CN109072225A - 用于检测靶核酸的方法和系统 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于核酸检测和鉴别的方法和系统。

Description

用于检测靶核酸的方法和系统
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.119(e)要求2016年2月20日提交的美国申请号62/297,826和2016年2月26日提交的美国申请号62/300,623的优先权。
技术领域
本公开一般涉及用于检测核酸的方法和系统。
背景技术
可以通过各种定性和/或定量的方法实施少量靶核酸的检测，大多数所述方法使用两种主要策略——信号放大或靶核酸扩增。在后一种方法中，采用各种荧光标记探针的设计以提高特异性的qPCR方法认为是各种医学和非医学应用的金标准。然而，在使用点或护理点背景中，对无需庞大、昂贵和/或精密设备的检测核酸的方法和组合物存在需要。
发明内容
在一方面，提供了无扩增的靶核酸序列检测的方法。此类方法通常包括：(a)提供包含至少一个靶核酸序列的样品；(b)使所述样品与包含核酸部分和带正电荷的标签的探针接触，其中所述核酸部分与靶核酸序列的至少一部分互补，其中所述接触在核酸部分和互补的靶核酸序列之间形成探针-靶复合物的条件下进行；(c)在探针-靶复合物内切割探针以释放可检测的带正电荷的标签；和(d)基于电信号的变化检测释放的带正电荷的标签通过纳米微孔的移动；其中电信号的变化指示样品中存在靶核酸序列。
在一些实施方案中，所述探针进一步包含选自下组的易切割的连接：RNA序列、DNA序列和无碱基核苷酸序列。易切割的连接可以包括至少一个RNA残基。易切割的连接可以包括氧化嘌呤或氧化嘧啶。易切割的连接可以包括无嘌呤位点或无嘧啶位点。易切割的连接可以包括脱氧尿苷、5-羟基尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶或5-甲酰基尿嘧啶。可以通过1型核糖核酸酶H或2型核糖核酸酶H切割易切割的连接。可以通过DNA N-糖苷酶和DNA AP-裂合酶活性的组合切割易切割的连接。可以通过DNA AP-裂合酶活性或内切脱氧核糖核酸酶切割易切割的连接。可以通过DNA N-糖苷酶和内切脱氧核糖核酸酶的组合，或DNA N-糖苷酶和DNAAP-裂合酶活性的组合切割易切割的连接。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括：在步骤(b)中，进一步使所述样品与引物接触，其中所述引物与靶核酸序列的至少一部分互补，所述靶核酸序列的至少一部分在探针与其互补的靶核酸序列的部分的上游，其中所述接触在引物和互补的靶核酸序列之间形成引物-靶复合物的条件下进行；和在步骤(c)中，使包含引物-靶复合物的样品与DNA聚合酶在引物延伸发生的条件下接触。
在一些实施方案中，在引物延伸期间通过DNA聚合酶切割所述探针。在一些实施方案中，通过DNA聚合酶的5’核酸酶活性介导所述切割。
在一些实施方案中，通过DNA聚合酶的延伸受反应中存在的dNTP类型数量的限制。在一些实施方案中，反应中存在的dNTP的数量为四种dNTP的一种，或两种，或三种。
此类方法可以进一步包括：在步骤(b)中，进一步使所述样品与至少两个引物接触，其中所述至少两个引物与靶核酸序列的部分互补，所述靶核酸序列的部分在探针与其互补的靶核酸序列的部分的旁侧，其中所述接触在所述至少两个引物和互补的靶核酸序列之间形成引物-靶复合物的条件下进行；和在步骤(c)中，使用DNA聚合酶扩增所述至少两个引物之间的靶核酸序列。
在一些实施方案中，扩增靶核酸序列包括聚合酶链式反应(PCR)或等温反应。在一些实施方案中，通过DNA聚合酶在扩增期间切割所述探针。在一些实施方案中，通过DNA聚合酶的5’瓣状内切核酸酶活性介导所述切割。在一些实施方案中，切割导致可检测的带正电荷的标签的检测，其指示靶扩增子的复制。
在一些实施方案中，所述探针包含净负电荷。在一些实施方案中，所述可检测的带正电荷的标签在释放之前和之后包含净正电荷。在一些实施方案中，所述可检测的带正电荷的标签在释放之前和之后包含带正电荷的核酸部分、非核酸部分或它们的组合。
在一些实施方案中，所述接触步骤包括使样品与多个探针接触，所述探针各自与至少两个不同的靶核酸序列互补并各自具有不同的正电荷(量或类型)，并且其中电信号(类型/量)能够区分所述至少两个不同的靶核酸序列。在一些实施方案中，所述切割步骤包括酶促切割所述探针。
在一些实施方案中，所述可检测的带正电荷的标签通过纳米微孔。在一些实施方案中，所述可检测的带正电荷的标签可通过它的电荷、形状、大小或它们的任何组合来检测。
在一些实施方案中，所述检测步骤进一步包括鉴别所述可检测的带正电荷的标签。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将经鉴别的标签与相应的靶核酸序列的存在相关联。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将电信号的量/水平与样品中靶核酸序列的量相关联。
在一些实施方案中，使用离子敏感的场效应晶体管检测所述可检测的带正电荷的标签。在一些实施方案中，所述方法使用计算机处理器。
在另一方面，提供了使用靶物特异性探针检测样品中的靶核酸的方法。此类方法通常包括(a)提供包含多个单链核酸片段的样品；(b)分子内环化所述单链核酸以产生单链环；(c)使所述单链环与至少一个探针特异性寡核苷酸引物接触，所述接触在所述至少一个探针特异性寡核苷酸引物与所述单链环中互补的序列杂交并形成双链引物-环复合物的杂交条件下进行；(d)使双链引物-环复合物与酶接触，所述接触在滚环复制发生的条件下进行；(e)使滚环复制的产物与靶物特异性的经染料标记的检测器探针接触，所述接触在所述靶物特异性的经染料标记的检测器探针与滚环复制的产物中互补的序列杂交的条件下进行；和(f)检测所述靶物特异性的经染料标记的检测器探针，其中所述靶物特异性的经染料标记的检测器探针的存在指示样品中存在靶核酸。
在一些实施方案中，所述靶物特异性探针与固体支持物结合。在一些实施方案中，通过单链DNA连接酶介导所述环化步骤。在一些实施方案中，所述方法进一步包括酶促消化未环化的线性核酸以富集单链环。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使滚环复制的产物沉积在固体支持物上。
在一些实施方案中，使用成像实施所述检测步骤。在一些实施方案中，所述检测步骤包括使滚环复制的产物沉积在固体支持物的表面上。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括定量所述靶物特异性的经染料标记的检测器探针和将靶物特异性的经染料标记的检测器探针与样品中的靶核酸的量相关联。
在一些实施方案中，所述方法用于对于检测胎儿非整倍性的产前检测并进一步包括：其中样品中的多个单链核酸片段包含胎儿和母体的无细胞基因组DNA；其中所述至少一个靶物特异性探针包含多个染色体特异性探针，其中所述多个染色体特异性探针包含第一组探针和第二组探针，所述第一组探针包含至少100个对应于针对非整倍性检测的第一染色体的不同的核酸序列，所述第二组探针包含至少100个对应于参考染色体的不同的核酸序列，其中针对非整倍性检测的第一染色体和参考染色体不同；其中所述至少一个靶物特异性探针包含多个染色体特异性探针；其中所述至少一个探针特异性寡核苷酸引物包含多个染色体特异性寡核苷酸引物，其中所述多个染色体特异性寡核苷酸引物包含至少一个对衍生自针对非整倍性检测的第一染色体的单链环特异的染色体特异性寡核苷酸引物，和至少一个对衍生自参考染色体的单链环特异的染色体特异性寡核苷酸引物；有选择地扩增双链引物-环复合物以生成线性单链产物，其中所述靶物特异性的经染料标记的检测器探针为多个染色体特异性染料标记的检测器探针，其中所述多个染色体特异性检测器探针包含至少一个与来自针对非整倍性检测的第一染色体的染色体特异性探针互补的染色体特异性检测器探针，和至少一个与来自参考染色体的染色体特异性探针互补的染色体特异性检测器探针，其中用第一荧光染料标记所述多个对针对非整倍性检测的第一染色体特异的染色体特异性染料标记的检测器探针并用第二荧光染料标记所述多个对参考染色体特异的染色体特异性染料标记的检测器探针，其中包含第一荧光染料的染色体特异性染料标记的检测器探针的存在指示存在胎儿非整倍性。
在一些实施方案中，所述多个染色体特异性探针共享共同的定制序列。在一些实施方案中，所述共同的定制序列包含与染色体特异性寡核苷酸引物互补的区域和与染色体特异性染料标记的检测器探针互补的区域。
有代表性的胎儿非整倍性包括但不限于21三体性、18三体性、13三体性、X单体性、三重X综合征、XYY综合征和XXY综合征。
在另一方面，提供了包括至少一组与至少两个不同的人染色体互补的染色体特异性寡核苷酸引物的组合物，包含：与来自第一染色体的多个靶序列互补的第一组染色体特异性寡核苷酸引物和与来自第二染色体的多个靶序列互补的第二组染色体特异性寡核苷酸引物。
在另一方面，提供了包括至少一组用于检测至少两个人染色体的染色体特异性染料标记的检测器探针的组合物包含：与多个对第一染色体特异的探针特异性寡核苷酸引物互补的第一组染色体特异性染料标记的检测器探针，和与多个对第二染色体特异的探针特异性寡核苷酸引物互补的第二组染色体特异性染料标记的检测器探针。
在另一方面，提供了包括本文所述的两种组合物的试剂盒。
本文提供了电子检测靶核酸的方法和系统，其包括核酸“无扩增”和“有扩增”方法和检测组合物，包括具有电子可检测的带正电荷的标签；和检测带正电荷的标签的系统，所述系统包含具有集成纳米微孔检测器的微流控装置，包含温度控制、两个室、具有放大器的电路板、具有至少一个纳米微孔的电阻屏障和信号处理软件；用于实施靶扩增和纳米微孔传感器检测的试剂盒。
在一方面，提供了检测靶核酸的方法。在一些实施方案中，所述方法为直接靶检测的方法，其包括：提供包含至少一个多核苷酸序列的样品，提供包含与靶序列互补的部分和可检测的带正电荷的标签的探针，提供用于将探针与靶多核苷酸序列杂交以形成探针-靶复合物以及用于随后的可检测标签的杂交依赖性酶切的条件，其中从探针释放标签，提供用于所述释放的标签流过纳米微孔的条件，借助电极检测标签，其中通过从所述探针释放后电信号的生成来检测标签；并且其中所述检测标签进一步包括鉴别所述标签；并且其中特异性可检测标签的检测转而检测到切割事件并因此检测到靶，将检测到的电信号与样品中存在的靶多核苷酸序列的量相关联。
在一些实施方案中，步骤(a)的靶多核苷酸序列位于双链或单链多核苷酸片段上。在一些实施方案中，步骤(a)的靶多核苷酸片段为脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。在一些实施方案中，靶多核苷酸片段包含各种病毒、细菌、真菌和高等真核生物DNA和RNA。
在一些实施方案中，步骤(b)的探针包含与靶和带正电荷的标签互补的带负电荷的寡核苷酸序列。在一些实施方案中，带正电荷的标签附接在带负电荷的互补部分的5’-或3’-末端。在一些实施方案中，两个不同的标签附接在探针的互补部分：一个在5’末端，另一个在3’-末端。在一些实施方案中，对于多重的靶检测，标签在正电荷的数量和/或化学结构上有所不同，以提供差异标签鉴别的手段。在一些实施方案中，化学结构上的差异进一步包含化合物的质量和形状上的差异。可以在探针与靶序列杂交后切除带正电荷的标签。
在一些实施方案中，提供了用于步骤(b)的探针与靶多核苷酸序列杂交以形成步骤(c)的探针-靶复合物的化学和热条件。在一些实施方案中，提供了用于可检测标签的杂交依赖性切割的条件，其中从探针释放标签。在一些实施方案中，标签的切割取决于探针与靶多核苷酸的杂交和探针中存在的易切割连接的酶催化的断裂两者。在一些实施方案中，切割在与靶互补的探针的部分内并与该部分和可检测的标签之间的接界相邻。在一些实施方案中，释放的标签含有几个衍生自探针的靶互补部分的核苷酸(带负电荷)，但释放的可检测标签的总体全局电荷为正。
在一些实施方案中，在步骤(d)，在微流控芯片的含有电解质溶液的顺式和反式室上施加电势，其中通过具有至少一个嵌入的纳米微孔的电阻屏障将室分开。这提供了用于使带净正电荷的标签通过流过纳米微孔从顺式室(+)移动到反式室(-)的条件，而带有净负电荷的未经切割的探针、带负电荷的引物、靶核酸和扩增产物留在顺式室中。在一些实施方案中，在整个切割反应期间连续施加电势，或在特定时间间隔以脉冲形式施加电势(实时检测模式)。在一些实施方案中，在切割反应完成后提供释放的标签流过纳米微孔的条件(终点检测模式)。
在一些实施方案中，释放的标签以不同的程度和持续时间阻断通过纳米微孔的离子电流，因此，产生电导的变化。在一些实施方案中，每个标签的电子变化是不同的，从而鉴别所述标签。在一些实施方案中，标签的检测转而检测到切割事件并因此检测到靶核酸的存在。
在一些实施方案中，电子变化的数量对应于流过纳米微孔的标签的数量，从而将检测到的电信号的数量与样品中存在的靶多核苷酸序列的量相关联。在一些实施方案中，电导变化的程度作为标签标识符，与样品中特定靶序列的量相关联，从而允许样品中每个标签的定量。
在另一方面，提供了多个靶同时(称为多重)的检测。在一些实施方案中，如本文所述的实施靶的检测。
在另一方面，提供了检测靶核酸的另外的方法。在一些实施方案中，所述方法为使用核酸扩增的靶检测的方法，并且它包括：提供包含至少一个多核苷酸序列的样品，提供至少一对核酸扩增引物，提供包含与靶序列互补的部分和可检测的带正电荷的标签的探针，实施聚合酶驱动的核酸扩增，提供用于将探针与靶多核苷酸序列杂交以形成探针-靶复合物以及随后的可检测标签的杂交依赖性酶切的条件，其中从探针释放标签，提供所述释放的标签流过纳米微孔的条件；借助电极检测标签，其中通过从所述探针释放后电信号的生成来检测标签；并且其中所述检测标签进一步包括鉴别所述标签；并且其中特异性可检测标签的检测转而检测到切割事件并因此检测到靶扩增子的复制，将检测到的电信号与样品中存在的靶多核苷酸序列的量相关联。
在一些实施方案中，使用至少一对步骤(b)的寡核苷酸引物扩增靶核酸，以选择指数扩增的DNA区域(扩增子)的位置和大小/长度。在一些实施方案中，可以使用一个引物以线性扩增靶核酸。
在一些实施方案中，步骤(d)的聚合酶驱动的核酸扩增为指数的，例如聚合酶链式反应(PCR)。在一些实施方案中，步骤(d)的聚合酶驱动的核酸扩增为线性的，例如用一个引物的聚合酶热循环反应。在一些实施方案中，步骤(d)的聚合酶驱动的核酸扩增为热循环PCR。在一些实施方案中，步骤(d)的聚合酶驱动的核酸扩增为等温扩增反应，例如重组酶聚合酶扩增(RPA)。
在一些实施方案中，提供了用于将步骤(c)的探针与靶多核苷酸序列杂交以形成步骤(e)的探针-靶复合物的化学和热条件。在一些实施方案中，提供了用于可检测标签的杂交依赖性切割的条件，其中从探针释放标签。在一些实施方案中，标签的切割取决于DNA合成期间探针的杂交和探针的聚合酶催化的切割两者，其中切割的位置不是精确固定的。在一些实施方案中，通过除DNA聚合酶之外的酶实施切割，并且它在探针的互补部分内的位置是固定的并通过探针的易切割连接的位置确定。在一些实施方案中，步骤(e)的切割在与靶互补的探针的部分内并与该部分和可检测的标签之间的接界相邻。在一些实施方案中，释放的标签含有几个衍生自探针的靶互补部分的核苷酸(带负电荷)，但释放的可检测标签的总体全局电荷为正。
在一些实施方案中，释放的标签以不同的程度阻断通过纳米微孔的离子电流，因此，产生电导的变化。在一些实施方案中，每个标签的电子变化是不同的，从而鉴别所述标签。在一些实施方案中，标签的检测转而检测到切割事件并因此检测到靶扩增子的复制。
在另一方面，靶核酸检测系统，其包含具有输入端口和集成纳米微孔检测器(传感器)芯片的微流控装置。所述装置包含温度控制、具有与导电溶液接触的相应电极的两个(顺式和反式)室；分离两种电解质溶液的具有直径为纳米级的嵌入的纳米微孔的电阻屏障、集成传感电路和信号处理软件。在一些实施方案中，所述纳米微孔可以为固态纳米微孔，在其他实施方案中它可以为生物纳米微孔。在一些实施方案中多个纳米微孔检测器可以形成纳米微孔阵列。在一些实施方案中，纳米微孔检测器是可单独寻址的。
在另一方面，呈现了电导测量系统，其包含：(a)分离具有电解质溶液的两个室的电阻屏障；(b)所述电阻屏障包含至少一个纳米微孔；(c)在顺式室的电解质溶液中的至少一个具有标签的探针；(d)使所述至少一个纳米微孔能够允许通过施加的电势驱动离子电流穿过电解质溶液；(e)配置所述至少一个靶核酸和生化反应组分以实施无扩增直接检测或DNA扩增偶联检测，并从探针释放可检测的标签；(f)测量离子电流的手段；(g)将电导时间过程记录为时间序列的手段。
在另一方面，提供了将电导时间序列的区段描绘成统计学上与无阻碍微孔和由流动标签瞬时阻碍的微孔的电导一致的区域，并且按类型定量标签并将这些数据转变为样品中存在的靶核酸的量的方法。
在另一方面，提供了用于实施如本文所述的检测核酸方法的试剂盒。
本文还提供了检测包含核酸片段的样品中的靶核酸的方法和组合物。一些方法包括靶物特异性探针的环化和随后的探针扩增以检测并计数靶。其他方法包括样品中存在的核酸片段的环化、包含靶核酸的环化片段的选择性线性扩增和扩增产物的检测。还提供了使用母体血液中循环的无细胞DNA以检测常见染色体非整倍性的无创产前检测(NIPT)的方法。组合物可以包含多个靶物特异性探针组、探针组特异性检测器探针和靶物特异性检测器探针。
在一方面，提供了使用靶物特异性探针检测样品中靶核酸的方法(图9A)，所述方法包括：提供包含多个多核苷酸片段的样品；提供使多核苷酸片段转化为单链形式的变性条件；使样品与至少一个靶物特异性探针接触；提供退火/杂交和连接的条件，在所述条件下靶物特异性探针与核酸片段内的它的靶序列杂交并生成连接产物，每个连接产物为包含至少一个连接接界的线性多核苷酸；提供线性多核苷酸分子内环化的条件，包括连接所述线性多核苷酸的游离末端的条件，导致形成单链环；通过酶促消化未环化的线性核酸来富集单链环；使单链环与探针特异性或靶物特异性寡核苷酸引物接触，包括退火条件，在所述条件下引物与环的互补序列杂交以形成适合于DNA合成起始的双链引物-环复合物；检测滚环复制的产物，包括使所述产物沉积在固相上、使所述产物与靶物特异性的经染料标记的检测器探针杂交和成像，其中检测到所述产物指示样品中存在靶多核苷酸；和用检测到的染料特异性信号计数产物，并将检测到的滚环复制的产物与样品中存在的靶多核苷酸序列的量相关联。
在一些实施方案中，(a)的样品包含片段化的脱氧核糖核酸或核糖核酸。在一些实施方案中，核酸片段包含各种病毒、细菌、酵母、真菌、高等真核生物或人DNA和RNA。
在一些实施方案中，通过逆转录的过程将核糖核酸的片段转化为脱氧核糖核酸，其中核糖核酸模板链由核糖核酸酶消化。
在一些实施方案中，在步骤(c)之前提供了包括用磷酸酶处理的多核苷酸片段末端去磷酸化的条件。
在一些实施方案中，步骤(c)的靶物特异性探针包含含有与靶序列不互补的5’末端部分和与靶序列互补的3’末端部分的左臂寡核苷酸，和含有与靶序列互补的5’末端部分和与靶序列不互补的3’末端部分的右臂寡核苷酸，因此当左臂和右臂与靶片段杂交时，形成双链复合物，其中左臂的3’末端与右臂的5’末端并置，其中在连接的条件下将左臂的3’末端与右臂的5’末端连接以形成连接接界，因此，生成包含核酸的连续线性链的连接产物。
在一些实施方案中，步骤(c)的靶物特异性探针包含含有与靶序列不互补的5’末端部分和与靶序列互补的3’末端部分的左臂寡核苷酸，和含有与靶序列互补的5’末端部分和与靶序列不互补的3’末端部分的右臂寡核苷酸，以及与靶序列互补的桥寡核苷酸，因此当左臂、右臂和桥与靶片段杂交时，形成双链复合物，其中左臂的3’末端与桥寡核苷酸的5’末端并置，而右臂的5’末端与桥寡核苷酸的3’末端并置，其中在连接的条件下将左臂的3’末端与桥的5’末端连接以形成第一个连接接界，并将桥的3’末端与右臂的5’末端连接以形成第二个连接接界，因此，生成包含核酸的连续线性链的双连接产物。
在一些实施方案中，不与靶互补的探针的左臂和右臂部分各自包含用于滚环复制引物退火的定制序列，或用于染料标记的探针特异性检测器探针杂交的定制序列，或两者都包含。在一些实施方案中，这两个所述定制序列位于同一臂上，或不同臂上。在一些实施方案中，这两个所述序列的任一个在左和右臂之间分开，因此仅在步骤(e)中形成的线性多核苷酸环化时才恢复它的完整性和功能性。
在一些实施方案中，步骤(e)的连接产物为双连接产物，各自包含第一个和第二个连接接界。
在一些实施方案中，提供用于步骤(d)中生成的线性多核苷酸分子内环化的步骤(e)的条件包括借助于单链DNA连接酶连接线性单链多核苷酸的5’和3’末端，其中在连接的条件下将线性多核苷酸的5’末端与线性多核苷酸的3’末端连接，因此，生成包含核酸的连续环状链的连接产物。例示性的单链DNA连接酶为CircLigaseTM、CircLigase IITM(Epicentre)和Thermophage Ligase(Prokaria)。
在一些实施方案中，提供用于步骤(d)中生成的线性多核苷酸分子内环化的步骤(e)的条件包括借助于双链DNA连接酶(例如T4DNA连接酶)连接线性单链多核苷酸的5’和3’末端与夹板寡核苷酸(splint oligonucleotide，包含与线性多核苷酸的5’末端和3’末端序列两者互补的寡核苷酸)，因此两个末端都与夹板寡核苷酸杂交以生成双链复合物，其中线性多核苷酸的5’末端与线性多核苷酸的3’末端并置，其中在连接的条件下将线性多核苷酸的5’末端与线性多核苷酸的3’末端连接，因此，生成包含核酸的连续环状链的连接产物。
在一些实施方案中，步骤(f)的富集单链环包括借助于一个或多个外切核酸酶消化未环化的线性片段。
在一些实施方案中，步骤(g)的引物包含发夹引物或封闭-可切割的rhPCR(RNaseH依赖性PCR，IDT)引物，或具有封闭-可切割的3’末端的发夹引物，以在步骤(h)增强滚环复制的特异性。
在一些实施方案中，本公开的方法包括多个靶的同时检测(称为多重检测(multiplexed detection)或多重(multiplexing))，其中使用多个靶物特异性探针并用荧光染料差异标记靶或探针特异性检测器探针。
在一些实施方案中，对于多重检测，靶物特异性检测器探针包含根据“多色组合探针编码(Multicolor Combinatorial Probe Coding)”(MCPC)(Qiuying Huang,et al.(2011),PLoS ONE Volume 6,Issue 1,e16033)的用荧光染料标记的探针、标记范例，其以各种组合使用有限数量(n)的不同颜色的荧光团以标记每个探针，使所有2n-1个靶能够在一个反应中检测到。
本文还提供了应用于检测胎儿非整倍性的无创产前检测的方法和组合物(图9B)，包括检测并定量染色体特异性或基因座特异性靶多核苷酸，其中多个探针组和它们相应的探测器探针的每一个对单个染色体或染色体基因座具有特异性，其中所述染色体选自对非整倍性易感的染色体和参考染色体的列表。用于检测胎儿非整倍性的产前检测的方法，所述方法包括：提供包含多个多核苷酸片段的样品，其中所述多核苷酸片段包含胎儿和母体的无细胞基因组DNA，提供使多核苷酸片段转化为单链形式的变性条件，使样品与多个染色体特异性探针接触，其中将探针与靶染色体的互补序列特异性退火以形成双链复合物，其中所述多个染色体特异性探针包含至少100个选自针对非整倍性检测的第一染色体的不同的多核苷酸序列(第一染色体的探针组)，和至少100个选自参考染色体的不同的多核苷酸序列(参考染色体的探针组)，其中针对非整倍性检测的第一染色体和参考染色体是不同的，提供杂交和连接的条件，在所述条件下多个染色体特异性探针与核酸片段内的它的靶序列杂交并生成多个染色体特异性连接产物，每个连接产物为包含至少一个连接接界的线性多核苷酸，提供多个线性多核苷酸分子内环化的条件，包括连接所述线性多核苷酸的游离末端的条件，导致形成多个染色体特异性单链环，通过酶促消化未环化的线性核酸来富集单链环，使单链环与多个染色体特异性寡核苷酸引物接触，包括退火条件，在所述条件下引物与染色体特异性环的互补序列杂交以形成适合于DNA合成起始的双链引物-环复合物，其中所述多个包含至少一个对衍生自针对非整倍性检测的第一染色体的环具有特异性的引物，和至少一个对衍生自参考染色体的环具有特异性的引物，提供用于染色体特异性引物-环复合物的滚环复制的条件，其中将衍生自针对非整倍性检测的第一染色体的环和衍生自参考染色体的环有选择地扩增以生成长线性单链产物，检测滚环复制的产物，包括使所述产物沉积在固相上、使所述产物与多个染色体特异性染料标记的检测器探针杂交和成像，其中所述多个染色体特异性检测器探针包含至少一个与选自针对非整倍性检测的第一染色体的步骤(c)的染色体特异性探针组的定制序列互补的多核苷酸序列，和至少一个与选自参考染色体的步骤(c)的染色体特异性探针组的定制序列互补的多核苷酸序列，其中针对非整倍性检测的第一染色体和参考染色体是不同的，其中用相同的荧光染料标记对针对非整倍性检测的第一染色体具有特异性的多个检测器探针，其与对参考染色体具有特异性的多个检测器探针的荧光染料不同，其中检测到所述产物指示样品中存在靶多核苷酸，计数展现染料特异性信号的产物，包括计数对应于对针对非整倍性检测的第一染色体具有特异性的胎儿和母体的多核苷酸片段的滚环复制产物和对参考染色体具有特异性的产物，对无细胞DNA样品确定胎儿非整倍性的存在或不存在，包括使用(j)的许多计数的对应于第一染色体的滚环复制产物和许多计数的对应于参考染色体的滚环复制产物。
在一些实施方案中，针对非整倍性检测的第一染色体选自下组：染色体13、染色体18、染色体21、染色体X和染色体Y；并且参考染色体选自下组：染色体1、染色体2和染色体3。
在一些实施方案中，所述方法询问在人群中检测到的主要非整倍性，包括21三体性、18三体性、13三体性和X单体性。
在另一方面，提供了使用样品的核酸片段的环化检测样品中靶核酸的方法(图9C)，所述方法包括：提供包含多个多核苷酸片段的样品，提供包括修复5’磷酸基团和3’羟基的用于多核苷酸片段的末端修复的条件，提供使多核苷酸片段转化为单链形式的变性条件，提供多核苷酸片段分子内环化的条件，包括连接酶和辅因子，导致形成单链环，通过酶促消化未环化的线性片段来富集单链环，使单链环与至少一个包含脱氧核糖核酸合成的引物的靶物特异性寡核苷酸接触，包括退火条件，在所述条件下引物与环状靶多核苷酸的互补序列杂交以形成双链复合物，提供用于靶物特异性引物-环复合物的滚环复制的条件，检测滚环复制的产物，包括使所述产物沉积在固相上、使所述产物与靶物特异性的经染料标记的检测器探针杂交和成像，其中检测到所述产物指示样品中存在靶多核苷酸，和用检测到的染料特异性信号计数产物，并将检测到的滚环复制的产物与样品中存在的靶多核苷酸序列的量相关联。
在一些实施方案中，(a)的样品包含片段化的脱氧核糖核酸或核糖核酸。在一些实施方案中，核酸片段包含各种病毒、细菌、酵母、真菌、高等真核生物DNA和RNA。
在一些实施方案中，通过逆转录的过程将核糖核酸的片段转化为脱氧核糖核酸。
在一些实施方案中，提供用于步骤(b)的多核苷酸片段的末端修复的条件包括用多核苷酸激酶处理样品。
在一些实施方案中，提供用于多核苷酸片段的分子内环化的步骤(d)的条件包括借助于单链DNA连接酶连接线性单链多核苷酸片段的5’和3’末端，其中在连接的条件下将线性多核苷酸的5’末端与线性多核苷酸的3’末端连接，因此，生成包含核酸的连续环状链的连接产物。例示性的单链DNA连接酶为CircLigaseTM、CircLigase IITM(Epicentre)和Thermophage Ligase(Prokaria)。
在一些实施方案中，步骤(f)的引物包含发夹引物或封闭-可切割的rhPCR(RNaseH依赖性PCR)引物，或具有封闭-可切割的3’末端的发夹引物，以在步骤(g)增强滚环复制的特异性。
在一些实施方案中，本公开的方法包括多个靶的同时检测(称为多重检测或多重)，其中用可区分的荧光染料标记靶物特异性检测器探针。
在一些实施方案中，对于多重检测，靶物特异性检测器探针包含根据“多色组合探针编码”(MCPC)(Qiuying Huang,et al.(2011),PLoS ONE Volume 6,Issue 1,e16033)的用荧光染料标记的探针、标记范例，其以各种组合使用有限数量(n)的不同颜色的荧光团以标记每个探针，使所有2n-1个靶能够在一个反应中检测到。
在一些实施方案中，步骤(g)包含在未标记的dNTP或荧光标记的dNTP，或以特定比例的两者的组合存在下的滚环复制。在一些实施方案中，检测步骤(h)的产物包含将所述产物沉积在固相上并对荧光成像。
在一些实施方案中，步骤(g)包含脉冲追踪反应，其中在未标记的dNTP存在下滚环复制的时间过程期间，在特定时间点添加荧光标记的dNTP并继续反应直至复制产物变为经荧光标记。
在一些实施方案中，多重检测包含从步骤(a)到步骤(e)的方法的任何步骤后将样品分为两个或更多个部分，并分开实施样品中存在的各个靶核酸的检测。
在一些实施方案中，多重包含分离样品和对专用室中的每个靶实施滚环复制，其中在未标记的dNTP以特定比例与荧光标记的dNTP混合存在下实施所述滚环复制，其中不同颜色的荧光团附接在不同的dNTP上，并且其中有限数量的不同颜色的dNTP的各种组合和未标记的与荧光标记的dNTP之间的各种比例用以实现比有色荧光团的数量更高水平的多重。在一些实施方案中，在滚环复制的产物沉积在固体基底上之前将它们汇集在一起，用于检测和解多重(de-multiplexing)。
在另一方面，检测包含胎儿和母体的无细胞基因组DNA的样品中染色体非整倍性的方法(图9D)，所述方法包括：提供包含多个多核苷酸片段的样品，其中所述多核苷酸片段包含胎儿和母体的无细胞基因组DNA，提供包括修复5’磷酸基团和3’羟基的用于多核苷酸片段的末端修复的条件，提供使多核苷酸片段转化为单链形式的变性条件，提供多核苷酸片段分子内环化的条件，包括连接酶和辅因子，导致形成单链环，通过酶促消化未环化的线性片段来富集单链环，使单链环与多个包含DNA合成的引物的染色体特异性寡核苷酸接触，在所述条件下其中引物与环的互补序列特异性杂交以形成双链引物-环复合物，其中所述多个染色体特异性引物包含至少100个选自针对非整倍性检测的第一染色体的不同的多核苷酸序列，和至少100个选自参考染色体的不同的多核苷酸序列，其中针对非整倍性检测的第一染色体和参考染色体不同，提供用于染色体特异性引物-环复合物的滚环复制的条件，其中将衍生自针对非整倍性检测的第一染色体的环和衍生自参考染色体的环有选择地扩增以生成各自包含至少200个拷贝的环化靶染色体片段的长线性单链产物，检测滚环复制的产物，包括使所述产物沉积在固相上、使所述产物与多个靶物特异性的经染料标记的检测器探针杂交和成像，其中所述多个靶物特异性检测器探针包含至少100个与步骤(f)的选自针对非整倍性检测的第一染色体的引物完全或部分互补的不同的寡核苷酸序列，和至少100个与步骤(f)的选自参考染色体的引物互补的不同的寡核苷酸序列，其中检测器探针的数量与步骤(f)的染色体特异性引物的数量相等，其中用相同的荧光染料标记多个对针对非整倍性检测的第一染色体具有特异性的检测器探针，其与用于标记多个对参考染色体具有特异性的检测器探针的荧光染料不同，计数展现染料特异性信号的产物，包括计数对应于对针对非整倍性检测的第一染色体具有特异性的胎儿和母体的多核苷酸片段的滚环复制产物和对参考染色体具有特异性的产物，对无细胞DNA样品确定胎儿非整倍性的存在或不存在，包括使用(i)的许多计数的对应于第一染色体的滚环复制产物和许多计数的对应于参考染色体的滚环复制产物。
在一些实施方案中，针对非整倍性检测的第一染色体选自下组：染色体13、染色体18、染色体21、染色体X和染色体Y；并且参考染色体选自下组：染色体1、染色体2和染色体3。
在一些实施方案中，所述方法询问在人群中检测到的主要非整倍性，包括21三体性、18三体性、13三体性和X单体性。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与主题的方法和组合物所属的领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管可以在主题的方法和组合物的实践和检测中使用与本文所述的那些相似或等同的方法和材料，下文描述了适合的方法和材料。另外，材料、方法和实例仅是说明性的而不是限制性的。通过引用整体并入本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献。
附图说明
A部分—使用带正电荷的标签检测靶核酸的方法
图1为显示各种探针配置的示意图。探针包含靶互补区段和可检测的标签或瓣。图(A)和(B)中，标签在探针的5’末端；图(C)和(D)中，标签在探针的3’末端。图(B)和(D)中，探针含有与标签相邻的易切割的连接。
图2为用于多重的探针的示意图。图(A)描绘含有具有不同数量的正电荷的可检测标签的探针的实例。图(B)显示由此类多重的探针生成的电信号的实例。
图3为另一种多重方法的示意图。图(A)和(B)描绘具有包含带正电荷的部分301和另外的化合物(中性或带正电荷)的可检测标签的探针的实例。图(C)描绘当这些探针流过纳米微孔时产生的电信号的实例。
图4为具有双标签的探针的示意图。图(A)、(B)和(C)描绘具有5’和3’可检测标签或瓣的探针的实例。在图(A)、(B)和(C)种显示的实施方案中，标签包括带正电荷部分和另外的化合物(中性或带正电荷)的各种组合。
图5为使用纳米微孔检测器直接(即无扩增)电子检测靶核酸的例示性方法的示意图概述。图(A)显示探针与靶区域退火并通过对易切割的连接(修饰)具有特异性的酶(例如内切核酸酶或裂合酶)切割以释放带正电荷的标签(或瓣)。释放的标签经受电场力并且移位通过纳米微孔以生成电信号，例如，电导的变化。其他核酸种类带负电荷并保留在顺式室中。图(B)显示探针和上游引物以切口或1nt缺口分开的串联与靶多核苷酸退火。具有5'-外切核酸酶活性的DNA聚合酶实施有限的DNA合成；如本文所述通过DNA聚合酶/外切核酸酶切割、释放并检测可检测的5’标签。
图6为使用纳米微孔检测器进行基于扩增的电子检测靶核酸的例示性方法的示意图概述。使用正向和反向引物及探针扩增靶DNA。在扩增期间，探针靶扩增子区域退火并经切割以释放可检测的带正电荷的标签(或瓣)。释放的标签经受电场力并且移位通过纳米微孔以生成电信号，例如，电导的变化。其他核酸种类带负电荷并保留在顺式室中。图(A)为显示缺乏5’外切核酸酶活性的链置换聚合酶的使用的示意图。在扩增的过程中，具有易切割的连接的探针与靶杂交并通过对易切割的连接(修饰)具有特异性的酶(例如内切核酸酶或裂合酶)切割；带正电荷的可检测标签与带有负电荷的探针的经置换的靶互补部分一起得到释放。图(B)为显示具有5’外切核酸酶活性的DNA聚合酶的使用的示意图。在扩增期间，位于探针5’末端的标签(或瓣)通过5’-3’外切核酸酶(也称为瓣状内切核酸酶)的活性切除；探针的其余部分通过相同的活性降解。图(C)为如图(B)中所示的显示具有5’外切核酸酶活性的DNA聚合酶的使用的示意图，但图(C)中的可检测标签位于探针的3’末端。DNA聚合酶切口平移探针的靶互补部分直至可检测标签(或瓣)得到释放。
图7为显示具有集成纳米微孔检测器的装置的一个实例的示意图。所述装置特征在于相对于常规DNA测序纳米微孔装置，电极的极性相反，因为，在本情况下，通过移位通过纳米微孔来检测带正电荷的标签。
图8为电泳凝胶的照片。凝胶显示通过伴随探针的切割的PCR进行靶DNA扩增的实例，所述探针包括带正电荷的标签。通过Taq DNA聚合酶切割在5’或3’末端带有探针的标签两者。
B部分—使用滚环复制检测靶核酸的方法
图9为本文所述的用于数字检测和定量核酸靶分子的方法的流程图。图(A)和(B)中的方法牵涉环化探针的滚环复制。图(C)和(D)中的方法牵涉具有靶序列的DNA环化片段的滚环复制。图(B)和(D)中的方法牵涉使用含有循环无细胞DNA的样品的染色体非整倍性的产前检测。
图10为探针和探针环化的方法的示意图。图(A)描绘探针和使用单链DNA连接酶的探针环化的实例。图(B)与图(A)类似，但图(B)中的探针包括“桥”寡核苷酸。
图11为探针和探针环化的方法的示意图。图(A)描绘探针和使用双链DNA连接酶及作为连接模板的“夹板”寡核苷酸的探针环化的实例。图(B)与图(A)类似，但图(B)中的探针包括“桥”寡核苷酸。
图12为检测靶核酸的方法的示意图概述，其包括样品的核酸片段的环化。作为实例，描绘了检测两个靶的方法，其中滚环复制的产物在与靶物特异性的经染料标记的检测器探针杂交时可视化。
图13为检测靶核酸的方法的示意图概述，其包括样品的核酸片段的环化。作为实例，描绘了检测两个靶的方法，其中滚环复制的产物用晚期添加至RCR反应中的荧光标记的dNTP可区分地标记(图(A))，或作为与反应开始时的未标记的dNTP的混合物(图(B))。
图14为检测靶核酸的方法的示意图概述，其包括样品的核酸片段的环化。作为实例，描绘了检测两个靶的方法，其中滚环复制的产物用晚期添加至RCR反应中的荧光标记的dNTP可区分地标记(图(A))，或作为与反应开始时的未标记的dNTP的混合物(图(B))。将包括单链环中间体的样品分开，并在分开的室中实施滚环复制和检测两者。
图15为荧光显微镜拍摄的相同视野的Cy3和Cy5的合成图像，显示在将其混合物沉积在氨基硅烷化载玻片的表面上后对人染色体1和21相应地具有特异性的RCR产物的检测。
发明详述
在过去的二十年中，已经开发了许多靶核酸检测的方法，并且一些方法目前广泛用于医学、农业、生物安全和食品安全应用。其中等温靶核酸检测方法(例如NASBA、LAMP和RPA)和PCR最为常见。基于PCR的方法，特别是基于探针的PCR，像TaqMan测定，由于其稳健性、简单性、灵敏性和特异性，认为是“金标准”。然而，它们的输出是通过荧光标记的探针或引物和嵌入染料生成的模拟光学信号。
最近，开发了通常称为下一代PCR的微滴式数字PCR(ddPCR)技术(Bio-Rad,Inc.,RainDance Technologies,Inc)，以提供样品中靶核酸的绝对定量的能力。然而，除了PCR模块外，这些技术还需要流体装置以生成乳液微滴以划分单个分子。此外，方法存在与PCR偏差相关，在非常小的反应器中有限量的试剂，以及微滴尺寸和组成的不均匀性的某些限制。另外，乳液微滴技术排除了其中递增添加试剂的多步化学反应，降低了其整体效用。
使用母体血液中循环的无细胞胎儿(cff)DNA的无创产前检测(NIPT)允许更早检测到遗传疾病和常见的染色体非整倍性，例如13三体性、18三体性和21三体性。这有助于在生殖健康和怀孕管理方面做出决定。商业化的NIPT测定基于对受影响染色体区域的大规模平行PCR扩增，然后通过鸟枪法测序或微阵列技术检测胎儿基因组中的染色体失衡。需要改进NIPT的成本和周转时间。本公开提供了用于无PCR和无测序NIPT的方法和组合物。这些方法代表了检测核酸靶的新方法，并且可以用于其他应用，例如病原体检测，基因型分型等。
A部分—使用带正电荷的标签检测靶核酸的方法
1.概述
本文提供了电子检测靶核酸的方法。可以扩增靶核酸(例如，使用但不限于PCR或等温扩增)，但本文所述的方法不需要扩增(即，本文所述的方法包括无扩增方法)。本文所述的方法的特征之一为探针，其作为可检测的带正电荷的标签的来源，所述标签在与互补的靶核酸杂交后释放。当借助于特异性扩增引物扩增靶多核苷酸时，探针与扩增子的杂交导致探针的扩增依赖性切割，因此，另外增加了靶核酸检测的特异性和灵敏度。
除了与带负电荷的与靶核酸互补的区域之外，探针还包括可检测的带正电荷的标签，其在探针与靶核酸杂交后形成瓣。可以使用纳米微孔电子检测标签通过酶的切割作用从探针中的靶依赖性释放(例如，在标签移位通过纳米微孔时)，其与其他基于探针的核酸检测方法(包括光学、电化学、光机械和机电方法)不同。图5和6中显示本公开的例示性方法的示意流程图。
作为本文所述方法的一部分，还提供了使用带正电荷的标签检测靶核酸的系统。此类系统通常包括具有纳米微孔传感器的微流控装置。此类微流控装置通常包括含有(+)电极和导电缓冲溶液中的样品的第一室、含有(-)电极的第二室以及嵌入分离两个室的屏障中的纳米微孔。此类微流控装置还可以包括温度控制元件、具有耦合到计算机处理器(包括例如存储器)的放大器的电路板和信号处理软件。应理解的是，本文所述的方法和系统可以允许靶核酸的实时检测。重要的是，所公开的微流控装置是便携式的、小型化的(例如，大约“记忆棒”或“闪存盘”(jump drive)的大小)，这使其成为护理点以及现场应用的理想选择。
同样作为本文所述方法和系统的一部分，提供了可以用于检测靶核酸的试剂盒。本文所述的试剂盒可以包括一个或多个对单个靶或多个靶(例如多重靶检测)具有特异性的探针。本文所述的试剂盒还可以包括一个或多个扩增引物、缓冲液和酶。另外，试剂盒也可以包括本文所述的微流控装置。
本文所述的电子检测靶核酸的方法可以用于检测医学、农业、生物防御、食品安全和环境监测意义的各种靶。这些包括但不限于各种病原体(例如细菌或病毒)、单核苷酸多态性(SNP)变体、突变或基因组结构变异。
本文所述的方法和系统具有可以显着降低体外诊断成本的多个特征。例如，本文所述的方法和系统不需要与其他目前使用的装置一样的昂贵的光学组件。因此，与目前使用的庞大的光学检测装置相比，如本文所述的微流控装置的低成本允许其构造为一次性使用的一次性装置。
2.用于核酸检测的方法和系统
现有的核酸检测策略可以分为三类：靶扩增、探针扩增和信号放大。已经开发了许多用于靶扩增的方法，聚合酶链式反应(PCR)目前是各种诊断应用的金标准。使用读出荧光探针(例如TaqMan双标记探针、Scorpion探针、分子信标(Molecular Beacons)、LightCycler探针和嵌入染料(例如SYBR Green))的定量PCR方法为核酸诊断中最常见的方法，但需要复杂且昂贵的设备来实施热循环和光学读数。为了避免PCR中的限制，特别是在护理点背景中，已经开发了各种等温扩增技术，包括链置换扩增(SDA)、环介导扩增(LAMP)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)和其他(综述于例如Yan et al.,2014,Mol.BioSyst.,10:970-1003)。
或者，探针扩增方法包括连接酶链式反应(LCR)、侵入测定(Invader assay)、挂锁探针(Padlock probe)、滚环扩增(RCA)和通过DNA探针的自组装进行检测以得出超分子结构。信号放大策略与探针扩增方法一样，不需要靶核酸扩增，并且包括切口内切核酸酶信号放大(NESA)和切口内切核酸酶辅助纳米粒子激活(NENNA)、结合(Junction)或Y探针、分裂DNAZyme(split DNAZyme)和脱氧核酶扩增策略、导致放大信号的模板导向化学反应、非共价DNA催化反应、杂交链式反应(HCR)、酪胺信号放大(Tyramide Signal Amplification)和分支DNA(bDNA)(综述于Andras et al.,2001,Mol.Biotech.,19(1):29-44；和Yan et al.,2014,Mol.BioSyst.,10:970-1003)。
随着纳米技术的发展，信号检测系统迅速采用生物共轭纳米粒子(NP)，并开发了多种检测系统(综述于例如Ju et al.,2011,Chapter 2in NanoBiosensing,pp 39-84)。大多数核酸检测方法采用光学、视觉和/或电化学信号检测系统。然而，随着纳米材料和纳米制造技术的发展，对于具有集成电子芯片/传感器的简单且具有成本效益的使用点设备出现小型化，进一步提高灵敏度，以及读数数字化的新机遇。为了适应这些新机遇，需要开发新的方法和检测技术。在本公开中，公开了电子检测核酸的新方法和系统。
本公开描述了用于电子检测核酸的方法和系统，其中现有核酸检测系统的许多限制得到放宽，包括复杂性，成本和灵敏度。本文所述的基于纳米结构的检测方法和系统可以在非常短的时间内以高灵敏度检测核酸靶(例如，单分子检测)。
本文描述了使用纳米微孔检测核酸的方法和系统。所述方法可以准确检测单独的可检测的带正电荷的标签，其存在与探针的切割事件相关联，例如在探针与互补的靶核酸杂交时。然后这些带正电荷的标签通过纳米微孔并可以被检测到。当同时询问多个靶时，可以使用不同的带正电荷的标签(即，对于每个靶是唯一的)，并且在释放时，在它们通过纳米微孔时鉴别所述标签，因此鉴别每个靶核酸的存在。可以实时检测在切割探针时可检测的带正电荷的标签的释放。
本文所述的方法为单分子数字检测方法，因为纳米微孔可以检测到单个标签分子通过。因此，可以检测和定量探针切割事件的数量，并因此检测和定量形成的靶-探针复合物的数量，并因此检测和定量靶分子的数量。当扩增靶核酸时，每个克隆分子生成信号，其允许本文所述的方法用于扩增的实时定量。
图5A示意性地说明了在没有靶扩增的情况下直接检测靶核酸的方法。所述方法包括提供含有靶多核苷酸的样品和使探针与靶杂交以形成双链体。杂交的方法和组合物是本领域公知的，并且可以包括在添加探针之前或同时使样品核酸变性。杂交的探针与靶多核苷酸形成复合物，其中可检测的标签形成“瓣”。所述可检测的标签可以为5’瓣和/或3’瓣。
位于探针互补部分内的易切割的连接在形成双链体结构时变得易于进行酶切。在一些实施方案中，所述易切割的连接为无碱基位点(AP位点)，例如四氢呋喃(THF)，其可以通过许多内切脱氧核糖核酸酶或DNA AP-裂合酶切割。例示性的市售酶包括内切核酸酶IV、Fpg、hOOG1、内切核酸酶VIII、外切核酸酶III,内切核酸酶III(Nth)和APE1。一些这些酶的热稳定同系物也是可得的，例如Tma内切核酸酶III和Tth内切核酸酶IV。在一些实施方案中，所述易切割的连接为单核糖核苷酸残基，其在双链体多核苷酸的背景下被识别并通过RNase H II切割。在一些实施方案中，所述易切割的连接为四个富含嘌呤的核糖核苷酸残基，其通过RNase H I识别并切割。在一些实施方案中，所述易切割的连接为8-氧代鸟嘌呤(8-oxoguanine)，其通过Fpg N-糖苷酶与AP裂合酶组合切割。
在一些实施方案中(见图5B)，不提供易切割的连接并且通过DNA聚合酶(例如，大肠杆菌聚合酶I、Bst聚合酶或Taq聚合酶)的5’-3’外切核酸酶活性或瓣状内切核酸酶活性从探针切除可检测的带正电荷的标签(例如5’或3’瓣)。这可以使用与至探针的靶退火部分上游的靶核酸退火的单个寡核苷酸引物来实现，使得在引物和探针的互补部分之间没有缺口或1至2nt的缺口。引物和探针的设计使得，在添加至少一种、或两种、或三种类型的脱氧核糖核苷酸(dNTP)，例如单独的dATP、dATP和dTTP、或dATP、dTTP和dGTP时，聚合酶沿靶核酸向下游前进并置换探针的靶互补部分的一个或几个碱基，以生成短的5’或3’瓣，其通过DNA聚合酶的5’-3’外切核酸酶(或瓣状内切核酸酶)活性切割。这些条件防止通过聚合酶大量合成双链DNA，因为反应混合物中不存在所有四种核苷酸，但仍导致探针的切割以生成可检测的标签。
作为通过内切脱氧核糖核酸酶或DNA AP-裂合酶切割的结果(见图5A)，在探针中形成切口或1个核苷酸的缺口，其在温和升高温度时释放可检测的带正电荷的标签，但可以不一定释放退火的探针的其余部分，因为退火的探针的其余部分可以设计为具有与靶核酸更稳定的双链体结构。在图5B描绘的方法中，可以在不升高温度的情况下从靶多核苷酸释放可检测的带正电荷的标签。即使探针的靶互补部分通过DNA聚合酶的5'-3'外切核酸酶活性部分降解并自发释放，释放的残余部分的全局电荷为负，因此，当在纳米微孔上施加电势时，它将留在顺式室中。相反，正确切割的带正电荷的标签将具有全局正电荷，其将流过纳米微孔(例如从顺式室向负电极)并生成电导的变化，将其记录为具有一定幅度和持续时间的电信号。因此，将单独检测到每个释放的带正电荷的瓣，并且信号的总数量将对应于样品中的核酸靶的数量。
图6A示意性地说明了使用纳米微孔检测器进行基于扩增的电子检测靶核酸的例示性方法。所述方法包括提供含有靶核酸、寡核苷酸引物和至少一个探针的样品。使用正向和反向引物扩增所述靶核酸并使用探针进行检测。在一些实施方案中，扩增方法利用聚合酶链式反应(PCR)。在一些实施方案中，扩增方法利用等温扩增方法，例如重组酶聚合酶扩增(RPA)。等温扩增方法的使用极大地简化了如本文所述的微流控装置的构建，然而提供了靶核酸序列的快速的指数扩增。在扩增期间，探针与靶扩增子区域退火以形成双链复合物并在易切割的连接经切割以释放可检测的带正电荷的标签。如本文所示，可检测的带正电荷的标签可以为5’和/或3’瓣的形式。位于探针互补部分内的易切割的连接仅在形成双链体结构时变得易于进行酶切。释放的标签经受电场力并且移位通过纳米微孔以生成电信号，例如，电导的变化。其他核酸种类(即非靶核酸)带负电荷并保留在顺式室中。在一些实施方案中，所述易切割的连接为无碱基位点(AP位点)，例如四氢呋喃(THF)，其可以通过许多内切脱氧核糖核酸酶或DNA AP-裂合酶切割。大多数这些酶在生理温度下具有活性，并且必须使用在此类温度下的等温扩增技术。例示性方法包括例如重组酶聚合酶扩增(RPA)，其可以在25℃和42℃之间的温度下进行。
内切脱氧核糖核酸酶和/或DNA AP-裂合酶可以选自在切割位点不生成3’羟基的酶的列表，因为3’羟基可以通过DNA聚合酶得到延伸，其将产生非生产性截短的二级扩增子。此类酶的实例包括Endo III和hOOG1，其在所产生的末端的3’末端产生3’-磷酸-alpha,beta-不饱和醛。此类酶的另外的Endo VIII、Fpg和hNEIL1，其所有都产生了不可延伸的3’磷酸末端。此外，可以掺入探针并通过I型和II型核糖核酸酶H(RNase HI和RNase HII)切割的RNA残基为可延伸的易切割的连接，因为在切割位点的3’末端生成3’-OH基团。当几个，例如三个或四个RNA残基用作易切割的连接(其通过RNase HI切割)时，3’-OH基团优先存在于第二RNA残基上。当单个RNA残基用作易切割的连接并通过RNase HII切割时，产生DNA上的3’-OH基团。在两种情况下，DNA或RNA上的3’-OH末端可以作为聚合酶驱动的3’末端延伸的模板，所述延伸通过例如大肠杆菌DNA聚合酶I和Bsu DNA聚合酶的此类嗜温DNA聚合酶进行。
酶的热稳定性允许其在对于特定的DNA:RNA异源双链体允许最高杂交严格性，最大化的灵敏度和选择性，同时最小化归因于非特异性杂交的背景的温度下使用。当扩增方法牵涉高温循环，例如在PCR中，探针中适合的易切割的连接通常包括至少四个RNA残基。在一些实施方案中，易切割的连接包括四个含有嘌呤的RNA残基，其为核糖核酸酶HI(RNaseHI)的底物。RNase HI是特异性水解与互补DNA的RNA段的磷酸二酯键的内切核糖核酸酶。得到的切口位于RNA序列内，并且3’-OH基团主要位于第二RNA残基。此类含有RNA的3’-末端不可以作为Taq聚合酶的底物。热稳定的RNase HI作为Hybridase(Epicentre)可商购获得，并且特异性降解DNA:RNA杂交体中的RNA而不影响DNA或未杂交的RNA。与在55℃快速灭活的大肠杆菌RNase H相反，Hybridase RNase H在高温下具有活性(例如，其在65℃以上具有最佳活性，并可以在高达95℃的温度下使用)。热稳定的RNase H2型酶作为Pyrococcus abysiiRNase H2(IDT)可商购获得。RNase HII为识别双链DNA内的单个RNA残基的内切核糖核酸酶，并优选对核糖核苷酸的5’切口。这在DNA残基上产生3’-OH基团，其可以通过任何聚合酶(包括Taq聚合酶)延伸，并且因此不适合于本公开的方法。当图6A中所示的靶扩增和检测方法等温但高于生理温度实施时，热稳定的AP内切核酸酶和裂合酶可以用于切割易切割的连接，例如Pyrobaculum aerophilum内切核酸酶III和海栖热袍菌(Thermotoga maritima)内切核酸酶IV。
图6B显示使用纳米微孔进行基于扩增的电子检测靶核酸的另一个例示性方法。在一些实施方案中，本文所述的方法包括提供含有靶多核苷酸、寡核苷酸引物和探针的样品，并且使用正向和反向引物和探针扩增所述靶DNA。在一些实施方案中，扩增方法可以利用聚合酶链式反应(PCR)。用于该方法的探针通常与靶序列扩增子互补并不与所使用的扩增引物重叠。所述探针也通常不含有易切割的连接。在此类探针与靶核酸杂交时，带正电荷的可检测的标签为5’-瓣，如图6B中所描绘。具有5’-3’外切核酸酶活性和瓣状结构特异性内切核酸酶活性的DNA聚合酶催化水解切割在单和双链DNA接界处的磷酸二酯键，所述接界形成于聚合酶到达退火的探针并置换探针的靶互补部分的一个或多个核苷酸后。在切割探针后，从靶核酸释放出所述瓣状结构(即可检测的带正电荷的标签)和一些带负电荷的DNA残基。在5’-瓣切割后，DNA聚合酶的5’-3’外切核酸酶活性消化探针的退火的靶互补部分的其余部分。具有净正电荷的释放的标签经受电场力，其引起它流过纳米微孔并生成电信号，例如，电导的变化。其他扩增反应的核酸种类(引物、探针、靶核酸以及扩增和5’-3’外切核酸酶降解产物)带负电荷并保留在顺式室中。例示性的具有5’-3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶包括Taq DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶和大肠杆菌DNA聚合酶I。后者不是热稳定酶并且不可以在标准PCR反应中所需的热循环条件中使用。
在一些实施方案中，可检测标签在探针的靶互补部分的3’末端。图6C显示使用纳米微孔进行基于扩增的电子检测靶核酸的例示性方法，其中可检测的标签显示为3’瓣。在一些实施方案中，所述方法包括提供含有靶多核苷酸、寡核苷酸引物和探针的样品。可以在存在探针的情况下使用正向和反向引物扩增靶DNA。在一些实施方案中，扩增方法可以为聚合酶链式反应(PCR)。用于该方法的探针通常与靶序列扩增子互补并不与所使用的扩增引物重叠。探针也不一定含有易切割的连接。在此类探针与靶核酸杂交时，带正电荷的可检测的标签为3’-瓣(图6C)。当具有其5’-3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶到达退火的探针，它连续通过切口平移复制模板，其中探针从5’端降解/消化，直至剩余的未降解互补部分的Tm下降至其与可检测的标签一起从靶序列分离的点。在该实施方案中，释放的可检测的标签包含探针的靶互补部分的3’末端核苷酸(带负电荷)和带正电荷的3’瓣。
此类可检测标签的净电荷取决于带负电荷的核苷酸的数量和3’瓣的正电荷数量。释放的标签中未消化的核苷酸数量越少，净正电荷越高。探针的带正电荷的3’-瓣可以通过与模板链的静电相互作用稳定探针互补部分的3’部分，从而减少释放的标签中核苷酸的数量。在一些实施方案中，与和所述瓣的接界相邻的探针的靶互补部分的部分可以包括一个或多个具有负电荷(例如LNA)，或电中性(例如PNA、PMO、甲基膦酸酯)或正电荷(例如PMOplus)主链的双链体稳定核苷酸类似物。在主链中使用此类修饰减少了可检测标签中带负电荷的核苷酸的数量，或者用具有中性或正电荷的残基取代它们。此外，这些经修饰的主链也展现出对通过核酸酶(例如通过DNA聚合酶的5’外切核酸酶)的降解的增强的抗性。在一些实施方案中，具有中性或阳离子主链的核苷酸类似物可以为PMO、PMOplus、PNA、甲基膦酸酯或它们的任何组合。然后具有净正电荷的释放的标签可以经受电场力，使得它流过纳米微孔并生成电信号，例如，电导的变化。其他扩增反应的核酸种类(例如引物、探针、靶核酸以及扩增和5’-3’外切核酸酶降解产物)带负电荷并保留在顺式室中。
本文所述的方法中使用的引物和探针可以具有适合于有效靶杂交和扩增并且适合于产生可检测标签的任何多种长度和构型。通常，引物和探针的长度可以为从约15至约30个核苷酸(例如，从约20至约25个核苷酸)，尽管也可以使用这些范围之外的长度。当引物含有一个或多个具有增强的碱基配对亲和力的核苷酸类似物例如锁核酸(LNA)或肽核酸(PNA)时，可以使用更短的长度。可以设计第一和第二引物以退火至靶核酸，以便产生任何所需长度的扩增产物，通常长度为至少30(例如，至少50)个核苷酸并且长度高达200(例如，高达300、500、1000)个或更多个核苷酸。可以以任何适合的浓度提供探针和引物。
3.核酸
本文所述的在电子检测和鉴别方法和系统中使用的靶核酸可以为单链或双链，或者可以含有双链和单链核酸的部分。例如，靶核酸可以为基因组DNA、线粒体DNA、cDNA、mRNA、核糖体RNA、小RNA、非编码RNA、核小RNA、核仁小RNA和Y RNA。在一些实施方案中，可以从样品中提取和/或纯化靶核酸。
可以从任何感兴趣的生物体中获得靶核酸(例如基因组DNA)。感兴趣的生物体包括例如，动物(例如哺乳动物，包括人和非人灵长类动物)；植物、真菌和病原体例如细菌和病毒。在一些实施方案中，靶核酸(例如基因组DNA或RNA)为细菌或病毒核酸。
可以从感兴趣的样品中获得靶核酸。样品的非限制性实例包括细胞；体液(包括但不限于血液、尿液、血清、淋巴液、唾液、肛门和阴道分泌物、汗液和精液)；环境样品(例如，空气、农业、水和土壤样本)；生物战剂样品；研究样品(例如，核酸扩增反应(例如PCR或MDA扩增反应)的产物)；经纯化的样品，例如经纯化的基因组DNA；RNA制剂；和原始样品(细菌、病毒、基因组DNA等)。从生物体中获得靶核酸(例如基因组DNA)的方法是本领域所公知的。参见，例如Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1999)；Ausubelet al.,eds.,Current Protocols in Molecular Biology,(John Wiley and Sons,Inc.,NY,1999)等。
在一些实施方案中，靶核酸为基因组DNA。在一些实施方案中，靶核酸为基因组的子集(例如，特定应用的感兴趣的子集，例如，可以在例如癌症患者的群体的特定子集中具有突变的所选基因)。在一些实施方案中，靶核酸为外显子组(exome)DNA，即，富集转录序列的全基因组DNA的子集。在一些实施方案中，靶核酸为转录组的全部或部分，即在细胞或细胞群中产生的所有mRNA或“转录物”的集合。
在一些实施方案中，靶核酸(例如基因组DNA)在使用前片段化。可以使用任何片段化方法。例如，在一些实施方案中，通过机械手段(例如超声剪切、声学剪切或针剪切)；通过化学方法；或通过酶方法(例如使用内切核酸酶)将靶核酸片段化。本领域已知片段化的方法(参见例如US 2012/0004126)。在一些实施方案中，可以使用超声完成片段化。
在一些实施方案中，本文所述的方法包括从样品中分离靶核酸并准备用于电子检测的靶核酸。一些用于从各种来源的样品中提取核酸的例示性技术包括使用裂解酶、超声处理、高压或它们的任何组合。在许多情况下，在从细胞释放后，可以通过商业上可获得的方法(包括例如使用蛋白酶、有机溶剂、脱盐、离心柱和与包括磁性纳米颗粒的功能化基质结合)从细胞壁碎片、蛋白质和其他组分中纯化核酸。在一些情况下，靶核酸为无细胞核酸(例如液体活组织检查)并且不需要从细胞中提取。
4.探针
通常，本文所述的方法中使用的探针包括两部分：靶互补寡核苷酸100和带正电荷的可检测标签101(见例如图1)。靶互补寡核苷酸具有磷酸二酯主链使得它在中性pH的水溶液中带负电荷。磷酸二酯主链通常包括交替的糖和磷酸酯部分的糖-磷酸主链，其中核苷酸碱基(通常，嘌呤或嘧啶基团)附接在每个糖部分。主链中可以包括任何糖，例如核糖(用于RNA)、脱氧核糖(用于DNA)、阿拉伯糖、己糖、2’-氟核糖和/或糖的结构类似物等。在一些实施方案中，可以用替代主链的核苷酸类似物取代互补寡核苷酸中的一个或多个残基。例示性的替代主链可以包括：a)带负电荷的氨基磷酸酯(参见，例如Beaucage et al.,1993,Tetrahedron,49(10):1925)、硫代磷酸酯(PS)(参见，例如Mag et al.,1991,NucleicAcids Res.,19:1437；和美国专利号5,644,048)、锁核酸(LNA)(参见，例如Koshkin etal.,1998,Tetrahedron,54:3607-30；WO 98/39352；WO 99/14226；WO 00/56746；和WO 99/60855)、解锁核酸(unlocked nucleic acids，UNA)(参见，例如Pasternak et al.,2011,Org.Biomol.Chem.,9:3591-97)、N3’-P5’氨基磷酸盐、2’-O-甲氧乙基(2’-MOE)RNA、2’-O-甲基(2’-OMe)RNA(参见，例如Kole et al.,2012,Nat.Rev.Drug Discov.,11(2):125-40)、己糖醇核酸(HNA)；b)不带电的(中性)甲基膦酸酯(参加，例如Miller et al.,1981,Biochemistry,20:1874-80)、磷酸二酰胺吗啉寡聚体(phosphorodiamidate morpholinooligomers，PMO)(参见，例如美国专利号5,185,444)、肽核酸(PNA)(参见，例如Egholm,1992,J.Am.Chem.Soc.,114:1895；Braasch and Corey,2001,Chem.Biol.,8(1):1-7；Nielsen,1995,Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.,24:167-83；Nielsen et al.,1999,Curr.Issues Mol.Biol.,l(l-2):89-104；和Ray et al.,2000,FASEB J.,14(9):1041-60)、三唑连接的DNA(triazole-linked DNA)(参见，例如Varizhuk et al.,2013,J.Org.Chem.,78(12):5964–69)。具有人工主链和/或部分的核酸可以用于增加或减少总电荷，增加或降低碱基配对稳定性，增加或降低化学稳定性，以改变被试剂作用的能力等。
在一些实施方案中，探针的靶互补部分的全长度为从约15至约60个碱基(例如，长度为约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55或约60个碱基)。
在一些实施方案中，探针包括3’，或5’，或3’和5’两者末端，其通过聚合酶阻断延伸和/或通过核酸酶阻断降解。为了通过聚合酶阻断3’末端延伸，可以修饰末端核苷酸以去除或用封闭基团(例如，烷基、非核苷酸接头、烷二醇、双脱氧核苷酸残基和虫草素)取代3’-OH基团。市售3’修饰或封闭基团的非限制性实例包括例如，3’氨基修饰剂(3AmMO,Integrated DNA Technologies(IDT),Coralville,IA)、3’间隔物(spacer)(例如，C3spacer 3SpC3,Integrated DNA Technologies(IDT))、双脱氧核苷酸(例如，ddC,Integrated DNA Technologies(IDT))、反向dT(invdT,Integrated DNA Technologies(IDT))或3-dT-Q/3-dA-Q/3-dC-Q/3-dG-Q(Operon/Eurofins,Huntsville,AL)。可以通过经修饰的5’或3’连接(参见，例如WO 93/13121)、经修饰的核苷酸和非核苷酸外切核酸酶抗性结构来阻断外切核酸酶降解5’和/或3’末端。例示性的末端封闭基团包括帽结构(例如，7-甲基鸟苷帽)、反向核单体(例如，具有3’-3’和/或5’-5’末端倒位，参见，例如Ortiagao etal.,1992,Antisense Res.Dev.,2:129)、甲基膦酸酯、亚磷酰胺、非核苷酸基团(例如，非核苷酸接头、氨基接头、缀合物)等。为了减少核酸酶降解，至少一个5’和/或3’最连接可以为经修饰的连接，例如硫代磷酸酯连接。
在一些实施方案中，所述探针包含靶互补部分100内的易切割的连接102(参见，例如图1B和图1D)。易切割的连接的非限制性实例包括至少一个RNA残基；氧化嘌呤；氧化嘧啶；无嘌呤或无嘧啶(AP)位点；脱氧尿苷、5-羟基尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶或5-甲酰基尿嘧啶中的任一个；或无碱基核苷酸类似物、四氢呋喃(THF—有时称为“dSpacer”)。在一些实施方案中，只有当探针与互补区域内的单链靶核酸形成双链核酸复合物时，才切割所述易切割的连接。
当与双链DNA内的脱氧-胞嘧啶或脱氧-鸟苷配对时，可以通过Fpg(甲酰胺嘧啶[fapy]-DNA糖苷酶，也称为8-氧代鸟嘌呤DNA糖苷酶)切割例示性的氧化嘌呤，8-氧代鸟嘌呤，其可以在合成期间掺入寡核苷酸中。所述酶充当N-糖苷酶和AP-裂合酶两者。N-糖苷酶活性从双链DNA释放受损的嘌呤、8-氧代鸟嘌呤，生成无嘌呤(AP位点)。然后，AP-裂合酶活性切割AP位点的3’和5’两者，从而去除AP位点并留下1个碱基的缺口。类似的酶，hOGG1(alpha同种型)，是充当N-糖苷酶和AP-裂合酶两者的8-氧代鸟嘌呤DNA糖苷酶。与Fpg相反，hOOG1的AP-裂合酶活性仅切割AP位点的3’，留下具有5’磷酸和3’-磷酸-alpha,beta-不饱和醛的切口。
通过N-糖苷酶生成或作为四氢呋喃(THF或dSpacer)整合到探针中的无嘌呤或无嘧啶(AP)位点被AP核酸酶(例如，内切脱氧核糖核酸酶)和DNA AP-裂合酶(例如，Endo IV内切核酸酶、AP裂合酶、FPG糖苷酶/AP裂合酶、Endo VIII糖苷酶/AP裂合酶、外切核酸酶III(大肠杆菌))切割。Endo IV在损伤的5’的第一个磷酸二酯键处切割，在3’末端留下羟基并在5’末端留下脱氧核糖5’-磷酸。内切核酸酶IV为Endo IV的热稳定同系物。内切核酸酶VIII(大肠杆菌)充当N-糖苷酶和AP-裂合酶两者。AP-裂合酶活性切割AP位点的3’和5’，留下5’磷酸和3’磷酸。虽然内切核酸酶VIII与内切核酸酶III相似，但内切核酸酶VIII具有beta和delta裂合酶活性，而内切核酸酶III具有beta裂合酶活性。Endo VIII也具有内在的N-糖苷酶活性，其从双链DNA释放受损的嘧啶(例如，尿素、5，6-二羟基胸腺嘧啶(5,6-dihydroxythymine)、胸腺嘧啶乙二醇、5-羟基-5-methylhydanton(5-hydroxy-5-methylhydanton)、尿嘧啶乙二醇、6-羟基-5，6-二氢胸腺嘧啶(6-hydroxy-5,6-dihydrothymine)和甲基噻吩脲(methyltartronylurea))，生成无嘌呤(AP位点)。来自大肠杆菌的内切核酸酶III(Nth)蛋白也充当N-糖苷酶和AP-裂合酶两者。酶的AP-裂合酶活性切割AP位点的3’，留下5’磷酸和3’开环糖(ring opened sugar)。Endo III也具有N-糖苷酶活性，其从双链DNA释放受损的嘧啶(例如，尿素、5，6-二羟基胸腺嘧啶(5,6-dihydroxythymine)、胸腺嘧啶乙二醇、5-羟基-5-methylhydanton(5-hydroxy-5-methylhydanton)、尿嘧啶乙二醇、6-羟基-5，6-二氢胸腺嘧啶(6-hydroxy-5,6-dihydrothymine)和甲基噻吩脲(methyltartronylurea))，生成无碱基(AP位点)。大肠杆菌内切核酸酶III(Nth)的热稳定同系物也称为Tma内切核酸酶III。大肠杆菌外切核酸酶III(AP内切核酸酶VI)是水解在双链和单链DNA两者中无碱基位点5’的磷酸二酯键的DNA修复酶(参见，例如Shida et al.,1996,Nucleic Acids Res.,24(22):4572–76)。人无嘌呤/无嘧啶(AP)内切核酸酶，APE 1，与大肠杆菌外切核酸酶III蛋白具有同源性。APE 1通过水解机制切割紧接AP位点5’的磷酸二酯主链以生成单链DNA断裂，留下3’-羟基和5’-脱氧核糖磷酸末端。
通过尿嘧啶DNA糖苷酶(UDG)的N-糖苷酶活性识别并释放探针内的脱氧尿苷，生成AP位点。然后通过AP核酸酶(内切脱氧核糖核酸酶)或DNA AP-裂合酶(例如，Endo IV内切核酸酶、AP裂合酶、FPG糖苷酶/AP裂合酶、Endo VIII糖苷酶/AP裂合酶)切割AP位点。当与双链探针-靶复合物中的脱氧-腺苷配对时，脱氧尿苷得到切割，但也可以在单链探针内得到切割，其需要通过尿嘧啶DNA抑制剂(New England Biolabs,MA)灭活UDF或在切割AP位点前去除探针。无碱基位点也可以在脱氧鸟苷外的核苷酸类似物生成，并且通过用内切核酸酶处理以类似的方式进行切割。例如，通过暴露于AlkA糖苷酶，可以将脱氧肌苷转化为无碱基位点。然后可以切割如此生成的无碱基位点，通常通过用适合的内切核酸酶(例如，Endo IV、AP裂合酶)处理的方式。参见，例如US 2011/0014657。
对于同时检测多个多核苷酸靶(多重检测)，可以使用多个不同的探针。多个探针可以包括不同的可检测标签101(见图1)。在一个实例中，探针具有带有可变数量电荷的标签201、202和203，如图2A所示。通过此类多重探针生成的电信号的实例如图2B中所示。标签的标识可以通过生成的电信号的唯一性来建立。相应地，经鉴别的标签可以与样品中存在的单独靶核酸相关联。在另一个实例中，可检测的标签305、306和307(见图3A)包括与靶互补部分300相邻的带正电荷部分301和附接在部分301的另外的化合物(或化学基团)302、303和304。这些化合物可以具有中性电荷，或者可以添加另外的正电荷至部分301，但是它们旨在通过形状、尺寸和电荷分布或它们的任何组合来区分可检测的标签305、306和307。通过这种类型的多重探针的可检测标签生成的电信号的实例如图3C中所示。在使用多重探针的另一个实例中，通过化学基团(或化合物)302、303和304从探针的靶互补部分300部分分离可检测的标签308、309和310的带正电荷的部分301(见图3B)以防止由带正电荷的部分301的接近对易切割的连接102的切割效率引起的潜在负面干扰。在另外的实例中，探针可以包括两个附接在探针的靶互补部分400的5’和3’末端的可检测的标签401和403(见图4A)、403和406(见图4B)或406和407(见图4C)。具有两个可检测标签的探针可以包括两个易切割的连接401和402，其可以得到酶切以释放两个标签。并未示出两个可检测标签的所有组合，但是所有组合都包括在本公开中。可检测的标签201、202和203(见图2)，305、306和307(见图3A)，以及308、309和310(见图3B)显示为5’瓣，仅用于提供实例–这些探针可以作为3’瓣附接在探针的靶互补部分的3’末端。
5.例示性标签
在一些实施方案中，带正电荷的可检测的标签101(例如，见图1)可以为具有带正电荷主链的多核苷酸，或多核苷酸类似物。可用于本发明方法的例示性适合的带正电荷的主链包括脱氧核胍(DNG)(参见，例如Dempcy et al.,1995,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:6097-101；Barawkar and Bruice,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:11047–52；Park andBruice,2008,Bioorg.Med.Chem.Lett.,18(12):3488-91)，核苷氨基酸(NAA)-修饰(参见，例如Schmidtgall et al.,2015,Beilstein J.Org.Chem.,11:50–60)，N,N-二乙基-乙二胺氨基磷酸酯连接(参见，例如Dagle and Weeks,1996,Nucl.Acids Res.,24(11):2143-49)，三唑连接的Plus DNA(TL DNA+)(参见，例如Fujino et al.,2013,Heterocycles,87(5):1023-28)，或在磷酸二酰胺吗啉(phosphorodiamidate morpholino)PMO(PMOplus)的主链中的带正电荷的哌嗪残基。在一些实施方案中，带正电荷的标签101可以为多核苷酸(或多核苷酸类似物)和肽的嵌合体。例示性嵌合体可以包括在肽缀合的磷酸二酰胺吗啉PMO(PPMO)中带正电荷的富含精氨酸的肽和带有正电荷的赖氨酸(Lys)尾的肽核酸(PNA)寡聚体。可以使用本领域公知的技术制备肽和核酸之间的缀合物。在一种此类技术中，可以分别合成所需氨基酸和核苷酸序列的肽和核酸组分，例如通过标准自动化学合成技术，然后在水/有机溶液中缀合。举例而言，可从Glen Research商购的OPeCTM系统基于N-末端硫代酸酯-功能化肽与5’-半胱氨酰寡核苷酸的天然连接。
在一些实施方案中，带正电荷的可检测标签101(见例如图1)包括寡阳离子或寡核苷酸-寡阳离子缀合物。例示性带正电荷的缀合物包括Zip核酸(ZNA)(参见，例如Moreau etal.,2009,Nucleic Acids Res.,37(19):e130；Paris et al.,2010,Nucleic Acids Res.,38(7):e95)。通过附接在寡核苷酸的阳离子精胺部分的数量调节ZNA的全局电荷。在一些实施方案中，探针可以合成为ZNA，以包括由寡核苷酸或寡核苷酸类似物代表的靶互补部分100和精胺单元的标签101。在一些实施方案中，在通过聚合酶的5’核酸酶活性切割标签时，或通过如上所述的酶活性在易切割的连接102处，释放的可检测标签101可以包括带正电荷的多聚精胺和至少一个带负电荷的核苷酸残基。根据本文所述的方法，应该选择阳离子精胺单元的数量，使得释放的可检测标签的全局(或净)电荷为正，而探针的全局(或净)电荷为负。
在一些实施方案中，构成带正电荷的可检测标签201、202和203的带正电荷的核苷酸或其类似物或非多核苷酸阳离子的数量可以在不同的探针中不同(例如，如图2A中描绘的用于多核苷酸靶的多重检测的不同探针)。
在一些实施方案中，附接在用于多重的可检测标签的带正电荷部分的另外的化学基团或化合物(例如，图3中所示的可检测标签305、306、307、308、309和310的302、303和304)包括聚乙二醇(PEG)链。该方法通过将12个乙二醇单元附接到具有磷酸二酯和硫代磷酸主链的寡核苷酸上来例示说明(参见，例如Shokrzadeh et al.,2014,Bioorg.Med.Chem.Lett.,24(24):5758–61)。
在一些实施方案中，另外的化学基团或化合物可以包括带正电荷的含糖聚合物。生产基于甲基丙烯酸酯或甲基丙烯酰胺的糖单体并通过RAFT或ATRP聚合它们以产生具有窄多分散性的直链或支链含糖聚合物的方法是众所周知的。另外，可以聚合基于寡糖的单体以获得明确定义的含糖聚合物。可以使用各种方法(例如通过二硫键交换)将这些含糖聚合物与寡-和多核苷酸缀合(参见，例如Engineered Carbohydrate-Based Materials forBiomedical Applications,Ed.Ravin Narain,2001,Ch 4,Willey)。可以通过将5’-硫醇修饰的寡核苷酸与通过调聚反应合成的碘乙酰胺化的含糖聚合物偶联来制备带有alpha-甘露糖苷和beta-半乳糖苷的寡核苷酸-含糖聚合物缀合物(参见，例如Akasaka et al.,2001,Bioconjugate Chem.,12(5):776–85)。这些缀合物最小程度地影响双链体的DNA构象和解链行为。
在一些实施方案中，另外的不带电或带正电荷的化学基团或化合物包括多肽和/或多类肽(polypeptoid)(即，聚-N-取代的甘氨酸)。在一些实施方案中，化学部分是其衍生物，例如N-甲氧乙基甘氨酸(NMEG)寡聚体(参见，例如美国专利号7,371,533；Meagher etal.,2008,Anal.Chem.,80:2842-48)。
在一些实施方案中，另外的不带电或带正电荷的化学基团或化合物可可以包括各种各种市售的寡核苷酸间隔物(spacer)或臂(arm)。间隔物和臂的非限制性实例包括3’己二醇(六碳乙二醇间隔物)、Spacer 9(可以在寡核苷酸的5’末端或3’末端掺入的三甘醇间隔物，包括每当需要更长的间隔物时连续地掺入)、Spacer 18(可以在5’末端或3’末端掺入的18-原子六乙二醇间隔物)。另外，如果需要更长的间隔物，可以连续添加掺入Spacer C12(用于将长间隔臂掺入寡核苷酸中的12-碳间隔物)(Tri Link Inc.)。在另一个实例中，间隔物亚磷酰胺(Fidelity Systems Inc.)可获得不同的长度和可变疏水性并可以在合成期间单独或依次添加到寡核苷酸的5’末端(例如，Arm26-Ach Spacer、Arm26-T Spacer、15ASpacer、14A Spacer、Diol 22A Spacer)。这些不同长度和可变疏水性的非核苷间隔物可以单独或依次添加5’末端，并且由常见的仲氨基醇，反式-4-氨基环己醇制成，其随后利用Fidelity Systems Inc.的专有MOX化学衍生化。改变5’末端修饰的另一种方法是使用分支单元(Branching Unit)11Amidite，其在寡核苷酸的5’末端导入接界点。分支单元可以单独或依次添加以制备高度分支化的寡核苷酸。
6.带正电荷的标签的检测
可以通过检测探针的切割的副产物(带正电荷的可检测标记)以在样品中电子检测靶核酸。在一些实施方案中，检测靶核酸分子的方法包括(a)在与靶多核苷酸杂交时切割探针，其中在切割时产生带正电荷的标签，和(b)使用纳米微孔检测释放的带正电荷的标签。如本文所述，可以通过纳米微孔上的电压差引导标签流过纳米微孔。
当带正电荷的标签穿过纳米微孔时，它会生成电子变化。在一些实施方案中，电子变化是电流幅度的变化、纳米微孔的电导变化，或它们的任何组合。
继续参考图2、3和4，可以将不同的标签附接至不同靶物特异性探针的靶互补部分，使得当标签得到释放并通过纳米微孔时，它们可以根据纳米微孔中生成的特定信号相互区分。特别参考图3C，可以检测三种不同的信号强度(305、306和307)。例如，一个穿过纳米微孔的标签可以生成具有幅度305的信号，另一个标签306可以生成具有较低幅度的信号，而第三个标签307可以生成具有较高幅度的信号。在一些情况下，信号可以返回到检测之间的基线水平311。在一些实施方案中，标签阻断纳米微孔的时间可以在标签之间不同，其中标签具有带正电荷的部分和不同质量的化合物(“阻力”)，例如不同数量单体的线性聚合物，例如PEG。此类标签通过纳米微孔的移位导致明显的质量依赖性电导状态，其具有特征性的平均停留时间。例如，Robertson等(2007,PNAS USA,104(20):8207–11)证明基于电导的质谱清楚地解析了乙二醇的重复单元，并且停留时间随着PEG的质量而增加。
本公开提供了用于确定具有另外的化合物(“阻力”)的带正电荷标签的标识的方法(例如图3)，其包括使化合物与测量电导的系统接触，并记录当带有化合物的可检测标签移位通过纳米微孔时电场的变化。电场的变化是标签与化合物、电解质和微孔之间相互作用的结果，其表示化合物的大小、电荷和组成，从而允许在电场的变化和化合物的特性之间进行关联。在一些情况下，可检测的标签不携带另外的“阻力”(图2)，并且仅通过构成标签的聚合物的带正电荷单元的数量而不同。
在一些实施方案中，用于确定标签标识的方法包括电导测量系统。电导测量系统可以包括由物理屏障分开的具有第一和第二电解质溶液的第一个第二室。在此类系统中，所述屏障具有至少一个直径为纳米级的纳米微孔；用于在屏障上施加电场的手段；和用于测量电场变化的手段。
在一些实施方案中，用于靶核酸检测的电子方法包括用于感测带正电荷的标签的场效应晶体管(FET)。在一些实施方案中，FET包括离子敏感FET(ISFET)或碳纳米管FET(CNFET)。
7.装置
本文公开的方法和材料可以与各种设备或装置中的任何一种结合使用。本文公开的靶核酸的电子检测可以有利于结合微流控装置以小型化格式实施所公开的方法。微流控装置可以利用各种几何形状的各种微通道、孔和/或阀门来制备、运输和/或分析样品。流体可以使用各种力传递通过装置，包括注射、泵送、施加抽吸、毛细管作用、渗透作用、电渗透以及热膨胀和收缩等。
在一些实施方案中，微流控装置可以包括一个或多个在适合的基底中制造的微流体室或通道、配置为用以接收含有至少一个靶多核苷酸序列的样品的入口；以及嵌入微流控装置中的通过通道与阀门与入口连接的纳米微孔检测器芯片。
在一些实施方案中，多个室或通道可以用于分离或分开含有靶核酸的样品并以单重形式(singleplex format)实施本公开的方法，即在每个反应室中单独询问不同的靶。在一些实施方案中，当另外配置有多个入口端口时，微流控装置的此类构造可以用于在一个反应室中询问多个样品用于单个(单重检测)或多个(多重检测)靶。
在一些实施方案中，纳米微孔检测器芯片包括一个或多个具有第一电极并且配置用于对样品进行温度控制的顺式室。通常，顺式室是从探针切割可检测的标签发生的位置。在一些实施方案中，纳米微孔检测器芯片包括一个或多个具有第二电极的反式室，其通过包括嵌入的纳米微孔的屏障与顺式室分开。此类纳米微孔检测器芯片适用于通过向电极施加电势并迫使可检测的标签移位通过纳米微孔从而引起电导的变化来检测和识别标签。
图7显示纳米微孔检测器芯片(或微流控装置)的实例。纳米微孔检测器可以包括含有顶部电极603和导电溶液的顺式室(顶部)600；嵌入在半导体基底608中并含有底部导电电极604的反式室(底部)601；以及分开两个室600和601并具有嵌入的纳米微孔602的电阻屏障或膜。纳米微孔检测器还可以包括用于控制电刺激(例如电压偏置)和用于处理嵌入基底(例如硅基底)内的检测到的电信号的电路607；包括为电路607的一部分的可变电压源609；以及温度控制元件606。电路还可以包括放大器、积分器、噪声滤波器、反馈控制逻辑和各种附加组件。温度控制元件606可以为热电加热和/或冷却装置(例如佩尔捷(Peltier)元件)。顺式室通常含有在缓冲电解质溶液中的靶核酸、酶混合物、探针和引物(适用时)。
在一些实施方案中，纳米微孔检测器的电路可以耦合到计算机处理器，其可以耦合到存储器。
在一些实施方案中，多个纳米微孔检测器可以形成纳米微孔阵列，其中纳米微孔可以为可单独寻址。
在一些实施方案中，在检测可检测的带正电荷的标签期间，提供电压偏置使得顺式室中嵌入的顶部电极为正电极并且反式室中嵌入的底部电极为负电极。此类电压偏置迫使可检测的带正电荷的标签从顺式室流过纳米微孔至反式室。这与本领域已知的常规核酸检测和/或测序纳米微孔装置相反，其中带负电荷的核酸在正电极的方向上移位通过纳米微孔。
在本文所述的方法和系统中使用的纳米微孔可以是用非导电材料制造的固态纳米微孔，或用蛋白质形成的能够自组装成形成通道的结构并能够嵌入脂质双层中的生物纳米微孔。
几种生物纳米微孔可以用于在单分子水平检测核酸(参见，例如Feng et al.,2015,Nanopore-based Fourth-generation DNA Sequencing Technology,Genomics,Proteomics&Bioinformatics,13(1):4–16)。其中之一是alpha-溶血素(alpha-HL)微孔。alpha-HL通道的内径和单链DNA(ssDNA)分子的大小非常接近(直径～1.3nm)。alpha-HL纳米微孔能够使用纳米微孔内的离子电流区分单核苷酸。纳米微孔的有限孔径允许线性单链而不是双链核酸分子(直径～2.0nm)通过。另一种纳米微孔为耻垢分枝杆菌孔蛋白A(Mycobacterium smegmatis porin A，MspA)；MspA八聚体的通道在最小点处直径～1nm，其与alpha-HL相比相对小且窄。因此，它可以提高ssDNA检测和测序的空间分辨率。alpha-HL和MspA两者都非常稳健，并且在极端实验条件下(例如将pH值从2变为12并将温度保持在100℃30分钟)通道保持活性。噬菌体Phi29纳米微孔是另一种生物纳米微孔。phi29微孔中的通道在末端之一处具有约10nm2(直径3.6nm)的横截面积，并且已经证明双链DNA(dsDNA)可以通过。与alpha-H和MspA相比，phi29微孔具有更大的直径，其允许测量更大的分子，例如dsDNA、与大基团(例如DNA或蛋白质的复合物)偶联的dsDNA。
虽然生物纳米微孔已经显示出对ssDNA测序有用，但此类蛋白质微孔具有恒定的孔径、剖面并缺乏稳定性。它们受传统支撑脂质膜的脆弱性影响。为克服这些缺陷，已经使用不同材料和方法制造了各种合成固态纳米微孔，并应用于核酸分析。固态纳米微孔与其生物对应物相比具有许多优点，例如化学、热和机械稳定性，以及尺寸可调节性。通常使用各种技术在氮化硅(Si3N4)、二氧化硅(SiO2)、氧化铝(Al2O3)、氮化硼(BN)、石墨烯、聚合物膜和杂化材料中制造纳米微孔。制造纳米微孔的方法包括离子铣削轨迹蚀刻方法、基于电子束的分解溅射、聚焦离子束(FIB)技术、激光烧蚀方法、电子束光刻、氦离子显微镜和介质击穿方法。固态纳米微孔的电学和几何特性使其具有优于其生物学对应物的明显优势。
纳米微孔可以形成或制造或以其他方式嵌入非导电屏障或膜中，所述非导电屏障或膜设置与感测电路(例如集成电路)的感测电极相邻。集成电路可以是专用集成电路(ASIC)。在一些实施方案中，集成电路是场效应晶体管或互补金属氧化物半导体(CMOS)。
8.试剂盒/制品
在另一方面，提供了用于实施本文所述的方法的试剂盒。
在一些实施方案中，试剂盒包括第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物，其作为正向和反向引物用于核酸扩增；和具有可检测标签的探针，用于如本文所述的靶核酸的检测。
在一些实施方案中，试剂盒包括寡核苷酸引物和用于检测如本文所述的两个或更多个靶核酸(例如，寡核苷酸引物和用于检测第一靶核酸的探针以及寡核苷酸引物和用于检测第二靶核酸的引物)的探针。
在一些实施方案中，试剂盒也可以包括一个或多个与如本文所述的核酸检测有关的另外的组分。在一些实施方案中，试剂盒可以进一步包括一个或多个用于实施如本文所述的一个或多个方法步骤的酶(例如，在DNA扩增中使用的酶，在探针的切割中使用的酶或实施RNA的逆转录的酶)，并任选地可以包括用于实施酶反应和/或检测如本文所述的标签的其他试剂(例如，缓冲液、核苷酸、添加剂等)。
在一些实施方案中，试剂盒包含易于使用的预混合制剂中的组分(例如，寡核苷酸引物、探针、酶和其他反应组分)。
B部分—使用滚环复制检测靶核酸的方法
1.概述
用于核酸检测的策略可以分为三类：靶扩增、探针扩增和信号放大。已经开发了许多用于靶扩增的方法，聚合酶链式反应(PCR)目前是各种诊断应用的金标准。使用荧光探针(例如TaqMan双标记探针、Scorpion探针、分子信标(Molecular Beacons)、LightCycler探针和嵌入染料(例如SYBR Green))的定量PCR为核酸诊断中最常见的方法。定量PCR需要复杂且昂贵的设备来实施热循环和光学读数。为了避免PCR使用中的限制，特别是在护理点背景中，已经开发了各种等温扩增技术，包括链置换扩增(SDA)、环介导扩增(LAMP)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)和其他(参见，例如Yan et al.,2014,Mol.BioSyst.,10:970-1003)。
或者，探针扩增方法包括连接酶链式反应(LCR)、侵入测定(Invader assay)、挂锁探针(Padlock probe)、滚环扩增(RCA)以及通过DNA探针的自组装进行检测以得出超分子结构。信号放大方法与探针扩增方法一样，不需要靶核酸扩增，并且包括切口内切核酸酶信号放大(NESA)和切口内切核酸酶辅助纳米粒子激活(NENNA)、结合(Junction)或Y探针、分裂DNAZyme(split DNAZyme)和脱氧核酶扩增策略、导致放大信号的模板导向化学反应、非共价DNA催化反应、杂交链式反应(HCR)、酪胺信号放大(Tyramide Signal Amplification)和分支DNA(bDNA)(参见，例如Andras et al.,2001,Mol.Biotech.,19(1):29-44；和Yan etal.,2014,Mol.BioSyst.,10:970-1003)。随着纳米技术的发展，信号检测系统迅速采用生物共轭纳米粒子(NP)，并开发了多种检测系统(参见，例如Ju et al.,2011,SignalAmplification for Nanobiosensing,Ch.2in NanoBiosensing,pp 39-84)。
在探针扩增方法中，滚环扩增(RCA)，常称为滚环复制(RCR)，在同一分子内生成多个拷贝(例如，串联重复)，使得难以从大的(例如，数百纳米至微米大小)盘绕的单分子结构检测小的单个DNA环，所述单分子结构在数百个荧光标记的检测器探针杂交时易于检测。此类大结构可以沉积在固体载体上并计数，提供用于检测和准确定量靶核酸的数字读数。概念上，本文所述的方法与微滴式数字PCR(ddPCR)相似，其中通过使用靶物特异性扩增引物的PCR特异性扩增封装到小反应器中的单个线性DNA分子。与ddPCR相比，RCA的益处在于，在扩增之前不需要分隔单个DNA分子，因为RCR机制生成长的单链DNA分子，其在相同的反应体积中自发地塌陷成大的有差异的个体结构。
在本公开中，检测靶核酸的新方法包括两个连续的探针连接反应，以生成环状探针并通过滚环复制机制扩增探针用于数字检测。与本领域已知的其他方法(例如挂锁探针和Selector探针)相比，本文所述的方法更具成本效益，其也利用滚环探针扩增，因为本文所述的方法可以在探针的组合物中利用更短的寡核苷酸，其比更长的探针更易制造并且成本明显更低。具体而言，本文所述的方法对于在从孕妇的血液中获得的无细胞DNA样品中检测胎儿非整倍性非常有用。
本文所述的另一种新方法也是基于滚环扩增，但不是生成和扩增环状探针，而是环化核酸样品中的片段，并且如果需要，通过滚环复制选择性地扩增靶核酸用于检测和计数。该方法特别适合于检测含有无细胞胎儿DNA的样品中的胎儿非整倍性，因为这些样品中大多数无细胞DNA种类的大小在约165至约190个核苷酸内，其易于直接的无模板环化/连接而无需片段化样品DNA。
本文所述的方法为单分子数字检测方法，因为来自单个探针或靶核酸分子的信号使用探针或靶的滚环扩增变得可检测。
在一些实施方案中，提供在包括核酸片段的样品中检测靶核酸的方法和组合物，其中通过采用靶物特异性探针实现检测的特异性，所述探针与靶核酸杂交并进一步转化为环状形式(例如靶物特异性环)。通过滚环复制扩增每个靶物特异性环(其为单分子)以生成具有多个串联重复的长线性核酸。因此，该具有多个串联重复的长线性核酸在与探针特异性荧光标记的检测器探针杂交后变得可检测和可定量(见图9A中的例示性方法)。在一些实施方案中，本文所述的方法经调整以适于检测含有无细胞循环DNA的样品用于胎儿染色体非整倍性。也公开了此类包括检测和定量染色体特异性片段的方法(见例如图9B)。
提供了在包括核酸片段的样品中检测靶核酸的方法和组合物，其中首先环化所述核酸的片段，然后选择靶物特异性环用于通过滚环复制，其通过使用靶物特异性引物从大型环的扩增。靶核酸的检测包括荧光标记的靶物特异性检测器探针与滚环复制产物的杂交，并且也可以包括计数染料特异性产物(见例如图9C)。这些方法也可以经调整以适于检测具有无细胞循环DNA的样品用于胎儿染色体非整倍性。也公开了此类包括检测和定量染色体特异性片段的方法(见例如图9D)。
2.使用探针检测并定量靶核酸
本文所述的靶核酸检测的方法包括使用靶核酸作为模板的探针臂的第一次连接，以及环化连接的探针的第二次连接(见例如图10A)。在使样品中的核酸与探针接触前，使样品中的核酸变性，例如通过加热和快速冷却。探针可以包括左臂寡核苷酸200和右臂寡核苷酸201(参见图10)。探针的左臂包括15-35个核苷酸长的部分201，其与靶核酸片段208中的上游序列互补，以及具有与检测器探针206互补的部分和与寡核苷酸的5’部分部分互补的部分207的定制非互补部分204(其作为用于滚环复制212的引物)。探针的右臂包括15-35个核苷酸长的部分203，其与靶核酸片段208中的下游序列互补，以及包括与寡核苷酸212的3’末端部分互补的2-5个核苷酸的短序列的非互补部分205(其作为用于滚环复制的引物)。
在探针的左和右臂退火至靶核酸208的条件下，靶互补部分202和203形成双链复合物，使得3’末端202与5’磷酸化末端203并置，并借助于DNA连接酶(例如T4DNA连接酶或Taq连接酶)连接两个末端。这生成了作为核酸的连续线性链的连接产物。在连接后，连接的探针与靶核酸的双链复合物通过加热变性并借助于单链DNA连接酶(例如CircLigase II)环化，以产生共价闭合的单链环209，其中与滚环复制212的引物互补的序列的完整性得到恢复。因为样品中的核酸片段用磷酸酶处理以去除5’末端磷酸基团，它们不可以环化。探针的未反应的左和右臂也可以环化，因为它们在其5’末端210和211处具有磷酸基团。
在使用外切核酸酶，例如外切核酸酶I消化连接混合物中的线性多核苷酸后，可以将探针特异性引物212与环退火。引物212与环化的探针209退火产生能够通过具有链置换活性的DNA聚合酶(例如噬菌体φ29 DNA聚合酶)来起始滚环复制的复合物，因为引物的3’末端与环完全退火。相反，将引物212与探针210的环化左臂退火产生不能起始DNA合成的复合物，因为引物212的3’末端与环状模板不匹配。
为防止通过噬菌体φ29 DNA聚合酶的3’-5’外切核酸酶活性消化引物212的3’末端(其可以导致环210的潜在启动和其他非特异性启动)，可以将对3’-5’外切核酸酶作用具有抗性的硫代磷酸主链导入到引物寡核苷酸212的最后1-3个核苷酸连接中。然后环化的右臂211不能与引物212形成稳定的复合物，并因此不能启动和起始滚环复制。因此，只有一种环化产物，全长环化探针209，用作滚环复制的模板，并产生具有探针的串联重复拷贝的长单链分子。
在一些实施方案中，可以设计探针以区分和检测基因组中的小遗传变异，例如单核苷酸多态性(SNP)或种系或癌细胞中的突变。通过设计改变左臂部分202中3’末端处或右臂部分203中第一5’核苷酸位置处的核苷酸类型允许区分两个等位基因，因为DNA连接酶(例如T4DNA连接酶)在标准条件下可以主要仅连接与连接接界的两个旁侧上的模板链完全匹配的DNA末端。因此，取决于连接点旁匹配或错配的存在，部分202和203可以通过DNA连接酶连接在一起或不连接在一起。
在一些实施方案中，靶核酸检测的方法包括使用靶核酸作为模板的探针的臂和另外的寡核苷酸(“桥”)的第一次连接，以及用以环化连接的探针的第二次连接(图10B)。与图10A中显示的方法相比，图10B中的探针除了左臂寡核苷酸200和右臂寡核苷酸201外，也包括桥寡核苷酸213。如本文所用，桥寡核苷酸213与上游和下游序列之间的靶核酸的中心区域互补，所述上游和下游序列与探针202和203的部分互补。向探针添加桥寡核苷酸不仅进一步提高了测定的特异性，因为需要两个连接事件以生成连接的线性探针多核苷酸，而且也提供了更好地询问靶核酸中小的遗传变异(例如SNP-单核苷酸多态性)的方法。桥寡核苷酸213可以为5-10个核苷酸长，并且核苷酸变异可以沿着桥寡核苷酸的长度放置在不同的位置，包括在5’或3’末端和/或与探针左或右臂的连接接界旁。桥寡核苷酸越短，匹配和错配之间的区分越好，因为在5-6个核苷酸长的桥内甚至一个错配对桥与其互补靶序列之间形成的双链复合物的稳定性具有显著影响。
在另一方面，提供了其中第二次连接(探针的环化)为模板依赖性的连接的方法(图11A和图11B)(即，其中与图10所示的实施方案相比，连接接界位于双链区域内)。在图11所示的实施方案中，不需要按照图10的方法中的要求分开与用于滚环复制311的引物互补的序列307，其中序列207完整性的恢复用作选择性机制，用以使用RCR仅扩增经历两次连续连接的环，并用以区分探针的环化单臂。与图10中所示的方法相比(其中使用单链DNA连接酶实施单链5’和3’末端的模板非依赖性连接)，模板依赖性分子内连接可用作形成靶物特异性环的第二次连接反应。
如图11A和11B中所描绘，只有具有左臂300和右臂301(参见图11A，或者参见图11B的左臂300、右臂301和“桥”309)的连接探针314和315可以使用夹板寡核苷酸310进行环化。本文所用的夹板寡核苷酸310与左臂的定制5’末端序列和右臂的3’末端序列互补。在促进这些末端退火至夹板寡核苷酸310的条件下，形成双链DNA复合物，其中左臂300的定制部分303的5’磷酸化末端与右臂301的定制部分306的3’末端并置，并且可以使用DNA连接酶(例如，T4 DNA连接酶或Taq连接酶)连接两个末端。这产生了连接312的产物，其包括共价闭合的环状单链DNA。图11B中所示的方法与图11A中所示的方法的不同之处仅在于一个方面——图11B中的“桥”寡核苷酸309用于进一步增加连接线性探针315形成的特异性，其中需要形成两个连接接界。夹板辅助的连接-环化导致形成共价闭合的单链DNA环313。此外，如本文所讨论的，“桥”的使用进一步增加了询问靶核酸中的小遗传变异的特异性和灵活性。
在一些实施方案中，多个靶物特异性引物中的每一个和多个检测器探针中的每一个的长度为10至200个核苷酸。
3.使用环化样品核酸的靶物特异性启动检测并定量靶核酸
图12显示本文所述的用于检测样品中靶核酸的方法的另一种实施方案，其包括片段化核酸(例如DNA)的环化。例如，图12描绘了两个核酸靶的并行检测。此类方法利用单链DNA连接酶的特性有效地环化单链DNA(ssDNA)的片段。市售的ssDNA连接酶包括但不限于，CircLigaseTM、CircLigase IITM(Epicentre)和Thermophage Ligase(Prokaria)。例如，CircLigaseTMII ssDNA连接酶为热稳定酶并可以催化具有5’磷酸基团和3’羟基的ssDNA模板的分子内连接(即环化)。它可以用于从线性ssDNA片段制备环状ssDNA分子。此类ssDNA环用作用于滚环复制或滚环转录的模板。与T4 DNA连接酶(其连接在互补的DNA模板上彼此相邻退火的DNA末端)相反，CircLigase II ssDNA连接酶在没有互补序列的情况下连接ssDNA的末端。通过CircLigase II酶环化>15个碱基的线性ssDNA，包括cDNA。在标准反应条件下，实际上没有产生线性多联体或环状多联体。随着ssDNA长度的增加，环化效率降低，例如，对于长度>500个碱基的模板，环化效率不高。因此，本文公开的此类方法通常使用长度在50-500个核苷酸范围内的片段化DNA或cDNA。
在一些实施方案中，可以通过以物理(例如超声处理)或酶促(例如，dsDNA片段酶，New England Biolabs Inc.)的方式对样品dsDNA进行片段化以生成该大小范围的ssDNA。在一些实施方案中，从片段化的RNA生成的cDNA可以用作用于环化的模板。在一些实施方案中，使用在人血液样品中发现的循环无细胞DNA(ccfDNA)。该DNA可以源自宿主的正常细胞、胎儿DNA或肿瘤DNA。ccfDNA主要由～170个碱基对的dsDNA片段表示。此类片段的大小大致对应于包裹在核小体周围的dsDNA的大小(长度)。变性后，～170个核苷酸的ssDNA片段非常适合于通过CircLigase II的有效环化。
在本文公开的方法中，样品中存在的dsDNA片段首先通过热变性/冰上迅速冷却，或碱变性/中和的方法转化为单链形式，然后环化(例如通过CircLigase II)，以生成ssDNA环。根据DNA剪切方法，dsDNA片段可以需要修复以恢复连接所需的5’磷酸基团和3’羟基。这可以通过用多核苷酸激酶处理dsDNA来实现。以酶促方式(例如通过dsDNA片段酶)生成的dsDNA片段不需要经历末端修复。
在一些实施方案中，在ssDNA环化后，可以用外切核酸酶(例如来自大肠杆菌的外切核酸酶I)消化未环化的线性片段，以富集ssDNA环。这防止了通过未环化线性片段的任何滚环复制的潜在非特异性启动，并确保靶标特异性引物仅在环上起始DNA合成。
在一些实施方案中，提供至少一个靶物特异性滚环复制引物以起始滚环复制。在一些实施方案中，多个引物，其也可以称为一组引物，与靶核酸互补。例如，当使用病原体或病毒的基因组，或染色体或染色体基因座，一组引物可以包括至少10个不同的各自特异性识别有差异的靶序列的引物(例如，至少不同的100个引物，或至少1000个不同的引物)。
在一些实施方案中，通过具有强链置换活性的DNA聚合酶从引物-环复合物起始滚环复制，其为持续滚环复制机制的先决条件。“链置换”描述了酶在合成期间置换酶所遇到的下游DNA的能力。例示性DNA聚合酶包括噬菌体φ29 DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶大片段和Bsu DNA聚合酶大片段。噬菌体φ29 DNA聚合酶具有最强链置换活性并在中等温度下具有活性(例如，大约20–37℃)。Bsu DNA聚合酶大片段具有中等链置换活性并在中等温度下具有活性(例如，20–37℃)。Bst DNA聚合酶，大片段，另一方面，为良好的链置换酶，其在升高的温度(例如，约65℃)下具有活性。滚环复制使用滚环(复制结构)，其中环状双链体的一条链用作用于多轮复制的模板，生成许多拷贝的所述模板。当从引物的3’末端起始DNA合成时形成滚环，并且生成dsDNA直至聚合酶到达退火引物的5’末端。然后DNA聚合酶开始置换上游5’末端。新合成的链置换原始的带切口的链，其不用作用于新合成的模板。因此，滚环机制仅复制DNA的一条链。通过环绕模板的复制(以类似滚环的模式)多次进行延伸。这导致产生大量拷贝的单链DNA，端对端连结(concatenated)或连接(connected)。由噬菌体φ29DNA聚合酶驱动的滚环复制在仅20-30分钟内生成>50千碱基的线性多联体产物。此类长线性分子折叠成微米大小的无规卷曲，其可以在沉积在表面上并通过荧光标记的探针的杂交染色时被检测到。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括对存在于ssDNA环混合物内的多个靶实施并行滚环复制。此类策略称为“多重靶检测”或“多重”。可以使用多个引物组实施多重靶检测，其中多个引物组的每一个包括多个特异性识别有差异的靶序列的引物。多个引物组包括至少两个引物组。引物组的数量仅受相应检测器探针的光学可分辨组数量的限制。图12描绘了核酸样品中两个有差异的靶的并行询问，其包括具有两个有差异的靶物特异性引物组的滚环复制的起始，其中，为简单起见，每个引物组由一个单个引物表示。
在一些实施方案中，滚环复制的启动包括引物与ssDNA环的杂交。这可以通过高于90℃加热环和引物的混合物，随后缓慢冷却至约30-37℃的反应温度，并随后添加Phi29DNA聚合酶、缓冲液和辅因子以起始DNA合成来实现。
在一些实施方案中，引物包括具有与分子信标探针类似的发夹(或茎-环)结构，但没有附接荧光团部分的寡核苷酸。例如，引物3’末端处的序列可以与靶互补并且可以添加5-8个与3’末端互补的核苷酸到引物的5’末端。发夹引物提高滚环复制的特异性，因为在滚环复制的温度(例如30-37℃)，此类引物为茎-环形式，其中3’末端隐藏在双链茎内，不能参与错误的DNA合成形成引物二聚体或非特异性RCR产物(在中等反应温度产生的滚环复制的两种主要乱真产物)。
为增强滚环复制的特异性，引物可以包括具有阻断可切割的3’末端的寡核苷酸，类似于IDT开发的rhPCR(RNase H依赖性PCR)引物(参见，例如Dobosy et al.,2011,BMCBiotechnol.,11:80)。此类引物包括(在3’到5’的方向)第一个与靶错配的DNA碱基、与位于第6位的靶匹配的RNA碱基、在第2和第5位的两个匹配的DNA碱基以及在第3和第4位的阻断基团(C3间隔物)。此类引物在通过RNase HII解除阻断前是不具功能的。在此类引物退火至ssDNA环后，通过在位于邻近引物3’末端的单个RNA残基处进行RNase HII介导的切割来实现解除阻断。切割去除阻断基团，留下能够启动DNA合成的3’-OH末端。切割对RNA碱基位置处和周围的匹配/错配敏感，导致该区域中对碱基序列的特异性非常高。
可以通过添加乙二胺四乙酸(EDTA)来停止滚环复制。滚环复制产物的长度随反应时间呈近似线性方式。因此，将复制产物折叠成无规卷曲导致形成具有一定直径的结构。例如，多联卷曲可以具有至少50纳米的横截面直径(例如，至少100纳米，至少500纳米，至少800纳米，至少1微米，至少2微米或更大)。
4.将RCR产物沉积到表面，检测和计数
可以将滚环复制的产物沉积在表面(例如，固体、半固体或凝胶表面)上。固体载体可以包括但不限于，材料例如玻璃、聚丙烯酰吗啉、二氧化硅、可控孔径玻璃、聚苯乙烯、聚苯乙烯/乳胶、羧基改性聚四氟乙烯(carboxyl modified Teflon)、聚合物LB膜、功能化玻璃、Si、Ge、GaAs、GaP、SiO2、SiN4、改性硅或(聚)偏二氟乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯或它们的组合。固体载体包括但不限于载玻片、板片、珠子、颗粒、球体、股线、薄板、容器(例如，试管、微量离心管、托盘等)、毛细管、薄膜、聚合物芯片等。基底的表面可以是平面的。基底上的区域可以彼此物理分离，例如，使用沟槽、凹槽、孔等。半固体载体可以选自聚丙烯酰胺、纤维素、聚酰胺(尼龙)以及交联的琼脂糖、葡聚糖和聚乙二醇。
在一些实施方案中，载体可以包括各种不同的结合部分以允许多联体与载体偶联。适合的结合部分包括但不限于，俘获部分例如疏水化合物、寡核苷酸、抗体或抗体的片段、蛋白质、化学交联剂、俘获对的一个或多个元件(例如生物素-链霉抗生物素蛋白、NHS-酯等)、硫醚键、静电荷相互作用、范德瓦耳斯力等。载体可以用本领域已知的任何各种官能团功能化。通常使用的化学官能团包括但不限于，羧基、氨基、羟基、酰肼、酰胺、氯甲基、环氧、醛等。
在一些实施方案中，滚环复制的产物沉积在氨基硅烷涂层玻璃的表面上或96孔板的孔中。
在一些实施方案中，在滚环复制的产物沉积在基底的表面上后，通过使它们与靶物特异性检测器探针接触来检测和可视化它们。检测器探针或检测器探针组，如图12中所例示(图9C的方法)，用荧光染料差异标记。在杂交时，两种产物变得可区分地标记，并且可以计算对应于两种靶的产物的数量。在图9A、9B和9C所示的方法中也可以使用相同的检测策略。图9A和9B中所示的方法与图9C和9D中所示的方法之间的主要不同之处在于，用于前两种方法的检测器探针与连接探针的定制部分互补(例如，图10A和10B中的206以及图11中的304)，而在后两种方法中，检测器探针与样品中存在的线性形式的以及相应的环状形式的靶DNA分子互补。
为了定量多种核酸的相对量，可以对每个种类使用不同的信号，例如与另一组探针的产物相比，一组探针的产物可以发射不同波长或光谱的荧光。在一些实施方案中，本文所述的方法可以经调整以适于含有无细胞循环DNA的样品用于检测胎儿染色体非整倍性(见例如图9B和图9D中的方法)。此类方法可以包括a)将对应于针对非整倍性检测的染色体和对照染色体的第一和第二RCR产物的混合物沉积到基底表面；b)与第一和第二多个检测器探针杂交，其中将第一和第二多个检测器探针差异标记；和c)对结合到第一多个检测器探针的RCR产物进行计数，并独立地对结合到第二多个检测器探针的RCR产物进行计数。由于每个RCR产物包括数百或数千个拷贝的初始单链DNA环，标记的检测器探针与这些多个重复序列杂交以产生可由光学成像系统容易地检测的强荧光信号，因此，允许对每个RCR产物进行计数。此类对来自单独RCR产物的信号进行的电子计数允许对无细胞DNA的样品中存在的对应于特定染色体(例如染色体21对对照染色体1)的DNA片段进行准确计数。本文所述的方法比PCR更准确，因为靶分子的扩增可以导致显著偏差，因为一些序列的扩增效率比其他序列高得多。
在一些实施方案中，可以荧光标记检测器探针。本文所述的方法中有用的适合的可区分的荧光标记对包括Cy-3和Cy-5(Amersham Inc.,Piscataway,NJ)、RadiantDY-547和RadiantDY-647(BioVentures,Inc.,Murfreesboro,TN)、Quasar 570和Quasar 670(Biosearch Technology,Novato CA)、Alexafluor555和Alexafluor647(MolecularProbes,Eugene,OR)、BODIPY V-1002和BODIPY V1005(Molecular Probes,Eugene,OR)、POPO-3和TOTO-3(Molecular Probes,Eugene,OR)。应当理解的是，多重靶检测需要两个以上的荧光标记。可以在网络资源“荧光染料数据库”(“Database on Fluorescent Dye”)和Kricka et al.(2002.,Ann.Clin.Biochem.,39:114-29)中找到适合的可区分的可检测标签。
由于同时使用的光谱上有差异的荧光团的有限数量，目前多重限于5-6种染料。然而，组合标记方法可以用于生成所需数量的不同发射光谱。在一些实施方案中，对于高于五重的多重检测，靶物特异性检测器探针可以包括根据“多色组合探针编码”(MCPC)(参见，例如Huang et al.,2011,PLoS ONE,6(1):e16033)用荧光染料标记探针，其描述了以各种组合使用有限数量(n)的不同颜色的荧光团标记每个探针的标记范例，使得能够在一个反应中检测到所有2n-1个靶。应当领会的是，RCA产物可以在它们分布在基底上之前或之后进行标记。
在一些实施方案中，本文所述的方法通常包括在RCR起始前将样品(其包括环化的DNA片段)分到几个反应中，如图13A中所描绘的以双重靶检测测定作为实例，其中使用聚合酶和dNTP在分开的室中实施两个RCR反应，并且其中在与染料标记的dNTP的追踪反应期间标记初期RCR产物，以生成可区分标记的靶物特异性RCR产物。或者，RCR反应可以在初始包括标记的dNTP，如图13B中所描绘。在这种情况下，染料标记的dNTP与未标记的dNTP的比率是决定染料标记的dNTP的掺入密度与RCR产物总长度之间平衡的主要因素。非常高的比率可以限制滚环复制的进展并且导致归因于通过掺入庞大染料部分而造成DNA螺旋扭曲的失败的RCR，最终导致DNA聚合酶不能实施进一步的DNA合成。已经证明了在滚环复制期间染料标记的dNTP掺入的可行性(参见，例如Smolina et al.,2005,Analyt.Biochem.,347:152–5)。荧光标记的dNTP可商购获得，例如Cy3.5-dCTP(GE Healhcare Life Sciences)；5-FAM-dUTP、Andy Fluor 488-X-dUTP、Andy Fluor 555-X-dUTP、Andy Fluor 568-X-dUTP、AndyFluor 594-X-dUTP、Andy Fluor 647-X-dUTP、Cy3-X-dUTP、Cy5-X-dUTP(AppliedBioProbes)；二乙氨基香豆素-5-dUTP、二乙氨基香豆素-5-dCTP、Cy5-dGTP、Cy5-dUTP、Cy5-dATP、Cy5-dCTP、Texas Red-5-dUTP、Texas Red-5-dCTP、Texas Red-5-dATP、Cy3-dUTP、Cy3-dCTP、Cy3-dGTP、Cy3-dATP、四甲基罗丹明-6-dUTP、四甲基罗丹明-6-dCTP、丽丝胺-5-dUTP、荧光素-12-dUTP、荧光素-12-dCTP、荧光素-12-dGTP、荧光素-12-dATP(PerkinElmer)。此类RCR产物标记方法(其为荧光团标记的检测器探针杂交的替代品)(见例如图12)可以导致在每个RCR产物中掺入数百或数千个荧光团，以便于信号检测。
在一些实施方案中，在沉积在表面上之前，将可区分标记的分开的RCR反应汇集在一起用于定量(见图13A和13B)，或者沉积在载体表面上的不同区域上(图14A和14B)。在后一种情况下，可以通过掺入相同的荧光团在RCR期间标记分开的反应。
根据本发明，可以采用本领域技术范围内的常规的分子生物学、微生物学、生物化学和重组DNA技术。此类技术在文献中有充分说明。在以下实施例中将进一步描述本发明，其不限制权利要求中描述的方法和物质组合物的范围。
实施例
A部分—使用带正电荷的标签检测靶核酸的方法
实施例1—寡聚精胺-寡核苷酸缀合物探针的切割
合成包含Zip核酸(ZNA)寡核苷酸的靶核苷酸检测探针，其中5’或3’可检测的标签为具有3或4个精胺单元的寡聚精胺聚阳离子5’或3’尾，分别具有(-++++)×3＝9+或(-++++)×4＝12+的净电荷。
用于RNaseP qPCR测定的探针1：5’-(精胺)3-(间隔物-31)-TTC TGA CCT GAA GGCTCT GCG CG-(间隔物-C3)-3’(SEQ ID NO:1)
用于RNaseP qPCR测定的探针2：5’-TTC TGA CCT GAA GGC TCT GCG CG-(间隔物-31)-(精胺)4(SEQ ID NO:2)
探针的寡核苷酸部分为与人RNaseP基因互补的序列。通过C3间隔物阻断探针1的3’末端以防止从退火的探针的3’末端通过DNA聚合酶启动DNA合成。设计PCR正向和反向引物以生成60bp的RNaseP扩增子。
用于RNaseP qPCR测定的正向引物：5’-AGA TTT GGA CCT GCG AGC G-3’(SEQ IDNO:3)
用于RNaseP qPCR测定的反向引物：5’-GAG CGG CTG TCT CCA CAA GT-3’(SEQ IDNO:4)
预期在PCR期间通过Taq聚合酶的5’外切核酸酶(瓣状内切核酸酶)活性切割探针1，以释放5’聚阳离子寡精胺标签。预期在PCR期间通过Taq聚合酶的5’外切核酸酶活性消化探针2的寡核苷酸部分，以释放3’聚阳离子寡精胺标签。
在下文指定的反应条件下，在探针1或探针2的存在下实施人RNaseP基因的60bp扩增子的PCR扩增。在反应混合物中实施PCR，所述反应混合物含有1x Taq缓冲液(NewEngland Biolabs Inc.)、200μM的每种dNTP、0.8μM正向引物、0.8μM反向引物、0.4μM探针、5U/μl热启动Taq(New England Biolabs Inc.)和100ng人DNA。六个PCR反应设置如下：
反应1：使用探针1的PCR；
反应2：“无模板对照(No-Template-Control)”(NTC)–与反应1相同，但不包括模板DNA；
反应3：使用探针2的PCR；
反应4：“无模板对照”(NTC)–与反应3相同，但不包括模板DNA；
反应5：“阴性对照”–具有探针1的反应混合物，但省略了正向引物、反向引物、Taq聚合酶和模板DNA，
反应6：“阴性对照”–具有探针2的反应混合物，但省略了正向引物、反向引物、Taq聚合酶和模板DNA。
在以下条件下实施热循环：95℃30秒；30个循环的95℃15秒，55℃30秒，68℃30秒；以及68℃5分钟。在完成PCR后，将反应物加样到15％TBE-尿素凝胶上，在180V运行，并用GelStar嵌入染料(Lonza,Inc.)染色。图8表明，与NTC(泳道2)相比，探针1在PCR反应(泳道1)期间受特异性切割。泳道5显示探针1的电泳迁移率。类似地，探针2仅在产物成功扩增的样品中受到切割(泳道3)，并且在对照NTC样品中没有观察到切割(泳道4)。泳道6显示探针2的电泳迁移率。这些结果证明在5’-或3’-末端处具有带正电荷的标签的探针可以通过Taq聚合酶有效切割。
B部分—使用滚环复制检测靶核酸的方法
实施例1—21三体性(唐氏综合征)的检测
如图11A所描绘的，设计例示性的方法以询问人染色体-特异性区域。合成了192个人染色体1特异性和192个人染色体21特异性探针。每个探针包括两个5’磷酸化寡核苷酸：左臂和右臂。每个左和右臂寡核苷酸具有20-30nt与靶向人序列同源的区域和具有如下序列的定制序列瓣：5’-TCG ACC GAC CAC CCT AGC GAC CCG TA-3’(SEQ ID NO:5)用于染色体1探针的左臂，5’-TCG ACC GAC CCT TCT GAG CTC CTG CG-3’(SEQ ID NO:6)用于染色体21的左臂，以及5’-GCC CGA CTT AGC GTA CCA-3’(SEQ ID NO:7)用于染色体1和染色体21特异性探针两者的右臂。
将来自Coriell Cell Repository(Camden，NJ)的NA19238女性的人DNA用片段酶(New England Biolabs)片段化，并选择大小至平均片段大小为180nt。将20ng的片段化DNA根据制造商的条件，与两个染色体特异性探针库的混合物结合(每个库由192个探针组成，384个探针的每一个的终浓度为5nM)、退火并通过HiFi Taq连接酶于62℃连接。通过凝胶电泳将具有平均大小～90nt的连接单链产物从探针分离、切下并使用Nucleospin试剂盒(Machereu-Nagel)从2％凝胶提取出来。将60μl的10mM Tris pH 8/0.1mM EDTA中的连接产物与10μl的10μM夹板寡核苷酸(5'-GGT CGG TCG ATG GTA CGC TAA GTC-3’(SEQ ID NO:8))混合、加热至95℃3分钟，然后在冰上快速冷却。添加50ul的由1x TA缓冲液(33mM Tris-醋酸(pH 7.5)、66mM醋酸钾、10mM醋酸镁和0.5mM DTT)、1mM ATP和2.1单位/μl的T4 DNA连接酶组成的连接混合物并于37℃实施连接/环化反应1小时。将外切核酸酶I和外切核酸酶III(两者均来自Enzymatics Inc)添加到连接混合物至终浓度分别为0.62单位/μl和1.03单位/μl并在热循环仪中于37℃温育0.5小时。为终止反应，将6μl的0.5M EDTA添加到样品中。使用Nucleospin Clean-Up试剂盒(Macherey-Nagel)纯化单链DNA环，并于20μl的10mMTris pH 8中洗脱。添加RCR引物(与夹板寡核苷酸相同)至终浓度0.5μM并将30μl反应混合物加热至93℃3分钟并在30分钟内缓慢冷却至30℃。通过添加以下反应组分至含有具有退火的RCR引物的环的混合物中设置滚环复制：1x Phi29缓冲液、0.2mM dNTP(每个)、0.2μg/μl BSA、200mU/μl Phi29 DNA聚合酶(New England Biolabs)。于30℃实施反应1小时并通过添加EDTA终止。将最终RCR产物在定制流动池中的氨基硅烷玻璃载玻片表面上沉积30分钟，并且在杂交缓冲液(1M NaCl/20mM EDTA/20mM Tris/0.1％Tween-20，于70℃2分钟和于50℃30分钟)中以5nM的最终装饰探针(decorator probe)浓度与染色体1特异性(5’-Cy3-CCACCC TAG CGA CCC GTA-3’(SEQ ID NO:9))和染色体21特异性(5’-Cy5-CCC TTC TGA GCTCCT GCG-3’(SEQ ID NO:10))的混合物杂交。用杂交缓冲液清洗流动池，并拍摄相同视野的Cy3和Cy5荧光图像以可视化对染色体1和21具有特异性的RCR产物。图15。
应当理解的是，虽然本文已经结合许多不同方面描述了方法和物质组合物，但是各个方面的前述描述旨在说明而不是限制方法和物质组合物的范围。其他方面、优点和修改在以下权利要求的范围内。
公开了方法和组合物，其可以用于、可以一起使用、可以用于制备或者是所公开的方法和组合物的产物。本文公开了这些和其他材料，并且应当理解的是，公开了这些方法和组合物的组合、子集、相互作用、组等。也就是说，虽然可以未明确公开对这些组合物和方法的每种不同的个体和集体组合和排列的具体参考，但在本文中具体考虑和描述了每一种。例如，如果公开和讨论了特定的物质组合物或特定的方法，并且讨论了许多组合物或方法，则除非特别指出相反的情况，否则特别考虑组合物和方法的每种组合和排列。同样地，还特别考虑和公开了这些的任何子集或组合。

Claims (47)

1.无扩增的靶核酸序列检测的方法，所述方法包括：
(a)提供包含至少一个靶核酸序列的样品；
(b)使所述样品与包含核酸部分和带正电荷的标签的探针接触，其中所述核酸部分与所述靶核酸序列的至少一部分互补，其中所述接触在所述核酸部分和互补的靶核酸序列之间形成探针-靶复合物的条件下进行；
(c)在所述探针-靶复合物内切割探针以释放可检测的带正电荷的标签；和
(d)基于电信号的变化检测释放的带正电荷的标签通过纳米微孔的移动；
其中电信号的变化指示样品中存在所述靶核酸序列。
2.根据权利要求1的方法，其中所述探针进一步包含选自下组的易切割的连接：RNA序列、DNA序列和无碱基核苷酸序列。
3.根据权利要求2的方法，其中所述易切割的连接包含至少一个RNA残基。
4.根据权利要求2的方法，其中所述易切割的连接包含氧化嘌呤或氧化嘧啶。
5.根据权利要求2的方法，其中所述易切割的连接包含无嘌呤位点或无嘧啶位点。
6.根据权利要求2的方法，其中所述易切割的连接包含脱氧尿苷、5-羟基尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶或5-甲酰基尿嘧啶。
7.根据权利要求2的方法，其中通过1型核糖核酸酶H或2型核糖核酸酶H切割所述易切割的连接。
8.根据权利要求2的方法，其中通过DNA N-糖苷酶和DNA AP-裂合酶活性的组合切割所述易切割的连接。
9.根据权利要求2的方法，其中通过DNA AP-裂合酶活性或内切脱氧核糖核酸酶切割所述易切割的连接。
10.根据权利要求2的方法，其中通过DNA N-糖苷酶和内切脱氧核糖核酸酶的组合，或DNA N-糖苷酶和DNA AP-裂合酶活性的组合切割所述易切割的连接。
11.根据权利要求1的方法，所述方法进一步包括：
在步骤(b)中，进一步使所述样品与引物接触，其中所述引物与靶核酸序列的至少一部分互补，所述靶核酸序列的至少一部分在与探针互补的靶核酸序列的部分的上游，其中所述接触在所述引物和互补的靶核酸序列之间形成引物-靶复合物的条件下进行；和
在步骤(c)中，使包含所述引物-靶复合物的样品与DNA聚合酶在引物延伸发生的条件下接触。
12.根据权利要求11的方法，其中在引物延伸期间通过所述DNA聚合酶切割所述探针。
13.根据权利要求11的方法，其中通过所述DNA聚合酶的5’核酸酶活性介导所述切割。
14.根据权利要求11的方法，其中通过所述DNA聚合酶的延伸受反应中存在的dNTP类型数量的限制。
15.根据权利要求14的方法，其中反应中存在的dNTP的数量为四种dNTP的一种，或两种，或三种。
16.根据权利要求1的方法，所述方法进一步包括：
在步骤(b)中，进一步使所述样品与至少两个引物接触，其中所述至少两个引物与所述靶核酸序列的部分互补，所述靶核酸序列的部分在与探针互补的靶核酸序列的部分的旁侧，其中所述接触在所述至少两个引物和互补的靶核酸序列之间形成引物-靶复合物的条件下进行；和
在步骤(c)中，使用DNA聚合酶扩增所述至少两个引物之间的靶核酸序列。
17.根据权利要求16的方法，其中扩增所述靶核酸序列包括聚合酶链式反应(PCR)或等温反应。
18.根据权利要求16的方法，其中通过所述DNA聚合酶在扩增期间切割所述探针。
19.根据权利要求16的方法，其中通过所述DNA聚合酶的5’瓣状内切核酸酶活性介导所述切割。
20.根据权利要求16的方法，其中切割导致可检测的带正电荷的标签的检测，其指示靶扩增子的复制。
21.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述探针包含净负电荷。
22.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述可检测的带正电荷的标签在释放之前和之后包含净正电荷。
23.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述可检测的带正电荷的标签在释放之前和之后包含带正电荷的核酸部分、非核酸部分或它们的组合。
24.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述接触步骤包括使所述样品与多个探针接触，所述探针各自与至少两个不同的靶核酸序列互补并各自具有不同的正电荷(量或类型)，并且其中所述电信号(类型/量)能够区分所述至少两个不同的靶核酸序列。
25.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述切割步骤包括酶促切割所述探针。
26.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述可检测的带正电荷的标签通过所述纳米微孔。
27.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述可检测的带正电荷的标签能通过它的电荷、形状、大小或它们的任何组合来检测。
28.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述检测步骤进一步包括鉴别所述可检测的带正电荷的标签。
29.根据权利要求28的方法，进一步包括将经鉴别的标签与相应的靶核酸序列的存在相关联。
30.根据前述权利要求中任一项的方法，进一步包括将所述电信号的量/水平与样品中靶核酸序列的量相关联。
31.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法使用计算机处理器。
32.根据前述权利要求中任一项的方法，其中使用离子敏感的场效应晶体管检测所述可检测的带正电荷的标签。
33.使用靶物特异性探针检测样品中的靶核酸的方法，所述方法包括：
(a)提供包含多个单链核酸片段的样品；
(b)以分子内环化所述单链核酸以产生单链环；
(c)使所述单链环与至少一个探针特异性寡核苷酸引物接触，所述接触在所述至少一个探针特异性寡核苷酸引物与所述单链环中互补的序列杂交并形成双链引物-环复合物的杂交条件下进行；
(d)在发生滚环复制的条件下使所述双链引物-环复合物与酶接触；
(e)在下述条件下使滚环复制的产物与靶物特异性的经染料标记的检测器探针接触，在所述条件中所述靶物特异性的经染料标记的检测器探针与所述滚环复制的产物中互补的序列杂交；和
(f)检测所述靶物特异性的经染料标记的检测器探针，其中所述靶物特异性的经染料标记的检测器探针的存在指示样品中存在所述靶核酸。
34.根据权利要求33的方法，其中所述靶物特异性探针与固体支持物结合。
35.根据权利要求33的方法，其中通过单链DNA连接酶介导所述环化步骤。
36.根据权利要求33的方法，进一步包括酶促消化未环化的线性核酸以富集单链环。
37.根据权利要求33的方法，进一步包括使所述滚环复制的产物沉积在固体支持物上。
38.根据权利要求33的方法，其中使用成像实施所述检测步骤。
39.根据权利要求33的方法，其中所述检测步骤包括使所述滚环复制的产物沉积在固体支持物的表面上。
40.根据权利要求33的方法，进一步包括定量所述靶物特异性的经染料标记的检测器探针并将靶物特异性的经染料标记的检测器探针的量与样品中的靶核酸的量相关联。
41.根据权利要求33的方法，其中所述方法用于检测胎儿非整倍性的产前检测，所述方法进一步包括：
其中所述样品中的多个单链核酸片段包含胎儿和母体的无细胞基因组DNA；
其中所述至少一个靶物特异性探针包含多个染色体特异性探针，其中所述多个染色体特异性探针包含第一组探针和第二组探针，所述第一组探针包含至少100个对应于针对非整倍性检测的第一染色体的不同的核酸序列，所述第二组探针包含至少100个对应于参考染色体的不同的核酸序列，其中针对非整倍性检测的第一染色体和参考染色体不同；
其中所述至少一个靶物特异性探针包含多个染色体特异性探针；
其中所述至少一个探针特异性寡核苷酸引物包含多个染色体特异性寡核苷酸引物，其中所述多个染色体特异性寡核苷酸引物包含至少一个对衍生自针对非整倍性检测的第一染色体的单链环特异的染色体特异性寡核苷酸引物，和至少一个对衍生自参考染色体的单链环特异的染色体特异性寡核苷酸引物；
有选择地扩增双链引物-环复合物以生成线性单链产物，
其中所述靶物特异性的经染料标记的检测器探针为多个染色体特异性染料标记的检测器探针，其中所述多个染色体特异性检测器探针包含至少一个与来自针对非整倍性检测的第一染色体的染色体特异性探针互补的染色体特异性检测器探针，和至少一个与来自参考染色体的染色体特异性探针互补的染色体特异性检测器探针，其中用第一荧光染料标记所述多个对针对非整倍性检测的第一染色体特异的染色体特异性染料标记的检测器探针，并用第二荧光染料标记所述多个对参考染色体特异的染色体特异性染料标记的检测器探针，
其中包含第一荧光染料的染色体特异性染料标记的检测器探针的存在指示存在胎儿非整倍性。
42.根据权利要求41的方法，其中所述多个染色体特异性探针共享共同的定制序列。
43.根据权利要求42的方法，其中所述共同的定制序列包含与染色体特异性寡核苷酸引物互补的区域和与染色体特异性染料标记的检测器探针互补的区域。
44.根据权利要求41的方法，其中所述胎儿非整倍性选自下组：21三体性、18三体性、13三体性、X单体性、三重X综合征、XYY综合征和XXY综合征。
45.包含至少一组与至少两个不同的人染色体互补的染色体特异性寡核苷酸引物的组合物，其包含：与来自第一染色体的多个靶序列互补的第一组染色体特异性寡核苷酸引物和与来自第二染色体的多个靶序列互补的第二组染色体特异性寡核苷酸引物。
46.包含至少一组用于检测至少两个人染色体的染色体特异性染料标记的检测器探针的组合物，其包含：与多个对第一染色体特异的探针特异性寡核苷酸引物互补的第一组染色体特异性染料标记的检测器探针，和与多个对第二染色体特异的探针特异性寡核苷酸引物互补的第二组染色体特异性染料标记的检测器探针。
47.包含权利要求45的组合物和权利要求46的组合物的试剂盒。
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