> RNA位点3

<400> 92

tctacggacg tgggatcctg caccctcgtc 30

<210> 93

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针15nt1-3

<400> 93

cgctaatagt cgataaaaaa aaaaatccca cgtccgtaga 40

<210> 94

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针15nt2-3

<400> 94

gacgagggtg caggaaaaaa aaaaatggct actacactct t 41

<210> 95

<211> 47

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针0nt1-1

<400> 95

cgctaatagt cgatagtaaa aaaaaaattg gtgggcaggt aggtgag 47

<210> 96

<211> 48

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针0nt2-1

<400> 96

gcaggaagga caggctggca aaaaaaaaaa cacggctact acactctt 48

<210> 97

<211> 47

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针0nt1-2

<400> 97

cgctaatagt cgatagtaaa aaaaaaaaga tctctgtgag gcttcga 47

<210> 98

<211> 48

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针0nt2-2

<400> 98

gatcaagacc cctcctttca aaaaaaaaaa cacggctact acactctt 48

<210> 99

<211> 47

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针0nt1-3

<400> 99

cgctaatagt cgatagtaaa aaaaaaatcc cacgtccgta gaaaggt 47

<210> 100

<211> 48

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针0nt2-3

<400> 100

gggcagacga gggtgcagga aaaaaaaaaa cacggctact acactctt 48

<210> 101

<211> 45

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针10nt1-1

<400> 101

cgctaatagt cgcgcaaaaa aaaaattggt gggcaggtag gtgag 45

<210> 102

<211> 46

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针10nt2-1

<400> 102

gcaggaagga caggctggca aaaaaaaaaa taactactac actctt 46

<210> 103

<211> 45

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针10nt1-2

<400> 103

cgctaatagt cgcgcaaaaa aaaaaagatc tctgtgaggc ttcga 45

<210> 104

<211> 46

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针10nt2-2

<400> 104

gatcaagacc cctcctttca aaaaaaaaaa taactactac actctt 46

<210> 105

<211> 45

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针10nt1-3

<400> 105

cgctaatagt cgcgcaaaaa aaaaatccca cgtccgtaga aaggt 45

<210> 106

<211> 46

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针10nt2-3

<400> 106

gggcagacga gggtgcagga aaaaaaaaaa taactactac actctt 46

<210> 107

<211> 68

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 锁式探针5'8+7-3'9+8

<400> 107

attagcgtgt ccgtctagga gagtagtaca gcagccgtca agagtgtcag tagccgtgac 60

tatcgact 68

<210> 108

<211> 67

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 锁式探针5'7+6-3'9+8

<400> 108

attagcggtc cgtctaggag agtagtacag cagccgtcaa gagtgtcagt agccgtgact 60

atcgact 67

<210> 109

<211> 66

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 锁式探针5'6+6-3'9+8

<400> 109

attagcgtcc gtctaggaga gtagtacagc agccgtcaag agtgtcagta gccgtgacta 60

tcgact 66

<210> 110

<211> 30

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> RNA位点1

<400> 110

ctacctgccc accaatgcca gcctgtcctt 30

<210> 111

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针5'8+7-1-1

<400> 111

acgctaatag tcgatcaaaa aaaaaattgg tgggcaggta g 41

<210> 112

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针5'7+6-1-1

<400> 112

cgctaatagt cgagcaaaaa aaaaattggt gggcaggtag 40

<210> 113

<211> 39

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针5'6+6-1-1

<400> 113

gctaatagtc gagcaaaaaa aaaattggtg ggcaggtag 39

<210> 114

<211> 42

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针3'9+8-2-1

<400> 114

aaggacaggc tggcaaaaaa aaaaacggct actgacactc tt 42

<210> 115

<211> 32

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> RNA位点2

<400> 115

agcctcacag agatcttgaa aggaggggtc tt 32

<210> 116

<211> 42

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针5'8+7-1-2

<400> 116

acgctaatag tcgatcaaaa aaaaaaagat ctctgtgagg ct 42

<210> 117

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针5'7+6-1-2

<400> 117

cgctaatagt cgagcaaaaa aaaaaagatc tctgtgaggc t 41

<210> 118

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针5'6+6-1-2

<400> 118

gctaatagtc gagcaaaaaa aaaaagatct ctgtgaggct 40

<210> 119

<211> 43

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针3'9+8-2-2

<400> 119

aagacccctc ctttcaaaaa aaaaaacggc tactgacact ctt 43

<210> 120

<211> 32

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> RNA位点3

<400> 120

ttctacggac gtgggatcct gcaccctcgt ct 32

<210> 121

<211> 42

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针5'8+7-1-3

<400> 121

acgctaatag tcgatcaaaa aaaaaatccc acgtccgtag aa 42

<210> 122

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针5'7+6-1-3

<400> 122

cgctaatagt cgagcaaaaa aaaaatccca cgtccgtaga a 41

<210> 123

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针5'6+6-1-3

<400> 123

gctaatagtc gagcaaaaaa aaaatcccac gtccgtagaa 40

<210> 124

<211> 43

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针3'9+8-2-3

<400> 124

agacgagggt gcaggaaaaa aaaaaacggc tactgacact ctt 43

<210> 125

<211> 32

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> RNA位点4

<400> 125

agaacctgca agtaatccgg ggacgaattc tg 32

<210> 126

<211> 42

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针5'8+7-1-4

<400> 126

acgctaatag tcgatcaaaa aaaaaaatta cttgcaggtt ct 42

<210> 127

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针5'7+6-1-4

<400> 127

cgctaatagt cgagcaaaaa aaaaaattac ttgcaggttc t 41

<210> 128

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针5'6+6-1-4

<400> 128

gctaatagtc gagcaaaaaa aaaaattact tgcaggttct 40

<210> 129

<211> 43

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针3'9+8-2-4

<400> 129

cagaattcgt ccccggaaaa aaaaaacggc tactgacact ctt 43

<210> 130

<211> 32

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> RNA位点5

<400> 130

cccacccagt gtgtcaactg cagccagttc ct 32

<210> 131

<211> 42

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针5'8+7-1-5

<400> 131

acgctaatag tcgatcaaaa aaaaaatgac acactgggtg gg 42

<210> 132

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针5'7+6-1-5

<400> 132

cgctaatagt cgagcaaaaa aaaaatgaca cactgggtgg g 41

<210> 133

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针5'6+6-1-5

<400> 133

gctaatagtc gagcaaaaaa aaaatgacac actgggtggg 40

<210> 134

<211> 43

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针3'9+8-2-5

<400> 134

aggaactggc tgcagtaaaa aaaaaacggc tactgacact ctt 43

<210> 135

<211> 67

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 锁式探针5'7+6-3'9+8

<400> 135

attagcggtc cgtctaggag agtagtacag cagccgtcaa gagtgtcagt agccgtgact 60

atcgact 67

<210> 136

<211> 65

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 锁式探针5'7+6-3'7+6

<400> 136

attagcggtc cgtctaggag agtagtacag cagccgtcaa gagtgagtag ccgtgactat 60

cgact 65

<210> 137

<211> 64

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 锁式探针5'7+6-3'6+6

<400> 137

attagcggtc cgtctaggag agtagtacag cagccgtcaa gagtagtagc cgtgactatc 60

gact 64

<210> 138

<211> 30

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> RNA位点1

<400> 138

ctacctgccc accaatgcca gcctgtcctt 30

<210> 139

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针5'7+6-1-1

<400> 139

cgctaatagt cgagcaaaaa aaaaattggt gggcaggtag 40

<210> 140

<211> 42

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针3'9+8-2-1

<400> 140

aaggacaggc tggcaaaaaa aaaaacggct actgacactc tt 42

<210> 141

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针3'8+7-2-1

<400> 141

aaggacaggc tggcaaaaaa aaaaatggct actacactct t 41

<210> 142

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针3'7+6-2-1

<400> 142

aaggacaggc tggcaaaaaa aaaaatagct actcactctt 40

<210> 143

<211> 39

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针3'6+6-2-1

<400> 143

aaggacaggc tggcaaaaaa aaaaatagct actactctt 39

<210> 144

<211> 32

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> RNA位点2

<400> 144

agcctcacag agatcttgaa aggaggggtc tt 32

<210> 145

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针5'7+6-1-2

<400> 145

cgctaatagt cgagcaaaaa aaaaaagatc tctgtgaggc t 41

<210> 146

<211> 43

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针3'9+8-2-2

<400> 146

aagacccctc ctttcaaaaa aaaaaacggc tactgacact ctt 43

<210> 147

<211> 42

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针3'8+7-2-2

<400> 147

aagacccctc ctttcaaaaa aaaaaatggc tactacactc tt 42

<210> 148

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针3'7+6-2-2

<400> 148

aagacccctc ctttcaaaaa aaaaaatagc tactcactct t 41

<210> 149

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针3'6+6-2-2

<400> 149

aagacccctc ctttcaaaaa aaaaaatagc tactactctt 40

<210> 150

<211> 32

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> RNA位点3

<400> 150

ttctacggac gtgggatcct gcaccctcgt ct 32

<210> 151

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针5'7+6-1-3

<400> 151

cgctaatagt cgagcaaaaa aaaaatccca cgtccgtaga a 41

<210> 152

<211> 43

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针3'9+8-2-3

<400> 152

agacgagggt gcaggaaaaa aaaaaacggc tactgacact ctt 43

<210> 153

<211> 42

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针3'8+7-2-3

<400> 153

agacgagggt gcaggaaaaa aaaaaatggc tactacactc tt 42

<210> 154

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针3'7+6-2-3

<400> 154

agacgagggt gcaggaaaaa aaaaaatagc tactcactct t 41

<210> 155

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针3'6+6-2-3

<400> 155

agacgagggt gcaggaaaaa aaaaaatagc tactactctt 40

<210> 156

<211> 32

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> RNA位点4

<400> 156

agaacctgca agtaatccgg ggacgaattc tg 32

<210> 157

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针5'7+6-1-4

<400> 157

cgctaatagt cgagcaaaaa aaaaaattac ttgcaggttc t 41

<210> 158

<211> 43

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针3'9+8-2-4

<400> 158

cagaattcgt ccccggaaaa aaaaaacggc tactgacact ctt 43

<210> 159

<211> 42

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针3'8+7-2-4

<400> 159

cagaattcgt ccccggaaaa aaaaaatggc tactacactc tt 42

<210> 160

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针3'7+6-2-4

<400> 160

cagaattcgt ccccggaaaa aaaaaatagc tactcactct t 41

<210> 161

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针3'6+6-2-4

<400> 161

cagaattcgt ccccggaaaa aaaaaatagc tactactctt 40

<210> 162

<211> 32

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> RNA位点5

<400> 162

cccacccagt gtgtcaactg cagccagttc ct 32

<210> 163

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针5'7+6-1-5

<400> 163

cgctaatagt cgagcaaaaa aaaaatgaca cactgggtgg g 41

<210> 164

<211> 43

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针3'9+8-2-5

<400> 164

aggaactggc tgcagtaaaa aaaaaacggc tactgacact ctt 43

<210> 165

<211> 42

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针3'8+7-2-5

<400> 165

aggaactggc tgcagtaaaa aaaaaatggc tactacactc tt 42

<210> 166

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针3'7+6-2-5

<400> 166

aggaactggc tgcagtaaaa aaaaaatagc tactcactct t 41

<210> 167

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针3'6+6-2-5

<400> 167

aggaactggc tgcagtaaaa aaaaaatagc tactactctt 40

<210> 168

<211> 65

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 锁式探针5'6+7-3'8+7

<400> 168

attagcgtcc gtctaggaga gtagtacagc agccgtcaag agtgtagtag ccgtgactat 60

cgact 65

<210> 169

<211> 30

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> RNA位点1

<400> 169

ctacctgccc accaatgcca gcctgtcctt 30

<210> 170

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针5'7+8-1-1

<400> 170

cgctaatagt cgataaaaaa aaaaattggt gggcaggtag 40

<210> 171

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针5'7+7-1-1

<400> 171

cgctaatagt cgatcaaaaa aaaaattggt gggcaggtag 40

<210> 172

<211> 39

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针5'6+7-1-1

<400> 172

gctaatagtc gatcaaaaaa aaaattggtg ggcaggtag 39

<210> 173

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针3'8+7-2-1

<400> 173

aaggacaggc tggcaaaaaa aaaaatggct actacactct t 41

<210> 174

<211> 32

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> RNA位点2

<400> 174

agcctcacag agatcttgaa aggaggggtc tt 32

<210> 175

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针5'7+8-1-2

<400> 175

cgctaatagt cgataaaaaa aaaaaagatc tctgtgaggc t 41

<210> 176

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针5'7+7-1-2

<400> 176

cgctaatagt cgatcaaaaa aaaaaagatc tctgtgaggc t 41

<210> 177

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针5'6+7-1-2

<400> 177

gctaatagtc gatcaaaaaa aaaaagatct ctgtgaggct 40

<210> 178

<211> 42

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针3'8+7-2-2

<400> 178

aagacccctc ctttcaaaaa aaaaaatggc tactacactc tt 42

<210> 179

<211> 32

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> RNA位点3

<400> 179

ttctacggac gtgggatcct gcaccctcgt ct 32

<210> 180

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针5'7+8-1-3

<400> 180

cgctaatagt cgataaaaaa aaaaatccca cgtccgtaga a 41

<210> 181

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针5'7+7-1-3

<400> 181

cgctaatagt cgatcaaaaa aaaaatccca cgtccgtaga a 41

<210> 182

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针5'6+7-1-3

<400> 182

gctaatagtc gatcaaaaaa aaaatcccac gtccgtagaa 40

<210> 183

<211> 42

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针3'8+7-2-3

<400> 183

agacgagggt gcaggaaaaa aaaaaatggc tactacactc tt 42

<210> 184

<211> 32

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> RNA位点4

<400> 184

agaacctgca agtaatccgg ggacgaattc tg 32

<210> 185

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针5'7+8-1-4

<400> 185

cgctaatagt cgataaaaaa aaaaaattac ttgcaggttc t 41

<210> 186

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针5'7+7-1-4

<400> 186

cgctaatagt cgatcaaaaa aaaaaattac ttgcaggttc t 41

<210> 187

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针5'6+7-1-4

<400> 187

gctaatagtc gatcaaaaaa aaaaattact tgcaggttct 40

<210> 188

<211> 42

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针3'8+7-2-4

<400> 188

cagaattcgt ccccggaaaa aaaaaatggc tactacactc tt 42

<210> 189

<211> 32

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> RNA位点5

<400> 189

cccacccagt gtgtcaactg cagccagttc ct 32

<210> 190

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针5'7+8-1-5

<400> 190

cgctaatagt cgataaaaaa aaaaatgaca cactgggtgg g 41

<210> 191

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针5'7+7-1-5

<400> 191

cgctaatagt cgatcaaaaa aaaaatgaca cactgggtgg g 41

<210> 192

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针5'6+7-1-5

<400> 192

gctaatagtc gatcaaaaaa aaaatgacac actgggtggg 40

<210> 193

<211> 42

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> V型探针3'8+7-2-5

<400> 193

aggaactggc tgcagtaaaa aaaaaatggc tactacactc tt 42

<210> 194

<211> 45

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> HER2 双C探针1-1

<400> 194

ttggtgggca ggtaggtgag aaaaaaaaaa cgctaatagt cgata 45

<210> 195

<211> 45

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> HER2 双C探针1-2

<400> 195

agatctctgt gaggcttcga aaaaaaaaaa cgctaatagt cgata 45

<210> 196

<211> 45

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> HER2 双C探针1-3

<400> 196

tcccacgtcc gtagaaaggt aaaaaaaaaa cgctaatagt cgata 45

Claims

1.一种检测样品中一种或多种靶核酸的存在或其水平的方法，所述方法包括：

(a)提供怀疑含有一种或多种靶核酸的检测样品，并且，针对每一种靶核酸，提供至少1个探针组，所述探针组包括第一探针、第二探针、锁式探针和检测探针；

其中，所述第一探针的序列包含：(i)与锁式探针特异性结合的第一互补序列；(ii)与所述靶核酸特异性结合的第一靶结合序列；(iii)用于连接第一互补序列和第一靶结合序列的第一连接序列；其中，所述第一连接序列不与靶核酸或锁式探针结合；

所述第二探针的序列从5’至3’方向包含：(i)与所述靶核酸特异性结合的第二靶结合序列；(ii)与锁式探针特异性结合的第二互补序列；(iii)用于连接第二靶结合序列和第二互补序列的第二连接序列；其中，所述第二连接序列不与靶核酸或锁式探针结合；

(c)在允许扩增的条件下，使用扩增酶对步骤(b)的产物进行滚环扩增；

(e)根据检测探针的信号的存在或水平，确定检测样品中靶核酸的存在或其水平；

其中，所述第一探针的第一互补序列与所述锁式探针的第一区域杂交，且所述第二探针的第二互补序列与所述锁式探针的第二区域杂交，并且，所述第一区域与所述第二区域之间含有位于检测探针序列内的间隔序列，所述间隔序列的长度为0-10nt；

其中，所述第一和第二靶结合序列的长度各自独立地为12-50nt。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，提供至少2个，至少3个，至少5个，或更多个探针组。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一靶结合序列位于所述第一互补序列的上游或者下游。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一靶结合序列与第二靶结合序列在所述靶核酸上间隔0nt。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，所述方法具有选自下列的一个或多个特征：

(1)所述检测样品选自单细胞，细胞群，组织，器官，或其任何组合；

(2)所述细胞选自真核细胞，原核细胞，古细菌细胞，人工细胞，或其任何组合；

(3)所述靶核酸为DNA和/或RNA；

(4)所述可检测标记选自荧光标记，生物发光标记，化学发光标记，同位素标记，或其任何组合；

(5)所述扩增酶为核酸聚合酶。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述核酸聚合酶为DNA聚合酶。

7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述核酸聚合酶为热稳定的DNA聚合酶。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述热稳定的DNA聚合酶获自，Thermusaquaticus(Taq),Thermus thermophiles(Tth),Thermus filiformis,Thermis flavus,Thermococcus literalis,Thermus antranildanii,Thermus caldophllus,Thermuschliarophilus,Thermus flavus,Thermus igniterrae,Thermus lacteus,Thermusoshimai,Thermus ruber,Thermus rubens,Thermus scotoductus,Thermus silvanus,Thermus thermophllus,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosiphoafricanus,Thermococcus litoralis,Thermococcus barossi,Thermococcusgorgonarius,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosiphoafricanus,Pyrococcus woesei,Pyrococcus horikoshii,Pyrococcus abyssi,Pyrodictiumoccultum,Aquifexpyrophilus和Aquifex aeolieus。

9.根据权利要求6所述的方法，其中，所述DNA聚合酶为Φ29聚合酶。

10.根据权利要求5所述的方法，其中，所述RNA为mRNA。

11.根据权利要求5所述的方法，其中，为所述荧光标记选自ALEX-350，FAM，VIC，TET，CAL Fluor Gold 540，JOE，HEX，CAL Fluor Orange 560，TAMRA，CAL Fluor Red 590，ROX，CAL Fluor Red 610，TEXAS RED，CAL Fluor Red 635，Quasar 670，CY3，CY5，CY5.5或Quasar 705。

12.根据权利要求5所述的方法，其中，所述扩增酶是模板依赖性核酸聚合酶。

13.根据权利要求1-4任一项所述的方法，所述方法具有选自下列的一个或多个特征：

(1)预处理所述检测样品；

(2)提供怀疑含有一种或多种靶核酸的检测样品、第一探针、第二探针、锁式探针和连接酶，并使检测样品与第一探针、第二探针、锁式探针和连接酶接触，然后提供检测探针，或者，提供怀疑含有一种或多种靶核酸的检测样品、第一探针、第二探针、锁式探针、连接酶和检测探针，并使检测样品与它们接触。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述连接酶选自T4 DNA连接酶，DNA连接酶Ⅰ，DNA连接酶Ⅲ和DNA连接酶Ⅳ。

15.根据权利要求13所述的方法，其中，所述连接酶为T4 DNA连接酶。

16.根据权利要求13所述的方法，其中，所述预处理选自细胞透化，核酸提取，纯化，富集。

17.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中，所述第一探针和第二探具有选自下列的一个或多个特征：

(1)所述第一探针和第二探针各自独立地包含或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；

(2)所述第一探针和第二探针的长度各自独立地为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-200nt，200-300nt，300-400nt，400-500nt，500-600nt，600-700nt，700-800nt，800-900nt，900-1000nt；

(3)所述第一互补序列和第二互补序列的长度各自独立地为10-15nt，15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt；

(4)所述第一互补序列具有与骨架序列互补的第一部分，以及与检测探针序列互补的第二部分；

(5)所述第二互补序列具有与骨架序列互补的第三部分，以及与检测探针序列互补的第四部分；

(6)所述第一和第二连接序列的长度各自独立地为5-10nt，10-15nt，15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt。

18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述天然存在的核苷酸为脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。

19.根据权利要求17所述的方法，其中，所述非天然的核苷酸为肽核酸或锁核酸。

20.根据权利要求17所述的方法，其中，所述第一互补序列和第二互补序列的长度各自独立地为10-20nt。

21.根据权利要求17所述的方法，其中，所述第一部分、第二部分、第三部分和第四部分的长度各自独立地为0nt-15nt。

22.根据权利要求17所述的方法，其中，所述第一部分、第二部分、第三部分和第四部分的长度各自独立地为5nt，6nt，7nt，8nt，9nt或10nt。

23.根据权利要求17所述的方法，其中，所述第一和第二连接序列的长度各自独立地为5nt，6nt，7nt，8nt，9nt，10nt，11nt，12nt，13nt，14nt或15nt。

24.根据权利要求17所述的方法，其中，所述第一和第二靶结合序列的长度各自独立地为12-15nt，15-20nt，20-30nt，30-40nt或40-50nt。

25.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中，所述检测探针具有选自下列的一个或多个特征：

(1)所述检测探针各自独立地包含或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；

(2)所述检测探针的长度各自独立地为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-200nt，200-300nt，300-400nt，400-500nt，500-600nt，600-700nt，700-800nt，800-900nt，900-1000nt；

(3)所述检测探针各自独立地具有3'-OH末端；或者，所述探针的3'-末端是封闭的；

(4)所述检测探针各自独立地是线性的，或者具有发夹结构；

(5)所述检测探针各自独立地带有可检测标记；

(6)所述检测探针不可被核酸聚合酶降解。

26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述天然存在的核苷酸为脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。

27.根据权利要求25所述的方法，其中，所述非天然的核苷酸为肽核酸或锁核酸。

28.根据权利要求25所述的方法，其中，通过在探针的最后一个核苷酸的3'-OH上添加化学部分，通过将探针的最后一个核苷酸的3'-OH去除，或者将所述最后一个核苷酸替换为双脱氧核苷酸，从而封闭检测探针的3'-末端。

29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述化学部分是生物素或烷基。

30.根据权利要求25所述的方法，其中，所述不同探针组中的检测探针具有不同的可检测标记。

31.根据权利要求25所述的方法，其中核酸聚合酶是DNA聚合酶。

32.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中，所述锁式探针具有选自下列的一个或多个特征：

(1)所述锁式探针在自然状态下，为一条线性的连续的多核苷酸；

(2)所述锁式探针在与第一探针和第二探针杂交或退火的状态下，为带有一个缺口的环状多核苷酸；

(3)所述锁式探针各自独立地包含或者由天然存在的核苷酸，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；

(4)所述锁式探针的长度各自独立地为15-20nt，20-30nt，30-40nt，40-50nt，50-60nt，60-70nt，70-80nt，80-90nt，90-100nt，100-200nt，200-300nt，300-400nt，400-500nt，500-600nt，600-700nt，700-800nt，800-900nt，900-1000nt；

(5)所述锁式探针不可被核酸聚合酶降解。

33.根据权利要求32所述的方法，其中，所述天然存在的核苷酸为脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。

34.根据权利要求32所述的方法，其中，所述非天然的核苷酸为肽核酸或锁核酸。

35.根据权利要求32所述的方法，其中，核酸聚合酶是DNA聚合酶。

36.一种探针组，所述探针组包括第一探针、第二探针、锁式探针和检测探针；

37.根据权利要求36所述的探针组，其中，所述第一靶结合序列位于所述第一互补序列的上游或者下游。

38.一种试剂盒，其包含一个或多个根据权利要求36或37所述的探针组。

39.根据权利要求38的试剂盒，其中，所述试剂盒还包含选自连接酶，扩增酶，用于进行核酸扩增的试剂，用于滚环扩增的试剂，用于检测荧光信号的试剂，或其任何组合。

40.根据权利要求38的试剂盒，其中，所述试剂盒具有选自下列的一个或多个特征：

(1)所述连接酶选自T4 DNA连接酶，DNA连接酶Ⅰ，DNA连接酶Ⅲ和DNA连接酶Ⅳ；

(2)所述扩增酶为核酸聚合酶；

(3)所述检测探针具有如权利要求17所述的特征；

(4)所述用于进行核酸扩增的试剂包括，酶的工作缓冲液、dNTPs、水、包含离子的溶液、单链DNA结合蛋白、或其任何组合；

(5)用于滚环扩增的试剂选自无核糖核酸酶水，dNTPs，RNA酶抑制剂，或其任何组合。

41.根据权利要求40的试剂盒，其中，所述连接酶为T4 DNA连接酶。

42.根据权利要求40的试剂盒，其中，所述核酸聚合酶是模板依赖性核酸聚合酶。

43.根据权利要求40的试剂盒，其中，所述核酸聚合酶为热稳定的DNA聚合酶。

44.根据权利要求43的试剂盒，其中，所述热稳定的DNA聚合酶获自，Thermusaquaticus(Taq),Thermus thermophiles(Tth),Thermus filiformis,Thermis flavus,Thermococcus literalis,Thermus antranildanii,Thermus caldophllus,Thermuschliarophilus,Thermus flavus,Thermus igniterrae,Thermus lacteus,Thermusoshimai,Thermus ruber,Thermus rubens,Thermus scotoductus,Thermus silvanus,Thermus thermophllus,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosiphoafricanus,Thermococcus litoralis,Thermococcus barossi,Thermococcusgorgonarius,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosiphoafricanus,Pyrococcus woesei,Pyrococcus horikoshii,Pyrococcus abyssi,Pyrodictiumoccultum,Aquifexpyrophilus和Aquifex aeolieus。

45.根据权利要求40的试剂盒，其中，所述核酸聚合酶为Φ29聚合酶。

46.根据权利要求40的试剂盒，其中，所述酶是核酸聚合酶。

47.根据权利要求40的试剂盒，其中，所述离子是Mg²⁺。

48.根据权利要求40的试剂盒，其中，所述dNTPs是标记或未标记的dNTPs。

49.根据权利要求40的试剂盒，其中，所述试剂盒用于检测样品中一种或多种靶核酸的存在或其水平。